DE2724992B2

DE2724992B2 - Verfahren zur Herstellung eines Monascus-Pigments

Info

Publication number: DE2724992B2
Application number: DE2724992A
Authority: DE
Inventors: Mariette Suzanne Catherine Orbe Carels; David Morges Shepherd
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1976-06-02
Filing date: 1977-06-02
Publication date: 1979-08-23
Also published as: FR2353616B1; CH606421A5; US4145254A; JPS52148693A; DE2724992C3; MY8100099A; GB1539494A; FR2353616A1; DE2724992A1; PH13337A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Monascus-Pigments durch Kultivierung eines Mikroorganismus dieser Art in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen.

Es ist seit langer Zeit bekannt daß Mikroorganismen der Gattung Monascus rote Pigmente erzeugen, die zum Färben von Nahrungsmitteln verwendet werden können. In gewissen Ländern des Orients werden solche Mikroorganismen auf Reiskörnern kultiviert Nachdem sich diese reichlich mit einem scharlachroten Mycel überzogen haben, wird das Ganze fein gemahlen. Das erhaltene Pulver wird beispielsweise zum Färben von Wein und Sojaköse verwendet

Wegen des starken Färbevermögens dieses natürlichen Farbstoffs wurden zahlreiche Studien auf die Molekülstruktur dieser Pigmente und auch auf die Kultivierung dieser Mikroorganismen gerichtet. Die gnaue Struktur dieser Pigmente und auch gewisse chemische Eigenschaften derselben sind bekannt So weiß man beispielsweise, daß das rote Pigment durch Reaktion eines orangen Pigments, wie z. B. Monascorubrin oder Rubropunctatin, mit einem Ammoniumion oder einer Aminogruppe, wie sie beispielsweise in einer Aminosäure, einem aminogruppenhaltigen Zucker, einem aminogruppenhaltigen Zuckerpolymer, einer mehrere Aminogruppen enthaltenden Säure oder einem aminogruppenhaltigen Alkohol, zustande kommt.

Diese Kenntnisse und Studien haben es ermöglicht Verfahren zur Fabrikation von Monascus-Pigmenten im industriellen Maßstab auszuarbeiten. Beispielsweise wird ein aus der US-PS 37 65 906 bekanntes Verfahren dadurch ausgeführt daß man einen Mikroorganismus der Art Monascus anka oder Monascus purpureus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das als Stickstoffquelle beispielsweise Reismehl, einen Hefeextrakt, ein Pepton oder ein Ammoniumsulfat enthält, kultiviert, das Mycel abtrennt, das Pigment aus dem Mycel mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Alkohol, extrahiert und schließlich das Pigment mit einem löslichen Protein oder mit löslichen Peptiden umsetzt, wobei ein in Wasser lösliches Pigment erhalten wird. Obwohl dieses Verfahren hinsichtlich der Bestimmtheit des erhaltenen Produkts gegenüber den alten Verfahren s zur Herstellung von farbstoffhaltigen Pulvern einen beträchtlichen Fortschritt darstellt, besitzt es immer noch Nachteile. Der größte Nachteil liegt darin, daß ein Teil des orangen Pigments, das für die spätere Umsetzung mit einem Protein gewonnen werden soll,

ίο bereits im Kulturmedium innerhalb des Mycels mit intracellulären Proteinen oder Aminosäuren reagiert

Dadurch wird die Extraktion des Pigments erschwert

und die Ausbeute an orangem Pigment verringert

Der Erfindung lag nunmehr die Aufgabe zugrunde,

1ί das im vorstehenden Absatz beschriebene Verfahren so zu verbessern, daß es die genannten Nachteile nicht mehr besitzt und ein oranges Pigment hoher Reinheit und in hoher Ausbeute liefert das hohen Anforderungen entspricht und genau reproduzierbare Eigenschaften aufweist

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, dsß man bei einem eingangs beschriebenen Verfahren den Mikroorganismus bei einem pH zwischen 4 und 7 in einem ersten Medium, das eine organische Stickstoffquelle und Wachstumsfaktoren enthält, kultiviert, wobei eine erste Biomasse erhalten wird, diese in ein zweites Medium, das als Stickstoffquelle ein Nitrat und/oder ein Ammoniumsalz enthält überführt, den pH auf einen Wert zwischen 2 und 4 einstellt, die Kultivierung

jo während einer Zeit von 2 bis 7 Tagen bei einer

Temperatur von 20 bis 35"C betreibt und das Pigment

aus der erhaltenen zweiten Biomasse mit Hilfe eines

Lösungsmittels extrahiert Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt also zwei

Phasen, wobei die erste eine Wachstumsphase des Mikroorganismus unter Bedingungen darstellt, welche die Bildung von sekundären Metaboliten, wie z. B. das fragliche Pigment vollständig verhindern können, und wobei die zweite eine Phase der Bildung des fraglichen

•to Pigments unter Bedingungen darstellt, welche vor allem dessen Bildung begünstigen können. Die erste Biomasse kann also nur schwach gefärbt oder sogar ungefärbt sein, während die zweite Biomasse einen fortgeschritteneren, entwickelten und gefärbten Zustand aufweist

r. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Herstellung eines orangen Pigments hoher Reinheit, welches dazu verwendet werden kann, ein rotes Pigment mit einer bestimmten Natur durch Umsetzung mit einer geeigneten reinen Substanz, wie z. B. einer

w Aminosäure, einem aminogruppenhaltigen Polysaccharid oder einem aminogruppenhaltigen Alkohol, herzustellen.

Es konnte festgestellt werden, daß die oben erwähnte Reaktion zwischen dem orangen Pigment und Ammo-

M niumionen oder Aminogruppen verhindert wird, wenn man den pH des Kulturmediums während der Phase der Bildung des Pigments durch den Mikroorganismus zwischen 2 und 4 hält. Es hat sich gezeigt, daß auf diese Weise praktisch kein Pigment wie Rubropunctatamin

mi oder Monascorubramin, sondern praktisch ausschließlich ein Pigment wie Rubropunctatin oder Monascorubrin gebildet wird, d. h. also ein oranges Pigment, das eine maximale Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 470 nm aufweist. Darüber hinaus kann die gebildete

h^r. Menge an orangem Pigment einen beträchtlichen Wert erreichen, wie z. B. 3 mg/ml Kulturmedium.

Schließlich wurde auch festgestellt, daß die Bildung von Conidien verhindert wird, wenn man den pH des

Kulturmediums auf einen Wert zwischen 2 und 4 hall. Das heißt also, die Bildung eines Pigments wiis Rubropunctation oder Monascorubrin verläuft in» vorliegenden Fall unter Verhinderung der Bildung vom Conidien.

Genauer gesagt, es wurde festgestellt, daß durch die Einstellung eines pH zwischen 2 und 4 die Bildung von Lipiden beschränkt wird, die zur Bildung von Conidieiu erforderlich sind. Anders ausgedrückt heißt das, daß durch die Konkurrenz bei der Ausnutzung der Fettsäuren während der Bildung von Conidien bzw. Pigment die Inhibierung der Bildung von Lipiden zu einer Stimulierung der Bildung von Pigmenten führt. Die Schaffung des vorliegenden Verfahrens umfaßt somit die Nennung allgemeiner Maßnahmen, die man. ergreifen muß, um die Bildung von Conidien zu beschränken und dadurch die fraglichen Pigmente zu erhalten.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jeder Mikroorganismusstamm der Gattung Monascus verwendet werden, der ein Pigment vom der Art Monascorubrin oder Rubropunctatin bildet Man kann ein Inoculum des gewählten Stamms am; einer lyophilisierten und rekonstituierten Kultur oder aus einer Kultur auf einem festem Medium in der Weise herstellen, wie es Fachleuten bekannt ist Man stellt ein Inoculum her, welches eine an die Abmessungen der für die Kultivierung vorgesehenen Anlage angepaßte Mycelmenge enthält Wenn beispielsweise Schüttelflaschen mit dem Inhalt einiger deziliter oder Liter verwendet werden, dann kann man Mycel vom festen Medium entnehmen und dieses mit einigen Zentilitern des zu inoculierenden Mediums homogenisieren. Mil dem Ausdruck »festes Medium* ist ein Kulturmedium gemeint, das eine ausnutzbare Kohle« jloffquelle, wie z. B. Glucose, eine Quelle für organischen Stickstoff und Wachstumsfaktoren beispielsweise in Form eines. Hefeextrakts sowie als Verfestigungsmittel Agar enthält

Man kann das so hergestellte Inoculum in ein erste; wäßriges Kulturmedium einführen, welches 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 4 Gew.-% Glucose und 0,1 bis 2 Gew.-% einer Quelle für Aminosäuren, vorzugsweise 1 Gew.-% Hefeextrakt, enthält Man kann dieses inoculierte Medium bei einer Temperatur zwischen 20 und 35° C, vorzugsweise 25° C, unter geeigneter Belüftung: und Rührung während einer Zeit inkubieren, die: ausreicht, daß ein gutes Mycelwachstum ohne Bildung von Pigment stattfindet Diese Zeit liegt in der Größenordnung von 24 st Man kann außerdem diese· Kultivierung im ersten Medium in mehreren Stufen, insbesondere in zwei Stufen, die jeweils 24 bis 48 si dauern, in zwei Flaschen aufeinanderfolgend durchführen. Das Mycel kann dann in ein zweites wäßriges Medium überführt werden, das 04 bis 10 Gew.-%„ vorzugsweise 3 Gew.*% Glucose und 0,05 bis 0£ Gew.-°/o, vorzugsweise 0,15 Gew.-%, eines Ammoniumsalzes und/oder eines Nitrats sowie die zur Sicherstellung eines maximalen Wachstums und einer maximalen Pigmentbildung erforderlichen Oligoelemente enthält Man kann den pH des zweiten Mediums dadurch auf einen Wert zwischen 2 und 4 einstellen, indem man die nötige Menge einer Säure zugibt, wobei die Art der Säure praktisch keine Rolle spielt. Wenn die verwendete Stickstoffquelle aus einem Ammoniumsalz besteht, dann kann man den pH auf einen Wert zwischen 2 und 4 dadurch fallen lassen, indem man den Gehalt an Ammoniumionen durch den Mikroorganismus aufbrauchen läßt Man kann die Kultivierung im zweiten Medium während einer Zeit durchführen, die ausreicht, daß eine maximale Pigmentbildung erhalten wird. Diese Zeit liegt in der Größenordnung von 2 bis 7 Tagen.

Dabei hält man die Temperatur auf einen Wert zwischen 20 und 35° C, vorzugsweise 25° C.

Hierauf kann man das Mycel, d.h. also die zweite Biomasse, vcm zweiten Medium durch irgendein bekanntes Verfahren, wie z. B. Filtration oder Zenu ifugation, abtrennen und das orange Pigment mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Äthanol, Methanol, Chloroform oder Methylendichlorid, extrahieren. Es wurde jedoch festgestellt, daß man eine maximale Ausbeute bei der Extraktion erhält, wenn man das

is Mycl mit dem Kulturmedium homogenisiert, oder anders ausgedrückt, wenn man die Suspension der zweiten Biomasse im zweiten Medium homogenisiert und dann das Pigment aus der homogenisierten Suspension mit einem geeigenten Lösungsmittel, wie sie oben erwähnt wurden, extrahiert Wenn man in dieser Weise verfährt, dann ist es ratsam, den pH vor der Extraktion zwischen 2 und 3 einzustellen, um ein Pigment mit maximaler Reinheit zu erzielen, oder anders ausgedrückt, um eine teilweise Umwandlung des orangen Pigments in ein rotes Pigment zu vermeiden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, worin 4)e Prozentangaben in Gewicht ausgedrückt sind.

_J0 Beispiel 1

Der Stamm Monascus rubiginosus ATCC 16 367 wird auf einem festen Medium kultiviert, das 4% Glucose, 1% Hefeextrakt, 03% KH₂PO₄ und 1,5% Agar enthält Hierauf wird 1 Woche bei 30° C inkubiert. Dann wird

r> das Mycel abgenommen und mit 30 ml eines ersten wäßrigen Kulturmediums homogenisiert, das 4% Glucose, 1% Hefeextrakt und 0,1% KH₂PO₄ enthält Das so erhaltene Inoculum wird dann in eine 500 ml fassende Schüttelflasche überführt, weiche 150 ml des gleichen wäßrigen Kulturmediums enthält, das für die Homogenisation verwendet worden ist. Hierauf wird 24 st bei 25° C auf einem Drehschüttler, der sich mit 150 U/min dreht, inkubiert. Nun werden 10 ml der erhaltenen Suspension in eine Schüttelflasche überführt,

V) in der 150 ml eines zweiten wäßrigen Nährmediums enthalten sind, das 3% Glucose, 0,15% NH₄CI, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,05% NaCl und 0,01% FeSO₄-7 H₂O enthält und mit destilliertem Wasser hergestellt und nach 20 min bei 121°C

Mi sterilisiert worden ist. Nun wird auf einem Drehschüttler, der sich mit 150 U/min dreht, bei 25° C inkubiert Nach 24 st ist der Stickstoffgehalt des Mediums von 413 mg/100 ml auf 30 mg/100 ml und der pH auf 23 gefallen, worauf die Bildung von Pigment beginnt Die

Ti Bildung des Pigments erreicht nach 120 st sein Maximum mit 2,5 mg/ml. Das Pigment wird mit 50%igern Äthanol extrahiert. Auf diese Weise wird eine orange Lösung erhalten, die ein einheitliches Pigment enthält.

Beispiele2bis7

Es werden verschiedene Stämme von Monascus (M.) kultiviert, und das Pigment wird in der in Beispiel I beschriebenen Weise extrahiert. Dabei ist aber das h'. zweite wäßrige Kulturmedium etwas verschieden und enthält 4% Glucose, 0,05% NH₄CI, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,05% NaCI und 0,01% FeSO₄ · 7 HjO. Es weiden die in der untenstehenden

Tabelle zu Findenden Resultate erhalten. In de Spalte »Pigment« ist die nach 7 Tagen Inkubation im zweiten Medium gebildete Menge oranges Pigment in mg/ml Kulturmedium eingetragen. In der Spalte »pH nach 24 st« ist angegeben, auf welchen Wert der pH im zweiten Kulturmedium nach einer Inkubationszeit von 24 st in diesem Medium gefallen ist

Bei	Mtaascus-Art	ATCC-Nr.	Pigment	pH
spiel			nach	nach
	Bezeichnung	6405	7 Tagen	24 st
		16362	in mg/ml
2	M. purpureus	16365	0,62	2,95
3	M. major	16367	1,47	2,45
4	M. purpureus	16427	1,7	2,6
5	M. rubiginosus	16435	2,35	2,55
6	M. purpureus	1,26	2,7
7	M. species	1,41	2,95
		Beispiele8bisl8

Es werden mehrere Inocula der Stämme Monascus major ATCC 16 362 und Monascus rubiginosus ATCC 16 367 hergestellt Zur Herstellung eines jeden Inoculums wird der Stamm auf einem festen Medium kultiviert, das 4% Glucose, 03% KH₂PO₄, 1% Hefeextrakt und 1,5% Agar enthält, wobei der Rest aus im Gel festgehaltenem destilliertem Wasser besteht Es wird 6 Tage bei 25° C inkubiert Nun wird das Mycel vom festen Medium abgenommen und mit 30 ml eines flussigen Kulturmediums (I) gemischt, welches die Zusammensetzung des oben angegebenen festen Kulturmediums aufweist mit der Ausnahme, daß kein Agar anwesend ist Hierauf wird das Gemisch während 45 see in einer 50 ml fassenden Kammer eines Sorvall-Omnimixer-Homogenisators homogenisiert

Ausgehend von diesen Inocula werden Mycele im Wachstumszustand hergestellt Hierzu wird jedes Inoculum in eine 500 ml fassende Schattelflasche eingebracht, die 150 ml des Mediums (I) enthält Hierauf wird 48 st bei 25° C auf einem Drehschüttler, der sich mit 150 U/min dreht, inkubiert. Dann werden 10 ml der erhaltenen Suspension entnommen und in eine andere 500 ml fassende Schüttelflasche eingebracht, die 150 ml des Mediums (I) enthält, worauf sich nochmals eine 24 st dauernde Inkubation bei 25° C anschließt

Es werden nun drei wäßrige Kulturmedien, nämlich

(II), (III) und (IV)₁ hergestellt, in denen die Stickstoffquelle aus einem Ammoniumsalz oder einem Nitrat besteht. Es handelt sich dabei um 0,3% NaNO₃ für das Medium (II), um 0,05% NH₄C! für das Medium(lII) und um 0,2% NH₄NO₃ für das Medium (IV). Ansonsten sind die drei Medien jedoch identisch und enthalten jeweils 4% Glucose, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,05% NaCl und 0,01% FeSO₄ · 7 H₂O. Die drei Medien werden mit Hilfe von destilliertem Wasser hergstellt und während 15 min bei 121⁰C sterilisiert Nach der Sterilisation besitzen die Medien (II), (III) und (IV) einen pH von 5,0, 5,2 bzw. 5,3, ohne daß der pH vor der Sterilisierung absichtlich gesenkt worden wäre.

Nun werden die beiden Mycele im oben erwähnten Wachstumszustand in den verschiedenen Medien, weiche die Pigmentbildung begünstigen, kultiviert Diese zweite Kultivierungsphaüe wird abgesehen von einer Veränderung des pH bei den einzelnen Versuchen in ähnlicher Weise ausgeführt Für jeden Versuch werden 10 ml der nach der zwejf ;n Inkubation von 24 st im Medium (I) erhaltenen Mycefcuspcnsion verwendet Diese 10 ml werden in eine 500 ml fassende Schüttelflasche, die 150 ml Medium (II), (HI) oder (IV) enthält, eingeführt

Hierauf wird bei 25° C während einer Zeit inkubiert die nötig ist, um eine maximale Pigmentbildung zu erhalten. Der pH wird ggf. mit Hilfe von HCl vor und manchmal auch während der Inkubation auf 2,5 gesenkt Es wird eine gefärbte Mycelsuspension erhalten, die 30 see lang in einem Sorvall-Omnimixer-Homogenisator homogenisiert wird. Der pH wird auf 2,5 eingestellt Das Pigment wird aus der homogenisierten Suspension mit Hilfe von Äthanol extrahiert, wobei 10 Vol.-Teile Äthanol von 50% auf 1 Vol.-Teil Suspension verwendet werden. Zur Entfernung des Mycels wird filtriert Die Konzentration des orangen Pigments wird durch spektralfotometrische Absorption gemessen. Die erhaltenen Resultate wie auch verschiedene Besonderheiten der Versuche sind in der untenstehenden Tabelle zusammengefaßt.

In der Spalte »pH gesenkt« bedeuten unter der Rubrik »wann« die Abkürzungen »vor Ster.«, » + nach 24 st« und »+ nach 48 st« daß der pH vor der Sterilisaton des Mediums und nach 24 st oder 48 st der Kultivierung im fraglichen Medium entsprechend abgesenkt worden ist Die Versuche 8 bis 14 sind mit dem Stamm ATCC 16 367 und die Versuche 15 bis 18 mit dem Stamm ATCC 16 362 durchgeführt worden.

Bei	Stamm	Medium	pH abgesenkt	wann	Pigment	Kultivie
spiel				_		rungszeit
			auf 2,5	vor Ster.	mg/ml	(Tage)
8	ATCC	II	nein	vor Ster. -	1,56	3
9	16367	II	ja	vor SteF. -	1,76	3
10		II	ja	vor Ster.	2,52	3
11		II	ja	-	2,84	4
12		III	ja	vor Ster.	2,30	4
13		IV	nein	-	1,68	3
14		IV	ja	vor Ster.	2,18	4
15	ATCC	II	nein	\or Ster. ^j	0,88	4
16	16362	Il	ja	vor Ster. -	1,13	3
17		II	ja		1,68	4
18		II	ja		1,60	4



h nach 24 st
l- nach 48 s»





h nach 24 st
H nach 48 st

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Monascus-Pigments durch Kultivierung eines Mikroorganismus dieser Gattung in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einem pH zwischen 4 und 7 in einen: ersten Medium, das eine organische Stickstoffquelle und Wachstumsfaktoren enthält, kultiviert, wobei eine erste Biomasse erhalten wird, diese in ein zweites Medium, das als Stickstoffquelle ein Nitrat und/oder ein Ammoniumsalz enthält, überführt, den pH auf einen Wert zwischen 2 und 4 einstellt, die Kultivierung während einer Zeit von 2 bis 7 Tagen bei einer Temperatur von 20 bis 35° C betreibt und das Pigment aus der erhaltenen zweiten Biomasse mit Hilfe eines Lösungsmittels extrahiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension der zweiten Biomasse im zweiten Medium homogenisiert, den pH auf einen Wert zwischen 2 und 3 einstellt und das Pigment aus der homogenisierten Suspension extrahiert