DE1809187B2 - Verfahren zur mikrobiologischen herstellung von daunorubicin - Google Patents

Description

Ώ'κ vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung des mit der Nummer 13 057 R. P. bezeichneten Antibioticums, das den Namen Daunorubicin erhalten hat (früher: Rubidomycin).

In der belgischen Patentschrift 6 32 391 sind das mit der Nummer 9865 R. P. bezeichnete Antibioticum, seine drei Hauptbestandteile, die mit den Nummern 13 213 R. P., 13 057 R. P. (oder Daunorubicin) und 13 330 R. P. bezeichnet sind, das mit der Nummer 13 567 R. P. bezeichnete Aglykon des 9865 R. P., die Herstellung des Antibioticums 9865 R. P. durch Züchtung von »Streptomyces 8899« oder »Streptomyces 31 723« im geeigneten Medium und die Trennung des Antibioticums 9865 R. P. in seine Bestandteile beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Daunorubicin durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der im folgenden vollständiger identifiziert wird, dem Genus Streptomyces angehört, mit »Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, Stamm D. S. 32 041« bezeichnet wird und aus einer in Indien in Bengalen entnommenen Erdprobe erhalten wurde, unter aeroben Bedingungen.

Eine Probe dieses Stamms wurde in United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois (USA) unter der Nummer NRRL 3383 hinterlegt. Proben dieses Mikroorganismus können von diesem Laboratorium unter Bezugnahme auf die vorliegende Erfindung erhalten werden.

Dieser neue Stamm weist Hauptcharakteristiken auf, die den Sch'dß erlauben, daß er zu der Reihe S. griseus von S. A. Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, S. A. W a k s m a n, the Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 133—143) gehört. Er ist durch seine Charakteristiken der für diese Reihe repräsentativen Species Streptomyces griseus Waksman und Henrici, die Streptomycin produziert und die in »Bergeys Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 791) beschriebene Species darstellt, sehr ähnlich, unterscheidet sich jedoch von dieser wesentlich dadurch, daß er kein Streptomycin produziert, sondern dagegen ein sehr charakteristisches intensives und häufig reichliches rotes lösliches Pigment, das im allgemeinen in Beziehung zu einer antibiotischen Aktivität steht. Durch die Gesamtheit seiner anderen Charakteristiken nähert er sich jedoch so an diese Spezies, daß er als eine Varietät von dieser angesehen werden kann und den Namen Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, Stamm D. S. 32 941, erhalten hat.

S S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm D. S. 32041, erzeugt kein Melaninpigment auf organischen Medien. Er bildet gerade oder schwach gebogene Sporophoren, die isoliert angegliedert sind oder einige Verzweigungen in Büscheln aufweisen. Seine Sporen sind

ίο oval bis zylindrisch mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7 μ/0,8 bis 1,2 μ. Sein reichliches sporuliertes luftausgesetztes Mycel, das pulvrig aussieht und eine hellgraugelbgrih Jiche Farbe hat, weist das charakteristische Aussehen von demjenigen eines Stammes von Streptomyces griseus auf. Gewisse Zonen dieses luftausgesetzten Mycels nehmen häufig eine rosa Farbe an, wenn das rote lösliche Pigment gebildet wird und das darunterliegende Medium färbt.

In der nachfolgenden Tabelle sind die Züchtungseigenschaften und biochemischen Eigenschaften des S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm D.S. 32 041, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Stämmen von Strepto-

»5 myces verwendeten Agar-Nährmedien und Nährbouillons angegeben. Ohne besondere genaue Angaben betreffen sie Kulturen von etwa zwei Wochen bei 25⁰C, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Kulturmedien wurde nach den in »The Actinomycetes« (S. A Waksman, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950, S. 193—197) angegebenen Rezepturen hergestellt. In diesem Falle sind sie mit dem Buchstaben W bezeichnet, dem die Nummer, die ihnen in »The Actionmycetes« gegeben ist, folgt.

Die Anmerkungen oder Zusammensetzungen der anderen Züchtungsmedien sind die folgenden:
Anm. A: K. L. Jones, Journal of Bacteriology, 57,142(1949).

Ainn. B: Rezeptur W 23, versetzt mit 2% Agar;
Anm. C: »Hickey und Tresners Agar«, T. G. P r i d h a m u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956— 1957, S. 950;

Anm. D: »Yeast Extract Agar«, T. G. P r i d h a m

u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956—1957, S. 950; Anm. E: »Tomato Paste Oatmeal Agar«, T. G.

P r i d h a m u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956— 195f, S. 950;

Anm. F: W. E. G rundy u. Mitarb., Antibiotics andChem. 2, 401(1952);

Anm. G: »Inorganic Salts — Starch Agar«, T. G. P r i d h a m u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956— 1957, S. 951;

Anm. H: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose ersetzt sind;

Anm. I: entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind;
Anm. J: »Plain gelatin«, hergestellt nach den An gaben des »Manual of Methods for Pure Cultun Study of Bacteria« der Society of American Bacteri olcgists, Geneva, N. Y. H₅₀-IS (Mai 1950);

Anm. K: »Manual of Methods for Pure Cultun Study of Bacteria« der Society of American Bacteri ologists, Geneva, N. Y. I1_6O-19 (Mai 1950);

Anm. L: »Manual of Methods for Pure Cultur Study of Bacteria« der Society of American Bacteri ologists, Geneva, N. Y. II₅<fl8 (Mai 1950);

Anm. M: entspricht der Rezeptur W18, wobei die Saccharose durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist;

Anm-N: handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers angemacht; Anm. P: The Actinomycetes, Band 2, S. 333, Nr. 42, S. A, Wa k s man, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1961);

Anm. Q: H. D. Tresner und F. Danga, 5 Journal of Bacteriology, 76, 239—244 (1958).

Kulturmedium Entwick- Vegetatives Mycel

lungsgrad (v.M.) oder Unterseite der Kultur

α) ο (3)

Luftausgesetzter Teil Lösliches (umfaßt Gesamtheit Pigment von luftausgesetztem Mycel und Sporu/ation)

Beobachtungen und biochemische

(6)

Agar nach Bennett (Anm. A)

gut

Agar nach E m e r- gut
son (Anm. B)

Agar nach
H ί c k e y und
Tresner
(Anm. C)

gut

Agar mit Hefe- gut
extrakt nach P r i d ham (Anm. D)

Agar mit Hafer und gut
Tomate nach
Pri dha m
(Anm. E)

Glucose-Pepton- ziemlich Agar (W-6) gut

Nähragar (W - 5) mittel

Agar mit Calciummalat nach
K rai nsky
(Anm. F)

mäßig

Glucose-Aspara- ziemlich |in-Agar (W - 2) gut

Glycerin-Aspara- gut
gin-Agar (W - 3)

Agar mit Stärke gut
nach P r i d h a m
(Anm. G)

rotes v. M., rote Unterseite

rotes v. ML, rote Unterseite

orangebraune Unterseite

rotes v. M., rotbräunliche Unterseite

hellbraunrote Unterseite

orangerötliche Unterseite

orangerötliche Unterseite

hellbraunrosa Unterseite

hellrote bis hellorange Unterseite

hellorangerote Unterseite

orangerötliche Unterseite hellgraugeibgrünlich bis rosagräulich, mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis blaßrosa, mittelmäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosagräulich mäßig entwickelt

schwachorangerot

schwach-

bräunlich-

orangerot

schwachrötlich- orangebraun

hellgraugelbgrünlich intensiv rot bis rosagräulich, mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich hellrotbraun bis rosagräulich, sehr gut entwickelt

hellgraugelbgrünlich

mäßig entwickelt

weißlich bis hellrosagelb, mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich mit einigen hellrosagräulichen Stellen, sehr mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosa, mäßig entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosa, ziemlich gut entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosagräulich gut entwickelt

schwachbräunlich- orangerötlich

hellorangerötlich

hellrosabräunlich

hellorangerötlich

hellorangebraunrot

hellbraunrötlich

ovale bis zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7μ 0,8 bis 1,2μ gerade oder schwach gebogene isolierte oder in Büscheln auftretende Sporophoren

Löslichmachung von Calciummalat: positiv

Hydrolyse von Stärke: positiv, ovale bis zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7 μ/ 0,8 bis 1,2 μ, gerade oder schwach gebogene isolierte, oder in Büscheln vorliegende Sporophoren

	5	Vegetatives Mycel	09 187	6	Lösliches	Beobachtungen und	Menge nahe der	Nitrit-Reaktion:
	Entwick	(v.M.) oder Unterseite		Pigment	biochemische	Oberfläche bei	positiv
Kulturmedium	lungsgrad	der Kultur	Luftausgesetzter Teil		Eigenschaften	3- oder 4wö-
			(umfaßt Gesamtheit			chiger Kultur
		(3)	von luf!ausgesetztem	(5)	(6)	hellrosa	Nitrit-Reaktion:
	(?)	schwachviolette··	Mycel und SporuJation)	hellviolettrot			positiv
O)	gut	hellrotbräur liehe	(4)
Synthetischer Agar		Unterseite	hellgraugelbgrünlich				Verwertungder Cellu
nach Czapek			bis hellrosa,			keines	lose: positiv, Nitrit-
mit Glucose		hellrotbräunliche	gut entwickelt	rosa			Reaktion: positiv
(Anm. H)	gut	Unterseite
Synthetischer Agar			hellgraugelbgrünlich			sehr hellrosa
nach Czapek			bis hellrosa,				Langsame Peptoni- sation, beginnend
mit Glycerin		dickes end gefal	gut entwickelt	schwach			nach 2 Wochen, fast
(Anm. I)	sehr gut	tetes v. M., rot		rotbräunlich			vollständig in
Züchtung auf			hellgraugelbgrünlich				1 Monat, keine Ko
Kartoffeln (W-27)		weißliche bis gelb	bis rosa, mittel	zögernd, fast	Verflüssigung der Ge		agulation, pH geht
	mittel	bräunliche und	mäßig entwickelt	keines nach	latine ziemlich gut		in 1 Monat von
Reine Gelatine		rosabraune Kolo	weißlich, in Form	2 Wochen,			6,3 auf 7,5.
mit 12% (Anm. J)		nien an der Ober	von Spuren	gelbbräunlich
		fläche der Gelatine		in sehr kleiner
		leichter Schleier,
	mittel	rosa Unterseite
Glucose-Nitrat-			weißlich bis hellrosa,
Bouillon nach			sehr mäßig
Dimmick		von Kolonien ge	entwickelt
(Anm. K)	ziemlich	bildeter Ring mit
Nitrat-Nähr-	gut	rosa Unterseite	weißlich, spärlich
Bouillon (Anm. L)		hellrosa v. M., als	entwickelt
	gut	Schleier auf der
Bouillon nach		Oberfläche der	sehr hellgelbgräu
Czapek mit		Bouillon	lich, mäßig ent
Cellulose (Anm. M)			wickelt auf dem aus
		hellbräunlicher bis roter Ring	der Bouillon heraus
	gut		ragenden Papier
Magermilch (Anm. N)			keiner

Tyrosin-Hefe- mittel

extrakt-Agar zur
Bildung von Melanin (Anm. P)

Agar nach gut

T r e s η e r und
D a η g a (Anm. Q)

schwach orange-

hellbraungelbe

Unterseite

sehr hellgelbgrau,

mittelmäßig

entwickelt

schwach Bildung von MeIa-

bräunlich leicht nin: negativ
rosa

Produktion von
H₈S: negativ

Die Fähigkeit von S. griseus, var. rubidofaciens, Stimm DS 32 041, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode von P r i d h a m und G ο 111 i e b (J. of Bact. 56, 107—114.[1948]) bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren

angegebenen Grundmedium bestimmt, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (N H^)₂SO₄ durch 65 die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

	~> 18 09	187	8	Verwertung
7			positiv
Geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	Geprüfte Si ickstoff quellen	positiv
D-Ribose	positiv	NaNO3	positiv
D-Xylose	positiv	NaNO2	positiv
L-Arabinose	negativ	(NHJ1SO4	positiv
L-Rhamnose	negativ	(NHJ1HPO,	positiv
D-Glucose	positiv	Adenin	negativ
D-Galactose	positiv	Adenosin	positiv
D-Fructose	positiv	Uracil	positiv
D-Mannose	positiv	Harnstoff	positiv
L-Sorbose	negativ	L-Asparagin	negativ
Lactose	langsam und mäßig	Glykokoll	positiv
Maltose	positiv	Sarcosin	positiv
Saccharose	negativ	DL-Alanin	positiv
Trehalose	negativ	DL-Valin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Asparaginsäure	positiv
Raffinose	negativ	L-Glutaminsäure	positiv
Dextrin	positiv	L-Arginin	positiv
Inulin	negativ	L-Lysin	positiv
Stärke	positiv	DL-Serin	negativ
Glykogen	positiv	DL-Threonin	negativ
Glycerin	positiv	DL-Methionin	positiv
Erythrit	negativ	Taurin	positiv
Adonit	negativ	DL-Phenylalanin	positiv
Dulcit	negativ	L-Tyrosir,	positiv
D-Mannit	positiv	DL-Prolin	positiv
D-Sorbit	negativ	L-Hydroxyprolin	negativ
Inosit	negativ	L-Histidin
		Betain

S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32 041, ist von den von S. A. Waksman innerhalb der Reihe der Stämme von S. griseus unterschiedenen Species verschieden, von denen keine bisher beschriebene ein rotes lösliches Pigment bildet, das mit dem von dem Stamm DS 32 041 vergleichbar wäre, und von denen keine eine antibiotische und antitumorale Substanz produziert, die mit Daunorubicin identisch ist (The Actinomycetes, Bd. II, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, S. 140—143).

Es wurde bereite ausgeführt, daß S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32041, der ein rotes lösliches Pigment bildet, von S. griseus Waksman und H e η r i c i verschieden ist. Er ist auch nicht mit S. griseinus Waksman identisch, der Grisein produziert Von diesen bekannten Stämmen bildet weder der eine noch der andere charakteristische lösliche Pigmente in ihren Kulturen mit Ausnahme gewisser Streptomycin erzeugender Stämme von S. griseus, die ein grünes lösliches Pigment in Medien mit Calcmmmalat baden, eine Eigenschaft, die S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm DS 32 041 nicht besitzt. Ebenso ist dieser Stamm von Streptomyces coehvolor (Müller) verschieden, der Candicidin und ΐίο blaues lösliches Pigment produziert, sowie von Streptomyces Californicus Waksman und Curtis, der Viromycin produziert und auf gewesen Medien eine rosa bis purpurne Mycdptgnwntierung auf Grund endoceHuülren Pigmente aufweist, das nicht in das Züchtungsmedium diffundiert, jedoch kein rotes lösliches Pigment bildet. Schließlich unterscheidet er sich auch von Streptomyces chrysomallus (Lindenbein) Waksman, der Actinomycin produziert und em goldgelbes lösliches Pigment, jedoch niemals ein rotes lösliches Pigment bildet.

Nach den Begriffen von S. A. Waksman, könnte der Stamm DS 32 041 möglicherweise auch als eine neue Species angesehen werden.

Auf Grund der Hauptunterschiede zwischen dem Stamm DS 32 041 und der Species S. griseus, die nur auf der Produktion des antibiotischen löslichen Pigmente beruhen, kann man den Stamm Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, DS 32041 Mr eine Varietät der bereite von S. A. Waksman beschriebenen Species S. griseus und nicht für eine andere Species halten.

Das Verfahren zur Herstellung des Daunorubicins besteht im wesentlichen darin, Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, Stamm DS 32041 auf geeigneten Medien und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, DS 32 041, ergibt hauptsächlich Daanorubicin, jedoch auch die anderen Bestandteile 13 213

C₅ R. P. und 13 330 R. P. des Antibioticums 9865 R. P„ die von dem Daunorubicin im Verlaufe der Extraktions- und Reinigungsarbeitsgänge abgetrennt werden gegebenenfalls iroliert werden können. Das

9 10

Hauptziel der vorliegenden Erfindung liegt jedoch in Zu Beginn der Züchtung sollte der pH-Wert des

der Herstellung von Daunorubicin. Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vorzugs-

Die Züchtung von Streptomyces griseus, var. rubi- weise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermen-

dofaciens, DS 32 041 kann nach jeder aeroben Ober- tation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C,

flächen- oder Submerszüchtungsmethode durch- 5 doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und

geführt werden, doch ist diese letztere aus Gründen 33⁰C eine zufriedenstellende Produktion erhalten,

der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten

zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, Werten variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß

die in der Fermentationstechnilc üblicherweise ver- Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je Liter Bouillon

wendet werden. ¹⁰ und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale

Man kann insbesondere den folgenden Gang für Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8tägiger

die Durchführung der Arbeitsgänge wählen: Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Streptomyces (NRRL 3383) — Stammansatz Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, daß

I 15 die zur Produktion von Daunorubicin angewendeten

, allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Strepto-

Kultur aul Agar _{myces griseuS) var} rubidofaciens, DS 32 041 in

I ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen

Kultur im Kolben unter Bewegung Erfordernis angepaßt werden können.

j 2o Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsimpfkultur im Fermenter maischen nach verschiedenen Methoden isoliert

^r werden.

ν Man kann die Fermentationsmaische bei einem

Produktionskultur im Fermenter pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen

25 Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen Filtrat. Nach Waschen mit Wasser enthält der Filtereine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimi- kuchen praktisch keine Aktivität mehr. Es ist vorteillierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenen- haft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium durchfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese zuführen, insbesondere unter Ansäuern auf einen Bestandteile in Form von gut definierten Produkten 30 pH-Wert zwischen 1,5 und 2 mittels Oxalsäure. Es oder von komplexen Gemischen, wie man sie in ist auch möglich, die Filtration bei einem pH-Wert biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs an- zwischen 2 und 7, vorzugsweise in der Nähe von 2. trifft, zugeführt werden können. in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohols mit 1

Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man bis 3 Kohlenstoffatomen durchzuführen.
Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, 35 Bei den obengenannten Extraktionsarbeitsgängen Dextrine, Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wird das Daunorubicin in wäßriger oder wäßrigwie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Mannit alkoholischer Lösung erhalten. Anschließend führt u. dgl., oder gewisse organische Säuren, z. B. Milch- man es durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht säure, Citronensäure u. dgl., verwenden. Gewisse mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielstierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise 40 weise Butanol, Methylisobutylketon, Äthylacetat oder Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Chloroform, bei einem pH-Wert zwischen 5,5 und 9. Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen vorzugsweise bei einem pH-Wert in der Nähe von beigefügt werden. 7,5, in eine organische Lösung über. Gegebenenfalls

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen führt man vor dieser Extraktion eine Behandlung sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können 45 mit einem Ionenaustauscherharz durch. In diesem sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Falle wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert Nitrate, anorganische oder organische Ammonium- in der Nähe von 4 eingestellt und anschließend mit salze, Harnstoff und Aminosäuren, sein. Sie können einem Kationenaustauscherharz behandelt. Das Dauauch in Form von komplexen Substanzen, die Stick- norubicin wird vorzugsweise mit Methanol, das 10°ό stoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, 50 Wasser und 1% Natriumchlorid enthält, eluiert. zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Das Eluat wird dann zur Entfernung des Alkohols Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydro- eingeengt und anschließend wie oben extrahiert, lysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fischmehlen, Man kann die Fermentationsmaische auch einer

Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers solubles Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren und Maisquellwasser. 55 organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol,

Unter den zugeführten mineralischen Stoffen können Äthylacetat oder Chloroform, bei einem pH-Wert gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise bei einem pH-Wert Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- in der Nähe von 7,5, unterziehen. In diesem Falle oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- und Ma- geht die gesamte Aktivität in die organische Phase, gnesiumcarbonate. ⁶«> die von der wäßrigen Phase nach üblichen Verfahren

Andere bewirken das zur Entwicklung des Strepto- abgetrennt wird.

myces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041 und zur Welche Extraktionsart auch gewählt wirH, wird

Bildung des Antibioticums erforderliche lonengleich- das Daunorubicin schließlich in organischer Lösung gewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalka'.i- erhalten. Es kann in diesem Stadium vorteilhaft sein, sulfate und -chloride. Schließlich wirken gewisse in 65 eine Reinigung durchzuführen, indem man das Antispeziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechsel- bioticutn nacheinander in wäßrige Lösung und dann reaktionen des Streptomyces DS 32041. Es sind dies in organische Lösung durch Modifikation des pH-die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze. Werts überführt. Das rohe Antibioticum kann an-

schließend aus der zuletzt erhaltenen organischen Lösung durch Einengen oder Ausfällen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden. Eine besonders vorteilhafte Isolierungsmethode besteht darin, die organische Lösung auf einen pH-Wert in der Nähe von 4 anzusäuern, vorzugsweise mit Hilfe von Essigsäure, und dann unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen einzuengen. Die Zugabe eines schlechten Lösungsmittels für das Daunorubicin, wie beispielsweise Hexan, zu dem erhaltenen Konzentral bewirkt dann die Ausfällung des rohen Antibioticum«.

Um reineres Daunorubicin zu erhalten, kann man die üblichen Methoden anwenden, wie beispielsweise die Chromatographie an verschiedene Adsorbentien, die Gegenstromverleilung oder die Verteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln.

Das Daunorubicin kann auch in ein Additionssalz mit Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, übergeführt werden. Diese Salze können durch Anwendung üblicher Methoden gereinigt werden.

Das nach diesem neuen Verfahren erhaltene Daunorubicin und seine Salze weisen Eigenschaften auf, die mit denjenigen des Antibioticums 13 057 R. P. und seinen Salzen, die in der belgischen Patentschrift 6 32 391 beschrieben sind, identisch sind.

Es sind zwar schon aus dem deutschen Patent 12 15 863 und aus dem britischen Patent 1003 383 Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin bekannt, jedoch ist das erfindungsgemäße Verfahren den bekannten Verfahren in überraschender Weise überlegen, da man ausgehend von gleichen Volumina Fermentationsmaische nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine weitaus bessere Ausbeute an Daunorubicin erhält als nach den bekannten Verfahren. So werden aus 100 I Fermentationsmaische nach dem Verfahren des deutschen Patents 12 15 863 0,240 g Daunorubicin-hydrochlorid, nach dem Verfahren des britischen Patents 10 03 383 1,25 g Daunorubicinhydrochlorid und nach dem erfinclungsgemäßen Verfahren 1,89 g Daunorubicin-hydrochlorid erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

In einen 170-!-F_-rmenier bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Sojamehl 3.600 kg

•Distillers solubles« 0,600 kg

Stärke 4,200 kg

Sojaöl 1.800!

Natriumchlorid 1,200 kg Leitungswasser ad 1101

Nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,45 mit 120ccm konzentrierter 1 On-Natronlauge sterilisiert man das Medium bei 122'C durch 40minüttge* Durchleiten von Dampf. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 6.80. Man beimpft dann mi« 200 ecm einer gerührten bzw geschüttelten Erlenmeyer-Kultur des Stamme« Strcptomyces griseus, var. rubidofaciens, DS 32 041 Drc Kultur wird 35 Stunden unter Bewegen und unter Belüften mit steriler Luft bei 30⁰C entwickelt. Sie ist dann zur Bcimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 800 t-Ferinenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Sojamehl 12 kg

»Distillers solubles« 2 kg

Starke 2 kg

Sojaöl 121

Natriumchlorid 4 kg

Leitungswasser ad 370 I

Nach Einstellen des pH-Wertes auf 7,50 mit 25Occm konzentrierter lOn-Nalronlauge sterilisiert man das Medium bei 122°C durch 40minütiges Durchleiten von Dampf. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 400 I und der pH-Wert 6,80. Man beimpft dann mit 401 der obigen Kultur aus dem 170-l-Fermenter. Die Züchtung wird 161 Stunden unter Bewegen mit Hilfe eines mit 250 UpM betriebenen Turbinenrührers und unter Belüften mit

ϊο steriler Luft in einer Menge von 25 m^a je Stunde bei 30''C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7,0 und das Volumen der Maische 350 I. Die in dem Medium vorhandene Menge an Daunorubicin beträgt 34 μg/ccm.

Beispiel 2

1001 der während der im Beispiel 1 beschriebenen Fermentation erhaltenen Fermentationsmaische werden in einen mit einer Vorrichtung zum Bewegen und einer Dampfheizschlange ausgestatteten Bottich gebracht. Man setzt 3 kg Oxalsäure zu und erhitzt die Masse auf 50⁰C. Qas Bewegen und die Temperatur werden eine Stunde aufrechterhalten. Nach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer Filterpresse

3.^r nach Zugabe von 4 kg Filierhilfe filtriert. Der Filterkuchen wird auf dem Filter mit 1101 Wasser gewaschen. Das Fikrat, dessen Volumen 190 I beträgt, wird auf 4 5°C abgekühlt und der pH-Wert mit 10%iger Natronlauge auf 4,5 eingestellt.

Das Filtrat wird in eine Säule, die 4 I Amberlite IRC₅₀ im sauren Zyklus enthält, so geleilet, daß es das Harzbett von oben nach unten mii einer Rate von 15 1 je Stunde durchströmt. Die Säule wird anschließend mit 15 1 Wasser, das in dem gleichen Richtungssinn wie das Filtrat und in der gleichen Rate zugeführt wird, dann mit 25 I Methanol mit einem Gehalt von 50% Wasser mit einer Rate von 151 je Stunde in einem Zuführungssinn von unten nach oben und dann, ebenfalls mit der gleichen Rate

so von unten nach oben mit SOI Methanol mit einem Gehalt von 10% Wasser gewaschen.

Der Abfluß und die Waschflüseigkeiten werden verworfen, und die Säule wird mit einer von oben nach unten durch das Harz strömenden Lösung der

5. folgenden Zusammensetzung eluiert:

Natriumchlorid 10 g

Wasser 100 ecm

Methanol ad 1000 ecm

Das Eluat wird ab dem Auftreten einer orangeroten Färbung und bis zum Verschwinden dies« Färbung gesammelt. Man erhält so ein Volumen von SO i, das den größten Teil des Antibioticums enthält Da« Eluat wird unter vermindertem Druck (2 Torr] bei 35 "C bis auf ein Volumen von 101 eingeengt.

Das Konzentrat wird bei pH-7,5 nadieinandei dreimal mit je SI Chloroform extrahiert. Der Chlor» formext rakt wird bei 30* C unter verminderten

Druck (2 Torr) bis auf ein Volumen von 100 ecm eingeengt. Das Antibioticum wird in Form der Base mit 11 Hexan ausgefällt, abgesaugt, gewaschen und getrocknet. Man erhält schließlich 5,5 g rohe Base mit einem Gehalt von 71 % Daunorubicin. ·

Beispiel 3

4,3 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Produkts werden in 43 ecm eines Gemischs n-Butanol-Wasser-10n-Salzsäure (94: 5 :1 Volumina) gelöst. Man erhält so eine Lösung von Daunorubicin-hydrochlorid. Das Daunorubicin-hydrochlorid wird durch Zugabe von 430 ecm eines Gemischs Aceton-Hexan (50: 50 Volumina) ausgefällt. Die Ausfällung wird abgesaugt, mit 43 ecm Hexan gewaschen und bei 50⁰C unter vermindertem Druck (5 Torr) während 15 Stunden getrocknet. Man erhält so 3 g halbgereinigtes Daunorubicin-hydrochlorid (mit einem Gehalt von 67% Daunorubicin) in einer Ausbeute von 66 %.

Beispiel 4

2,9 g des gemäß Beispiel 3 erhaltenen halbgereinigten Hydrochloride werden in 30 ecm eines Gemischs n-Butanol-Wasser (95 : 5 Volumina) gelöst. Dann setzt man nach und nach 30 ecm Aceton zu, um die Kristallisation des Daunorubicin-hydrochlorids zu bewirken. Die Kristalle werden abgesaugt, mit 6 ecm Aceton gewaschen und bei 50⁰C 15 Stunden unter vermindertem Druck (5 Torr) getrocknet. Man erhält so 2 g Hydrochlorid (mit einem Gehalt von 90% Daunorubicin) in einer Ausbeute von 92%.

Beispiel 5

1,9 g des gemäß Beispiel 4 erhaltenen kristallisierten Hydrochloride werden in 24 ecm eines Gemischs Dioxan-Wasser (80 : 20) Volumina gelöst. Man iäßt langsam unter vermindertem Rühren 174 ecm wasserfreies Dioxan zufließen, um die Kristallisation des Daunorubicin-hydrochlorids zu bewirken. Die Kristalle werden abgesaugt, mit 7 ecm wasserfreiem Dioxan gewaschen und 15 Stunden bei 50° C unter vermindertem Druck (5 Torr) getrocknet. Man erhält 1.36 g reines Daunorubicin-hydrochlorid in einer Ausbeute von 75%,.

ίο Das erhaltene Daunorubicin-hydrochlorid ist in Wasser und Alkoholen löslich, in Chloroform wenig löslich und in Benzol und Äther unlöslich.

Das Daunorubicin-hydrochlorid weist die folgende Elementarzusammensetzung auf:

C = 54,5%, H == 5,55%, N = 2,45%, Cl = 6,1%.

Seine physikalischen Eigenschaften sind die folgenden :
ao

Aussehen:

Orangerote Nadeln.
Schmelzpunkt:
225 bis 230° C.
Drehvermögen:

[«]» = + 234 ± 5° (c = 0,1 % in Methanol mit 0,1 % reiner Chlorwasserstoffsäure).

Die Infrarot- und Ultraviolettspektren dieses Produkts sind mit denjenigen identisch, die für das Hydrochlorid des Antibioticums 13 057 R. P. in det belgischen Patentschrift 6 32 391 beschrieben sind.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung des Daunoruhicin genannten Antibioticums 13 057 R. P. durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß ein neuer Stamm, der »Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, DS 32 041« genannt wird (NRRL 3383), verwendet wird.