DE1809187C3

DE1809187C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Daunorubicin

Info

Publication number: DE1809187C3
Application number: DE19681809187
Authority: DE
Inventors: Denise Charenton; Ninet Leon; Preud'Homme Jean; Paris; Mancy geb. Courtillet (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1967-11-15
Filing date: 1968-11-15
Publication date: 1977-03-17

Description

Anm. M: entspricht der Rezeptur W18, wobei die Saccharose durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist;

Anm. N: handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers angemacht; Anm. P: The Actinomycetes, Band 2, S. 333, Nr. 42, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1961);

Anm. Q: H. D. Trcsner und F. Danga, 5 Journal of Bacteriology, 76, 239—244 (1958).

Kulturmedium	Entwick	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter Teil	Lösliches	Beobachtungen und
	lungsgrad	(v.M.) oder Unterseite	(umfaßt Gesamtheit	Pigment	biochemische
		der Kultur	von luftausgesetztem		Eigenschaften
			Mycel und Sporulation)
(1)	(2)	(3)	<4)	(5)	(6)

Agar nach Bennett (Anm. A)

gut

Agar nach E m e r- gut
son (Anm. B)

Agar nach
H i c k e y und
Tresner
(Anm. C)

gut

Agar mit Hefe- gut

extrakt nach P r i db a m (Anm. D)

Agar mit Hafer und gut
Tomate nach
Pridham
(Anm. E)

Glucose-Pepton- ziemlich Agar (W - 6) gut

Nähragar (W - 5) mittel

Agar mit Calcium- mäßig malat nach
K rai η s ky
(Anm. F)

Glucose-Aspara- ziemlich gin-Agar (W - 2) gut

Glycerin-Aspara- gut
gin-Agar (W - 3)

Agar mit Stärke gut
nach Pridham
(Anm. G)

rotes v. M., rote Unterseite

rotes v. M., tote Unterseite

orangebraune Unterseite

rotes v. M., rotbräunliche Unterseite

hellbraunrote Unterseite

orangerötliche Unterseite

hellbraunrosa Unterseite

hellrote bis hellorange Unterseite

hellorangerote Unterseite

orangerötliche Unterseite

hellgraugelbgrünlich schwach-

bis rosagräulich, orangerot mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich schwachbis blaßrosa, mittel- bräunlichmäßig entwickelt orangerot

hellgraugelbgrünlich schwachbis rosagräulich rötlichmäßig entwickelt orangebraun

hellgraugelbgrünlich intensiv rot bis rosagräulich,
mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich hellrotbraun bis rosagräulich,
sehr gut entwickelt

ovale bis zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7μ 0,8 bis l,2u gerade oder schwach gebogene isolierte oder in Büscheln auftretende Sporophoren

hellgraugelbgrünlich
mäßig entwickelt

weißlich bis hellrosagelb, mäßig
entwickelt

hellgraugelbgrünlich mit einigen hellrosagräulichen

Stellen, sehr mäßig
entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosa, mäßig
entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosa, ziemlich
gut entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosagräulich
gut entwickelt

schwachbräunlich- orangerötlich

hellorangerötlich

hellrosabräunlich

hellorangerötlich

hellorangebraunrot

hellbraunrötlich

Löslichmachung von Calciummalat: positiv

Hydrolyse von Stärke: positiv, ovale bis zylindrische Sporen mit abgerundeten Ende und Abmessungen von 0,4 bis 0,7 μ/ 0,8 bis 1,2 μ, gerade oder schwach gebogene isolierte odi in Büscheln vorliegende Sporophoren

	5	18	Vegetatives Mycel	09 187	H	6	Lösliches	Beobachtungen und
	Entwick		(v.M.) oder Unterseile		Pigment	biochemische
Kulturmedium	lungsgrad	-ler Kultur	Luftausgesetzter Teil		Eigenschaften
			(umfaßt Gesamtheit
		(3)	von luftausgesetztem	(5)	(6)
	(2)	schwachviolette-	Mycel und Sporulation)	hellviolettroi
(1)	gut	heilrotbräunliche	(4)
Synthetischer Agar		Unterseite	hellgraugelbgrünlich
nach Czapek			bis hellrosa,
mit Glucose		hellrotbräunliche	gut entwickelt	rosa
(Anm. H)	gut	Unterseite
Synthetischer Agar			hellgraugelbgrünlich
nach Czapek			bis hellrosa.
mit Glycerin		dickes und gefal	gut entwickelt	schwach
(Anm. I)	sehr gut	tetes v. M., rot		rotbräunlich
Züchtung auf			hellgraugelbgrünlich
Kartoffeln (W - 27)		weißliche bis gelb	bis rosa, mittel	zögernd, fast	Verflüssigung der Gc
	mittel	bräunliche und	mäßig entwickelt	keines nach	latine ziemlich gut
Reine Gelatine		rosabraune Kolo	weißlich, in Form	2 Wochen,
mit 12% (Anm. J)		nien an der Ober	von Spuren	gelbbräunlich
		fläche der Gelatine		in sehr kleiner
				Menge nahe der
				Oberfläche bei
				3- oder 4wö-
				chiger Kultur
		leichter Schleier,		hellrosa	Nitrit-Reaktion:
	mittel	rosa Unterseite			positiv
Glucose-Nitrat-			weißlich bis hellrosa,
Bouillon nach			sehr mäßig
Dimmick		von Kolonien ge	entwickelt	keines	Nitrit-Reaktion:
(Anm. K)	ziemlich	bildeter Ring mit			positiv
Nitrat-Nähr-	gut	rosa Unterseite	weißlich, spärlich
Bouillon (Anm. L)		hellrosa v. M., als	entwickelt	sehr hellrosa	Verwertung der Cellu
	gut	Schleier auf der			lose: positiv, Nitrit-
Bouillon nach		Oberfläche der	sehr hellgelbgräu		Reaktion : positiv
Czapek mit		Bouillon	lich, mäßig ent
Cellulose (Anm. M)			wickelt auf dem aus
		hellbräunlicher bis	der Bouillon heraus		Langsame Peptoni-
	gut	roter Ring	ragenden Papier		sation, beginnend
Magermilch			keiner		nach 2 Wochen, fast
(Anm. N)					vollständig in
					1 Monat, keine Ko
					agulation, pH geht
					in 1 Monat von
					6,3 auf 7,5.
		schwachorange-		schwach	Bildung von Mela
	mittel	hellb-aungelbe		bräunlich leicht	nin: negativ
Tyrosin-Hefe-		Unterseite	sehr hellgelbgrau,	rosa
extrakt-Agar zur			mittelmäßig
Bildung von Mela			entwickelt		Produktion von
nin (Anm. P)	gut				HjS: negativ
Agar nach
T r e s η e r und
D a η g a (Anm. Q)

Die Fähigkeit von S. griseus, var. rubidofaciens, Stimm DS 32 041, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von P r i d h a m und G ο 111 i e b (J. of Bact. 56, 107—114 [1948]) bestimmt. Der Entwi,klungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren

angegebenen Grundmedium bestimmt, wobei dii Glucose durch die verschiedenen jeweilig unter suchten Kohlenstoffquellen oder das (NH₄)_?SO₄ durcl die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoff quellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in de nachfolgenden Tabelle angegeben:

	18 09	Verwertung	187 \	8	Verwertung
7			j
Geprüfte Kohlenstoff-	positiv	Geprüfte Stickstoff	positiv
quellen	positiv	quellen	positiv
D-Ribose	negativ	NaNO₃	positiv
D-Xylose	negativ	NaNO₂	positiv
L-Arabinose	positiv	(NH₄)₂SO₄	positiv
L-Rhamnose	positiv	(NH₄)₂HPO₄	positiv
D-Glucose	positiv	Adenin	negativ
D-Galactose	positiv	Adenosin	positiv
D-Fructose	negativ	Uracil	positiv
D-Mannose	langsam und mäßig	Harnstoff	positiv
L-Sorbose	positiv	L-Asparagin	negativ
Lactose	negativ	Glykokoll	positiv
Maltose	negativ	Sarcosin	positiv
Saccharose	positiv	DL-Alanin	positiv
Trehalose	negativ	DL-Valin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Asparaginsäure	positiv
Raffinose	negativ	L-Glutaminsäure	positiv
Dextrin	positiv	L-Arginin	positiv
Inulin	positiv	L-Lysin	positiv
Stärke	positiv	DL-Serin	negativ
Glykogen	negativ	DL-Threonin	negativ
Glycerin	negativ	DL-Methionin	positiv
Erythrit	negativ	Taurin	positiv
Adonit	positiv	DL-Phenylalanin	positiv
Dulcit	negativ	L-Tyrosin	positiv
D-Mannit	negativ	DL-Prolin	positiv
D-Sorbit		L-Hydroxyprolin	negativ
Inosit	L-Histidin
	Betain

S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32 041, ist von den von S. A. Waksman innerhalb der Reihe der Stämme von S. griseus unterschiedenen Species verschieden, von denen keine bisher beschriebene ein rotes lösliches Pigment bildet, das mit dem von dem Stamm DS 32 041 vergleichbar wäre, und von denen keine eine antibiotische und antitumorale Substanz produziert, die mit Daunorubicin identisch ist (The Actinomycetes, Bd. II, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 140—143).

Es wurde bereits ausgeführt, daß S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32 041, der ein rotes lösliches Pigment bildet, von S. griseus Waksman und H e η r i c i verschieden ist Er ist auch nicht mit S. griseimis Waksman identisch, der Grisein produziert Von diesen bekannten Stämmen bildet weder der eine noch der andere charakteristische lösliche Pigmente in ihren Kulturen mit Ausnahme gewisser Streptomycin erzeugender Stämme von S. griseus, die ein grünes lösliches Pigment in Medien mit Calciummalat bilden, eine Eigenschaft, die S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32 041 nicht besitzt Ebenso ist dieser Stamm von Streptomyces coelicolor (Müller) verschieden, der Candicidm und iin blaues lösliches Pigment produziert, sowie von Streptomyces Californicus Waksman und Curtis, der Viromycin produziert und auf gewissen Medien eine rosa bis purpurne Mycelpigmentierung auf Grund eines endocellulären Pigments aufweist, das nicht

in das Züchtungsmedium diffundiert, jedoch kein rotes lösliches Pigment bildet. Schließlich unterscheidet er sich auch von Streptomyces chrysomallus (Lindenbein) Waksman, der Actinomycin produziert und ein goldgelbes lösliches Pigment, jedoch niemals ein rotes lösliches Pigment bildet.

Nach den Begriffen von S. A. Waksman, könnte der Stamm DS 32 041 möglicherweise auch als eine neue Species angesehen werden.

Auf Grund der Hauptunterschiede zwischen dem Stamm DS 32 041 und der Species S. griseus, die nur auf der Produktion des antibiotischen löslichen Pigments beruhen, kann man den Stamm Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, DS 32 041 für eine Varietät der bereits von S. A. Waksman beschriebenen Species S. griseus und nicht für eine andere Species halten.

Das Verfahren zur Herstellung des Daunorubicins besteht im wesentlichen darin, Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, Stamm DS 32 041 auf geeigneten Medien und unter geeigneten Bedingungen

zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, DS 32 041, ergibt hauptsächlich Daunorubicin, jedoch auch die anderen Bestandteile 13 213

R P. und 13 330 R. P. des Antibioticums 9865 R. P., die von dem Daunorubicin im Verlaufe der Extraktions- und Reinigungsarbeitsgänge abgetrennt werden und gegebenenfalls iroliert werden können. Das

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Hauptziel der vorliegenden Erfindung liegt jedoch in der Herstellung von Daunorubicin.

Die Züchtung von Streptomyces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041 kann nach jeder aeroben Oberflächen- oder Submerszüchtungsmethode durchgeführt werden, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die in der Fermentationstechnik üblicherweise verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Gang für die Durchführung der Arbeitsgänge wählen:

Streptomyces (NRRL 3383) — Stammansatz

Kultur auf Agar

i
Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkter oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Mannit u. dgl., oder gewisse organische Säuren, z. B. Milchsäure, Citronensäure u. dgl., verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugeführten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkalioder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Magnesiumcarbonate.

Andere bewirken das zur Entwicklung des Streptomyces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041 und zur Bildung des Antibioticums erforderliche lonengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalkalisulfate und -chloride. Schließlich wirken gewisse in speziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces DS 32 041. Es sind dies die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Zu Beginn der Züchtung sollte der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C₁ S doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Werten variieren. Hs wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Bouillon

ίο und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8tägigei Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, daß

die zur Produktion von Daunorubicin angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041 in ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.

Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen Methoden isolierl werden.

Man kann die Fermentationsmaische bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das Filtrat. Nach Waschen mit Wasser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium durchzuführen, insbesondere unter Ansäuern auf einen

?£J>H-Wert zwischen 1,5 und 2 mittels Oxalsäure. Es ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 7, vorzugsweise in der Nähe von 2, in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen durchzuführen.

Bei den obengenannten Ext-^ktionsarbeitsgängen wird das Daunorubicin in wäßriger oder wäßrigalkoholischer Lösung erhalten. Anschließend führt man es durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispiels-

weise Butanol, Methylisobutylketon, Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9. vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5, in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls führt man vor dieser Extraktion eine Behandlung

mit einem Ionenausta^scherharz durch. In diesem Falle wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 eingestellt und anschließend mit einem Kationenaustauscherharz behandelt. Das Daunorubicin wird vorzugsweise mit Methanol, das 10%

Wasser und 1% Natriumchlorid enthält, eluiert. Das Eluat wird dann zur Entfernung des Alkohols eingeengt und anschließend wie oben extrahiert.

Man kann die Fermentationsmaische auch einer Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Athylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von 7,5, unterziehen. In diesem Falle geht die gesamte Aktivität in die organische Phase,

die von der wäßrigen Phase nach üblichen Verfahren abgetrennt wird.

Welche Extraktionsart auch gewählt wird, wird das Daunorubicin schließlich in organischer Lösung erhalten. Es kann in diesem Stadium vorteilhaft sein,

eine Reinigung durchzuführen, indem man das Antibioticum nacheinander in wäßrige Lösung und dann m organische Lösung durch Modifikation des pH-Werts überführt. Das rohe Antibioticum kann an-

schließend aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden. Eine besonders vorteilhafte Isolierungsmethode besteht darin, die organische Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 anzusäuern, vorzugsweise mit Hilfe von Essigsäure, und dann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen einzuengen. Die Zugabe eines schlechten Lösungsmittels für das Daunorubicin, wie beispielsweise Hexan, zu dem erhaltenen Konzentrat bewirkt dann die Ausfällung des rohen Antibioticums.

Um reineres Daunorubicin zu erhalten, kann man die üblichen Methoden anwenden, wie beispielsweise die Chromatographie an verschiedene Adsorbentien, die Gegenstromverteilung oder die Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln.

Das Daunorubicin kann auch in ein Additionssalz mit Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, übergeführt werden. Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.

Das nach diesem neuen Verfahren erhaltene Daunorubicin und seine Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Antibioticums 13 057 R. P. und seinen Salzen, die in der belgischen Patentschrift 6 32 391 beschrieben sind, identisch sind.

Es sind zwar schon aus dem deutschen Patent 12 15 863 und aus dem britischen Patent 10 03 383 Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin bekannt, jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren den bekannten Verfahren in überraschender Weise überlegen, da man ausgehend von gleichen Volumina Fermentationsmaische nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine weitaus bessere Ausbeute an Daunorubicin erhält als nach den bekannten Verfahren. So werden aus 1001 Fermentationsmaische nach dem Verfahren des deutschen Patents 1215 863 0,240 g Daunorubicin-hydrochlorid, nach dem Verfahren des britischen Patents 10 03 383 1,25 g Daunorubicinhydrochlorid und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 1,89 g Daunorubicin-hydrochlorid erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In einen 170-1-Fermenter bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Sojamehl 3,600 kg

»Distillers solubles« 0,600 kg

Stärke 4,200 kg

Sojaöl 1,800 1

Natriumchlorid 1,200 kg

Leitungswasser ad 1101

Nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,45 mit 120ccm konzentrierter lOn-Natronlauge sterilisiert man das Medium bei 122°C durch 40minfitiges Durchleiten von Dampf. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 6,80. Man beimpft dann mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlcnmeyer-Kultur des Stammes Streptomyces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041. Die Kultur wird 35 Stunden unter Bewegen und unter Belüften mit steriler Luft bei 30⁰C entwickelt Sie ist dann zur Beimpfimg der Produktionskultur ge- :ignet

Die Produktionskultur wird in einem 8001-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Sojamehl 12 kg

»Distillers solubles« 2 kg

Stärke 2 kg

Sojaöl 121

Natriumchlorid 4 kg

Leitungswasser ad 370 1

Nach Einstellen des pH-Wertes auf 7,50 mit 250ccm konzentrierter 10n-Natronlauge sterilisiert man das Medium bei 122°C durch 40minütiges Durchleiten von Dampf. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 400 1 und der pH-Wert 6,80. Man beimpft dann mit 401 der obigen Kultur aus dem 170-1-Fermenter. Die Züchtung wird 161 Stunden unter Bewegen mit Hilfe eines mit 250 UpM betriebenen Turbinenrührers und unter Belüften mit steriler Luft in einer Menge von 25 m³ je Stunde bei 30⁰C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7,0 und das Volumen der Maische 350 I. Die in dem Medium vorhandene Menge an Daunorubicin beträgt 34 μg/ccm.

Beispiel 2

100 1 der während der im Beispiel 1 beschriebenen Fermentation erhaltenen Fermentationsmaische werden in einen mit einer Vorrichtung zum Bewegen und einer Dampfheizschlange ausgestatteten Bottich gebracht. Man setzt 3 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse auf 50°C. Qas Bewegen und die Temperatur werden eine Stunde aufrechterhalten. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer Filterpresse nach Zugabe von 4 kg Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird auf dem Filter mit 1101 V/asser gewaschen. Das Filtrat, dessen Volumen 190 1 beträgt, wird auf +5°C abgekühlt und der pH-Wert mit 10%iger Natronlauge auf 4,5 eingestellt.

Das Filtrat wird in eine Säule, die 4 1 Amberlite IRC₅₀ im sauren Zyklus enthält, so geleitet, daß es das Harzbett von oben nach unten mit einer Rate von 15 I je Stunde durchströmt. Die Säule wird anschließend mit 151 Wasser, das in dem gleichen Richtungssinn wie das Filtrat und in der gleichen Rate zugeführt wird, dann mit 251 Methanol mit einem Gehalt von 50% Wasser mit einer Rate von 15 1 je Stunde in einem Zuführungssinn von unten nach oben und dann, ebenfalls mit der gleichen Rate von unten nach oben mit 50 1 Methanol mit einem Gehalt von 10% Wasser gewaschen.

Der Abfluß und die Waschflüssigkeiten werden verworfen, und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz strömenden Lösung der

5, folgenden Zusammensetzung eluiert:

Natriumchlorid 10 g

Wasser 100 ecm

Methanol ad ICKX) ecm

Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orangeroten Färbung und bis zum Verschwinden dieser Färbung gesammelt Man erhält so ein Volumen von 501, das den größten Teil des Antibioticums enthält. Das Eluat wird unter vermindertem Druck (2 Torr) bei 35°C bis auf ein Volumen von 101 eingeengt

Das Konzentrat wird bei pH-7,5 nacheinander dreimal mit je 51 Chloroform extrahiert Der Chloroformextrakt wird bei 30⁰C unter vermindertem

h

Druck (2 Torr) bis auf ein Volumen von 100 ecm eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit 1 I Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält schließlich 5,5 g rohe Base mit einem Gehalt von 71 % Daunorubicin.

Beispiel 3

4,3 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Produkts werden in 43 ecm eines Gemischs n-Butanol-Wasser-10n-Salzsäure (94 : 5 : 1 Volumina) gelöst. Man erhält so eine Lösung von Daunorubicin-hydrochlorid. Das Daunorubicin-hydrochlorid wird durch Zugabe von 430 ecm eines Gemischs Aceton-Hexan (50: 50 Volumina) ausgefällt. Die Ausfällung wird abgesaugt, mit 43 ecm Hexan gewaschen und bei 50°C unter vermindertem Druck (5 Torr) während 15 Stunden getrocknet. Man erhält so 3 g halbgereinigtes Daunorubicin-hydrochlorid (mit einem Gehalt von 67% Daunorubicin) in einer Ausbeute von 66%.

Beispiel 4

2,9 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen halbgereinigten Hydrochlorids werden in 30 ecm eines Gemischs n-Butanol-Wasser (95: 5 Volumina) gelöst. Dann setzt man nach und nach 30 ecm Aceton zu, um die Kristallisation des Daunorubicin-hydrochlorids zu bewirken. Die Kristalle werden abgesaugt, mit 6 ecm Aceton gewaschen und bei 50⁰C 15 Stunden unter vermindertem Druck (5 Torr) getrocknet. Man erhält so 2 g Hydrochlorid (mit einem Gehalt von 90% Daunorubicin) in einer Ausbeute von 92%.

Beispiel 5

1,9 g des gemäß Beispiel 4 erhaltenen kristallisierten Hydrochlorids werden in 24 ecm eines Gemischs

Dioxan-Wasser (80: 20) Volumina gelöst. Man läßt langsam unter vermindertem Rühren 174 ecm wasserfreies Dioxan zufließen, um die Kristallisation des Daunorubicin-hydrochlorids zu bewirken. Die Kristalle werden abgesaugt, mit 7 ecm wasserfreiem Dioxan gewaschen und 15 Stunden bei 50 C unter vermindertem Druck (5 Torr) getrocknet. Man erhält 1,36 g reines Daunorubicin-hydrochlorid in einer Ausbeute von 75%.

ίο Das erhaltene Daunorubicin-hydrochlorid ist in Wasser und Alkoholen löslich, in Chloroform wenig löslich und in Benzol und Äther unlöslich.

Das Daunorubicin-hydrochlorid weist die folgende Elementarzusammensetzung auf:

C = 54,5%, H = 5,55%, N = 2,45%, Cl = 6,1%.

Seine physikalischen Eigenschaften sind die folgenden:

Aussehen:

Orangerote Nadeln.
Schmelzpunkt:
225 bis 230⁰C.
Drehvermögen:

[«]«> = + 234 ± 5° (c = 0,1 % in Methanol mit 0,1 % reiner Chlorwasserstoffsäure).

Die Infraiot- und Ultraviolettspektren dieses Produkts sind mit denjenigen identisch, die für das Hydrochlorid des Antibioticums 13 057 R. P. in der belgischen Patentschrift 6 32 391 beschrieben sind.

Claims

Spezies, daß er als eine Varietät von dieser angesehen

Patentanspruch: werden'kann und den Namen Streptomyces griseus,

Varietät rubidofaciens, Stamm D. S. 32 941, erhalten Verfahren zur Herstellung des Daunorubicin hat.

genannten Antibiotikums 13 057 R. P. durch 5 S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm D. S. 32041, Fermentation, dadurch gekennzeich- erzeugt kein Meianinpigment auf organischen Menet, daß ein neuer Stamm, der »Streptomyces dien. Er bildet gerade oder schwach gebogene Sporogriseus, Varietät rubidofaciens, DS 32 041« ge- phoren, die isoliert angegliedert sind oder einige Vernannt wird (NRRL 3383), verwendet wird. zweigungen in Büscheln aufweisen. Seine Sporen sind

ίο oval bis zylindrisch mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7 μ/0,8 bis 1.2 μ. Sein reichliches sporuliertes luftausgesetztes Mycel, das pulvrig aussieht und eine hellgraugelbgrünliche Farbe

hat, weist das charakteristische Aussehen von dem-

15 jenigen eines Stammes von Streptomyces griseus auf.

Gewisse Zonen dieses luftausgesetzten Mycels nehmen

häufig eine rosa Farbe an, wenn das rote lösliche

Pigment gebildet wird und das darunterliegende

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Ver- Medium färbt.

fahren zur mikrobiologischen Herstellung des mit 20 In der nachfolgenden Tabelle sind die Züchtungsder Nummer 13 057 R. P. bezeichneten Antibioti- eigenschaften und biochemischen Eigenschaften des curns, das den Namen Daunorubicin erhalten hat S. gnseus, var. rubidofaciens, Stamm D. S. 32 041, (früher: Rubidomycin). auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur

In der belgischen Patentschrift 6 32 391 sind das Prüfung des Aussehens von Stämmen von Streptomit der Nummer 9865 R. P. bezeichnete Antibioti- 25 myces verwendeten Agar-Nährmedien und Nährcum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den bouillons angegeben. Ohne besondere genaue AnNummern 13 213 R. P., 13 057 R. P. (oder Dauno- gaben betreffen sie Kulturen von etwa zwei Wochen rubicin) und 13 330 R. P. bezeichnet sind, das mit bei 25⁰C, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht der Nummer 13 567 R. P. bezeichnete Aglykon des haben. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Kultur-9865 R. P., die Herstellung des Antibioticums 9865 30 medien wurde nach den in »The Actinomycetes« R. P. durch Züchtung von »Streptomyces 8899« oder (S.A. Waksman, Chronica Botanica Company, »Streptomyces 31 723« im geeigneten Medium und Waltham, Mass., USA, 1950, S. 193—197) angedie Trennung des Antibioticums 9865 R. P. in seine gebenen Rezepturen hergestellt. In diesem Falle sind Bestandteile beschrieben. sie mit dem Buchstaben W bezeichnet, dem die

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Ver- 35 Nummer, die ihnen in »The Actionmycetes« gegeben fahren zur Gewinnung von Daunorubicin durch ist, folgt.

Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der im Die Anmerkungen oder Zusammensetzungen der

folgenden vollständiger identifiziert wird, dem Genus anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:
Streptomyces angehört, mit »Streptomyces griseus, Anm. A: K. L. Jones, Journal of Bacteriology,

Varietät rubidofaciens, Stamm D. S. 32 041« bezeich- 40 57, 142 (1949).

net wird und aus einer in Indien in Bengalen ent- Amn. B: Rezeptur W 23, versetzt mit 2% Agar;

nommenen Erdprobe erhalten wurde, unter aeroben Anm. C: »Hickey und Tresners Agar«, T. G.

Bedingungen. P r i d h a m u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956—

Eine Probe dieses Stamms wurde in United States 1957, S. 950;

Department of Agriculture in Peoria, Illinois (USA) 45 Anm. D: »Yeast Extract Agar«, T. G. Pridham unter der Nummer NRRL 3383 hinterlegt. Proben u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956—1957, S. 950; dieses Mikroorganismus können von diesem Labo- Anm. E: »Tomato Paste Oatmeal Agar«, T. G.

ratorium unter Bezugnahme auf die vorliegende Er- P r i d h a m u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956— findung erhalten werden. 1957, S. 950;

Dieser neue Stamm weist Hauptcharakteristiken 50 Anm. F: W.E. Grundy u. Mitarb., Antibiotics auf, die den Schluß erlauben, daß er zu der Reihe S. and Chem. 2, 401 (1952);

griseus von S.A. Waksman (The Actinomycetes, Anm. G: »Inorganic Salts — Starch Agar«, T. G.

Bd. H, S. A. Waksman, the Williams and Wilkins Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956— Company, Baltimore, 1961, S. 133—143) gehört. 1957, S. 951;

Er ist durch seine Charakteristiken der für diese 55 Anm. H: entspricht der Rezeptur W-I, wobei Reihe repräsentativen Species Streptomyces griseus 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind;
Waksman und H e η r i c i, die Streptomycin Anm. I: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g

produziert und die in »Bergeys Manual of Deter- Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind;
minative Bacteriology« (7. Auflage, The Williams Anm. J: »Plain gelatin«, hergestellt nach den An-

and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 791) be- 60 gaben des »Manual of Methods for Pure Culture schriebene Species darstellt, sehr ähnlich, unter- Study of Bacteria« der Society of American Bacterischeidet sich jedoch von dieser wesentlich dadurch, ologists, Geneva, N. Y. II_S0—18 (Mai 1950);
daß er kein Streptomycin produziert, sondern da- Anm. K: »Manual of Methods ior Pure Culture

gegen ein sehr charakteristisches intensives und Study of Bacteria« der Society of American Bacterihäufig reichliches rotes lösliches Pigment, das im 65 ologists, Geneva, N. Y. II₅₀-19 (Mai 1950);
allgemeinen in Beziehung zu einer antibiotischen Anm. L: »Manual of Methods for Pure Culture

Aktivität steht. Durch die Gesamtheit seiner anderen Study of Bacteria« der Society of American Bacteri-Charakteristiken nähert er sich jedoch so an diese ologists, Geneva, N. Y. U₅₀-18 (Mai 1950);