DE3030107A1 - Polysaccharid mit antikarzinogener aktivitaet und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents
Polysaccharid mit antikarzinogener aktivitaet und verfahren zu seiner herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Polysaccharide mit einer antikarzinogenen
Aktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Insbesondere befaßt sich die Erfindung mit Polysacchariden mit einer antikarzinogenen Aktivität und mit einem Verfahren
zur Herstellung derartiger Polysaccharide aus einem Myzel- und/oder Stromatoidextrakt eines Stammes, der ein
antikarzinogenes Polysaccharid zu erzeugen vermag und zu
dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, oder aus einem Kulturmedium, in dem der Stamm bebrütet worden ist.
Erfindungsgemäß kann jeder Stamm einer Spezies verwendet
werden, die zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört und ein anti karzinogenes Polysaccharid zu
erzeugen vermag.
Im Falle der nachstehend geschilderten erfindungsgemäßen
Ausführungsform wird ein Stamm von Isaria atypicola Yasuda
K-2583 eingesetzt, der durch Züchten eines Stromatoids (Gewebes) einer Pilzspezies erhalten worden ist, die in
"Kiyotaki" in der Prefektur Kyoto in Japan im Sommer 1965 gesammelt worden ist. Die Identifizierung dieser Spezies
erfolgt gemäß der folgenden Literaturstellen: "Icones of Japanes Fungi", herausgegeben von Seiichi Kawamura
(-veröffentlicht von Kazama-shobo, Tokyo, Japan) 8, 854 857,
1968; "Colored Illustrations of Fungi of Japan", herausgegeben von Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (veröffentlicht
von Hoiku-sha, Osaka, Japan) 1965.
Die charakteristischen Eigenschaften dieses Stammes sind
folgende: dieser Stamm ist ein Parasit auf Kishinouyeus typicus Kishida (eine Spinnenart), wobei der tote Körper
dieser Spinne unter der Erde mit Myzeln dieses Stammes bedeckt ist und sich daraus Stromatoid entwickelt. Das
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Stromatoid besitzt eine Höhe von 5 bis 8 cm und eine
weiße zylindrische fleischige Form. An der Oberseite des Stengels mit einem Durchmesser von 2,5 bis 4,0 mm mit
einer glatten" Oberfläche befindet sich ein tragender Teil, der- etwas dicker und länger als der Stengel ist. Der tragende
Teil weist leicht samtartige violette Sporen auf, die zylindrisch,halbglatt und farblos sind und eine Größe
von 4 bis 5x1,5 bis 2,Q μ besitzen.
Aus diesen Charakteristika sowie unter Heranziehung der vorstehend erwähnten Literaturstellen wurde dieser Stamm
als Isaria atypicola Yasuda identifiziert. Der Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial
Science and Technology, in Japan unter der Registriernummer FERM-P 5086 sowie bei der American Type Culture Collection
unter der Reg is trier nummer ATCC 2060 3 hirrterlegt.
Das erfindungsgemäße antikarzinogene Polysaccharid kann
aus einem flüssigen Stromatoid- und/oder Myzelextrakt des Stammes, der bebrütet worden ist, oder aus einer filtrierten
Kulturbrühe, in der ein derartiges Myzel bebrütet worden ist, erhalten werden.
Es ist jedoch nicht einfach, ein derartiges Stromatoid in einer ausreichend großen Menge in der Natur zu sammeln.
Daher ist es vorteilhaft, den Stamm zur Gewinnung einer großen Stromatoidmenge zu bebrüten. Die Bebrütung kann
in einer für die Bebrütung von Pilzen der Klasse Hyphomycete-s
bekannten Weise durchgeführt werden^ beispielsweise auf einem Holzmehl— oder Sägemehlme'dium. Beispielsweise
kann man 200 g Sägemehl, 100 g Reiskleie und 300 ml Wasser
gut zur Herstellung eines Kulturmediums vermischen, das in ein geeignetes Gefäß eingefüllt und sterilisiert
wird. Der Stamm, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden ist, wird auf dem in der vorstehenden Weise hergestellten Kulturmedium in herkömmlicher Weise bei
25 bis 270C während ungefähr 1 Monat zum ausreichenden
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Myzelwacbstum bebrütet. Das Kulturmedium läßt man dann
ungefähr 1 Monat bei 20 bis 25°C zum Stromatoidwachstum
stehen. Das auf diese Weise gewachsene Stromatoid wird gesammelt und als Ausgangsmaterial für die Erfindung eingesetzt.
Di« erfindungsgemäß eingesetzten Myzeln können nach einer
herkömmlichen Züchtungsmethode hergestellt werden,
beispielsweise unter Einsatz einer festen oder flüssigen Kultur. Im Falle einer festen Kultur kann beispielsweise
Agar, Gelatine, Stärke, Holzmehl, Kraftzellstoff oder
ein anderes herkömmliches festes Kulturmedium oder eine Kombination davon verwendet werden. Im Falle einer flüssigen
Kultur kann man auf ein flüssiges Kulturmedium zurückgreifen, das verschiedene Nährmittel enthält, die
auf dem Gebiet des Züchtens von Mikroorganismen bekannt sind. So kann das flüssige Kulturmedium Kohlenstoffquellen,
wie Glukose, Maltose, Lactose, Rohrzucker, Stärke, Melassen etc. eine Stickstoffquelle (organisches oder anorganisches
Stickstoffmaterial), wie Pepton, Hefeextrakt, Hefe7 Maisflüssigkeit, Harnstoff, Ammoniumsalze etc.,
oder eines oder mehrere organische oder anorganische Salze, wie Phosphate.oder Magnesiumsalze etc. enthalten. Gegebenenfalls
können andere Materialien zugesetzt werden, die für das Wachstum erforderlich sind, wie beispielsweise
Vitamine. Diese Materialien für feste und flüssige Kulturmedien sind auf dem Gebiet des Züchtens von Pilzen bekannt,
so daß keine weiteren Erläuterungen erforderlich sind. Das Züchten der flüssigen Kultur kann in herkömmlicher
Weise durchgeführt werden, beispielsweise in Form einer stationären Kultur, einer Schüttelkultur oder einer
Submerskultur. Aus wirtschaftlichen Erwägungen sowie im
Hinblick auf die Handhabung ist eine flüssige Kultur vorteilhafter als-eine feste Kultur.
Bei einem Züchten einer flüssigen Kultur können folgende Bedingungen eingehalten werden:
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Anfangs-pH 2 Tdxs 9
Bebrütungstemperatur 15 bis 33°C Bebrütungszeitspanne 3 bis 30 Tage
Im Falle einer Submerskultur wird das Medium mit einer Geschwindigkeit
von 0,1 bis 2,0 1/1/min unter Hühren bei 30
bis 500 Upm belüftet.
Die durch die feste oder flüssige Kultur erzeugten Myzeln werden in herkömmlicher Weise gesammelt und als Ausgangsmaterial
für -die Erfindung verwendet.
Beispielsweise können im Falle einer flüssigen Kultur die Myzeln dadurch gesammelt werden., daß das angefallene flüssige
Kulturmedium einer herkömmlichen Trennmethode unterzogen wird, beispielsweise einem Zentrifugieren, Filtrieren etc.
Das nach dieser Trennmethode erhaltene Filtrat wird als filtrierte
Brühe bezeichnet, die ebenfalls als Ausgangsmaterial für die Erfindung eingesetzt werden kann.
Erfindungsgemäß werden das Stromatoid und/oder die Myzeln,
die in der vorstehend beschriebenen Weise gesammelt worden sind, mit einem wäßrigen Lösungsmittel extrahiert. In diesem
Falle können das Stromatoid und/oder die Myzeln als solche direkt der Extraktion unterzogen werden. Gegebenenfalls
kann man vor einer derartigen Extraktion das Stromatoid und/ oder die Myzeln einer Vorbehandlung unterziehen, beispielsweise
einem Waschen mit Wasser, einem Trocknen mit Luft, einein Zerstoßen (Pulverisation) oder einer Extraktion mit einem
nicht-polaren Lösungsmittel, i
Das für die Extraktion eingesetzte wäßrige Lösungsmittel ist Wasser oder eine Mischung aus Wasser und wenigstens einem wasserlöslichen
Material, wobei als wasserlösliche Materialien beispielsweise Säuren, Basen, Salze oder organische Lösungsmittel
in Frage kommen.
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Zur Durchführung der Extraktion werden das vorbehandelte
oder nicht-vorbehandelte Stromatoid oder die Myzeln mit
dem wäßrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des
Lösungsmittels ist nicht kritisch, falls sie unter 120°~C
gehalten wird. Die bevorzugte Temperatur kann unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten ausgewählt werden. Die Extrak-
oder nicht-vorbehandelte Stromatoid oder die Myzeln mit
dem wäßrigen Lösungsmittel vermischt. Die Temperatur des
Lösungsmittels ist nicht kritisch, falls sie unter 120°~C
gehalten wird. Die bevorzugte Temperatur kann unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten ausgewählt werden. Die Extrak-
p 't
tion wird während einer Zeitspanne durchgeführt, die dazu
ausreicht, die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen nimmt mit höherer Temperatur die Extraktionszeit
ab. Innerhalb des vorstehend geschilderten bevorzugten Temperaturbereiches wird die Extraktion vorzugsweise in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 10 Stunden durchgeführt. Die
Extraktion wird vorzugsweise unter Rühren in einem Gefäß
durchgeführt, das aus Glas besteht oder mit Glas oder Email ausgekleidet ist» Ferner kann es sich um ein Gefäß aus rostfreiem Stahl handeln. Die Menge des Lösungsmittels kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, beträgt jedoch
im allgemeinen das 10- bis 100-fache des Gewichts (auf Trokkenbasis) des Stromatoids und/oder der Myzeln. Die Verwendung von pulverisiertem Stromatoid oder Myzel wird für die
Extraktion bevorzugt. Nach der Extraktion werden das Myzel oder Stromatoid sowie andere feste Materialien von der Flüssigkeit durch herkömmliche Maßnahme entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren. Der flüssige Extrakt
wird für eine weitere Behandlung konzentriert, beispielsweise durch Vakuumeindampfen oder dgl. Im allgemeinen wird der wäßrige Extrakt auf das 1/3- bis 1/10-fache seines ursprünglichen Volumens konzentriert.
ausreicht, die gewünschte Extraktion zu bewirken. Im allgemeinen nimmt mit höherer Temperatur die Extraktionszeit
ab. Innerhalb des vorstehend geschilderten bevorzugten Temperaturbereiches wird die Extraktion vorzugsweise in einer Zeitspanne von 30 Minuten bis 10 Stunden durchgeführt. Die
Extraktion wird vorzugsweise unter Rühren in einem Gefäß
durchgeführt, das aus Glas besteht oder mit Glas oder Email ausgekleidet ist» Ferner kann es sich um ein Gefäß aus rostfreiem Stahl handeln. Die Menge des Lösungsmittels kann innerhalb eines breiten Bereiches variieren, beträgt jedoch
im allgemeinen das 10- bis 100-fache des Gewichts (auf Trokkenbasis) des Stromatoids und/oder der Myzeln. Die Verwendung von pulverisiertem Stromatoid oder Myzel wird für die
Extraktion bevorzugt. Nach der Extraktion werden das Myzel oder Stromatoid sowie andere feste Materialien von der Flüssigkeit durch herkömmliche Maßnahme entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren. Der flüssige Extrakt
wird für eine weitere Behandlung konzentriert, beispielsweise durch Vakuumeindampfen oder dgl. Im allgemeinen wird der wäßrige Extrakt auf das 1/3- bis 1/10-fache seines ursprünglichen Volumens konzentriert.
Der in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltene Extrakt
wird dann in der nachfolgend beschriebenen Weise gereinigt, was eine Ausfällung und Gewinnung des gesuchten Polysaccharids
bedingt. Der Begriff "flüssiger Extrakt", wie er im vorliegenden Falle verwendet wird, bedeutet ein Filtrat oder Zentrifugat,
das bei der Entfernung des Myzels und/oder des Stromatodds sowie anderer fester Materialien aus dem Extrakt anfällt.
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Die filtrierte- Brühe Rann ebenfalls f irr die nachfolgend erläuterte
Reinigung verwendet werden, was ein Ausfällen und eine- Gewinnung; des gesuchten Palysaccharids ermöglicht. Guter
dem Begriff "filtrierte Bröne11"" ist ein: Filtrat zu. verstehen, das den aktiven Bestandteil, d. h. das Polysaccharid,
enthält und durch Entfernung des Myzels sowie- anderer fester Materialien- von der Kulturbröhe, d. h» dem Kulturmedium, indem
der Stamm in der vorstehend beschriebenen Weise in flüssiger Kultur bebrütet worden ist., erhalten worden ist. Die
filtrierte Brühe wird zur weiteren Behandlung konzentriert, beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum. Im allgemeinen
wird die filtrierte Brühe auf ein Drittel bis ein Zehntel
des ursprünglichem Volumens konzentriert. Die konzentrierte filtrierte Brühe wird dann- gereinigt.
Der flüssige·Extrakt und die filtrierte Brühe können getrennt
gereinigt werden, der flüssige Extrakt und die filtrierte Brühe können jedoch auch miteinander vereinigt werden, worauf
die Mischung gereinigt wird.
Die Reinigung kann nach jieder der folgenden Methoden durchgeführt
werden:
(A) Ausfällung der gesuchten Substanz durch Zugab& eines
hochpolaren organischen Lösungsmittels (beispielsweise
eines niederen Alkohols oder Ketons, beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Buta—
ησί, Aceton etc. I oder durchs Aussalzen; (durch Zugabe
von wasserlöslichen anorganischere Salzen, wie ÄiranortiunrsuXfat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid
etc~i
Entfernen von Säuren', Ionen; sowie Substanzen mit
niederem Molekulargewicht durch Dialyse, Gelfiltration (diircFf Einsatz vent Dextran odeir Polyacrylamidgel,
wie Sephadex, Bio-Gel etc.), Ionenaustauscherharzbehandlung'
(durch Einsatz- von beispielsweise
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versctiiedenen im Handel erhältlichen Anionen-
und Ka-tionenaustauscherharzen^ wie Amberlite,
Dowex, Duolite etc.), ültrafiltrafcion sowie
eine Kombination -davon, zur Gewinnung einer im wesentlichen reinen Lösung, aus der die
gewünschte aktive Substanz gewonnen wird;
(C) Behandlung zur Entfernung von freien Proteinen,
beispielsweise unter Anwendung der Sevag-Methode,
der TrifluortrIchlormethanmethode, durch Proteasebehandlung
etc.
Diese Methoden sind bekannt. Gegebenenfalls können zwei oder mehrere dieser Methoden zusammengefaßt werden. Im
allgemeinen wird jedoch der flüssige Extrakt oder die
filtrierte Brühe nach der Konzentration einer Ionenaustauscherharzbehandlung, einer Dialyse, einer Gelfiltration, Ultrafiltration oder e"iner Kombination davon zur Bewirkung einer Entfärbung, Entsäuerung sowie Entfernung von Substanzen mit niederen Molekulargewichten unterzogen.
Aus einer derartig gereinigten Lösung kann die gesuchte Wirksubstanz nach einer geeigneten Methode entfernt werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen. Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Methoden zur Erzielung des gewünschten Reinigungsgrades wiederholen.
allgemeinen wird jedoch der flüssige Extrakt oder die
filtrierte Brühe nach der Konzentration einer Ionenaustauscherharzbehandlung, einer Dialyse, einer Gelfiltration, Ultrafiltration oder e"iner Kombination davon zur Bewirkung einer Entfärbung, Entsäuerung sowie Entfernung von Substanzen mit niederen Molekulargewichten unterzogen.
Aus einer derartig gereinigten Lösung kann die gesuchte Wirksubstanz nach einer geeigneten Methode entfernt werden, beispielsweise durch Gefriertrocknen. Gegebenenfalls kann man eine oder mehrere der vorstehend angegebenen Methoden zur Erzielung des gewünschten Reinigungsgrades wiederholen.
Die auf diese Weise erhaltene Substanz besitzt folgende charakteristische Eigenschaften:
(1) Diese Substanz ist ein weißes oder hellbraunes
Pulver und nicht-dialysierbar
(2) Die Molisch-Re'aktion, die Anthron-Reaktion sowie
die Ninhydrin-Reaktion sind positiv '
(3) Die Elson-Morgain-Reaktion· ist schwach-positiv oder
negativ
(4) Die Jodreaktion sowie die Bialreaktion* sind negativ
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{5) Diese Substanz ist In "Wasser und in einer wäßrigen
.Lösung einer Substanz, die in Wasser löslich ist, beispielsweise eines organischen Lösungsmittels,
einer Säure, einer Base, eines Salzes oder dgl., löslich^ jedoch unlöslich in einem organischen Lösungsmittel/
^wie Petrolätner., Ä" thy lather, Benzol,
Aceton* Jithanol, Methanol etc.
t'6") Diese Substanz besitzt keinen scharfen Schmelzpunkt
und wird beim starken Erhitzen verkohlt.
il) Das Hydrolysat dieser Substanz, das durch Auflösen
dieser Substanz in 0,1 η wäßriger Schwefelsäure und Erhitzen der liögung idle 0,5 Gew. -%· dieser Substanz
enthält) auf 1000C während 5 Stunden erhalten
worden ist, enthält wenigstens eine oder mehrere der Komponenten Glukose, Galactose und Mannose,, wobei
die Art des Zuckers von der Art und dem Ausmaß der Reinigung abhängt.
<8) Die Elementaranalyse dieser Substanz ist wie folgt:
C 35,78 %, H 6/28 %; N 0,65 % '
Aus den vorstehenden Charakteristika nimmt man an, daß diese
Substanz ein Polysacchafid mit hohem Molekulargewicht ist,
das sich aus dem vorstehend erwähnten Zucker zusammensetzt und ein Molekulargewicht von wenigstens 8000 und ein durchschnittliches
Molekulargewicht von ungefähr 2 χ 10 besitzt.
Das erfindungsgemäße Polysacchärid besitzt weder eine Cytotoxizität
noch Nebenwirkungen, wie sie in herkömmlicher Weise im Zusammenhang mit dem Einsatz von herkömmlichen jMitteln auftreten,
beispielsweise wird keine Abnahme der Anzahl der Leukocyten,
keine Anämie der Leber sowie anderer Organe, keine Atrophie der Milz, kein Körpergewichtsverlust sowie ein Appetitverlust
festgestellt. Die akute Toxizität (LD50) dieses
Polysaccharids in Mäusen beträgt mehr als 2000 mg/kg bei einer intraperitonealen Injektion.
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- Vt: -
erfindungrsgemä&e Polysaccharid besitzt eine antikareinogene
Aktivität. Die antikarzinogene Aktivität wurde nach folgendem Test bestätigt und ermittelt:
Eine Maus des ICR-JCL-Stamms mit einem Gewicht von 2Ϊ + 2 ?
wurde intraperitoneal mit Sarcoma-180 Krebszellen-oder Ehrlich-Krebszellen
beimpft- 1 Woche nach der Beimpfung wurde eine ausreichende Zunahme der Ascitesflüssigkeit in der Maus
festgestellt. Die darin enthaltenen, Krebszellen wurden subkutan
auf Achselflächen von anderen Mäusen in einer Menge vor £000000 Zellen pro Maus transplantiert. Diese Mäuse wurden
in verschiedene Gruppen eingeteilt, wobei jede Gruppe aus fünf bis acht Individuen bestand. An die erste Gruppe
(Vergleichsgruppe) wurde nur eine Kochsalzlösung verabreicht t während an jede der anderen Gruppen das erfindungsgemäße
Polysaccharid verabreicht wurde. Die erste Verabreichung der Kochsalzlösung oder des Polysaccharids erfolgte intraperitoneal·
1 Tag nach der Transplantation, während die anschließenden Verabreichungen fünfmal an jedem anderen Tag
wiederholt wurden. Der feste auf die Mäuse transplantierte
Kxebs wurde beobachtet- nach der letzten Verabreichung
.[4m T&. TagT wurde die durchschnittliche Zunahme
des Körpergewichts, gemessen, worauf die Mäuse zur Untersuchung
von Nebenwirkungen und zur Bestimmung des Gewichts der Tumore, die aus der Vergleichsgruppe entnommen wurden, sowie
der Tumore, die aus den mit Polysaccharid behandelten Gruppen herausgeschnitten worden sind, anatomisiert. Das-'rInhibierungsverhältnis
(IR)" in den folgenden Tabellen wird gemäße der Formel
IR (%][ = (C- T)/C χ tOö i
wobei C das Durchschnittsgewicht der Tumore wiedergibt H die
aas jeder Vergleichsgxuppe der Mäus& entnommen worden sind-,
und T das Durchschnittsgewicht der Tumore wieder spiegelt, die aus den mit Polysaccharid behandelten Mäusegruppen entfernt
worden sind.
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303OtOT
Die an die kar zLnogene Aktivität gegenüber einem syngenetischen
Tumor in den Mäusen wurde ebenfalls bestimmt. Die Testmethode ist die gleiche, wie sie vorstehend beschrieben worden
ist, mit der Ausnahme des Tumors, des Mäusematerials sowie
der Verabreichungsmethode. Es wurde das 3-Methylcholanthren-induzierte
Sarkom (Meth A) des BALB/C-Orsprungs in fester Form in syngenetischen Mäusen verwendet. Das eingesetzte
Mäusematerial war BALB/C aus den Charles River Breeding Laboratories in Japan. Die Verabreichungsmethode war Intratumoral
(i. t.).
Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid
eine starke antikarzinogene Aktivität gegenüber Sarkom-180,
Ehrlich-föxzinoin und Meth Ä ausübt.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
erläutert, wobei Bezug genommen wird auf die Fig. T, 2 und 3, welche Infrarotspektren von erfindungsgemäßen Polysacchariden
(als KBr-Tabletten) wiedergeben.
Ein Stamm XFERM-P 5086, ATCC 20603) von Isaria atypicola Yasuda wird in dem folgenden flüssigen Kulturmedien bebrütet:
Glukose 20 g Polypepton (Daigo) 5 g
Hefeextrakt (Difco) 1 g
Kaliumphosphat (primäres) 1g Magnesiumsulfat (7H2O) 0,5 g-
Wasser 1 1
An-fangs-pH 5,6-5,8 (ohne
Einstellung)
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Die Bebrütung erfolgt durch Einfüllen von TOO ml des vorstehend
beschriebenen Kulturmediums in jeweils 500 ml Erlenmeyer-Kolben. Die Kolben werden mit Baumwolle verschlossen
und 30 min bei 1200C sterilisiert- Nach dem Abkühlen erfolgt
ein Beimpfen mit dem Stamm in herkömmlicher Weise, der getrennt in einem Schrägkulturmedium gezüchtet worden ist,
das 2 % Glukose, 0,5 % Ebios und 1,5 % Agar enthält. Nach 7 Tagen dauerndem Bebrüten unter Schütteln bei 270C werden
die Kolbeninhälte für die anschließende Bebrütung verwendet. 20 1 des vorstehend beschriebenen flüssigen Kulturmediums
in einem Stahlgärungsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 30 1 werden bei 1200C 30 Minuten sterilisiert und abgekühlt.
Dann werden die Inhalte der vorstehend beschriebenen Kolben auf das Kulturmedium in der Gärungsvorrichtung aufgeimpft.
Das Medium wird aerob unter Rühren (250 Upm) 16 Tage bei 27°C bebrütet, wobei die Belüftungsgeschwindigkeit 0,5 1/1/
min beträgt. Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wird zur Gewinnung von 1700 g Myzeln (feucht) und 15 1 Kulturbrühe
filtriert. Das Myzel wird mit 1 1 Wasser gewaschen, worauf die Waschflüssigkeit mit der filtrierten Brühe vereinigt
wird. Das gewaschene Myzel wird mit 2 1 Wasser vermischt und die Mischung auf 1200C 30 Minuten in einem geschlossenen
Gefäß erhitzt. Dann läßt man die Mischung auf Zimmertemperatur abkühlen und filtriert, worauf sich eine
Konzentrierung des Filtrats auf 1 1 anschließt. Der konzentrierte Flüssigkeitsextrakt wird gegen Wasser dialysiert und
dann zur Gewinnung von 4,0 g einer weißen bis leicht bräunlichen pulverförmigen Substanz gefriergetrocknet. Das Infrarotspektrum
dieser Substanz geht aus Fig. 1 hervor.
Die filtrierte Brühe (16 1) wird auf 2 1 konzentriert und gegen Wasser dialysiert und geffiergetrocknet, wobei 26,5 g
einer weißen bis hellbraunen pulverförmigen Substanz erhalten werden. Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus
Fig. 2 hervor.
Die antikarzinogenen Aktivitäten dieser Polysaccharidsubstanzen
gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor.
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ca ο ο ο co
Tabelle I | Vfeg | vollständiger Rückgang |
Brühe | |
Substanz | ip ip ip |
0/8 3/8 7/8 |
IR % |
|
Dosierung mg/kg/Tag Weg |
- 9,8 73,0 96,0 |
|||
10 ip 50 ip 250 ' ip |
aus dem Myzel Substanz aus der filtrierten | |||
Krebszelle: | vollständiger IR Dosierung Rückgang % mg/kg/T&g |
nach der | Transplantation | |
Tiermaterial: | 2/8 83,8 0,5 7/8 94,1 5 4/8 79,5 50 |
|||
Behandlung: | Sarkom 180 4 χ 1Ö6 Zellen/Maus | |||
Bestimmungi | ICR-JCL 20 g + 2 g | |||
Intr.aperitoneale Verabreichung 1 Tag (Vergleich: Kochsalzlösung) fünfmal |
||||
Tumorgewicht (fester Typ) |
IR (Ihhibierungsverhältnis) = (C - T)/C X 10
C: durchschnittliches Gewicht der Tumore, die aus der Vergleichsgruppe
entnommen worden sind
Ti durchschnittliches Gewicht der Tumore, die aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entnommen worden sind
Dosierung mg/kg/Tag
10
5Q
25Q
ip
vollständiger IR
Rückgang _ji
2/8 ' 81,5
7/8 95,3
5/8 80,9
Dosierung vollständiger IR
mg/kg/Tag Weg Rückgang JjJj-
0,5 ip 0/8 - 9,7
5 ip 4/8 75,2
ip 7/8 96,3
"s. O CO CO
Krebszellen: Ehrlich-Karzinom 4 χ 10 Zellen/Maus
Tiermaterial: Behandlung und Bestimmung wie in Tabelle I.
Der Stamm von- FERM-P 5086, ATCC 20633 wird in einem Gärungsgefäßnach
der in Beispiel t beschriebenen Methode bebrütet. Dann, wird die filtrierte Brühe fct6 ü in der
folgenden Weise gereinigte diei filtrierte^ Brühe wird auf
2 1 durch Vakuumeindampfen konzentriert und das Konzentrat
24 Stunden in fließendem Wasser dialysiertv Das Dialysat
(2,5 Ii wird auf einen pH von 8,0 durch- wäßriges MaOH eingestellt
und einer DEAE-Sephadex-Behandlung unterzogen.
Die Flüssigkeit, die durch das DEAE-Sephadex-Material hindurchläuft,
wird auf" einen pH von 3r5 durch HCl eingestellt
und dann einer SP-Sephadex-Behandlung unterzogen» Die Flüssigkeit, die durch das SP-Sephadex-Material hindurchgeht,
wird mit Äthanol zur Einstellung einer 50 %igen Alkbholkanzenträtion unter Bildung eines Niederschlags eingestellt,
der dann in 1 1 Wasser aufgelöst und erneut einer Dialyse in fließendem Wasser während 24 Stunden unterzogen
wird. Das-Diälysat wird gefriergetrocknet, wobei man 24,9 g
einer festen Substanz fPolysaccharidi erhält, bei der es
sich um eine weiße bis hellbraune pulverförmige Substanz^
handelt,, die sdLch aus Glukose-, Galaktose und Mannose zusammensetzt.
Das Infrarotspektrum dieser Substanz geht aus Fig. :
hervor.
Die antikarzfnogerten Eigenschaften dieser Substanz in Mäusen
sind wie folgte
(Ai Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Sarkom-180)
Krebszellen ι Sa^QnL-ISQ- 4 χ ΐθ Zellen/Maus
Tiermaterialt ICR-JCL 20- + 2 g
Behandlung: Intraperitonearle Verabreichung t" Tag
nach der Transplantation (Vergleich:: Kochsalzlosungi fünfmal
Bestimmung: Tumorgewicht des festen_Tumors_(IR Inhi-
bierungsverhältnis) = (C - Ti/C χ 100
130Ό09/0894
3030WI
T:
durchschnittliches Gewicht der Turoore,
die aus der Vergleichsgr^tppe entfernt
worden sind
durchschnittliches Gewicht jder Tumore",
die aus der mit Polysaccharid behandelten Gruppe entfernt worden sind
(JB) Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Sarkom-
.Behandlung: Intravenös verabreicht 1 Tag nach der
Transplantation (Vergleich: Kochsalzlösung) fünfmal
Krebszellen, Tiermatexial und Bestimmung~sind die gleichen
wie untex (A)
(C) Antikarzinogene Aktivität in Mäusen (Meth A)
Krebszellen:
Tiermaterial:
Behandlung:
Bestimmung:
Meth A 2 χ 10 Zellen/Maus
BALB/C 20 g + 2 g jeden Tag nach
intratumorale Verabreichungin Tag nach der Transplantation (Vergleich: Kochsalzlösung)
zehnmal
wie unter (A) beschrieben
(A)
Dosierung mg/kg/Tag
0,15 0,80 4,00
20,00
Vergleich
Weg
1P ip ip
vollständiger IR
Rückgang _%
2/5 7 9,0
4/5 98,2
5/5 100,0
5/5 100,Ό 0/6
13000 9/0894
Tabelle III (Fortsetzung)
ίΒ) | Weg | vollständiger | IR |
Dosierung | iv | Rückgang | |
mg/kg/Tag | iv | 0/3 | - 19,8 |
0,02 | iv | 1/5 | 4 S^ 1 |
0,10 | iv | .6/6 " | 1ΰΟ,0 |
0,50 | iv | _6/6 | 100^0 |
2,50 | 0/7 | .— | |
Vergleich | |||
ic)
Dosierung- mg/kg/Tag |
We |
10 | it |
50 | at |
Vergleich | it |
vo1Iständiger Rückgang |
IR |
3/6 | 65,0 |
0/7 | 16,0 |
0/7 | —_ |
130009/0894
Claims (8)
1. Polysaccharid mit anti karzinogener Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem flüssigen Stromatoid-
und/oder Myzel-Extrakt eines Stammes, der ein antikarzinogenes
Polysaccharid zu erzeugen vermag und zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, oder aus
einem -Kulturmedium isoliert worden ist, in welchem der
Stamm bebrütet worden ist.
2. Polysaccharid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Stamm der Spezies Isaria atypicola angehört.
130009/089 4
3:330107
3. Polysaecharid -nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Stamm Isaria atypicola Yasuda (FEEM-P 5086,,
ATCC 20603) ist.
4. Pplysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß es bezüglich der Moliseh-, Anthron-
und Ninhydrinreaktion positiv und negativ bezüglich der Jod- und Bial-Reaktion sowie schwach positiv oder negativ
gegenüber der Elson-Morgan-Reaktion ist, wofcei sein
Hydrolysat wenigstens eine der Komponenten Galactose, Glukose und Mannose enthält.
5. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids mit einer antikarzinogenen Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß
eine filtrierte Brühe aus einem Kulturmedium oder einem flüssigen Stromatoid- oder Myzelextrakt eines Stammes
gebildet wird,, der ein antikarzinogenes Polysaccharid zu
erzeugen vermag und zu dem genus Isaria der Klasse Hyphomycetes gehört, und das Polysaccharid aus der filtrierten
Brühe oder dem flüssigen Extrakt in gereinigter Form gewonnen wird.
S. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Stamm zu der Spezies Isarla atypicola
gehört.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
der eingesetzte Stamm Isaria atypicola Yasuda ATCC 206Ό3) ist.
-i
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch ge kennzeichnet, daß das hergestellte Polysaccharid eines
gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 Ist.
130009/0894
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US4268505A (en) * | 1978-04-13 | 1981-05-19 | Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical composition comprising a nitrogen-containing polysaccharide and an antibiotic agent, and a method of treating an infectious disease therewith |
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1981
- 1981-02-03 US US06/231,575 patent/US4409385A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
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Colored Illustrations of Fungi of Japan, 1965 * |
Icones of Japan Fungi 8, 854-857, 1968 * |
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GB2055873B (en) | 1983-05-05 |
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CH648595A5 (de) | 1985-03-29 |
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