<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Autibiotikums, u. zw. eines neuen Naphthacenderivates der Formel
EMI1.1
EMI1.2
EMI1.3
<tb>
<tb>
VerbiAbsorptionsmaximum <SEP> E <SEP> 1%
<tb> bei <SEP> 1cm
<tb> 233 <SEP> nm <SEP> 620
<tb> 254 <SEP> nm <SEP> 495
<tb> 292 <SEP> nm <SEP> 140
<tb>
Dieses Spektrum ist in der beigefügten Fig. 1 angegeben.
Sichtbares Spektrum : Bestimmung ausgehend von einer Lösung von 10, 65 mg/l in Äthanol mit 0, 1% in Salzsäure.
EMI1.4
<tb>
<tb>
1%
<tb> Absorptionsmaximum <SEP> 1%
<tb> beibei <SEP> :
<tb> 493 <SEP> nm <SEP> 272
<tb> 512 <SEP> nm <SEP> 189
<tb> 527 <SEP> nm <SEP> 190
<tb>
Dieses Spektrum ist in der beigefügten Fig. 2 wiedergegeben.
Infrarotspektrum : (Bestimmung an einem KBr-Pressling).
<Desc/Clms Page number 2>
Dieses Spektrum ist in der beigefügten Fig. 3 wiedergegeben, worin als Abszisse einerseits die Wellen- längen in Mikron (am oberen Teil der Zeichnung) und anderseits die Wellenzahlen in cm-1 (am unteren
Rand der Zeichnung) und als Ordinaten die optischen Dichten angegeben sind.
In der folgenden Tabelle I sind die hauptsächlichsten Infrarot-Absorptionsbanden für diese Verbindung, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm-1), angegeben :
Tabelle 1
EMI2.1
<tb>
<tb> 3410 <SEP> F <SEP> 2680 <SEP> Sch <SEP> 1580 <SEP> Sch <SEP> 1195 <SEP> F <SEP> 915 <SEP> Sch <SEP> 725 <SEP> m <SEP> 530 <SEP> f
<tb> 3250 <SEP> Sch <SEP> 2600 <SEP> Sch <SEP> 1510 <SEP> Sch <SEP> 1165 <SEP> F <SEP> 885 <SEP> m <SEP> 708 <SEP> m <SEP> 485 <SEP> m
<tb> 3220 <SEP> Sch <SEP> 1980 <SEP> tf <SEP> 1460 <SEP> F <SEP> 1115 <SEP> F <SEP> 875 <SEP> m <SEP> 695 <SEP> Sch <SEP> 475 <SEP> Sch
<tb> 3050 <SEP> Sch <SEP> 1930 <SEP> Sch <SEP> 1440 <SEP> F <SEP> 1062 <SEP> F <SEP> 845 <SEP> Sch <SEP> 665 <SEP> Sch <SEP> 465 <SEP> f
<tb> 2970 <SEP> F <SEP> 1900 <SEP> tf <SEP> 1405 <SEP> F <SEP> 1050 <SEP> Sch <SEP> 840 <SEP> Sch <SEP> 640 <SEP> Sch <SEP> 450 <SEP> Sch
<tb>
2930 <SEP> F <SEP> 1800 <SEP> tf <SEP> 1370 <SEP> Sch <SEP> 1030 <SEP> Sch <SEP> 820 <SEP> F <SEP> 625 <SEP> Sch <SEP> 438 <SEP> m
<tb> 2900 <SEP> Sch <SEP> 1735 <SEP> Sch <SEP> 1315 <SEP> Sch <SEP> 1010 <SEP> F <SEP> 810 <SEP> Sch <SEP> 600 <SEP> m <SEP> 415 <SEP> tf
<tb> 2860 <SEP> Sch <SEP> 1690 <SEP> Sch <SEP> 1285 <SEP> F <SEP> 985 <SEP> F <SEP> 780 <SEP> m <SEP> 580 <SEP> f <SEP> 390 <SEP> m
<tb> 2820 <SEP> Sch <SEP> 1635 <SEP> Sch <SEP> 1255 <SEP> m <SEP> 960 <SEP> Sch <SEP> 762 <SEP> m <SEP> 565 <SEP> f <SEP> 320 <SEP> f
<tb> 1600 <SEP> rF <SEP> 1235 <SEP> F <SEP> 930 <SEP> m <SEP> 750 <SEP> m <SEP> 540 <SEP> f
<tb>
tF = sehr stark f = schwach
F = stark tf = sehr schwach m = mittel Sch = Schulter
Das 32999 RP kann durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxydgel unter Verwendung eines Gemisches aus
Methylenchlorid/Ameisensäure/Methanol (80-17-3 in Volumina) bei einer Temperatur von 240C RP-Hydrochlorid charakterisiert werden. In diesem System hat das Chlorhydrat von 32 999 RP einen Rf-Wert in der Nähe von 0,2.
Durch saure Hydrolyse von 32 999 EP oder eines seiner Salze erhält man eine Verbindung der Formel
EMI2.2
diedasAglyconvon 32 999 RP ist.
EMI2.3
Dioxan, Chloroform und Methylenchlorid und von wenigstens 0,1 mgfcm3 in Aceton, Äthylacetat, Hexan und Wasser löslich.
Diese Verbindung besitzt im übrigen die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften :
Aussehen : mikrokristallines rot-orange-farbenes Pulver.
Schmelzpunkt : etwa 185 C (unter Zers.).
Elementaranalyse : Sie beträgt etwa :
EMI2.4
% = 61, 57 H % = 5, 31 0 % = 30, 16Ultraviolettspektrum : Bestimmung ausgehend von Lösungen mit 50 und 5 ml/l in Äthanol mit 0, 1% in Salzsäure.
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
<tb>
<tb>
Absorptionsmaximum <SEP> E.,
<tb> 1cm
<tb> bei <SEP> : <SEP>
<tb> 234 <SEP> nm <SEP> 770
<tb> 254 <SEP> nm <SEP> 640
<tb> 293 <SEP> nm <SEP> 190
<tb>
EMI3.2
EMI3.3
<tb>
<tb>
:Absorptionsmaximum <SEP> E
<tb> bei <SEP> : <SEP> lem <SEP>
<tb> 493 <SEP> nm <SEP> 370
<tb> 515 <SEP> nm <SEP> 255
<tb> 528 <SEP> nm <SEP> 270
<tb>
Dieses Spektrum ist in Fig. 5 wiedergegeben.
Infrarotspektrum : (Bestimmung an KBr-Presslingen).
Dieses Spektrum wird in Fig. 6 wiedergegeben, worin auf den Abszissen einerseits die Wellenlängen in Mikron (oberer Rand) und anderseits die Wellenzahlen in cm-1 (unterer Rand) und als Ordinaten die optischen Dichten aufgetragen sind.
In der folgenden Tabelle II sind die hauptsächlichsten Infrarot-Absorptionsbanden für diese Verbindung, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm- 1) wiedergegeben.
Tabelle II
EMI3.4
<tb>
<tb> 3500 <SEP> Sch <SEP> 2680 <SEP> Sch <SEP> 1412 <SEP> F <SEP> 1095 <SEP> f <SEP> 910 <SEP> m <SEP> 740 <SEP> m <SEP> 530 <SEP> tf
<tb> 3240 <SEP> F <SEP> 1980 <SEP> tf <SEP> 1370 <SEP> F <SEP> 1070 <SEP> Sch <SEP> 885 <SEP> m <SEP> 710 <SEP> m <SEP> 505 <SEP> Sch
<tb> 3360 <SEP> Sch <SEP> 1705 <SEP> f <SEP> 1315 <SEP> Sch <SEP> 1062 <SEP> F <SEP> 875 <SEP> m <SEP> 700 <SEP> Sch <SEP> 485 <SEP> m
<tb> 3080 <SEP> Sch <SEP> 1640 <SEP> Sch <SEP> 1285 <SEP> tF <SEP> 1050 <SEP> Sch <SEP> 865 <SEP> f <SEP> 680 <SEP> tf <SEP> 465 <SEP> m
<tb> 2975 <SEP> m <SEP> 1600 <SEP> tF <SEP> 1255 <SEP> tF <SEP> 1030 <SEP> m <SEP> 840 <SEP> m <SEP> 665 <SEP> tf <SEP> 450 <SEP> m
<tb> 2925 <SEP> m <SEP> 1580 <SEP> Sch <SEP> 1240 <SEP> Sch <SEP> 1020 <SEP> m <SEP> 815 <SEP> F <SEP> 625 <SEP> Sch <SEP> 435 <SEP> m
<tb> 2910 <SEP> Sch <SEP> 1540 <SEP> Sch <SEP> 1195 <SEP>
F <SEP> 1005 <SEP> m <SEP> 805 <SEP> Sch <SEP> 595 <SEP> f <SEP> 385 <SEP> tf
<tb> 2890 <SEP> Sch <SEP> 1458 <SEP> F <SEP> 1165 <SEP> F <SEP> 975 <SEP> m <SEP> 785 <SEP> Sch <SEP> 585 <SEP> f <SEP> 360 <SEP> tf
<tb> 2860 <SEP> Sch <SEP> 1448 <SEP> F <SEP> 1130 <SEP> m <SEP> 950 <SEP> m <SEP> 775 <SEP> Sch <SEP> 570 <SEP> f <SEP> 320 <SEP> tf
<tb> 925 <SEP> m <SEP> 765 <SEP> m <SEP> 545 <SEP> f
<tb>
tF = sehr stark tf = sehr schwach f = schwach m = mittel
F = stark Sch = Schulter
Das Aglycon von 32 999 RP kann durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxydgel unter Verwendung eines Gemisches aus Methylenchlorid/Ameisensäure/Methanol (80-17-3 in Volumina) als Entwicklungslösungsmittel bei einer Temperatur von 240C charakterisiert werden. In diesem System hat das Aglycon einen Rf-Wert von 0, 7.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums der Formel
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
EMI4.2
<Desc/Clms Page number 5>
EMI5.1
coeruleorubidus Stamm DS 7126 genannt.
Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 bildet kurze sphärische bis ovale Sporen, mit Abmessungen 0, 7 bis 0, 9 Po/0, 8 bis 1, 1 Po.
Er entwickelt einfache Sporophoren oder in Trauben ; seine Sporenketten, die ziemlich lang sind und bis zu mehreren Zehnem Sporen umfassen können, rollen sich auf unter Bildung von mehr oder weniger offenen Spiralen, die meistens 2 bis 5 oder 6 Spiralwindungen aufweisen. Durch seine Sporulationsart fällt Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 in die Section Spira der Klassifikation nach Pridham.
EMI5.2
Tyrosinase positiv
Verflüssigung von Gelatine positiv, langsam
Verwertung von Cellulose positiv
Produktion von Nitriten aus
Nitraten negativ auf Nitrat-Nährbouillon, positiv auf synthetischen Medien
Hydrolyse von Stärke positiv, mässig
Züchtung auf entrahmter Milch weder Koagulation noch
Peptonisation
In der folgenden Tabelle sind die Züchtungseigenschaften zusammengestellt, welche Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 auf einer bestimmten Zahl von Medien, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomyces-Stämmen verwendet werden, aufweist ; die Kulturen auf Gelose-Medien wurden auf Schräg-Gelosen durchgeführt.
Die Eigenschaften sind solche von auf einem guten Entwicklungsstadium angekommenen Kulturen, d. h. etwa 3 Wochen bei 26 C, wenn nichts anderes angegeben ist. Die Literaturreferate für die verwendeten Züchtungsmedien sind die folgenden :
Ref. A - "Medium 1 with a mineral source of nitrogen"-G. F. GauzeundMitarb.-Problems inthe Classification of Antagonistic Actinomycetes - S. 13 - The American Institute of Biological Sciences, Washington 6, D. C., 1959,
EMI5.3
1950, S. 194-Nr. 10,
Ref. C-'Tnorganic Salts-StarchAgar"-T. G. Pridham und Mitarb.-Antibiotics Annual, 1956-1957S. 951,
EMI5.4
Actinomycetes-S. A.1950 - S. 193 - Nr. 1,
Ref. F - entspricht Ref. E - wo 3% der Saccharose ersetzt wird durch 1, 5% Glucose,
Ref. G-The Actinomycetes-S. A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U. S. A., 1950-S. 195-Nr. 18,
Ref. H - entspricht Ref. G - wo 3% der Saccharose ersetzt wird durch 1, 5% Glucose,
Ref. I - entspricht Ref. G - wo die Saccharose weggelassen und durch kleine Streifen von Filterpapier ersetzt ist, welche teilweise in die Flüssigkeit tauchen,
Ref. J - Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria - Society of American Bacteriologists Geneva, N. Y. II50 - 18,
Ref. K-"Bennett's Agar"-S. A.
Waksman-The Actinomycetes, Bd. 2, S. 331 - Nr. 30 - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961,
Ref. L - "Melanin formation medium"-S. A. Waksman-The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333-Nr. 42The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961,
Ref. M-The Actinomycetes-S. A. Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U. S. A., 1950-S. 197-Nr. 27,
<Desc/Clms Page number 6>
Ref. N - "Plain Gelatin"-hergestellt nach den Angaben des "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" - Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y. II50-18,
Ref. 0 - entrahmte Milch als handelsübliches Pulver, zubereitet nach den Angaben des Herstellers,
Ref.
P - Medium für die Herstellung von H S gemäss : H. D. Tresner und F. Danga-Journal of Bacteriology, 76, 239 - 244, 1958.
EMI6.1
<tb>
<tb>
Züchtungs- <SEP> Grad <SEP> der <SEP> vegetatives <SEP> Mycel <SEP> (v. <SEP> M.) <SEP> Luftorgane <SEP> lösliches <SEP> Beobachtungen <SEP> und
<tb> medium <SEP> Entwicklung <SEP> oder <SEP> (umfassend <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> biochemische
<tb> Unterseite <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> gesamte <SEP> Luftmycel <SEP> Eigenschaften
<tb> u. <SEP> d. <SEP> Sporenbildung)
<tb> Gelose <SEP> mit <SEP> ziemlich <SEP> v. <SEP> M. <SEP> rotlich <SEP> hellblau-grünlich <SEP> karmineiner <SEP> anor-gut <SEP> rotganischen <SEP> bräunlich
<tb> Stickstoffquelle <SEP> nach
<tb> Gauze
<tb> (Ref. <SEP> A)
<tb> Gelose- <SEP> ziemlich <SEP> v. <SEP> M. <SEP> rötlich <SEP> weisslich <SEP> bis <SEP> karmin- <SEP> Hydrolyse <SEP> der
<tb> Stärke-Ni- <SEP> gut <SEP> Blaustich, <SEP> sehr <SEP> rot <SEP> Stärkte <SEP> :
positiv,
<tb> trat <SEP> mässig <SEP> entwickelt <SEP> mässig
<tb> (Ref. <SEP> B)
<tb> Gelose- <SEP> ziemlich <SEP> Unterseite <SEP> rot- <SEP> helles <SEP> blau- <SEP> orange- <SEP> Hydrolyse <SEP> der
<tb> Stärke- <SEP> gut <SEP> orange-schwach <SEP> grünlich <SEP> schwach <SEP> Stärke: <SEP> positiv,
<tb> Mineral- <SEP> bräunlich <SEP> bräunlich <SEP> mässig
<tb> salze <SEP> nach <SEP> kurze <SEP> sphärische
<tb> Pridham <SEP> bis <SEP> ovale <SEP> Sporen,
<tb> (Ref. <SEP> C) <SEP> Abmessungen
<tb> 0, <SEP> 7-0, <SEP> 91-1/0, <SEP> 8- <SEP>
<tb> 1, <SEP> 1 .
<tb>
Sporenketten <SEP> in
<tb> mehr <SEP> oder <SEP> weniger <SEP> geöffneten
<tb> Spiralen <SEP> mit <SEP> 2 <SEP> bis
<tb> 5 <SEP> oder <SEP> 6 <SEP> Drehungen
<tb>
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb>
<tb> Züchtungs- <SEP> Grad <SEP> der <SEP> vegetatives <SEP> Mcel <SEP> (v. <SEP> M.) <SEP> Luftorgane <SEP> lösliches <SEP> Beobachtungen <SEP> und
<tb> medium <SEP> Entwicklung <SEP> oder <SEP> (umfassend <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> biochemische
<tb> Unterseite <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> gesamte <SEP> Luftmycel <SEP> Eigenschaften
<tb> u. <SEP> d. <SEP> Sporenbildung)
<tb> Gelose- <SEP> ziemlich <SEP> Unterseite <SEP> rot-orange <SEP> weisslich <SEP> bis <SEP> rosaGlycerin- <SEP> gut <SEP> Blaustich, <SEP> sehr <SEP> orange
<tb> Asparagin <SEP> mässig <SEP> entwickelt
<tb> (Ref. <SEP> D)
<tb> synthet. <SEP> ziemlich <SEP> v. <SEP> M.
<SEP> rosa-gelblich <SEP> bis <SEP> weisslich, <SEP> karminGelose <SEP> nach <SEP> gut <SEP> rot-bräunlich <SEP> sehr <SEP> schwach <SEP> rot
<tb> Czapek <SEP> mit <SEP> Unterseite <SEP> rötlich <SEP> entwickelt
<tb> Saccharose
<tb> (Ref. <SEP> E)
<tb> synthet. <SEP> ziemlich <SEP> v. <SEP> M. <SEP> rosa-gelblich <SEP> bis <SEP> weisslich <SEP> karminGelose <SEP> gut <SEP> rot-bräunlich <SEP> Spuren <SEP> rotnach <SEP> Czapek <SEP> Kehrseite <SEP> rosa-rötlich <SEP> bräunlich
<tb> mit <SEP> Glucose
<tb> (Ref. <SEP> F)
<tb> Bouillon <SEP> sehr <SEP> schwacher <SEP> rosa-braun-keine <SEP> keines <SEP> Erzeugung <SEP> von
<tb> nach <SEP> Czapek <SEP> mässig <SEP> licher <SEP> Schleier <SEP> Nitriten <SEP> :
<SEP> positiv
<tb> mit <SEP> zu <SEP> Beginn <SEP> der
<tb> Saccharose <SEP> Züchtungen
<tb> (Ref. <SEP> G)
<tb>
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<tb>
<tb> Züchtung-rad <SEP> der <SEP> vegetatives <SEP> Mycel <SEP> (v. <SEP> M.) <SEP> Luftorgane <SEP> lösliches <SEP> Beobachtungen <SEP> und
<tb> medium <SEP> Entwicklung <SEP> oder <SEP> (umfassend <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> biochemische
<tb> Unterseite <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> gesamte <SEP> Luftmycel <SEP> Eigenschaften
<tb> u. <SEP> d. <SEP> Sporenbildung) <SEP>
<tb> Bouillon <SEP> sehr <SEP> schwacher <SEP> grau-rosa- <SEP> keine <SEP> keines <SEP> Erzeugung <SEP> von
<tb> nach <SEP> Czapek <SEP> mässig <SEP> bräunlicher <SEP> Schleier <SEP> Nitriten <SEP> :
<SEP> positiv
<tb> mit <SEP> Glucose <SEP> zu <SEP> Beginn <SEP> der
<tb> (Ref. <SEP> H) <SEP> Züchtungen
<tb> Bouillon <SEP> sehr <SEP> weisslicher <SEP> Schleier <SEP> keine <SEP> keines <SEP> Verwertung <SEP> der
<tb> nach <SEP> Czapek <SEP> mässig <SEP> Cellulose <SEP> : <SEP>
<tb> mit <SEP> positiv, <SEP> mässig
<tb> Cellulose
<tb> (Ref. <SEP> I)
<tb> Nährbouillon <SEP> mässig <SEP> heller <SEP> braun-röt- <SEP> keine <SEP> braun <SEP> Erzeugung <SEP> von
<tb> mit <SEP> Nitrat <SEP> licher <SEP> Ring <SEP> Nitriten <SEP> :
<SEP> negativ
<tb> (Ref. <SEP> J)
<tb> Gelose <SEP> gut <SEP> braun-rötlich <SEP> hellblau- <SEP> grünlich <SEP> braun- <SEP>
<tb> nach <SEP> bis <SEP> blau-gräulich <SEP> rötlich
<tb> Bennett
<tb> (Ref. <SEP> K)
<tb> Gelose-Tyro- <SEP> mässig <SEP> braun-schwärzlich <SEP> gränlich <SEP> - <SEP> wenig <SEP> braun- <SEP> Melanin-Produksin-Hefeex- <SEP> entwickelt <SEP> schwärz- <SEP> tion <SEP> :
<SEP> positiv
<tb> trakt <SEP> zur <SEP> lich <SEP> (Ablesungen <SEP> nach
<tb> Bildung <SEP> von <SEP> den <SEP> Angaben <SEP> des
<tb> Melanin <SEP> Autors <SEP> durchge-
<tb> (Ref. <SEP> L) <SEP> führt)
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
<tb>
<tb> Züchtungs- <SEP> Grad <SEP> der <SEP> vegetatives <SEP> Mycel <SEP> (v. <SEP> M.) <SEP> Luftorgane <SEP> lösliches <SEP> Beobachtungen <SEP> und <SEP>
<tb> medium <SEP> Entwicklung <SEP> oder <SEP> (umfassend <SEP> das <SEP> Pigment <SEP> biochemische
<tb> Unterseite <SEP> der <SEP> Kultur <SEP> gesamte <SEP> Luftmycel <SEP> Eigenschaften
<tb> u. <SEP> d. <SEP> Sporenbildung)
<tb> Kultur <SEP> auf <SEP> gut <SEP> dunkelbraun <SEP> bis <SEP> weiss-gräulich <SEP> bis <SEP> dunkelbraunKartoffeln <SEP> orange-braun-rötlich <SEP> weiss-rosa <SEP> und <SEP> orange-röt-
<tb> (Ref.
<SEP> M) <SEP> hellblau-gräulich, <SEP> lieh <SEP> bis <SEP>
<tb> ziemlich <SEP> wenig <SEP> braunentwickelt <SEP> schwärzlich
<tb> reine <SEP> Gela- <SEP> ziemlich <SEP> braun- <SEP> schwärzlich <SEP> keine <SEP> braun-Verflüssigung
<tb> tine <SEP> von <SEP> gut <SEP> schwärzlich <SEP> positiv, <SEP> langsam
<tb> 12%
<tb> (Ref. <SEP> N)
<tb> entrahmte <SEP> gut <SEP> orange-bräunlicher <SEP> keine <SEP> keines <SEP> oder <SEP> keine <SEP> KoagulaMilch <SEP> bis <SEP> braun-rötlicher <SEP> schwach- <SEP> tion <SEP> und <SEP> keine
<tb> (Ref.
<SEP> 0) <SEP> Ring <SEP> gräulich <SEP> Peptonisation,
<tb> sehr <SEP> leichte
<tb> Säuerung <SEP> des <SEP> PH,
<tb> die <SEP> von <SEP> 6,2-6, <SEP> 3
<tb> bis <SEP> 6, <SEP> 0-6, <SEP> 1 <SEP> in
<tb> 1 <SEP> Monat <SEP> geht
<tb> Gelose <SEP> nach <SEP> mässig <SEP> grau-schwärzlich <SEP> keine <SEP> schwarz <SEP> Produktion <SEP> von
<tb> Tresner <SEP> H2 <SEP> S <SEP> : <SEP> positiv
<tb> und <SEP> Danga <SEP> (Ablesungen
<tb> (Ref. <SEP> P) <SEP> durchgeführt
<tb> nach <SEP> den <SEP> Angaben
<tb> des <SEP> Autors)
<tb>
<Desc/Clms Page number 10>
Der Streptomyces DS 7126 gehört infolge der Färbung von blau bis blaugrünlich seines SporenLuftmycels zu der Serie "Coerulescens", die von Gauze und Mitarb. beschrieben ist.
Unter den in dieser Serie beschriebenen Stämmen zeigt es ein vegetatives Mycel, das sich rot färbt, wie S. coeruleorubidus und S. bicolor. Jedoch unterscheidet er sich von S. bicolor durch die Tatsache, dass er im Gegensatz zu diesem Cellulose verwertet, er koaguliert nicht die Milch und ganz besonders vermag er ein rotes lösliches Pigment zu bilden, das in die Gelose auf synthetischem Medium diffundiert, eine Eigenschaft, welche er nur mit der Spezies S. coeruleorubidus teilt. Diese letztgenannte Eigenschaft, verbunden mit der Gesamtheit der übrigen Eigenschaften, zeigt, dass er der Spezies S. coeruleorubidus nahekommt oder eventuell zugeordnet ist.
Die Fähigkeit von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126, verschiedene Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen für seine Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 56, 107-114, [1948]) bestimmt ; der Grad der Entwicklung wurde auf dem Basismedium, das von den Autoren angegeben ist, beobachtet, wobei entweder die Glucose durch verschiedene untersuchte Kohlenstoffquellen oder (NH) SO durch verschiedene untersuchte Stickstoffquellen ersetzt wurde.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt :
EMI10.1
<tb>
<tb> untersuchte <SEP> Verwertung <SEP> untersuchte <SEP> Verwertung
<tb> Kohlenstoffquellen <SEP> Stickstoffquellen
<tb> D-Xylose <SEP> positiv <SEP> NaNO <SEP> positiv
<tb> L-Arabinose <SEP> positiv <SEP> NaNO <SEP> positiv
<tb> L-Rhamnose <SEP> positiv <SEP> (NH) <SEP> SO <SEP> positiv <SEP>
<tb> D-Glucose <SEP> positiv <SEP> (NH)
<SEP> HPO <SEP> positiv
<tb> D-Galactose <SEP> positiv <SEP> Harnstoff <SEP> positiv
<tb> D- <SEP> Fructose <SEP> positiv <SEP> L-Asparagin <SEP> positiv
<tb> D-Mannose <SEP> positiv <SEP> Glycokoll <SEP> positiv
<tb> Lactose <SEP> positiv <SEP> Sarcosin <SEP> negativ
<tb> Maltose <SEP> positiv <SEP> DL-Alanin <SEP> positiv
<tb> Saccharose <SEP> positiv <SEP> DL-Valin <SEP> positiv
<tb> Trehalose <SEP> positiv <SEP> L-Lysin <SEP> positiv
<tb> Cellobiose <SEP> positiv <SEP> DL-Methionin <SEP> positiv,
<tb> langsam
<tb> Dextrin <SEP> positiv <SEP> Taurin <SEP> negativ
<tb> Inulin <SEP> negativ <SEP> L-Tyrosin <SEP> positiv
<tb> Stärke <SEP> positiv
<tb> Glycerin <SEP> positiv
<tb> Erythrit <SEP> negativ
<tb> Dulcit <SEP> negativ
<tb> D-Mannit <SEP> positiv <SEP>
<tb> D-Sorbit <SEP> positiv
<tb> Inosit <SEP> positiv
<tb> Salicin <SEP> positiv
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Das Verfahren zur Herstellung von 32 999 RP besteht darin, die oben erwähnten Streptomyces-Stämme auf einem Milieu und unter geeigneten Bedingungen in Gegenwart einer ausreichenden Menge Hilfsmittel zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.
Die Züchtung der Mikroorganismen kann nach jeder aeroben Oberflächen"oder Submersen-Züchtungs- methode erfolgen, jedoch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit vorzuziehen. Man verwendet zu die- sem Zweck die verschiedenen Typen von Apparaturen, welche in der Industrie der Fermentationen laufend verwendet werden.
EMI11.1
stoff, mineralische Elemente, insbesondere Chloride oder Carbonate, und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von wohldefiniertenProdukten oder komplexen Mischungen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedener Herkunft antrifft, eingebracht werden.
Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff kann man Kohlehydrate, wie Glucose, Lactose, Dextrine, Stärke oder andere kohlenstoffhaltige Substanzen, wie Zuckeralkohole (Glycerin) oder gewisse organische Säuren : Milchsäure, Zitronensäure verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie Specköl oder Sojaöl, können mit Vorteil diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder ihnen zugefügt werden.
Die geeigneten Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind ausserordentlich verschieden. Es können sehr einfache chemische Substanzen sein, wie anorganische oder organische Ammoniumsalze, Harnstoff oder gewisse Aminosäuren. Es können auch komplexe Substanzen eingebracht werden, welche hauptsächlich den Stickstoff in protidischer Form enthalten, z. B. Kasein, Lactalbumin, Gluten oder deren Hydrolysate, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Fleischextrakte, Hefeextrakte, distiller's solubles und Maisquellwasser.
Unter den zugefügten mineralischen Elementen können einige einen Puffer- oder Neutralisationseffekt haben, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- und Magnesiumcarbonate. Andere tragen zur Einstellung des ionischen Gleichgewichts bei, welches zur Entwicklung der Mikroorganismen und zur Ausbildung von 32 999 RP notwendig ist, wie die Alkali-und Erdalkalichloride und-sulfate. Schliesslich wirken gewisse Stoffe speziell als Aktivatoren der metabolische Reaktionen der Mikroorganismen, das sind Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer-, Mangansalze.
Die Wachstumsfaktoren sind im allgemeinen Produkte mit Vitamin-Natur, wie Thiamin, Riboflavin, Pantothensäure.
Die Hilfsmittel können im Verlaufe der verschiedenen Stadien der Züchtung zugegeben werden : Entweder bei der Impfkultur in bewegten Flaschen, bei der Produktionskultur im Fermentationsgefäss.
Die besten Resultate werden jedoch erhalten, wenn diese Hilfsmittel entweder zu Beginn der Produktionsphase oder im Verlauf derselben zugegeben werden.
Unter den Hilfsmitteln, welche besonders geeignet sind, kann man Sulfanilamid, Sulfathiazol und Sulfapyridazin nennen.
Die Konzentration des Hilfsmittels im Fermentationsmedium kann in weiten Grenzen je nach der Zusammensetzung des Kulturmediums und der Natur des Hilfsmittels variieren. Im allgemeinen sind Konzentrationen zwischen 0, 01 und 1 g/l Fermentationsbrühe besonders zweckmässig.
Der pH-Wert des Fermentationsmediums zu Beginn der Züchtung soll zwischen 5, 6 und 7, 4 und vorzugsweise zwischen 5,8 und 7,2 liegen. Die optimale Temperatur zur Fermentation liegt zwischen 25 und SOOC, jedoch kann auch eine zufriedenstellende Produktion für Temperaturen zwischen 23 und 330C erhalten werden. Die Belüftung der Fermentation kann zwischen weiten Grenzen variieren, es wurde jedoch festgestellt, dass Belüftungen von 0, 3 bis 3 l Luft/l Brühe und je Minute besonders gut entsprechen. Die maximale Ausbeute an 32 999 RP wird nach 2 bis 10 Tagen Züchtung erhalten, diese Zeit hängt jedoch auch im wesentlichen von dem verwendeten Nährmedium ab.
Aus den obigen Ausführungen wird ersichtlich, dass die allgemeinen Bedingungen der Züchtung des Mikroorganismus in Gegenwart der Hilfsmittel in weitem Masse variieren können und für jeden speziellen
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etwa 9 mittels eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Methylenchlorid, n-Butanol, oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel in geeigneten Mengenverhältnissen extrahiert werden.
Die Fermentationsbrühe kann auch in Gegenwart eines Filterhilfsmittels bei einem pH-Wert zwischen 1, 5 und 9 filtriert werden. Es ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Milieu durchzuführen und insbesondere auf einen PH-Wert zwischen 1, 5 und 2 mittels Oxalsäure anzusäuern. Es ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert zwischen 2 und 8 in Gegenwart eines aliphatischen Alkohols mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen vorzunehmen. Die Verbindung 32 999 RP kann aus dem Filtrat nach dem Einengen mittels eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Methylenchlorid, n-Butanol, oder Gemischen dieser Lösungsmittel in geeigneten Mengenverhältnissen extrahiert werden.
Die Verbindung 32 999 RP kann aus den organischen Extrakten nach aufeinanderfolgenden Wasch- und Extraktionsmassnahmen durch Ausfällung nach dem Einengen der Extrakte auf ein kleines Volumen isoliert werden oder aber durch Zugabe in ein mischbares Lösungsmittel, worin die Verbindung 32 999RPpraktisch unlöslich ist, wie Hexan, gegebenenfalls nach Umwandlung des Antibiotikum in ein Additionssalz mit einer Säure, wie beispielsweise das Hydrochlorid.
Das 32 999 RP kann gegebenenfalls durch die verschiedenen klassischen Reinigungsmassnahmen gereinigt werden, wie Kristallisation oder Chromatographie an verschiedenen Adsorbentien.
Die Verbindung 32 999 RP und ihre nichttoxischen Salze, d. h. die pharmazeutisch annehmbaren Salze, haben sich besonders wirksam bei einpflanzbaren Tumoren der Maus in Dosen zwischen 0, 125und 0, 250 mg/kg hop., bei der Leukämie L 1210, der Leukämie P 388 und der Leukosarcomatose erwiesen.
Die Toxizität des Hydrochlorids von 32 999 RP wurde hauptsächlich an der Maus untersucht. Die 50% ige letale Dosis (DL50) wurde intraperitoneal bestimmt (Behandlung während vier aufeinanderfolgenden Tagen) und liegt bei etwa 0, 4 mg/kg.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird a) die Identifizierung von 32 999 RP durch Dünnschicht-Chromatographie an Siliciumdioxydgel durch- geführt, wobei die Rf-Werte der erhaltenen Produkte mit denjenigen von Carminomycin oder von
32 999 RP in demselben Lösungsmittelsystem verglichen wurden, b) die Produktion von 32 999 RP ausgehend von den Dünnschicht-Chromatogrammen bestimmt, entwe- der durch Vergleich der Intensitäten der entsprechenden Flecken des Extrakts und desjenigen von reinem, als Kontrollprobe genommenen 32 999 RP, oder aber durch Vergleich der Oberflächen der
Piks, welche auf der "Chromoscan"-Platte registriert wurden, oder aber durch kolorimetrische
Bestimmung von 32 999 RP,
das aus dem chromatographischen Träger auf der Höhe des Fleckens des gesuchten Produktes eluiert wurde.
Beispiel l : Man stellt ein Kulturmedium A mit folgender Zusammensetzung her :
Sojamehl 8 g
Bäckerhefe im Stück 40 g reine Lactose 58 g
Natriumchlorid 2 g
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gZinksulfat-heptahydrat 0, 1 g destilliertes Wasser von 750C 800 cm3
Der pH-Wert der Suspension wird durch Zugabe von 1 cm3 10 n Natronlauge auf 6, 5 eingestellt, dann gibt man zu :
Glycerin (d = 1, 26) 19 g
Calciumcarbonat 2 g destilliertes Wasser auffüllen auf 1000 cm3
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Dieses Medium wird auf 300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben verteilt. Die Kolben werden während 20 min bei 1220C sterilisiert. Nach dem Abkühlen beträgt der pH-Wert des Mediums 5, 9. Man stellt
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0eine"Millipore 0, 45 jn"-Membrane her.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in 6 Gruppen mit je 2 Kolben eingeteilt.
Die Kolben der Gruppe A erhalten keinen weiteren Zusatz.
Die Kolben der 5 andern Gruppen erhalten die folgenden weiteren Zusätze :
EMI13.2
(NRRL 8098) beimpft.
Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegtem Tisch in einem Raum von 26 C entwickelt.
Die Kolben der Gruppe A6 erhalten nach 48 und 72 h Inkubation zwei neue Zusätze der Sulfanilamidlosung
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ben aus jeder der Gruppen, um das 32 999 RP festzustellen. Diese Behandlung wird bewirkt, indem in jeden Kolben 4 g Oxalsäure (was den PH-Wert der Brühe auf 1, 5 bringt) und 50 cm3 absolutes Äthanol zugesetzt wird. Der dieses Gemisch enthaltende Kolben wird hermetisch verschlossen und 1 h lang auf einen mit 220 Umdr/min bewegten Tisch gegeben. Die Mischung wird dann über Papier filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 500C bis auf die Hälfte seines Anfangsvolumens (50 cm3) destilliert. Das Konzentrat
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wiederholt die Behandlung bei den wässerigen Mutterlaugen, welche mit 50 cm3 desselben Lösungsmittelgemisches ausgeschüttelt werden.
Die organischenphasen werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Volumen der organischen Phase wird schliesslich durch Zugabe desselben Lösungsmittelgemisches auf 100 cm3 eingestellt.
Um die Erzeugung von 32 999 RP zu bestimmen, unterwirft man diese Extrakte der DünnschichtChromatographie.
1. Die Erzeugung wird qualitativ ausgewertet, indem auf Silicagelplatten (Merck 60 - Glasunterlage
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gegeben werden. Die Platten werden mit einem Gemisch : Methylenchlorid-Äthanol-Essigsäure-Wasser (80-20-10-4 in Vol. ) entwickelt. Die eventuell vorhandene Anwesenheit von 32 999 RP in den Extrakten wird nach dem Entwickeln ersichtlich, indem die Chromatogramme entweder am Tageslicht oder an ultraviolettem Licht bei 254 nm geprüft werden.
2. Die Erzeugung von 32 999 RP wird quantitativ bestimmt, indem auf Silicagelplatten (Merck60 F 254 - Glasträger mit Fluoreszenzindikator) Volumina von Extrakten, die nach der qualitativen Chromatographie bestimmt wurden, zwischen 10 und 100 J. gegeben werden. Man gibt auch auf diese Platten eine Reihe (0, 5 bis 1, 5 jug) von reinen 32 999 RP-Proben. Die Platten werden mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Nach dem Entwickeln werden diese Platten auf den Plattenleser "Chromoscan" gegeben, der die Pics entsprechend dem in den Extrakten enthaltenen 32 999 RP registriert. Man rechnet die Flächen dieser Pies aus und diejenigen der entsprechenden aus den Proben von reinem 32 999 RP und man bestimmt so die Erzeugung von 32 999 RP dieser Kulturen.
Bei den mit dem Sulfanilamid behandelten Kulturen erhielt man durch diese Bestimmungsmethode die folgenden Ergebnisse :
<Desc/Clms Page number 14>
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfanilamid <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Ai <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> A2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> Ag <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> M <SEP>
<tb> A4 <SEP> 0,6 <SEP> 42
<tb> A5 <SEP> 0,8 <SEP> 33
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> (0, <SEP> 2x3) <SEP> 50 <SEP>
<tb>
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mit dem in Beispiel 1 beschriebenen identisch ist.
Man stellt auch eine Sulfanilamidlösung mit 10 mg/cm3 unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen her.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen A, A', A und At von je zwei Kolben aufgeteilt und man gibt in jeden Kolben der :
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(NRRL 3046), die 72 h alt ist, die Gruppen A1' und A5' mit 2,5 cm3/Kolben einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 31723 (NRRL 3045), die 72 h alt ist.
Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegten Tisch in einem Raum von 260C entwickelt.
Die 7 Tage unter diesen Bedingungen bebrüteten Kolben werden dann wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt, um das 32 999 RP festzustellen.
Es wurden folgende Produktionen erhalten :
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<tb>
<tb> Proben <SEP> Sulfanilamid <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (in <SEP> mg/l)
<tb> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> DS <SEP> 8899 <SEP> DS <SEP> 31723 <SEP>
<tb> A <SEP> A'0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A, <SEP> A'0, <SEP> 8 <SEP> 17 <SEP> 25
<tb> 5 <SEP>
<tb>
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mit dem in Beispiel 1 beschriebenen identisch ist.
Man bereitet ebenfalls eine Sulfanilamidlösung mit 10 mg/cm3 unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen zu je zwei Kolben aufgeteilt und man gibt in jeden Kolben :
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<tb>
<tb> Gruppe <SEP> Sulfanilamid <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Al <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A2 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 36
<tb> Ag <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 28
<tb> A4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 13 <SEP>
<tb>
Beispiel 4 :
Man stellt ein Züchtungsmedium B mit folgender Zusammensetzung her :
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<tb>
<tb> Sojamehl <SEP> 30 <SEP> g
<tb> distillers'solubles <SEP> 5 <SEP> g
<tb> teilweise <SEP> hydrolysierte <SEP> Stärke <SEP> 5 <SEP> g
<tb> ("Fox <SEP> head") <SEP>
<tb> Sojaöl <SEP> 27, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> (d <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 92) <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Destilliertes <SEP> Wasser <SEP> 1000 <SEP> cm3
<tb>
Dieses Medium, dessen pH-Wert durch Zugabe von n-Natronlauge auf 7, 20 eingestellt ist, wird in 300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben aufgeteilt und während 20 min bei 1220C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen beträgt der pH-Wert 6,60.
Man stellt eine wässerige Sulfanilamidlösung her, die mit der im Beispiel 1 beschriebenen identisch ist.
Die das sterile Medium B enthaltenden Kolben werden in zwei Gruppen B, und B2 mit je zwei Kolben eingeteilt. Die Kolben der Gruppe Bi erhalten keinen weiteren Zusatz. Zu jedem Kolben der Gruppe B2 gibt man 2 cm3 der Sulfanilamidlösung (0, 4 g/l). Nach diesen Zugaben beimpft man alle Kolben der Gruppen B und B2 mit 2,5 cm3 einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045), die 72 h alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegten Tisch in einem Raum von 260C entwickelt. Die unter diesen Bedingungen 7 Tage lang inkubierten Kolben werden wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, um den Gehalt an 32 999 RP festzustellen.
Es wurden die folgenden Produktionen erhalten :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfanilamid <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> B1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> B2 <SEP> 0,4 <SEP> 7
<tb>
EMI15.4
300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt weiterhin eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/cm3 unter den in Beispiel 1 für die Herstellung der Sulfanilamidlösung beschriebenen Bedingungen her.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen mit je zwei Kolben eingeteilt, und man macht bei jedem Kolben folgenden Zusatz :
Gruppe A : 0, 25 cm3 der Sulfathiazollösung (0,05 g/l)
Gruppe A : 1 cm3 der Sulfathiazollösung (0, 2 g/l)
Gruppe A 9 : 0, 5 cm3 der Sulfathiazollösung (0, 1 g/l)
Die Kolben der Gruppe A erhalten keinen Zusatz.
Man beimpft dann jeden Kolben der Gruppen A, A, A und A mit 2, 5 cm3 einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098), die 72 h alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegten Tisch in einem Raum von 260C entwickelt. Die Kolben der Gruppe A9 erhalten nach 48 und 72 h Inkubation zwei neue Zugaben von 0, 5 cm3 der Sulfathiazollosung (Gesamtkonzentration an
<Desc/Clms Page number 16>
Sulfathiazol 0,3 g/l). Nach jeder dieser Zugaben wird die Bebrütung der Kolben unter denselben Rühr- und Temperaturbedingungen wiederaufgenommen.
Die während 7 Tagen bebrüteten Kolben werden dann zur Bestimmung des 32 999 RP wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfathiazol <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> A1 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A7 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0
<tb> A8 <SEP> 0,2 <SEP> 51
<tb> A9 <SEP> 0,3 <SEP> (0,1x3) <SEP> 64
<tb>
Beispiel 6 : Man verteilt ein Medium A, das mit dem im Beispiel 1 beschriebenen identisch ist, auf 300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt ferner unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/cm3 her.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen zu je zwei Kolben eingeteilt. Die Kolben der Gruppen Ai erhalten keinen weiteren Zusatz. In jeden der andern Kolben werdenfolgende Zusätze gegeben :
Gruppe A10 : 0, 5 cm3 der Sulfathiazollösung (0, 1 g/l)
Gruppe Al1 : 2 cm3 der Sulfathiazollösung (0,4 g/l)
Gruppe AI2: 2,5 cm3 der Sulfathiazollösung (0, 5 g/l)
Nach diesen Zugaben beimpft man alle Kolben der Gruppen A1,A10,A11 und A mit 2,5 cm3 einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045), die 72 h alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegten Tisch in einem Raum von 260C entwickelt.
Die unter diesen Bedingungen während 7 Tagen inkubierten Kolben werden wie im Beispiel 1 beschrieben zur Feststellung des 32 999 RP behandelt. Es wurden die folgenden Produktionen erhalten :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfathiazol <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Ai <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> A10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 9
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 13
<tb>
Beispiel 7 : Man verteilt ein Medium A, das mit dem im Beispiel 1 beschriebenen identisch ist, auf 300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt ferner unter den im Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen eine Sulfathiazollösung mit 10 mg/cm3 her.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt bei jedem Kolben die folgenden Zusätze :
Gruppe A : 0, 5 cm3 der Sulfathiazollösung (0, 1 g/l)
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Die Kolben der Gruppe A erhalten keinen Zusatz.
Nach den Zugaben beimpft man jeden Kolben der Gruppen ,A , A und A11 mit 2, 5 cm3 einer Impfkultur von Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539), die 72 h alt ist. Die Kulturen werden auf einem mit 220 Umdr/min bewegten Tisch in einem Raum von 260C entwickelt.
Die unter diesen Bedingungen während 7 Tagen inkubierten Kolben werden zur Bestimmung von 32 999 RP wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Es wurden folgende Produktionen erhalten :
<Desc/Clms Page number 17>
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfathiazol <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Ai <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A10 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 18
<tb> Ag <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 22
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 5
<tb>
Beispiel 8 : Man stellt ein Kulturmedium C her, enthaltend :
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<tb>
<tb> Bohnenkörner <SEP> 40 <SEP> g
<tb> distiller's <SEP> solubles <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> 15 <SEP> g
<tb> Sojaöl <SEP> 18, <SEP> 5 <SEP> g
<tb> (d <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 92) <SEP>
<tb> Kobaltchlorid-hexahydrat <SEP> 0, <SEP> 02g <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfathiazol <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> C <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> C2 <SEP> 0,1 <SEP> 16
<tb>
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300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt ferner eine Sulfapyridazinlösung mit 10 mg/cm3 her, indem das Produkt in einem Gemisch aus destilliertem Wasser und 5 n Salzsäure gelöst wird. Die Lösung, deren PH-Wert 2, 0 beträgt, wird durch Filtrieren über eine Membran "Millipore 0,45 " sterilisiert.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in drei Gruppen zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt unter sterilen Bedingungen in jeden Kolben den folgenden Zusatz :
Gruppe A 13 : 0, 5 cm3 der Sulfapyridazinlösung (0, 1 g/l)
Gruppe A : 1 cm3 der Sulfapyridazinlösung (0, 2 g/l)
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Die Kolben der Gruppe Ai erhalten keinen Zusatz.
Dann beimpft man jeden Kolben der Gruppen A1, A13 und A14 mit 2,5 cm3 einer Impfkultur von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098), die 72 h alt ist.
Die Kulturen werden unter Rühren unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen während 7 Tagen bebrütet. Die unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen ausgeführten Bestimmungen ergeben die folgenden Resultate :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Sulfapyridazin <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Al <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> A13 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 38
<tb> A14 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 32
<tb>
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300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt ferner eine Amethopterinlösung mit 20 mg/cm3 her, indem das Produkt in einer Mischung aus destilliertem Wasser und 5 n Natronlauge gelöst wird. Die Lösung, deren pH-Wert 10, 0 beträgt, wird
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"Millipore 0,45 Il " sterilisiert.während 7 Tagen unter Rühren unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen inkubiert.
Die Ergebnisse der Bestimmung von 32 999 RP, ausgeführt unter den üblichen Bedingungen, sind die folgenden :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Amethopterin <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Ai <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Als <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 11
<tb> A <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Beispiel 11 : Man verteilt ein Medium das mit dem im Beispiel 1 beschriebenen identisch ist, auf 300 cm3 Kolben in einer Menge von 50 cm3/Kolben.
Man stellt ferner eine Barbitallösung mit 50 mg/cm3 her, indem das Produkt in einem Gemisch aus destilliertem Wasser und 5 n Natronlauge gelöst wird. Die Lösung, deren pH-Wert 11, 0 beträgt, wird durch Filtrieren über eine Membran "Millipore 0,45 " sterilisiert.
Die das sterile Medium A enthaltenden Kolben werden in vier Gruppen A, A16, A19 und A20 zu je zwei Kolben eingeteilt, und man bewirkt bei jedem Kolben der Gruppen Ai8 und A19 die folgenden Zusätze :
Gruppe A18: 0,5 cm3 der Barbita11ösung (0, 5 g/l)
Gruppe A19: 2 cm3 der Barbitallösung (2 g/l)
Die Kolben der Gruppe A erhalten keinen Zusatz und die Kolben der Gruppe A erhalten unter den weiter unten angegebenen Bedingungen einen Zusatz im Verlaufe der Züchtung.
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Nach 7tägiger Inkubation werden die Kolben unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen behandelt.
Es werden folgende Ergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Barbital <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Ai <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> A18 <SEP> 0,5 <SEP> 11
<tb> 18
<tb> A <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP>
<tb>
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Inkubation von 9 Tagen durchgeführt wird, so erhält man die folgenden Resultate :
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<tb>
<tb> Gruppen <SEP> Adjuvantien <SEP> (g/l) <SEP> 32 <SEP> 999 <SEP> RP <SEP> (mg/l)
<tb> Al <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> A <SEP> Phenobarbital <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 9
<tb> A22 <SEP> Butobarbital <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 12
<tb> A23 <SEP> Penthiobarbital <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 12
<tb> A24 <SEP> Penthiobarbital <SEP> 2 <SEP> 22
<tb>
Beispiel 12 : a) Fermentation Man gibt in ein Fermentationsgefäss von 75 1:
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<tb>
<tb> Sojamehl <SEP> 1500 <SEP> g
<tb> distiller's <SEP> solubles <SEP> 250 <SEP> g
<tb> teilweise <SEP> hydrolysierte <SEP> Stärke <SEP> 1750 <SEP> g
<tb> Sojaöl <SEP> 750 <SEP> cm3
<tb> Natriumchlorid <SEP> 500 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> auffüllen <SEP> auf <SEP> 451
<tb>
Der pH-Wert wird durch Zugabe von 40 cm310 n Natronlauge auf 7, 50 eingestellt. Man sterilisiert das Medium durch Durchlaufen von Dampf von 1220C während 40 min. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon auf Grund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 50 I ; der pH-Wert beträgt 6, 70. Man beimpft dann mit 200 cm3 einer Kultur im bewegten Erlenmeyer-Kolben von Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098).
Die Kultur wird während 25 h bei 300C entwickelt, wobei gerührt und mit steriler Luft belüftet wird ; sie ist dann zum Animpfen der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wird in einem Fermentationsgefäss von 800 1, das mit den folgenden Substanzen beschickt ist, durchgeführt :
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<tb>
<tb> Sojamehl <SEP> 3, <SEP> 2 <SEP> kg <SEP>
<tb> Bäckerhefe-Paste <SEP> 24 <SEP> kg
<tb> Lactose <SEP> 23, <SEP> 2 <SEP> kg <SEP>
<tb> Natriumchlorid <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> kg <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 20>
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<tb>
<tb> Monokaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> kg
<tb> Magnesiumsulfat-heptahydrat <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> kg
<tb> Eisen-lI <SEP> - <SEP> sulfat- <SEP> heptahydr <SEP> at <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP> kg
<tb> Zinksulfat-heptahydrat <SEP> 0,04 <SEP> kg
<tb> Antischaummittel <SEP> 30 <SEP> cm3
<tb> Leitungswasser <SEP> auffüllen <SEP> auf <SEP> 200 <SEP> l
<tb>
Nach dem Einstellen des pH-Werts auf 6,
50 durch Zugabe von 210 cm3 10 n Natronlauge gibt man zu :
Glycerin 7, 6 kg
Calciumcarbonat 0, 800 kg
Leitungswasser auffüllen auf 360 l
Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 6, 45. Man sterilisiert die Bouillon durchDurchperlenvonDampf bei 1220C während 40 min ; nach dem Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon auf Grund der Kondensation des Dampfes im Verlaufe der Sterilisation 400 l ; der pH-Wert des Mediums beträgt 6, 25.
Man gibt dann 10 l einer wässerigen sterilen Lösung zu, welche 308 g Sulfanilamid enthält.
Der PH-Wert der Bouillon wird 6, 80. Man beimpft mit 401 der oben beschriebenen Impfkultur aus dem
75 l Fermentationsgefäss. Die Kultur wird unter Rühren mit einer Turbine mit 205 Umdr/min und unter Be- lüften mit steriler Luft von 20 m3/h bei 270C gehalten. Nach 24 h Züchtung gibt man 3 1 wässerige sterile
Lösung mit :
Sulfanilamid 44 g zu und setzt die Fermentation fort. Nach 140 h Züchtung beträgt der pH-Wert der Brühe 6, 75 und ihr Volumen 350 l ; der Gehalt der Brühe an 32 999 RP beträgt 35 mg/l. b) Extraktion
Zu 3501 Brühe, die wie vorstehend erhalten wurde, gibt man 350 l Methanol und 6 n Natronlauge, um den pH-Wert auf 7, 5 zu bringen. Man rührt während 1 h.
Nach Zugabe von 25 kg Filterhilfe wird die Suspension auf einer Filterpresse filtriert. Man sammelt das Filtrat. Der Filterkuchen wird mit 100 l wässerigem 50% igem Methanol gewaschen. Das Filtrat und die Waschwässer werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 2501 eingeengt. Nach dem Alkalischmachen durch Zugabe von 220 cm3 6 n Natronlauge wird das in diesem Konzentrat enthaltene Antibiotikum zweimal mit 150 l eines Gemisches aus Methylenchlorid/Butanol (80 - 20 in Volumina) extrahiert. Die 238 1 der vereinigten organischen Extrakte werden unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 301 eingeengt.
Man gibt dann zu dem Konzentrat 100 cm3 n-Butanol, das mit 11n Salzsäure gesättigt ist, zu. Nach dem Einengen bis auf ein Volumen von 3 l gibt man die Lösung langsam in 211 Hexan. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 137 g rohes 32 999 RP-Hydrochlorid. c) Reinigung
1. 112 g rohes 32 999 RP-Hydrochlorid, das wie vorstehend angegeben erhalten wurde, werden in 11 Wasser von 500C in Lösung gebracht. Die Lösung, deren pH-Wert 2, 9 beträgt, wird auf einer Glasfritte filtriert. Die in dem Filtrat enthaltenen gefärbten Verunreinigungen werden mit zweimal 500 cm3 und dann einmal 11 Chloroform extrahiert. Nach Zugabe von 75 g Natriumchlorid zu der wässerigen Phase extrahiert man das Antibiotikum mit dreimal 0, 5 I n-Butanol.
Der pH-Wert der wässerigen Phase wird durch Zugabe von konz. Natronlauge auf 9, 5 eingestellt, und das verbleibende Antibiotikum wird mit 0, 5 l n-Butanol extrahiert.
Die das Antibiotikum enthaltenden Butanolextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis auf ein Volumen von 11 eingeengt. Man gibt dann 11 Chloroform zu diesem Konzentrat. Die Lösung wird mit zweimal 500 cm3 Wasser, das auf PH 9, 5 alkalisch gemacht wurde, gewaschen. Die Waschwässer werden mit zweimal 500 cm3 eines Gemisches aus Chloroform/n-Butanol (80 - 20 in Volumina) bei PH 9, 5 extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Während des Einengens gibt man 300 cm3 eines Gemisches n-Butanol/Wasser/11 n Salzsäure (94 - 5 - 1 in Volumina) zu. Das Einengen wird bis zur Erzielung eines Volumens von 150 cm3 fortgesetzt, und dann wird die Lösung langsam zu 2 l Hexan gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet.
Man erhält so 30 g eines Produktes, das 32 999 RP-Hydrochlorid enthält.
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2.13 g des so erhaltenen Produktes werden in 26 cm3 eines Gemisches Wasser/Dioxan (20 - 80 in Volumina) bei 350C in Lösung gebracht. Das Antibiotikum kristallisiert durch langsame Zugabe von 624 cm3 Dioxan. Nach 3 stündigem Rühren werden die Kristalle abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2 g eines kristallisierten Produktes, das 32 999 RP-Hydrochlorid enthält.
3. 4, 47 g eines wie oben beschrieben erhaltenen kristallisierten Produktes werden in 40 cm3 Wasser in Lösung gebracht Die Lösung wird filtriert. Das in dem Filtrat enthaltene Hydrochlorid des Antibiotikum 32 999 RP kristallisiert durch Zugabe von 405 cm3 Aceton unter Rühren. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2, 47 g eines Produktes, das kristallisiertes 32 999 RPHydrochlorid enthält.
4. 2, 84 g des wie oben beschrieben erhaltenen Produktes werden in 28, 4 cm3 eines Gemisches Metha- nol/Aceton (50 - 50 in Volumina) in Lösung gebracht. Man gibt zu der Lösung 16, 9 cm3 eines Gemisches aus Aceton/Wasser (84 - 16 in Volumina). Durch Erwärmen auf 300C und dann Abkühlen kristallisiert das 32 999 RP-Hydrochlorid. Die erhaltenen Kristalle werden abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 2, 33 g halbgereinigtes Hydrochlorid von kristallisiertem 32 999 RP.
5. 1, 85 g des wie oben beschrieben erhaltenen halbgereinigten Hydrochlorids werden in 400 cm3 Wasser bei PH 5, 5 in Lösung gebracht. Gefärbte Verunreinigungen werden aus dieser Lösung mit zehnmal 400 cm3
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und getrocknet. Man erhält so 1, 4 g reines 32 999 RP-Hydrochlorid.
Beispiel 13 : 0, 5g reines 32 999 RP-Hydrochlorid wirdhydrolysiert durch Lösen in 50 cm3 Wasser, das mit 10 cm3 11 n Salzsäure versetzt ist, und Erhitzen während 2 h zum Sieden. Während der Hydrolyse bildet sich ein kristalliner Niederschlag von Aglycon. Der Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält so 0, 3 g reines Aglycon.