DE1809187A1 - Verfahren zur Herstellung von Daunorubicin - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren aur Herstellung dee »it der luaeer 13 057 R.P. beiei ohne ten Antibiotiouiia, das den Haeen Duunorubicin erhalten hat (früher» Rubidomycin).

In der belgieoben Patentschrift 632 391 Sind dae eit der Wtuwer 98*5 H.P. beselöbn«te Antibiotiou«, siine drei Haupt- ^

bestandteil·, die «it den NuB«ern'13 213 R.P*. 13 057 R«F« (oder D»unorubioin) und 13 330 R.P. bezeichnet sind» das alt der Keener 13 5^7 R.P. bezeichnete Aglykon de« 9865 H.F.t die

Herstellung des Antibioticu*e 9865 R.P- durch ZUohtung τοη

*8trepto«yo·· 8899? «der "Ätref^oey·.·* 31 723" ^im β»·1ΐ-ntten Mediu» und di· JHfnpnruj d·^ Antibioticues 9865 R,P.

in seine Bestandteil· beschrieb·». .

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren Gewinnung von Daunorubioin durch Züchtung eines neuen Mikroorganismus, der in folgenden vollständiger identifieiert wird» des Genus Streptomyees angehört, »it »Strepfcomye·» gria«ue, „ Varietät rubidofaciens, Stamm D.S, 32 041" beaeiohnetwird und aus einer in Indien in Bengalen entnommenem Erdprobe erhalten wurde» unter aeroben

Eine Probe dieses Stamms wurde in United States Department of Agriculture in Feorla, Illinois (USA) unter der Rummer BSlI 3383 hinterlegt· Proben dieses Mikroorganismus können von diesem Laboratorium unter Besugnahme auf die vorliegende Erfindung erhalten werden·

Dieser neue Stan» weist Haupt Charakteristiken auf_t die den Schluß erlauben« dafi er asu der Reihe S. griseua τοη S.A. WAK3MAK (The Actinomycetes, Band II» 3·A. WAKSMAH, the Williams, and Wilkins Company· Baltimore, 1961, Seiten 133 - 143) gehört. Br ist durch seine Charakteristiken der für diese Reihe repräsentativen Species' Streptamycea grijteus WAKSMAN und EKHRICI₉ al« Streptomycin, produsiert und die in "Bergey'a Manual of Determinatiire Bacteriology" (7. Auflage, She Williams and Wilkine Company, Baltimore, 1961» Seite 791} beschriebene Sptoi·· darstellt, aehr ähnlich, unterscheidet sich jedoch iron di«a«r wesentlich dadurch* daß er kein Streptomycin produziert, sondtrn dagegen ein sehr charakteristisches intensives lind häufig reiohliohe· rot·» ijSslichee Pigment, das ie allgeeeinen

_ 3 —

in Besiehung eu einer antibiotischen Aktivität steht. Durch die Gesamtheit seiner anderen Charakteristiken nähert er eich jedoch so an diese Spezies, daß er als eine Varietät von dieser angesehen werden kann und den Namen Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, Stamm D.S. 32 041, erhalten hat.

S> griseus, var. rubidofaciens, Stamm S.S. 32 041, erzeugt kein Melaninpigment auf organischen Medien« Br bildet gerade oder schwach gebogene Sporophoren, die isoliert angegliedert sind oder einige Verzweigungen in Büscheln aufweisen. Seine Sporen sind oval bis zylindrisch mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,4 bis 0,7 μ /0,8 bis 1,2 μ₀ Sein reichliches sporuliertes luftausgesetztes My eel, das pulvrig aussieht und eine hell-grau-gelb-grünliche Farbe hat, weist das charakteristische Aussehen von demjenigen eines Stammes von Streptomyces griseus auf. Gewisse Zonen dieses luftausgesetzten Mycels nehmen häufig eine rosa Farbe an, wenn das rote lösliche Pigment gebildet wird und das darunter liegende Medium färbt.

In der nachfolgenden !Tabelle sind die Zuchtungseigenschaften und biochemischen Eigenschaften des S. griseus, var. rubidofaciens, Stamm D.S. 32 041, auf einer gewissen Anzahl von üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Stämmen von Streptomyces verwendeten Agar-Hährmedien und Nährbouillons angegeben. Ohne besondere genaue Angaben betreffen sie Kulturen von etwa zwei Wochen bei 25 C, die ein gutes Entwicklungastadium erreicht haben. Eine

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gewisse Anzahl der Yerwendeten Kulturmedien wurde nach den in "The Actlnomyoetes" (S.A. Wakeman, Chronica Botanioa Company« Valtham, Hass·, USA, 1950, Seiten 193 - 197) angegebenen Resepturen hergestellt» In diesem Falle sind sie mit dem Buohstaben W bezeichnet, dels die Mummer, die ihnen in "The Actinomyoetes" gegeben ist, folgt.

Die Anmerkungen oder Zusammensetzungen der anderen Jittchtungsmedien sind die folgenden:

Ann. A: K.L. Jones, Journal of Bacteriology, 52, 142 (1949) Ann. B: Rezeptur W 23» ▼ er set Bt mit 2 i» Agar

Ann». Cs "Rickey und Treaner's Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 950

Anm. D: "Yeast Extract Agar", T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 950

Anm· Ei "Tomato Paste Oatmeal Agar", T.Ö. Fridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957, Seite 950

Anm· Ft W.E. Grundy u. Mitarb., Antibiotics and Chen· 2., 401(1952)

Anm· Gs "Inorganic Salts - Starch Agar", T.G. Fridhan u. Hitarb., Antibiotics Annual, 1956 - 1957« Seite 951

Anm· Hs entspricht der Rezeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glucose er set ist sind

Anm. Is entspricht der Seaeptur W-1, wobei 30 g Saccharose durch 15 g Glycerin ersetzt sind

Anm· Js "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben des

"Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, Η.Ϊ. II_5O-18 (Mai 1950)

Anm. K: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, H.i. H₅₀-19 (Mai 1950)

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Annu 1: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of Anerioan Bacteriologist«, Geneva» N.Y. II50-I8 (Mai 1950)

Ahm. H: entspricht der Reseptur W 18, wobei die Saccharose durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen» ersetzt ist

Ann. Hat Handelsüblich es Mag errai Ichpulver, nach den Angaben des Herstellers angemacht

Anm. P: The Aotinonycetes» Band 2, Seite 333t Nr* 42» S.A. Waksman, !The Williame and Wilkins Company» Baltimore (1961)

Anm. Q: H.D. Tresöer und P. Danga, Journal of Bacteriology, 76» 239 - 244 (1958).

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αedium
(D

Entwicklungsgrad

(2)

Vegetatives Myeel (ν.MU oder Unterseite der Kultur

(3)

luftauageaetster Seil (umfaßt Gesamtheit ▼on luftausgesetztem Myοel und Sporulation)

Lösliches	Beobachtungen und	i	ovale bis sy1ind	1 ^ B	CX)
FIgB ent	biochemische	risch e Sporen mit	1	O
	Eigenschaften	abgerundeten Enden		CD
(5)	(6)	und Abmessungen		OO
schwach-		von 0,4 bis 0,7 μ/
orange-rot		0,6 bis 1,2 a.
sohwacb—		Gerade oder schwach
brftunlich-		gebogene isolierte
orange-rot	oder in Büscheln
schwach	auftretende Sporo-
rötlich-.	phoren
orangebraun
intensiv
rot

g
nach
Bennett (Anm. A)

^ω Agar

co Emerson

j>. (Anm· B)

jgut

- Agar kut

aaoh

Hickey unö

!Dresner (Anm. Q)

gut

ait

gut

nacfa ,
Priöham (Anm. D)

rotes v.M., rote Unterseite

rotes v.tu, rote Unterseite

orangebraune Unterseite

hellgraugelbgrtinlich bis rosagraulioh. Haßig entwickelt

hellgraugelbgrtinlioh bis blaßroaa. Mittel· mäßig entwickelt

hellgraugeibgrünlich bis rosagraulich. Mäßig entwickelt.

rotes v.M., rotbräunliche Unterseite

hellgraugelbgrtinlioh bis rosagräulich· Mäßig entwickelt

(D

Agar mit Hafer, and Sonate nach Fridhan (Mm· E)

Gluooee-

Pepton-Agar

(W-6)

Hähragar (WS)

S Agar mit er* Calcium- ^malat nach <=> Krainsky »(Ana. P)

Gluooet-Aeparagin-Agar
(1-2)

Glycerin-Asparagin-Agar
(W-3)

(2)

gut

ziemlich gut

mittel

mäßig

aieolioh gut

gut

belXbraunrote Unterseite

orangerötliche Unterseite

orangerötliche Unterseite

hellbraunroea Unterseite

hellrote bis hellorange Unterseite

hellorangerote Unterseite

(4)

hellgraugelbgrünlioh bia rosagräuliöb. Sehr gut entwickelt

b ellgraug el bgrtlnl ich · Mäßig entwickelt

weißlich bi· hellroaagelb. mSig entwickelt

h ellgraug elbgrflnlieh mit einigen hellrosagräulichen Stellen. Sehr mäßig entwickelt

hellgraugtlbgrttnlieh bis roaa. MÄfiig entwickelt

hellgraugelbgrünlich bis rosa. Ziemlich gut entwickelt

(5)

hellrotbraun

schwach«· b raun Hchorangerötlioh

hellorangerötlich

hellrosabräunlich

hellorangerOtlioh

hellorangi braunrot

(6)

Löslichmachung iron Calciummalat ί

SOSitiT

OO O CO

(1)

Agar mit Stärke naoh Prldhara (Ann. G)

Synthetischer

Ag&r nach <£ Czapek mit ° Glucose co (Annu H)

"^ Synthetischer ° Agar nach Ceapek mit Γ» Glycerin (Anm. I)

Züchtung auf Kartoffeln

(W-27)

reine Gelatine mit 12 ^ (Anm· J)

(2) gut

gut

gut

sehr gut

mittel

(3)

orangerötliche Unterseite

8 cfa wach vi ο let teil ellrot bräunliche Unterseite

hellrotbräunliche Unterseite

dickes und gefaltetes v.M., rot

weißliehe bis gelbbräunliche und rosabraune Kolonien an der Oberfläche der Gelatine

(4)

hei lgraug elbgrtinlieb bis rosagräulioh. Gut entwickelt

h ellgraugelbgrünlioh bis hellrosa. Gut entwickelt

hellgraugelbgrOnllch bis hellrosa* Gut entwickelt

hellgraugelbgrtinlich bis rosa« Mittelmäßig entwickelt

weißlich, in Pore ▼on Spuren

(5)

hellbraunrot Ii oh

(6)

Hydrolyse von Stärket positiv. Ovale bis sylindrische Sporen mit abg «rund et en End en nd Abmessungen on 0,4 bis 0,7 η/ ,8 bis 1,2 /a. erade oder schwach ebogene isolierte der in Büscheln vorliegende Sporo-)horen.

hellviolettrot

rosa

schwach
rotbräunlich

zögernd. Fast

keines nach 2 Wochen· Gelbbräunlioh in sehr kleiner Menge nahe der Oberfläche bei 3- oder 4-wöchiger Kultur

Verflüssigung der

Gelatine ziemlich gut

(D (2)

Glucose- mittel Nitrat-Bouillon nach
Eiaaick (Ana. K)

Nitrat-Nähr-Boaillon (Ann. I)

ienlieh sut

Jf Bouillon nach

_ω Csapek nit

co Cellulose «-(Ann· M)

E? Magermilch

S (Sn. N)

Tyroain-Befeextrakt-Agar cur

BiIdUBg TOA

Melanin (Ana. P)

Agar nach Xresner und Danga (Anm. Q)

(3)

leichter Schleier. Rosa Unterseite

gut

gut

mittel

gut

Ton Kolonien gebildeter Ring mit rosa Unterseite

hellrosa v.M., als Schleier auf der Oberfläche der Bouillon

hellbräunlicher bis roter Sing

eohwaehorangehellbraungelbe Unterseite

(4)

weißlich bis hellrosa, sehr näßig entwickelt

weißlich. Spärlich entwiokelt

sehr hell-gelbßräalich. Mäßig entwickelt auf den aus der Bouillon herausragenden Papier

keiner

sehr hellgelbgrau· Mittelmäßig entwickelt

(5)

hellrosa

keines

sehr
hellrosa

schwach
bräunlich
leicht
rosa

(6)

Nitrit-Reaktion: positiv

Nitrit-Heaktion» positiv

Verwertung der Cellulose* positiv. Hitrit-HeaJrtion: positiv

Langsame Peptonisation, beginnend nach 2 Wochen, fast vollständig in 1 Monat.

Keine Koagulation. pH geht in 1 Monat von 6,3 auf 7,5.

Bildung von Melanin: negativ

Produktion von negativ

Die Fähigkeit von S. gri-seus* var· rubidofaciens, Stamm DS 32 041» verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoff quellen aur Gewährleistung seiner Entwicklung su verliert ent wurde naoh dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb β* ot Bact. «j6, 107 - 114 (I948l/ bestimmt. Der Entwicklungen grad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium bestimmt, wobei die Glucose duroh die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoff quell en oder das (HH₄)g30₄ duroh die verschiedenen jeweilig untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die jjrgebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegebens

Geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	negativ	Geprüfte Verwertung Stickstoff- quellen	positiv
D-Ribose	positiv	negativ	NaNO3	positiv
U-XyIose	positiv		HaHO2	positiv
L-Arablnose			(HH4)2S04	positiv
L-Rbamnose			(HH4)2BP04	positiv
D-Oluooae	positiv		Adenin	positiv
D-Galaotoee	positiv	negativ	Adenosln	negativ
D-Pructoae	positiv	und roäßii	TTraoil	positiv
D-Uannose	positiv		Harnstoff	positiv
!,-.Sorbose		negativ	!!«Asparagin	positiv
lactose	langsam	negativ	Gljkokoll	negativ
Maltose	positiv		Sarooain	positiv
Saccharose		negativ	BX-Alanin	positiv
frehalose			Dl-Valin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Aßparaginsftüre	positiv
Baffinose		L-Glütajtinsäure	positiv
Dextrin	positiv	!-Arginin

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Forteatsung der Subella

Geprüft· Kohlenstoff- quellen	Verwartung	positiv	negativ	positiv	negativ	Geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung
Inulin	negativ	positiv	negativ	negativ	I-Iyain	positiv
StUrlce	positiv	negativ		DI-Serin	positiv
Glykogen	DI-Threonin	positiv
Glycerin	DL-Methionin	negativ
lärythrlt	Taurin	negativ
Adonit	DL-Ph eny!alanin	positiv
Dulclt	Ii-TyroBin	positiv
D-Hannit	DL-Prolin	positiv
D-Jorbit	L-IIy droxyprol In	positiv
Inosit	!.-Histidin	positiv
	Betain	negativ

S. griseus, vnr. rubidofaoiens, Stamm D3 J2 041, ist von den von 3.A. iTakeman innerhalb der Reihe der StKaae von 3. griseus untereohledenen Opeolea verschieden, von denen keine bisher beschriebene ein rotes löiliohee Fignent bildet, das «it dea von dem Stamm BS 52 041 vergleichbar «fire, und von denen keine eine antlbiotisohe und antitunorale Substan« produelert, die ■it DAunorubloln Identisch 1st (The Actiooejrcetes, Band II» S.A. üaksman, She Γ/illiaas and Wilkins Coapehy, Baltimore, 1961» Selten 140 - 143).

Es wurde bereits ausgeführt» dafi 8. grleeutt var. rabidofaeiene, Stawi I» 52 041· der ein rotes löslichee Pigeent bildet, von S. criseue iTaksman und Henrici verschieden ist. Br ist au oh

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nicht ait S* griseinus Vaksman identisch« der Grisein produziert« Ton diesen bekannten Stämmen bildet weder der eine noch der andere charakteristische lösliche Pigmente in ihren Kultaren mit Ausnahme gewieser Streptomycin erzeugender ' Stämme von S. griseus, die ein grünes lösliches Pigment in Medien mit Caloiummalat bilden» eine Eigenschaft» die S. griseus» yar· rubidofaciens, Stamm S3 32 041 nicht besitzt· Ebenso ist dieser Stamm von Streptomyoes coelioolor (Mttller) verschieden» der Candioidin und ein blaues lösliches Pigment φ produziert, sowie von Streptomyces Californicus ^aksnan und Curtis« der Viromycin produziert und auf gewiesen Medien eine rosa bis purpurne Mycelpigaentierung auf Grund eines endooellulären Pigments aufweist, das nicht in das Züohtungsmedium diffundiert, jedoch kein rotes lösliches Pigment bildet. Schließlich unterscheidet er sich auch von Streptomyoes chrysomallus (Lindenbein) Waksman, der Acti aemycin produziert und ein goldgelbes lösliches Pigment, jedoch niemals ein rotes lösliches Pigment bildet.

Nach den Begriffen von S.Ao Waksman», könnte der Stamm BS 32 möglicherweise auch als eine neue Species angesehen werden·

Auf Grund der Hauptunterschiede zwischen dem Stamm S3 32 041 und der Species S· grlseus, die nur auf der Produktion des antibiotischen löslichen Pigmente beruhen, kann man den Stan Streptomyces griseus, Varietät rubidofaciens, SS 32 041

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für eine Varietflt der bereits ron S.A· Vakjtaan beschriebenen Speeiea S. grieeos und nicht für ·1η· ander» Species halten.

Das Verfahren tür Htr«teilung des Daunorubioine besteht im wesentlichen darin, Streptoejce· griaeua, Varietät rubidoiaoltMt 9««ai DS 32 041 auf geeigneten Medien und unter geeigneten Bedingungen su «Hebten »ad das in Verlauf· der XUohtung gebildete Antibioticum absutrtnnen.

Si· läohtune von Streptoayoes griseus, Varietät rubidofaolena, S3 32 041» ergibt hauptsächlichDaunorubioin, ^edoph auoh die anderen Beetandteile 13.213 H.P. and 13 33p 1·P. dee Antlbiotiouae f 865 B»P»t die von dfs Daunorubioin in Verläufe der EitraJrÜione- und ReinigunesarbeitHänge abgetrennt werden und gegebenenfalls isoliert worden können. Des Hatiptiiel der vorlietenäen Krfindung liegt Jedoch in der nerstellurt| ven Saunertttloin.

rubidofaoiens,

letKterβ verwendet , «i* in

Man kann insbesondere den folgenden Gang für die Durchführung der Arbeitsgänge wählen:

Streptomyces (HRBI 3383) -

Kultur auf Agar Kultur Io Kolben unter Beilegung

Iapfkultur in Fernenter Produktionakultur in Fernenter

Das Fernen tat lonsnediun soll im wesentlichen eine aeainili erbare Kohlenstoffquell« und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile ?.n Forn von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie nan sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs an- , trifft, zugeführt werden können»

Als assimilierbare Kohlenstoffqueilen kenn nan Kohlehydrate, wie beisplel3neiee Glucose, Maltose, Dextrine, Stärke, od|er , andere Kohlehydratsubstansen, wie beispieleweise Zuokeralkohole, a.B. Mannit und dergl., oder gewisse organische Säuren, κ.B. Milchsäure, Citronensäure und dergl., verwenden· Gewiseβ tierische oder pflaiisliohe öle, wie beiapielsvieise SciimalKÖl oder Sojaul, können diese verschiedenen Kohleiijdmt^uilaii.mit Vorteil ersetsen oder ihnenbeigefügt werden.

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Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Hitrate, anorganische oder organische Amnoniumsalse, Harnstoff und Aminosäuren, sein. Sie können auch in Fora von komplexen Substaneen, die Stickstoff hauptsächlich in protldischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Laetalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehlen, Araohismehlen, Fischmehlen, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distiller's solubles und Haisquellwasser· *

unter den zugeführten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Caloium- und Magnesiumcarbonate.

Andere bewirken das rar Entwicklung des Streptomyces griseus,

νar. rubidofaciens, DS 32 041 und sur Bildung des Antibioticuma erforderliche Ionengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- μ und Erdalkalisulfat· und -chloride. Schllefilich wirken gewisse in speziellerer Art als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen des Streptomyces DS 32 041. Es sind dies die Zink-, Kobalt-»

Eisen-, Kupfer- und Manganealze.

Zu Beginn der Züchtung sollte der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5,

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liegen· Sie eur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 3O⁰C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33⁰C eine sufriedensteilende Produktion erhalten. Die Beltiftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Werten variieren« Be wurde jedoch gefunden» daß Belüftungen von 0*3 bis 3 1 luft je liter Bouillon und Minute besonders gut geeignet sind· Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 2- bis 8-tägiger Züchtung erhalten* wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt·

Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich» daß die eur Produktion von Daunorubioin angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyoes griseus* var· rubidofaoiens» DS 32 041 in ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.

Das Daunorubicin kann aus den Fermentationsmaisohen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.

Man kann die Fermentationsmalsche bei einem pH-Wert zwischen 1,5 und 9 filtrieren. Unter diesen Bedingungen geht der Hauptteil der Aktivität in das PiItrat. Hich Waschen mit Wasser enthält der Filterkuchen praktisch keine Aktivität mehr. Ea ist vorteilhaft, diesen Arbeitsgang in saurem Medium durchzuführen, insbesondere unter Ansäuern auf einen pH-Wert zwischen 1,5 und mittels Oxalsäure. Bs ist auch möglich, die Filtration bei einem

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pH-Wert zwischen 2 und 7, vorsugsweise in der Habe τοη 2, in Anwesenheit eines aliphatischen Alkohole «it 1 bis 3 Kohlenstoffatomen durohsufUhren.

Bei den oben genannten Kartraktionsarbeltsgängen wird das Baunorubloln in wäßriger oder wftfirig-alkobolisober Lösung erbalten· Anschließend führt «an es durch Extraktion alt eine« ■it \fesser nicht Mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol» Methylisobutylketon, Xthylaoetat oder Chloroforej, bei eine« pH-Wert swleoben 5#5 und 9, vorsugswelse bei eine« pH-tfert in der BMhe von 7,5, in eine organische LOsung Ober* Gegebenenfalls führt «an vor dieser Extraktion eine Behandlung mit eine« lonenaustaueoberbars durch· In diesem lalle wird die wäßrige Lösung auf einen pH-Wert in der Habe von 4 eingestellt und anschließend mit einem Katlonenaustauaoherhars bebandelt· Bas Baunorubloln wird vorsugsweise alt Methanol, das IO Jf Wasser und 1 i> Natriumchlorid enthält, elulert. Bas. Bluat wird dann sur Entfernung des Alkohols eingeengt und anschließend wie Oben extrahiert.

Man kann die ?ermentationemaische auch einer Extraktion mit eine« ■lt nasser nicht «leonbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Xthylaoetat oder Chloroform, bei eine« pH-Wert zwischen 5»5 ond 9._t vorsugsweise bei eine« pH-Wert in der lähe von 7_t5» untersieben· In diesem. Falle geht die gesamte Aktivität in die organische Phase, die von der wäflrigen Phase nach UbIleben »erfahren abgetrennt wird·

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«·· 18 —

Velohe Extraktionsart auch gewählt wird, wird das Daunorubicin schließlich in organischer Lösung erhalten. 2s kann in diesen Stadium vorteilhaft βein, eine Reinigung duronsufUhren, Indem nan das Antibioticum nacheinander in wäßrige Lösung und dann in organische LOsnng durch Modifikation des pH-Werts überführt» Das rohe Antibioticum kann anschließend aus der suletst erhaltenen organischen Lttsung durch Einengen oder Ausfallen mit einem schlechten Lösungsmittel, wie beispielsweise Hexan, isoliert werden. Bine besonders vorteilhafte Isolierungemethode besteht darin, die organische Löeung auf einen pH-Wort in der Nähe Ton 4 anaueäuern, vorsugsweise mit Hilfe von Essigsäure, und dann unter vermindertem Sruok auf ein kleines Volumen einsuengen· Die Zugabe eines schlechten IBsungsmittels für das Daunorubioin, wie beispielsweise Hexan, su dem erhaltenen Konsentrat bewirkt dann die Ausfällung des rohen Antibiotloums·

üb reineres SaunoFuhloin su erhalt«*!, kann man die üblichen . Methoden anwenden» wie beispielsweise die Chrümatograpfaie an Φ verschiedene Idsorbentlen, die Gegenstromvertellung oder die Verteilung swlsohen verschiedenen Lusnngsmltteln.

Bas DaunorubloiJtr kann auch In ein Addltionssals mit Säuren, wie beispielsweis· Salssiture, üb@ipg«führt werden. Biese Salse kennen durch Anwendung üblicher Methodem- gereinigt werden«

nach diesem nmm Verfahren erhalten.® Salse weisen Klgeneohefien auf, ii# mit

·* 19 ·*

ticueβ 13 057 R.P. und seinen Salzen, die in der britischen Patentschrift 632 391 beschrieben sind« identisch sind.

Sie folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie au beschränken·

Beispiel 1

In einen 170 1-Pereenter bringt man die folgenden Bestandteile eint

Sojamehl 3,600 kg

"Distiller's solubles" 0,600 kg

Stärke A,200 kg

Sojaul 1*800 1

Natriumchlorid 1,200 kg Leitungswasser ad 110 1

Nach Einstellen des pH-Werte auf 8,45 Bit 120 com konsentrierter 1On-Hatronlaugβ sterilisiert aan das Medina bei 122⁰C durch 40-ainütiges Durohleiten von Daapf. Wach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 120 1 und der pH-Wert 6,80. Man beiapft dann mit 200cc» einer gerührten be«, geschüttelten Erleneeyer-Kultur des Staues Streptoeyces grlseus, var. rubidofaciens, SS 32 041. Die Kultur wird 35 Stunden unter Bewegen und unter Belüften nit steriler Luft bei 30⁰C entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionekultur geeignet·

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Die Produktionskultur wird in einem 800 l~Fennenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beachiokt lets

Sojamehl 12kg

"Distiller's solubles¹¹ 2 leg

Stärke 2 kg

Sojaöl 12 1

Natriumchlorid 4 Ϊ« Leitungawaseer ad 570 1

Haeh Einstellen des pH-Werte auf 7,50 mit 250 co« koneentrierter i0n-Natronlauge sterilisiert man das Medium bei 122⁰C durch 40~mlnÜtiges Durchleiten von Dampf. Nach Abkühlen betragt dae Volumen der Bouillon 400 1 und der pH-Wert 6,80. Man beimpft dann mit 40 1 der obigen Kultur aus dem 170 l-Fermenter. Die Züchtung wird 161 Stunden unter Bewegen mit Hilfe eines mit 250 UpM betriebenen TurbinenrÜhrers und unter Belüften mit steriler luft in einer Menge von 25 w? je Stunde bei 30⁰C durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7,0 und das Volumen der Maische 350 1· Die In d,ai Medium vorhandene Menge an Daunorubioin beträgt 34 jig/ecu.

Beispiel 2 :. - - ■' - - ■" ■-. - · - ■■-· ■ - - ■,-

100 1 der während der im Beispiel 1 beschriebenen Fermentation erhaltenen Fermentationsmaische werden in einen mit einer Vor* richtung sum Bewegen und einer Dampfheizschlange ausgestatteten

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Bottich gebracht· Han setst 3 kg Oxalsäure su und erhltst dl· Haas· auf 5O⁰C. Das Bewegen und die Temperetor werden •in· Stand· aufrechterhalten. lach dieser Zeitspanne wird die Suspension auf einer filterpresse nach Zugabe von 4 leg PiIterhilf e filtriert. Der filterkuchen wird auf dem Tilter «it 110 1 Wasser gewaschen· Das filtrat, dessen Voluaen 190 1 beträgt, wird auf t 5°o abgekühlt und der pH-Wert alt lOjtiger Natronlauge auf 4«5 eingestellt.

Das Pilfcrat wirA in eine Säule, die % 1 Aabcrllte XHC₅₀ sauren Zyklus enthält, so geleitet« dae es das Harsbett von oben naoh unten »it einer Rate von 15 1 je Stunde durchstroat. Die Säule wird anachlietend alt 15 1 Wasser, das in den gleichen Rlohtungssinn wie das Piltrat und in der gleichen Rate zugeführt wird, dann alt 25 1 Methanol alt eine» Gehalt von 50 % Wasser alt einer Rate von 15 1 Je Stunde in einea Zuftlhrungeslnn von unten naoh oben und dann, ebenfalls alt der gleichen Rate von unten nach oben alt 50 1 Methanol alt einea Gehalt von to Jf Wasser gewaschen· '

Der Abfluß und die Waschflüssigkeit en werden verworfen» und die Säule wird alt einer von oben nach unten durch das Bars ströeenden lösung der folgenden Zuseaaettsetsung eluiertt

latriuachlorid 10 g

Wasser 100 cca

Methanol ad 1000 ooa

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Das Eluat wird ab den Auftreten einer orangeroten Färbung und blB zum Verschwinden dieser Färbung gesäuselt. Man erhält so ein Volunen von 50 1, das den größten Teil des Antibiotioums enthält· Das Eluat wird unter verminderte« Druck (2 Torr)

bei 35⁰G bis auf ein Volunen von IO 1 eingeengt.

Das Konsentrat wird bei pH 7 t5 nacheinander dreiaal alt je 5 1 Chloroform extrahiert. Der Chloroforaeoctrakt wird bei 30⁰C

unter verminderte» Druck (2 Torr) bis auf ein Volumen Von 100 con eingeengt· Das Antibiotics» wird in Fora der Baae mit 1 1 Hexan ausgefällt, abgesaugt* gewaschen und getrocknet· Man erhält schließlich 5,5 g rohe Base mit einem Gehalt von 71 $> Daunorubloin·

Beispiel 3

4,3 g des gemäß Beispiel 2 erhaltenen Produkts werden in 43 ocn eines Gemische n-Butanol-Waeser-IOn-Salssäure (94s5s 1 Volumina) gelöst« Man erhält so eine lösung -von Daunorubleln-hydrochlorid. Das Daunorubioin-hydroohlorld wird durch Zugabe von 430 oca eines Seelachs Aceton-Hexan (50:50 Volumina) ausgefällt. Die Ausfällung wird abgesaugt, mit 43 com Hexan gewaschen und bei 50⁰C unter verminderte« Brack (5 Torr) während 15 Stunden getrocknet· Man erhält so 3 g halbgereinigtes Daunorubioin-hydrochlorid (mit einem Gehalt von 67 i« Daunorubloin) in einer Ausbeute von 6$.£»■.'■

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Beispiel 4

2,9 g des geaeS Beispiel 3 erhaltenen halbgereinigten Hydrochloride werden in 30 cc» eines Gemische n-Butanol-Waseer (95*5 Volueina) geigst. Bann eetst nan nach und na oh 30 oea Aceton SU₉ «b die Kristallisation dee Daunorubicin-hydroohlorids sä bewirken· Die Kristalle werden abgesaugt, ait 6 ecm Aceton gewaschen und bei 5O⁰C 15 Stunden unter veraindertea Druck (5 Torr) getrocknet. Kan erhält so 2 g Hydroohlorid («it sine« Gehalt -von 90 Jt Daunorabicin) in einer Ausbeute von 92 J*·

Beispiel 5

1,9 g dee geafiß Beispiel 4 erhaltenen kristallisierten Hydroohlorid e werden in 24 oca eines Geaischs Sioxan-wasser (80*20 Volueina) gelöst. Man läßt langen« unter Tersindertea Rühren 174 oca wasserfreies Dioxan isufließen, m die rrietallisation des Daunorubicin-hydrochlorids sn bewirken. Sie Kristalle werden abgesaugt, ait 7 con wasserfreie« Dioxan gewaschen und 15 Standen bei 50⁰C unter verhindertes Druck (5 Torr) getrocknet. Man erhält 1,36 g reines Daunorubicin-bydrochlorid in einer Ausbeute -von 75 ^· .

Das erhaltene Daunorubicin-hydroohlorid ist in Wasser und Alkoholen löslich, in Chlorofor* wenig löslich und in Bensei und Xther unlöslich. .

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Dae Daunorubicin-bydroehlorid weist die folgende Elementar-Eusaimneneetzung auf:

C - 54,5 * H - 5,55 * N « 2,45 * öl «6,1

Seine physikalischen Eigenschaften sind die folgenden!

Adssehen: Orangerote Nadeln

Schmelzpunkt; 225 bis 230⁰C

Drehvermögen: Af§° -■+ 234 £ 5° (o ■ 0,1 Jl In Methanol

mit 0,1 j> reiner Chlorwasserstoff säure) „

Die Infrarot- und Ultraviolettspektren dieses Produkts sind mit denjenigen identisch, die für das Bydroehlorid des Antibioticums 13 057 Ε·Ρ. in der belgischen Patentschrift 632 beschrieben sind.

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Claims (1)

1. Fat entanspruch

   BsmaansaimssBasass

   Verfahren zur Heratellung dee Daanorublein genannten Antibioticums 13 057 R.P. durch Fermentation« dadurch gekennzeichnet, daß ein neuer Stamm, der "Streptomycea griseue, Varietät rubidofaciene, DS 32 041" genannt wird (HRRI 3383)t verwendet wird.

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