DE3030107A1

DE3030107A1 - Polysaccharid mit antikarzinogener aktivitaet und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3030107A1
Application number: DE19803030107
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Hirata; Yoshie Kimizuka; Kazuo Nakajima; Akira Obayashi; Osamu Tanabe; Tsutomu Taniguchi; Hiroyuki Uchida
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1979-08-08
Filing date: 1980-08-08
Publication date: 1981-02-26
Also published as: CA1139748A; CH648595A5; JPS5626198A; GB2055873A; JPS5646793B2; GB2055873B; US4409385A; FR2463185B1; DE3030107C2; FR2463185A1

Description

Die Erfindung betrifft Polysaccharide mit einer antikarzinogenen Aktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit Polysacchariden mit einer antikarzinogenen Aktivität und mit einem Verfahren zur Herstellung derartiger Polysaccharide aus einem Myzel- und/oder Stromatoidextrakt eines Stammes, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, oder aus einem Kulturmedium, in dem der Stamm bebrütet worden ist.

Erfindungsgemäß kann jeder Stamm einer Spezies verwendet werden, die zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört und ein anti karzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag.

Im Falle der nachstehend geschilderten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Stamm von Isaria atypicola Yasuda K-2583 eingesetzt, der durch Züchten eines Stromatoids (Gewebes) einer Pilzspezies erhalten worden ist, die in "Kiyotaki" in der Prefektur Kyoto in Japan im Sommer 1965 gesammelt worden ist. Die Identifizierung dieser Spezies erfolgt gemäß der folgenden Literaturstellen: "Icones of Japanes Fungi", herausgegeben von Seiichi Kawamura (-veröffentlicht von Kazama-shobo, Tokyo, Japan) 8, 854 857, 1968; "Colored Illustrations of Fungi of Japan", herausgegeben von Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (veröffentlicht von Hoiku-sha, Osaka, Japan) 1965.

Die charakteristischen Eigenschaften dieses Stammes sind folgende: dieser Stamm ist ein Parasit auf Kishinouyeus typicus Kishida (eine Spinnenart), wobei der tote Körper dieser Spinne unter der Erde mit Myzeln dieses Stammes bedeckt ist und sich daraus Stromatoid entwickelt. Das

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Stromatoid besitzt eine Höhe von 5 bis 8 cm und eine weiße zylindrische fleischige Form. An der Oberseite des Stengels mit einem Durchmesser von 2,5 bis 4,0 mm mit einer glatten" Oberfläche befindet sich ein tragender Teil, der- etwas dicker und länger als der Stengel ist. Der tragende Teil weist leicht samtartige violette Sporen auf, die zylindrisch,halbglatt und farblos sind und eine Größe von 4 bis 5x1,5 bis 2,Q μ besitzen.

Aus diesen Charakteristika sowie unter Heranziehung der vorstehend erwähnten Literaturstellen wurde dieser Stamm als Isaria atypicola Yasuda identifiziert. Der Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, in Japan unter der Registriernummer FERM-P 5086 sowie bei der American Type Culture Collection unter der Reg is trier nummer ATCC 2060 3 hirrterlegt.

Das erfindungsgemäße antikarzinogene Polysaccharid kann aus einem flüssigen Stromatoid- und/oder Myzelextrakt des Stammes, der bebrütet worden ist, oder aus einer filtrierten Kulturbrühe, in der ein derartiges Myzel bebrütet worden ist, erhalten werden.

Es ist jedoch nicht einfach, ein derartiges Stromatoid in einer ausreichend großen Menge in der Natur zu sammeln. Daher ist es vorteilhaft, den Stamm zur Gewinnung einer großen Stromatoidmenge zu bebrüten. Die Bebrütung kann in einer für die Bebrütung von Pilzen der Klasse Hyphomycete-s bekannten Weise durchgeführt werden^ beispielsweise auf einem Holzmehl— oder Sägemehlme'dium. Beispielsweise kann man 200 g Sägemehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser gut zur Herstellung eines Kulturmediums vermischen, das in ein geeignetes Gefäß eingefüllt und sterilisiert wird. Der Stamm, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden ist, wird auf dem in der vorstehenden Weise hergestellten Kulturmedium in herkömmlicher Weise bei 25 bis 27⁰C während ungefähr 1 Monat zum ausreichenden

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Myzelwacbstum bebrütet. Das Kulturmedium läßt man dann ungefähr 1 Monat bei 20 bis 25°C zum Stromatoidwachstum stehen. Das auf diese Weise gewachsene Stromatoid wird gesammelt und als Ausgangsmaterial für die Erfindung eingesetzt.

Di« erfindungsgemäß eingesetzten Myzeln können nach einer herkömmlichen Züchtungsmethode hergestellt werden, beispielsweise unter Einsatz einer festen oder flüssigen Kultur. Im Falle einer festen Kultur kann beispielsweise Agar, Gelatine, Stärke, Holzmehl, Kraftzellstoff oder ein anderes herkömmliches festes Kulturmedium oder eine Kombination davon verwendet werden. Im Falle einer flüssigen Kultur kann man auf ein flüssiges Kulturmedium zurückgreifen, das verschiedene Nährmittel enthält, die auf dem Gebiet des Züchtens von Mikroorganismen bekannt sind. So kann das flüssige Kulturmedium Kohlenstoffquellen, wie Glukose, Maltose, Lactose, Rohrzucker, Stärke, Melassen etc. eine Stickstoffquelle (organisches oder anorganisches Stickstoffmaterial), wie Pepton, Hefeextrakt, Hefe₇ Maisflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsalze etc., oder eines oder mehrere organische oder anorganische Salze, wie Phosphate.oder Magnesiumsalze etc. enthalten. Gegebenenfalls können andere Materialien zugesetzt werden, die für das Wachstum erforderlich sind, wie beispielsweise Vitamine. Diese Materialien für feste und flüssige Kulturmedien sind auf dem Gebiet des Züchtens von Pilzen bekannt, so daß keine weiteren Erläuterungen erforderlich sind. Das Züchten der flüssigen Kultur kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise in Form einer stationären Kultur, einer Schüttelkultur oder einer Submerskultur. Aus wirtschaftlichen Erwägungen sowie im Hinblick auf die Handhabung ist eine flüssige Kultur vorteilhafter als-eine feste Kultur.

Bei einem Züchten einer flüssigen Kultur können folgende Bedingungen eingehalten werden:

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Anfangs-pH 2 Tdxs 9

Bebrütungstemperatur 15 bis 33°C Bebrütungszeitspanne 3 bis 30 Tage

Im Falle einer Submerskultur wird das Medium mit einer Geschwindigkeit von 0,1 bis 2,0 1/1/min unter Hühren bei 30 bis 500 Upm belüftet.

Die durch die feste oder flüssige Kultur erzeugten Myzeln werden in herkömmlicher Weise gesammelt und als Ausgangsmaterial für -die Erfindung verwendet.

Beispielsweise können im Falle einer flüssigen Kultur die Myzeln dadurch gesammelt werden., daß das angefallene flüssige Kulturmedium einer herkömmlichen Trennmethode unterzogen wird, beispielsweise einem Zentrifugieren, Filtrieren etc. Das nach dieser Trennmethode erhaltene Filtrat wird als filtrierte Brühe bezeichnet, die ebenfalls als Ausgangsmaterial für die Erfindung eingesetzt werden kann.

Erfindungsgemäß werden das Stromatoid und/oder die Myzeln, die in der vorstehend beschriebenen Weise gesammelt worden sind, mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert. In diesem Falle können das Stromatoid und/oder die Myzeln als solche direkt der Extraktion unterzogen werden. Gegebenenfalls kann man vor einer derartigen Extraktion das Stromatoid und/ oder die Myzeln einer Vorbehandlung unterziehen, beispielsweise einem Waschen mit Wasser, einem Trocknen mit Luft, einein Zerstoßen (Pulverisation) oder einer Extraktion mit einem nicht-polaren Lösungsmittel, i

Das für die Extraktion eingesetzte wäßrige Lösungsmittel ist Wasser oder eine Mischung aus Wasser und wenigstens einem wasserlöslichen Material, wobei als wasserlösliche Materialien beispielsweise Säuren, Basen, Salze oder organische Lösungsmittel in Frage kommen.

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Zur Durchführung der Extraktion werden das vorbehandelte
oder nicht-vorbehandelte Stromatoid oder die Myzeln mit
dem wäßrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des
Lösungsmittels ist nicht kritisch, falls sie unter 120°~C
gehalten wird. Die bevorzugte Temperatur kann unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten ausgewählt werden. Die Extrak-

p 't

tion wird während einer Zeitspanne durchgeführt, die dazu
ausreicht, die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen nimmt mit höherer Temperatur die Extraktionszeit
ab. Innerhalb des vorstehend geschilderten bevorzugten Temperaturbereiches wird die Extraktion vorzugsweise in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 10 Stunden durchgeführt. Die
Extraktion wird vorzugsweise unter Rühren in einem Gefäß
durchgeführt, das aus Glas besteht oder mit Glas oder Email ausgekleidet ist» Ferner kann es sich um ein Gefäß aus rostfreiem Stahl handeln. Die Menge des Lösungsmittels kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, beträgt jedoch
im allgemeinen das 10- bis 100-fache des Gewichts (auf Trokkenbasis) des Stromatoids und/oder der Myzeln. Die Verwendung von pulverisiertem Stromatoid oder Myzel wird für die
Extraktion bevorzugt. Nach der Extraktion werden das Myzel oder Stromatoid sowie andere feste Materialien von der Flüssigkeit durch herkömmliche Maßnahme entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren. Der flüssige Extrakt
wird für eine weitere Behandlung konzentriert, beispielsweise durch Vakuumeindampfen oder dgl. Im allgemeinen wird der wäßrige Extrakt auf das 1/3- bis 1/10-fache seines ursprünglichen Volumens konzentriert.

Der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Extrakt wird dann in der nachfolgend beschriebenen Weise gereinigt, was eine Ausfällung und Gewinnung des gesuchten Polysaccharids bedingt. Der Begriff "flüssiger Extrakt", wie er im vorliegenden Falle verwendet wird, bedeutet ein Filtrat oder Zentrifugat, das bei der Entfernung des Myzels und/oder des Stromatodds sowie anderer fester Materialien aus dem Extrakt anfällt.

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Die filtrierte- Brühe Rann ebenfalls f irr die nachfolgend erläuterte Reinigung verwendet werden, was ein Ausfällen und eine- Gewinnung; des gesuchten Palysaccharids ermöglicht. Guter dem Begriff "filtrierte Bröne¹¹"" ist ein: Filtrat zu. verstehen, das den aktiven Bestandteil, d. h. das Polysaccharid, enthält und durch Entfernung des Myzels sowie- anderer fester Materialien- von der Kulturbröhe, d. h» dem Kulturmedium, indem der Stamm in der vorstehend beschriebenen Weise in flüssiger Kultur bebrütet worden ist., erhalten worden ist. Die filtrierte Brühe wird zur weiteren Behandlung konzentriert, beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum. Im allgemeinen wird die filtrierte Brühe auf ein Drittel bis ein Zehntel des ursprünglichem Volumens konzentriert. Die konzentrierte filtrierte Brühe wird dann- gereinigt.

Der flüssige·Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt gereinigt werden, der flüssige Extrakt und die filtrierte Brühe können jedoch auch miteinander vereinigt werden, worauf die Mischung gereinigt wird.

Die Reinigung kann nach jieder der folgenden Methoden durchgeführt werden:

(A) Ausfällung der gesuchten Substanz durch Zugab& eines hochpolaren organischen Lösungsmittels (beispielsweise eines niederen Alkohols oder Ketons, beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Buta— ησί, Aceton etc. I oder durchs Aussalzen; (durch Zugabe von wasserlöslichen anorganischere Salzen, wie ÄiranortiunrsuXfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid etc~i

Entfernen von Säuren', Ionen; sowie Substanzen mit niederem Molekulargewicht durch Dialyse, Gelfiltration (diircFf Einsatz vent Dextran odeir Polyacrylamidgel, wie Sephadex, Bio-Gel etc.), Ionenaustauscherharzbehandlung' (durch Einsatz- von beispielsweise

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versctiiedenen im Handel erhältlichen Anionen- und Ka-tionenaustauscherharzen^ wie Amberlite, Dowex, Duolite etc.), ültrafiltrafcion sowie eine Kombination -davon, zur Gewinnung einer im wesentlichen reinen Lösung, aus der die gewünschte aktive Substanz gewonnen wird;

(C) Behandlung zur Entfernung von freien Proteinen, beispielsweise unter Anwendung der Sevag-Methode, der TrifluortrIchlormethanmethode, durch Proteasebehandlung etc.

Diese Methoden sind bekannt. Gegebenenfalls können zwei oder mehrere dieser Methoden zusammengefaßt werden. Im
allgemeinen wird jedoch der flüssige Extrakt oder die
filtrierte Brühe nach der Konzentration einer Ionenaustauscherharzbehandlung, einer Dialyse, einer Gelfiltration, Ultrafiltration oder e"iner Kombination davon zur Bewirkung einer Entfärbung, Entsäuerung sowie Entfernung von Substanzen mit niederen Molekulargewichten unterzogen.
Aus einer derartig gereinigten Lösung kann die gesuchte Wirksubstanz nach einer geeigneten Methode entfernt werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen. Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Methoden zur Erzielung des gewünschten Reinigungsgrades wiederholen.

Die auf diese Weise erhaltene Substanz besitzt folgende charakteristische Eigenschaften:

(1) Diese Substanz ist ein weißes oder hellbraunes Pulver und nicht-dialysierbar

(2) Die Molisch-Re'aktion, die Anthron-Reaktion sowie die Ninhydrin-Reaktion sind positiv '

(3) Die Elson-Morgain-Reaktion· ist schwach-positiv oder negativ

(4) Die Jodreaktion sowie die Bialreaktion* sind negativ

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{5) Diese Substanz ist In "Wasser und in einer wäßrigen .Lösung einer Substanz, die in Wasser löslich ist, beispielsweise eines organischen Lösungsmittels, einer Säure, einer Base, eines Salzes oder dgl., löslich^ jedoch unlöslich in einem organischen Lösungsmittel/ ^wie Petrolätner., Ä" thy lather, Benzol, Aceton* Jithanol, Methanol etc.

t'6") Diese Substanz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt und wird beim starken Erhitzen verkohlt.

il) Das Hydrolysat dieser Substanz, das durch Auflösen dieser Substanz in 0,1 η wäßriger Schwefelsäure und Erhitzen der liögung idle 0,5 Gew. -%· dieser Substanz enthält) auf 100⁰C während 5 Stunden erhalten worden ist, enthält wenigstens eine oder mehrere der Komponenten Glukose, Galactose und Mannose,, wobei die Art des Zuckers von der Art und dem Ausmaß der Reinigung abhängt.

<8) Die Elementaranalyse dieser Substanz ist wie folgt: C 35,78 %, H 6/28 %; N 0,65 % '

Aus den vorstehenden Charakteristika nimmt man an, daß diese Substanz ein Polysacchafid mit hohem Molekulargewicht ist, das sich aus dem vorstehend erwähnten Zucker zusammensetzt und ein Molekulargewicht von wenigstens 8000 und ein durchschnittliches Molekulargewicht von ungefähr 2 χ 10 besitzt.

Das erfindungsgemäße Polysacchärid besitzt weder eine Cytotoxizität noch Nebenwirkungen, wie sie in herkömmlicher Weise im Zusammenhang mit dem Einsatz von herkömmlichen jMitteln auftreten, beispielsweise wird keine Abnahme der Anzahl der Leukocyten, keine Anämie der Leber sowie anderer Organe, keine Atrophie der Milz, kein Körpergewichtsverlust sowie ein Appetitverlust festgestellt. Die akute Toxizität (LD₅₀) dieses Polysaccharids in Mäusen beträgt mehr als 2000 mg/kg bei einer intraperitonealen Injektion.

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- Vt: -

erfindungrsgemä&e Polysaccharid besitzt eine antikareinogene Aktivität. Die antikarzinogene Aktivität wurde nach folgendem Test bestätigt und ermittelt:

Eine Maus des ICR-JCL-Stamms mit einem Gewicht von 2Ϊ + 2 ? wurde intraperitoneal mit Sarcoma-180 Krebszellen-oder Ehrlich-Krebszellen beimpft- 1 Woche nach der Beimpfung wurde eine ausreichende Zunahme der Ascitesflüssigkeit in der Maus festgestellt. Die darin enthaltenen, Krebszellen wurden subkutan auf Achselflächen von anderen Mäusen in einer Menge vor £000000 Zellen pro Maus transplantiert. Diese Mäuse wurden in verschiedene Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus fünf bis acht Individuen bestand. An die erste Gruppe (Vergleichsgruppe) wurde nur eine Kochsalzlösung verabreicht _t während an jede der anderen Gruppen das erfindungsgemäße Polysaccharid verabreicht wurde. Die erste Verabreichung der Kochsalzlösung oder des Polysaccharids erfolgte intraperitoneal· 1 Tag nach der Transplantation, während die anschließenden Verabreichungen fünfmal an jedem anderen Tag wiederholt wurden. Der feste auf die Mäuse transplantierte Kxebs wurde beobachtet- nach der letzten Verabreichung .[4m T&. TagT wurde die durchschnittliche Zunahme des Körpergewichts, gemessen, worauf die Mäuse zur Untersuchung von Nebenwirkungen und zur Bestimmung des Gewichts der Tumore, die aus der Vergleichsgruppe entnommen wurden, sowie der Tumore, die aus den mit Polysaccharid behandelten Gruppen herausgeschnitten worden sind, anatomisiert. Das-'^rInhibierungsverhältnis (IR)" in den folgenden Tabellen wird gemäße der Formel

IR (%][ = (C- T)/C χ tOö i

wobei C das Durchschnittsgewicht der Tumore wiedergibt _H die aas jeder Vergleichsgxuppe der Mäus& entnommen worden sind-, und T das Durchschnittsgewicht der Tumore wieder spiegelt, die aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusegruppen entfernt worden sind.

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Die an die kar zLnogene Aktivität gegenüber einem syngenetischen Tumor in den Mäusen wurde ebenfalls bestimmt. Die Testmethode ist die gleiche, wie sie vorstehend beschrieben worden ist, mit der Ausnahme des Tumors, des Mäusematerials sowie der Verabreichungsmethode. Es wurde das 3-Methylcholanthren-induzierte Sarkom (Meth A) des BALB/C-Orsprungs in fester Form in syngenetischen Mäusen verwendet. Das eingesetzte Mäusematerial war BALB/C aus den Charles River Breeding Laboratories in Japan. Die Verabreichungsmethode war Intratumoral (i. t.).

Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid eine starke antikarzinogene Aktivität gegenüber Sarkom-180, Ehrlich-föxzinoin und Meth Ä ausübt.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, wobei Bezug genommen wird auf die Fig. T, 2 und 3, welche Infrarotspektren von erfindungsgemäßen Polysacchariden (als KBr-Tabletten) wiedergeben.

Beispiel "1

Ein Stamm XFERM-P 5086, ATCC 20603) von Isaria atypicola Yasuda wird in dem folgenden flüssigen Kulturmedien bebrütet:

Glukose 20 g Polypepton (Daigo) 5 g

Hefeextrakt (Difco) 1 g

Kaliumphosphat (primäres) 1g Magnesiumsulfat (7H₂O) 0,5 g-

Wasser 1 1

An-fangs-pH 5,6-5,8 (ohne

Einstellung)

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Die Bebrütung erfolgt durch Einfüllen von TOO ml des vorstehend beschriebenen Kulturmediums in jeweils 500 ml Erlenmeyer-Kolben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen und 30 min bei 120⁰C sterilisiert- Nach dem Abkühlen erfolgt ein Beimpfen mit dem Stamm in herkömmlicher Weise, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden ist, das 2 % Glukose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar enthält. Nach 7 Tagen dauerndem Bebrüten unter Schütteln bei 27⁰C werden die Kolbeninhälte für die anschließende Bebrütung verwendet. 20 1 des vorstehend beschriebenen flüssigen Kulturmediums in einem Stahlgärungsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 30 1 werden bei 120⁰C 30 Minuten sterilisiert und abgekühlt. Dann werden die Inhalte der vorstehend beschriebenen Kolben auf das Kulturmedium in der Gärungsvorrichtung aufgeimpft. Das Medium wird aerob unter Rühren (250 Upm) 16 Tage bei 27°C bebrütet, wobei die Belüftungsgeschwindigkeit 0,5 1/1/ min beträgt. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wird zur Gewinnung von 1700 g Myzeln (feucht) und 15 1 Kulturbrühe filtriert. Das Myzel wird mit 1 1 Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit der filtrierten Brühe vereinigt wird. Das gewaschene Myzel wird mit 2 1 Wasser vermischt und die Mischung auf 120⁰C 30 Minuten in einem geschlossenen Gefäß erhitzt. Dann läßt man die Mischung auf Zimmertemperatur abkühlen und filtriert, worauf sich eine Konzentrierung des Filtrats auf 1 1 anschließt. Der konzentrierte Flüssigkeitsextrakt wird gegen Wasser dialysiert und dann zur Gewinnung von 4,0 g einer weißen bis leicht bräunlichen pulverförmigen Substanz gefriergetrocknet. Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus Fig. 1 hervor.

Die filtrierte Brühe (16 1) wird auf 2 1 konzentriert und gegen Wasser dialysiert und geffiergetrocknet, wobei 26,5 g einer weißen bis hellbraunen pulverförmigen Substanz erhalten werden. Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus Fig. 2 hervor.

Die antikarzinogenen Aktivitäten dieser Polysaccharidsubstanzen gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor.

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ca ο ο ο co

	Tabelle I	Vfeg	vollständiger Rückgang	Brühe
Substanz		ip ip ip	0/8 3/8 7/8	IR %
Dosierung mg/kg/Tag Weg				- 9,8 73,0 96,0
10 ip 50 ip 250 ' ip	aus dem Myzel Substanz aus der filtrierten
Krebszelle:	vollständiger IR Dosierung Rückgang % mg/kg/T&g	nach der	Transplantation
Tiermaterial:	2/8 83,8 0,5 7/8 94,1 5 4/8 79,5 50
Behandlung:	Sarkom 180 4 χ 1Ö⁶ Zellen/Maus
Bestimmungi	ICR-JCL 20 g + 2 g
Intr.aperitoneale Verabreichung 1 Tag (Vergleich: Kochsalzlösung) fünfmal
Tumorgewicht (fester Typ)

IR (Ihhibierungsverhältnis) = (C - T)/C X 10 C: durchschnittliches Gewicht der Tumore, die aus der Vergleichsgruppe entnommen worden sind

Ti durchschnittliches Gewicht der Tumore, die aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entnommen worden sind

Tabelle II Substanz aug dem Myzel

Dosierung mg/kg/Tag

10

5Q

25Q

ip

vollständiger IR

Rückgang _ji

2/8 ' 81,5

7/8 95,3

5/8 80,9

Substanz aus der filtrierten Brühe

Dosierung vollständiger IR

mg/kg/Tag Weg Rückgang JjJj_-

0,5 ip 0/8 - 9,7

5 ip 4/8 75,2

ip 7/8 96,3

"s. O CO CO

Krebszellen: Ehrlich-Karzinom 4 χ 10 Zellen/Maus Tiermaterial: Behandlung und Bestimmung wie in Tabelle I.

Beispiel 2_

Der Stamm von- FERM-P 5086, ATCC 20633 wird in einem Gärungsgefäßnach der in Beispiel t beschriebenen Methode bebrütet. Dann, wird die filtrierte Brühe fct6 ü in der folgenden Weise gereinigte diei filtrierte^ Brühe wird auf 2 1 durch Vakuumeindampfen konzentriert und das Konzentrat 24 Stunden in fließendem Wasser dialysiertv Das Dialysat (2,5 Ii wird auf einen pH von 8,0 durch- wäßriges MaOH eingestellt und einer DEAE-Sephadex-Behandlung unterzogen. Die Flüssigkeit, die durch das DEAE-Sephadex-Material hindurchläuft, wird auf" einen pH von 3_r5 durch HCl eingestellt und dann einer SP-Sephadex-Behandlung unterzogen» Die Flüssigkeit, die durch das SP-Sephadex-Material hindurchgeht, wird mit Äthanol zur Einstellung einer 50 %igen Alkbholkanzenträtion unter Bildung eines Niederschlags eingestellt, der dann in 1 1 Wasser aufgelöst und erneut einer Dialyse in fließendem Wasser während 24 Stunden unterzogen wird. Das-Diälysat wird gefriergetrocknet, wobei man 24,9 g einer festen Substanz fPolysaccharidi erhält, bei der es sich um eine weiße bis hellbraune pulverförmige Substanz^ handelt,, die sdLch aus Glukose-, Galaktose und Mannose zusammensetzt. Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus Fig. : hervor.

Die antikarzfnogerten Eigenschaften dieser Substanz in Mäusen sind wie folgte

(Ai Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Sarkom-180) Krebszellen ι Sa^QnL-ISQ- 4 χ ΐθ Zellen/Maus Tiermaterialt ICR-JCL 20- + 2 g Behandlung: Intraperitonearle Verabreichung t" Tag

nach der Transplantation (Vergleich:: Kochsalzlosungi fünfmal

Bestimmung: Tumorgewicht des festen_Tumors_(IR Inhi-

bierungsverhältnis) = (C - Ti/C χ 100

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T:

durchschnittliches Gewicht der Turoore, die aus der Vergleichsgr^tppe entfernt worden sind

durchschnittliches Gewicht jder Tumore", die aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernt worden sind

(JB) Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Sarkom-

.Behandlung: Intravenös verabreicht 1 Tag nach der

Transplantation (Vergleich: Kochsalzlösung) fünfmal

Krebszellen, Tiermatexial und Bestimmung~sind die gleichen wie untex (A)

(C) Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Meth A)

Krebszellen:

Tiermaterial:

Behandlung:

Bestimmung:

Meth A 2 χ 10 Zellen/Maus

BALB/C 20 g + 2 g jeden Tag nach

intratumorale Verabreichungin Tag nach der Transplantation (Vergleich: Kochsalzlösung) zehnmal

wie unter (A) beschrieben

Tabelle III

(A)

Dosierung mg/kg/Tag

0,15 0,80 4,00

20,00

Vergleich

Weg

¹P ip ip

vollständiger IR

Rückgang _%

2/5 7 9,0

4/5 98,2

5/5 100,0

5/5 100,Ό 0/6

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Tabelle III (Fortsetzung)

ίΒ)	Weg	vollständiger	IR
Dosierung	iv	Rückgang
mg/kg/Tag	iv	0/3	- 19,8
0,02	iv	1/5	4 S^ 1
0,10	iv	.6/6 "	1ΰΟ,0
0,50	iv	_6/6	100^0
2,50		0/7	.—
Vergleich

ic)

Dosierung- mg/kg/Tag	We
10	it
50	at
Vergleich	it

vo1Iständiger Rückgang	IR
3/6	65,0
0/7	16,0
0/7	—_

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Claims

31 Γ 1.1.KH-Jt. >ΐ*ΐ. · ϊ»Ι Γ ί'4-Π. · S(M-O \- II KItTKl.. I'A~J" E Λ" TA N WA-LT E DR. WOLFGANG M O L UEP-BOH έ < PATENTANWALT VON 1927-1975) OR PAUL OEUFEU DH=L-CHEM. OR ALf RFD SCHON. DIPI. -CHEM. WtRiJPR HtRTFL. DIPL.-PHYS. !.CHEM PATENTAMT ε« FnIlNI Cr-FICt τ 146 4 -8. AUG. 1980 Takara Shuzo Co., Ltd., 609 Takenaka-cho, Fushimi-ku, Kyoto, Japan Polysaccharide mit antikarzinogener Aktivität und Verfahren zu seiner Herstellung Patentansprüche

1. Polysaccharid mit anti karzinogener Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem flüssigen Stromatoid- und/oder Myzel-Extrakt eines Stammes, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, oder aus einem -Kulturmedium isoliert worden ist, in welchem der Stamm bebrütet worden ist.

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm der Spezies Isaria atypicola angehört.

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3. Polysaecharid -nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Isaria atypicola Yasuda (FEEM-P 5086,, ATCC 20603) ist.

4. Pplysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es bezüglich der Moliseh-, Anthron- und Ninhydrinreaktion positiv und negativ bezüglich der Jod- und Bial-Reaktion sowie schwach positiv oder negativ gegenüber der Elson-Morgan-Reaktion ist, wofcei sein Hydrolysat wenigstens eine der Komponenten Galactose, Glukose und Mannose enthält.

5. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids mit einer antikarzinogenen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß eine filtrierte Brühe aus einem Kulturmedium oder einem flüssigen Stromatoid- oder Myzelextrakt eines Stammes gebildet wird,, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, und das Polysaccharid aus der filtrierten Brühe oder dem flüssigen Extrakt in gereinigter Form gewonnen wird.

S. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Stamm zu der Spezies Isarla atypicola gehört.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Stamm Isaria atypicola Yasuda ATCC 206Ό3) ist.

-i

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß das hergestellte Polysaccharid eines gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 Ist.

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