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Herstellung eines Antibiotikums Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum
und das Verfahren zu seiner Herstellung. Insbesondere betrifft sie ein neues Antibibtikum
in verschiedenen Formen und Verfahren zu seiner Herstehung durch Gärung, Konzentrierung
und/ oder Reinigung, Isolierung und Salzbildung. Die Erfindung umfaßt sowohl das
Antibiotikum sowie dessen Salze in Lösung als auch als Konzentrate und in reiner
kristalliiner Form.
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Das erfindungsgemäße Antibiotikum wird durch Mehtung unter geregelten
Bedingungen einer hisher noch nicht besrJhriebenen Species von Streptomyces erhalten,
-#velq#hes aus einer un-reinen in North Charleston, North Carolina, ethailte-nen
Probe isoliert wurde und nachstehend' als StreptOmYces sP. WC 3628 bezeichnet
wird. Eine Kultur des lebenden Organismus wurde in der Stock Culture Collection
der New jerseyer Agricultur Experimenta,1-Abteilung, New Brunswick, N.
J.,
eingereiht und dort als Streptomyces sp. Waksmann Cdl,Iection
3628 bezeichnet.
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Zur Isolierung undCharakterisierungdes Mikroorganismus wird ein Teil
der unreinen Probe (etwa i g) in sterilisiertem Wasser verdünnt und auf einen
Agar übertragen, welcher in destilliertem Wasser die folgenden Bestandteile enthielt:
il/o Saccharose, 0,120/0 Zitronensäure 0,04'/o (N,H4),HPO4, o,oo8% KCL, 0,0418')/o
MgCL2 X6H201 0,0036% MnCL,X6H20, 0,00230/0 Fe C L3 X 6 H#
0, 0,002 10/0 Cn C L2' 0,0004 %
C 0 C L2 X
6 H2 0, 1 % Galactose und 1,5 % Agar. Die Inkubationszeit beträgt
dann io Tage bei 26' C. Eine Kolonie des neu isolierten Streptornyces, die
von den so gezüchteten Organismen entnommen wurde, war bei einem Test gegen Bakterien
aktiv gegenüber Mi,erococcus pyogenes var. aure-us, Aerobacillus polymyxa und Streptococcus
faecalis.
In der folgenden Beschreibung von Kolonien des Organismus,
welche bei sechstägiger Inkuhationszeit bei :26' C in verschiedenen Agarmedien
erhalten wurden, beruhen die bezeichneten Farben auf der »Color Standards und Color-Nomenclature«,
Washington D. C., igi2 von Ridgway.
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Kolonien in: Pilz-Rindfleisch-Extrakt-Agar, bestehend aus
0,3 "/0- Pilzextrakt, o, 15 1/o Rindfleischextrakt o,6 % Pepton, o,
i 1/o Dextrose, 1,5 % Agar und destilliertem Wasser. Das Wachstum ist gut. Das in
Luft befindliche Mycelium und die Sporen sind rötlichgelb bis blasrauchgrau. Die
Kolonien sind konvex und undurchsichtig mit eingerissenen Rändern. Die Sporenbildung
ist stark. Das in Luft befindliche Mycelium ist schwach mit kurzen unregelmäßigen
Auswüchsen. Die Farbe der Rückseite ist lohfarbenrötlichgelb. Es wurde ein in den
Agar eind#ffundierendes Pigment erzeugt, welches rosagelb ist. Das pflanzliche Mycelium
besitzt einen Durchmesser von 0,5 bis 0,7,u und das in Luft befindliche Mycelium
einen solchen von 0,7 bis i u. Der Durchmesser der Sporen beträgt
0,5 bis 1,5 fl.
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In Czapek-Dox-Agar, bestehend ans 0,3 11/o Na N 0,3,
0,10/9
KH2P041 0105'/@ KC" 0,05% M9S04 X 7 H2 0, o,oo i 11/o Fe
S 04 X 7 H2 0, 4 % Glucose, 1,5 1/o Agar und destilliertem
Wasser. Die Kolonien sind kreisförmig, feinkörnig und schwach konvex mit ausgefransten
Rändern. Die Sporen sind blaßrötlichgelb, und die Rückseite der Kolonie ist primelgelb.
Es wurde kein Exopigment erzeugt.
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In Sabouraud's Agar, bestehend aus: i % Neopepton, 4 1/9 Dextrose,
1, 5 (l/o Agar und destilliertem Wasser. Die Kolonien sind kreisförmig, feinkörnig
und schwach konvex mit ausgef ransten Rändern, die Sporen sind holzbraun bis hellrosagelb,
und die Rückseite der Kolonie ist von einer warmen Sepiafarbe. Es wurde ein in den
Agar eindiffundierendes kreidefarbenes Pigment erzeugt.
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In Sojabohnen-Infusion-Agar, bestehend aus:2% Soja,-Infusion
(30 Minuten gekocht, filtriert), o,21/o Dextrose, o,5 1/o Natriumchlorid,
2 % Agar und destilliertein Wasser, welches vor der Sterilisierung auf einen pli-Wert
von 7 eingestellt wurde. Die Kolonien sind kreisförmig, feinkörnig, undurchsichtig
und konvex mit ausgefransten Rändern. Die Sporen sind weiß bis hellrauchgrau. Die
Rückseite der Kolonie ist in der Mitte hornbraun, die Außenseiten sind warmrötlichgelb.
Es wurde kein Exopigment erzeugt.
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In Henrici-Agar, bestehend aus o,5 1/o. Caseinhydrolysat, o,
5 1/o Glycerin, o, 2 1/o K 2HP041 01:2'/o Mgs04X7H20, o,21/oFeS04X7H.0, 1,50/0
Agar und destilliertem Wasser. Die Kolonien sind kreisförmig, undurchsichtig und
erhöht mit ausgefransten Rändern. Die Farbe der Kolonien ist weiß mit einer blaßmausgrauen,
kronenartigen Erhöhung. Die Rückseite der Kolonie ist gelbbraun mit einem kreisförmigen
Rand der Farbe Schwarzbraun Nr. 3. Das Exopigment ist rötlichbraun.
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Die vorstehende Beschreibung der zur Gewinnung der erfindungsgemäßen
Antibiotika verwendeten Organismen ist nur erläuternd, und die Erfindung ist natürlich
nicht auf diese Organismen, d. h. die der obigen Beschreibung völlig entsprechenden,
beschränkt, sondern umfaßt unter anderem auch Mutationsprodukte des vorstehend beschriebenen
Organismus, welche beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung
und Zuführung von Stickstoff erzeugt wurden.
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Der erfindungsgemäße Mikroorganismus kann Kohlenstoffe aus den folgenden
Verbindungen in einem (N,14)2S04 als Stickstoffquelle enthaltenden Grundmedium assimilieren:
Rhamnose, Xylose, Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Lactose, Maltose, Succharose,
Raffinose, Glycerin, Mannitol, Dextrin, Inulin, Stärke, Inositol und Ammoniumtartrat.
Die folgenden Kohlenstoffverbindungen unterhalten das Wachstum nur schwach: Arabinose,
Sorbitol, Natriumzitrat. Das Wachstum wird durch die folgenden Kohlenstoffverbindungen
überhaupt nicht unterhalten: Dulcin, S aligenin, Natriumacetat, Ammoniumformiat,
Ammoniumüxalat.
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In einem Stärke als Kohlenstoffquelle enthaltendenGrundmedium unterhalten
die folgendenStickstoffverbindungen das Wachstum: Ammoniumsulfat, Natriumnitrat,
Natriumnitrit und Asparagin. Tyrosin unterhält das Wachstum nur schwach, und Acetamid
unterhält es gar nicht.
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Der Mikroorganismus kennzeichnet sich auch durch seine Fähigkeit,
bei .26 und 37' C auf Pilz-Rindfleisch-Extrakt, Sojabohnenmehl und Sabouraud's
Agar zu wachsen. Er erzeugt kein Indol und reduziert kein Nitrat, verflüssigt jedoch
Gelatine unter Bildung von braunem Pigment und reagiert auf Lackmus sauer.
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Die erfindungsgernäßen Antibiotika besitzen in vitro-Testen gegen
eine Vielzahl von Organismen einen weiten antibiotischen Wirksamkeitsbereich. Organismen,
die sich in Anwesenheit des erfindungsgemäßen Antibiotikums nicht weitervermehren,
sind unter anderem: Micrococcus pyogenes var. aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
faecalis, Diplococcus pneumoniae Typ.2, Diplococcus pneumoniae TYP 3, 4acillus
subtilis, Clostridum septicum, Klebsiella pneutnoniae, Escherichia coli, Aerobacter
aerogenes, Salmonella typhosa, Salmonella schottmülleri, Shigella dysenteriae, Shigella
sonnei, Protens vulgaris, Pseudomonas aerugniose und Mycobacterium tuberculosis
var. bovis BCG. In reiner kristalliner Form besitzen die erfindungsgemäßen Antibiotika
einen Üdhen Wirkungsgrad, welcher dem von Chloramphenicol bei einem Test geben Meningopneumonitis-Virus
entspricht und etwa viermal so stark ist wie der von Chloramphenicol beim Test gegen
Rickettsia rickeitsi. Eerner sind die erfindungsgemäßen Antibiotika infolge ihrer
Öllöslichkeit besonders zur Verwendung in verschiedenen Zusammensetzungen auf Ölgrundlage
mit verzögerter Wirkung geeignet.
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Die folgenden Daten zeigen die Wirksamkeit von gemäß der Erfindung.hergestellten
Antibiotika enthaltenden Fleischbrühen. Diese Wirksamkeit ist in den Verdünnungseinheiten
gemessen, welche den reciproken Wert der stärksten Verdünnung der Fleischbrühe darstellen,
bei welcher noch das Wachstum eines Testorganismus vollständig gehindert
wird.
Dieser Organismus ist, wenn nicht anders angegeben, Micrococcus pyogenes var. aureUS
209 P. Bei diesen Testen ließ man die Gärung während der angegebenen Zeiten in einem
Sojabohnenmehlnährmedium erfolgen, welches nach der Sterilisierung auf einen pH-Wert
von
7 eingestellt wurde und aus
30/0 Sejabohnenmehl, 2 "/0 Dextrose,
0,0005 0/0 CO C12 X
6 H2
0 und o, i % Ca
C 0, in destilliertem
Wasser bestand. Dann wurden die Verdünnungseinheiten in bezug auf den ausgewählten
Testorganismus bestimmt.
| Verdünnungseinheiten |
| Merococcus |
| pyogenes ICebsiella B. C. G. |
| var. aureus pneumoniae |
| 209 P |
| 4 Tage 7 Tage 4 Tage 7 Tage 4 Tage
7 Tage |
| Neutrale |
| pasteurisierte |
| Probe ....... 315 342 <25 62 <25 25 |
| Saure |
| pasteurisierte |
| Probe ....... # 125 342 , <25 44
, 25 1 25 |
| pli der Gärung bei 4 Tagen: 7,9 |
| pH der Gärung bei 7 Tagen: 7,7 |
Das erfindungsgemäße Antibiotikum wird zweckmäßig in bedeckten, belüfteten Kulturen
des Organismus unter Erzielung von Brühen (bei einer Gärung im großen Maßstab) gezüchtet,
welche Wirksamkeiten von bis zu etwa 2000 oder mehr Verdünnungseinheiten/mg besitzen.
Sie können
je-
doch auch in Oberflächenkulturen gezüchtet werden, wobei die
Belüftung dadurch erfolgt, daß man der Oberfläche der Kultur sterile Luft zuführt.
In beiden Fällen enthält das Medium jedoch eine Energie liefernde Kohlenstoffquelle
und eine das Wachstum unterhaltende Stickstoffquelle.
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Als Energie liefernder Stoff kann verwendet werden: ein Kohlehydrat,
z. B. Stärke, lösliche Stärke, Dextrose, Saccharose und Maltose, ein Zuckeralkohol
(z. B. Glycerin) oder ein Lipoid, wie erstens eine Fettsäure, zweitens ein Fett
oder drittens eine Mischung dieser beiden. Erfindungsgemäß zu verwendende Fette
sind: Schweinefett, Sojabohnenöl, Leinsamenöl, Baumwollsamenöl, Erdnußöl, Kokosnußöl,
Weizenöl, Rizinußöl, Sesamöl, rohes Palmöl, Hammeltalg, Spermöl, Olivenöl, Tristearin,
Tripalmitin, Triolein und Trilaurin. Als Fettsäuren können verwendet werden: Essigsäure,
Propionsäure, Buttersäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Linolensäure
und Myristinsäure. Als Energie liefernde Stoffe sind die Kohlehydrate, und zwar
insbesondere Dextrose, bevorzugt.
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Als Wachstums fördernde stickstoffhaltige Substanzen werden die für
diese Verfahren üblichen verwendet. Es können dies natürliche organische Stoffe
sein (z. B. Sojabohnenmehl, Weizenkeimflüssigkeit, Fleischextrakt, Kasein, Fischmehl,
Leber und/oder lösliche, bei der Brennerei anfallende Stoffe). Synthetische Verbindungen,
wie z. B. anorganische Nitrate oder Ammoniumverbindungen können ebenfalls verwendet
werden. Weizenkeimflüssigkeit ist wegen der großen Vielzahl der darin enthaltenen
Stoffe eine wertvolle Zugabe zu dem Gärungsmedium.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Medien können außer den Nährstoffen
noch Vorstufen anderer wertvoller Verbindungen enthalten. So kann z. B. eine assimilierbare
Kobaltverbindung dann zugegen sein, wenn Cobalamine (Vitamin Bl" und Vitamin-Bl.ähnliche
Stoffe) erwünscht sind, und diese Nebenprodukte können dann nach üblichen Verfahren
gewonnen werden. Es können auch Steroide ergebende Verbindungen, wie z. B. Progesteron
oder Reichsteins Verbindung S oder S-Acetat, zugegeben werden, wobei man
dann ein in der ii-Stellung oxydiertes Steroid erhält. Wie bei den meisten Gärungsverfahren
wird auch das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßig unter Verwendung eines flüssigen
Mediums durchgeführt, welches mineralische, das Wachstum des Organismus fördernde
Bestandteile enthält, wie z. B. Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel, Eisen oder
andere Spurenelemente und Phosphat. Diese Bestandteile werden dem Medium zweckmäßig
zugesetzt, wenn sie noch nicht darin z. B. als Verunreinigungen des rohen Kohlenstoff
oder Stickstoff liefernden Stoffes (z. B. Weizenkeimflüssigkeit) enthalten sind.
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Bei der Gärung im großen Maßstab von überdeckten, belüfteten Kulturen
wird der pH-Wert des Mediums, wenn nötig durch Zugabe von Puffern, auf etwa
7 eingestellt (es können auch PH-Werte von etwa 5 bis 9 angewendet
werden). Der pH-Wert neigt mit fortschreitender Gärung dazu, sich in den leicht
alkalischen Bereich zu verschieben (pji - 7,5
bis 8,5). Es können Gärungstemperaturen
von etwa 2o bis etwa 40' C und vorzugsweise von etwa :25' C angewendet
werden. Es kann eine mechanische Durchrührung mit ioo oder mehr Umdrehungen pro
Minute erfolgen, während die Belüftung mit einer Oberflächengeschwindigkeit bis
zu - 3 m oder mehr pro Minute durchgeführt wird.
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Eine Gärung in kleinem Maßstab, z. B. bei Laboratoriumsversuchen oder
bei der Erzeugung von Keimen für eine Gärung in größerem Maßstab kann in mit Watte
verschlossenen Schüttelkolben erfolgen. So werden z. B. :250 ccm eines wäßrigen
Nährmediums enthaltend 3)/o Sojabohnenmehl, 2 % Dextrose, o,ooo5 % Co Cl. X
6 H20 und o,i % Ca.CO, in einen i-l-Erlenmeyer-Kolben gebracht, auf die übliche
Weise in einem Autoklav sterilisiert und dann mit 12 n-Na OH auf einen pH-Wert
von 7,o eingestellt. Das Medium wird dann mit dem auf einem Schrägagar (entweder
Pilz-Rindfleisch- oder Sojainfusion) gewachsenen StreptomYces sP. WC 3628
geimpft. Während der Inkubationszeit von 48 bis 96 Stunden wird der Kolben
auf einer hin und her gehenden Schüttelmaschine mit 140 2,5 cm langen Oszillationen/Minute
gehalten.
Es können auch andere Medien verwendet werden, z. B. wäßrige Medien, welche enthalten:
A. o, 15 % Rindfleischextra,kt, 0, 15'9/0 Pilzextrakt, o,
5 1/o Pepton, o, 5 % Dextrose, o,35 % Natriumehlorid,0,368%K2HPO410,132%KH.P04;
B. i"/o Dextrose, i% Pepton, 0,030/0, Rindfleischextrakt, o,51/o Pilzextrakt und
C. 411/o Dextrose, i % Pepton.
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Die erfindungsgemäßen Antibiotika können in kristalliner Form aus
der filtrierten Gärungsbrühe auf die folgende Weise erhalten werden: i. Extraktion
mit einem mit Wasser nahezu unmischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Benzol,
Chloroform, Amylacetat, Äthylacetat, Butanol, Amylalkohol, Trichloräthylen und Äther
bei einem pli-Wert von zweckmäßig etwa 6,6 oder höher; :2. Abdestillation
des organischen Lösungsmittels im Vakuum und in Anwesenheit von Wasser, wobei man
eine wasserunlösliche Ölfraktion und e ine wasserlösliche Fraktion erhält, welche
durch Ausfrieren getrocknet und aus einem organischen Lösungsmittel oder einer Lösungsmittelmischung,
z. B. Isopropanol, einer Mischung von Benzol und Petroläther, wäßrigem Methanol,
Äthanol oder Aceton umkristallisiert wird. Das erhaltene Produkt ist farblos und
scheidet sich in Form von Prismen oder Nadeln ab. Die Kristalle sind nicht hydratisiert
und sind nach dem Trocknen bei ioo' C
im Vakuum nicht hygroskopisch.
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Das so erhaltene kristalline Antibiotikum (die freie Base) ist in
Chloroform, Äthylacetat, Eisessig, Amylacetat, Butanol, Benzol und Aceton leicht
und in Methanol, Äthanol, Äthyläther und Isopropanol etwas schwerer löslich. Die
freie Base ist in heißem oder kaltem Wasser oder Petroläther nahezu unlöslich, löst
sich jedoch leicht in wäßriger Säurelösung (z. B. 0,05 n-F-Ssigsäurc oder
Salzsäure). In wäßrigem Alkali ist sie unlöslich.
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Die im Vakuum getrockneten Kristalle der freien Base schmelzen bei
207 WS 209' iM offenen Kapillarröhrchen in einem Ölbad. Der Schmelzpunkt
beträgt 2.2o bis 222'
C; der Erweichungsgrad liegt bei 215'
C. Die
spezifische Drehung der freien Base ist.
| r«122 |
| a]D 57 0 + 3" (absoluter Äthylalkohol, |
| c = 0,5), |
| 22 |
| -ID 53' ± 30 (o,o5 n-Essigsäure, c = 0,3). |
Im folgenden sind die bei Analyse der kristallinen im Vakuum bei iool getrockneten
freien Base erhaltenen Werte angegeben: Berechnet für C4.H7,N016:
C59,48; 118,68;
N
1,65; MethOxYl 7,31.
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Gefunden: C 59,24; H 8,64; N 1,76; Methoxyl
7,33.
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Der kristalline Stoff enthält keine nachweisbare Menge Halogen oder
Schwefel. In verdünnter wäßriger Säurelösting (o,o5 n-Essigsäure) ergibt er i. einen
Niederschlag mit Phosphor-Wolframs-äure, Pierinsäure, Methylorange un6 Reineckesäure,
2. keinen Niederschlag mit Silbernitra#t oder Quecksilberchlorid]Ösung;
3. er reduziert nicht Fehlingsche Lösung oder Tollenssches Reagenz; 4. er
reduziert Permanganat bei Raumtemperatur; 5. er verbraucht Bromwasser unter
Bildung einer trüben Lösung; 6. er ergibt mit Eisen(III)-chlorid-Lösung keine
Färbung, und 7. bei Zugabe eines gleichen Volumens konzentrierter Salzsäure
ergibt er eine braunrote Farbe, welche langsam braun wird, Das Konzentrat,
d. h. die wasserlösliche, bei der Ätherextraktion des Kulturfiltrats erhaltene
Fraktion, aus welcher der Äther in Anwesenheit von Wasser abgedampft wurde, kann
nach einer Reinigung durch Adsorption ebenfalls kristallisiert werden. Das Konzentrat
wird hierzu in einer io0/9 Aceton enthaltenden Benzollösung an einer Säule aus Kieselsäuregel
adsorbiert, und das Chromatogramm wird durch Eluieren mit Lösungsmittelmischungen
aus Aceton und Benzol, welche einen fortschreitend größeren Teil Aceton enthalten,
entwickelt. Der wirksame Stoff, der sich in einer einzigen Zone befindet, wird bei
einer Mischung von 30% Aceton in Benzol aus der Säule herausgewaschen (die so erhaltene
Ausbeute beträgt 8oO/o). Der nach Verdampfen des Lösungsmittels aus dem Eluat verbleibende
Rest kann leicht aus Isopropanol kristallisiert werden (Schmelzpunkt 207
bis 209' C).
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Säureadditionsprodukte der freien Base (Salze von. Mineralsäuren,
z. B. das Hydrochlorid" Sulfat, Phosphat und Salze organischer Säuren, z. B. das
Citrat, Tartrat, Gluconat und das Salz der p-Toluolsulfonsäure) können nach den
üblichen Verfahren erhalten werden, wobei wasserlösliche Salze von pharmakologisch
erwünschten Säuren bevorzugt sind. Das Hydrochlorid kann so nach einer der folgenden
Methoden erhalten werden: a) durch Einleiten von trockener Chlorwasserstoffsäure
in eine Ätherlösung der freien Base, b) durch Lösen der freien Base in absolutem
Methylalkohol, Zugabe einer äquivalenten Menge von methanolischer Salzsäure, Entfernung
des Lösungsmittels durch Verdampfung in einem Kohlendioxydstrom und mehrmaliges
Auswaschen des Rückstandes mit trockenem Äther, c) durch Lösen der freien Base in
absolutem Äther, tropfenweise Zugabe einer methanolischen Salzsäurelösung bis zur
vollständigen Ausfällung, Abzentrifugieren des Niederschlags und mehrmaliges Auswaschen
mit trockenem Äther.
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Das amorphe Hydrochlorid (Schmp. 157 bis 159' C in einem offenen
Kapillarröhrchen in einem Ölbad) ist in Methanol, Äthanol und Aceton leicht löslich,
in Wasser löslich und in Äthyläther und Hexan unlöslich. Seine spezifische Drehung
beträgt laI'DJ = -54' ± 3' (absolutes Methanol, c = o,6).
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Es folgen Angaben über weitere Eigenschaften der kristallinen freien
Base: Craig-Verteilung: Man löst in einer Mischung aus Äthyläther und 2% wäßrigem
NaH2P04 (Pli 4,5) und läßt die Lösung durch ein aus vierundzwanzig Röhren bestehendes
Craig - Verteilungssystern laufen. Die maximale biologische Wirksamkeit und
das Ultraviolettabsorptionsmaximum von :24o mu traten bei Röhre 6 auf, wo
man
Ausbeuten von über 95 0/0 erzielte. Keinerlei Anzeichen
deuteten auf die Anwesenheit noch eines anderen Stoffes.
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Ultraviolettabsorption, gerneSSen ini 2'/o NaH2P04-DieUltraviolettabsorptionskurvezeigtbei24im,tt
ein Maximum EI"o cm = 158, gemessen in Methanol beobachtete man ein Maximum
bei 240 mY, cm = 157.
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Polarographische Messungen
| Konz. 1 Electrolyt PH id
E 1/, v.. S C E |
| 0,10/, o,iMLiCI-Me0H 5,5 (i."") -i,og
(E |
| CJ% o,iMLiCI-Me0H |
| + o,o:rO/O Gelatine 3,1 -0199 |
| 0,05 % 2 0/, wäßriges |
| NaH.p04 ..... 4,6 2,o _I,07 |
| 0,05 "/, 2)/" wäßriges |
| NaH 2p04 |
| +o,o20/,Gelatine14,6 1,6 -o,85 |
Ultrarotabsorption Das Ultrarotabsorptionsspektrum wurde von den Kristallen in,
Paraffinöl (Nujol) gewonnen. Fig. i ist eine graphische Darstellung der so erhaltenen,
in der nachstehenden Tabelle wiedergegebenen Werte
| 3,45 2899 9,43 io6o |
| 5,76 1736 9,67 1034 |
| 5,88 1701 9,89 ioii |
| 6,11 1637 io,ii 989 |
| 6,83 1464 10,40 962 |
| 7,01 1427 10,59 944 |
| 7,24 1381 io,78 928 |
| 7,66 1305 10,95 913 |
| 7,87 1271 11,46 873 |
| 8,o8 1238 11,61 861 |
| 8,38 1193 ii,go 840 |
| 8,62 116o 12,18 821 |
| 8,86 1129 12,42 805 |
| g,oi Mio i2,8o 781 |
| 9J3 1095 13,48 742 |
| 9,30 1075 14,51 689 |
Das Verhalten des erfindungsgemäßen Antibiotikums in Form der kristallinen Base
bei einer aufsteigenden Papierchromatographie bei :26'
C unter Verwendung
einer Kultur von Micrococcus pyogenes var. aureus als Testorganismus ist nachstehend
angegeben. Die Lage des Antibiotikums (Rf) wird in jedem Falle durch eine ganz bestimmte
Wachstumshemmungszone angezeigt, wenn das Chromatogramm auf ein mit dem Testorganismus
besätes Agarmedium aufgebracht wird. Bestimmung von Ri
| Entwick- |
| System lungszeit RF |
| 1 (Stunden) |
| A. Benzol : Wasser : Essig- |
| säure = 1 : 9 : 05 ........... 4 0,80 |
| B. n-Butanol: Wasser - Essig- |
| säure = 4: 5: 1 ............ 16
o'90 |
| C. o,2 n-Essigsäure ............. 4 o,8o |
| D. Wasser, gesättigt mit n - Butanol 4
0,95 |
Die folgenden Beispiele erläutern dasVerfahren, nach welchem das erfindungs-gemäße
Antibiotikum ZD erhalten werden kann. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele
beschränkt.
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Bei,spiel I Herstellung des Inoculums I. Stadium: Pilz-Fleisch-Extrakt
oder Sojabohnen-Infusion-Schrägagar von Streptomyces sp. WC36:28 wird verwendet,
um 5oo-ccm-Kolbe.n, von welchen jeder i oo ccm des folgenden Keimmediums
enthält, zu impfen: i,511/o Sojabohnenmehl, :21/o, Glucose, o,i% Natriumchlorid,
o,5%, Calciumcarbonat, o,ooo5% CoCL2X6H20 und Leitungswasser q. s. ioo ccm.
Das Medium wird mit i:2n-NaOH vor der Sterilisation in einem Autoklav auf einen
pli-Wert von 6,8 bis 7,2 eingestellt. Die SteriUsation dauert
30 Minuten bei 121' C.
Die Kolben werden dann geimpft. Die Inkubationszeit
beträgt 7:2 Stunden bei 25' C, während welcher Zeit die Kolben sich
auf einer Schüttelmaschine mit i2o Bewegungen von 5 cm Länge/Minute befinden.
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II. Stadium: Nach den 72 Stunden werden aus den Kolben des
ersten Stadiums 15 ccm steril in zwei i-I-Schüttelkolben mit Ansatzrohr übertragen.
Die Schüttelkolben enthalten beide 300 ccm desselben Keimmediums, wie es
im ersten Stadium verwendet wurde. Die Inkubationszeit beträgt 48 Stunden bei
25' C unter denselben Bedingungen wie im ersten Stadium.
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Gärung: Zu io 1 eines Gärungsmediums bestehend aus: Soj abohnenmehl
3 0/9, Dextrose 2,2 0/0,
Na,triumchlorid o,il/o, Calciumearbonat o,25%,
Cobaltchlorid 0,0005'101, Schweineschmalz o,41/o und Leitungswasser q. s.
in einem 18,9 1 fassenden Behälter aus rostfreiem Stahl wird der Inhalt eines
der Kolben des zweiten Stadiums zugegeben. Das Gärungsmedium war vorher
15 Minuten bei i?-i' C
dampfsterilisiert worden. Man läßt dann die
Gä-
rung bei 25' C unter mechanischer Durchrührung mit 300 Urndrehungen/Minute
und belüftet mit einer Geschwindigkeit 61 cm/Minute (Oberflächengeschwindigkeit
61 cm/Mintite). Der positive Behälterdruck wird auf 0,35 kg/qcm gehalten.
Man fügt Schweineschmalz oder Brennöl als Antischaummittel zu. Nach 84stündiger
Gärung wird das Medium mit konzentrierter 1-12 S 04 auf einen
pli-Wert
von 2 bis 3 eingestellt und dann unter Verwendung einer Filtrierhilfe filtriert.
Das filtrierte Medium wird zweimal Mit 1/4Volumen Äthyläther mit einem pli-Wert
von 6,6 extrahiert. Man läßt den Äther im Vakuum in Anwesenheit von Wasser
verdampfen, wobei man erstens eine kleine Menge eines wasserunlöslichen Öles und
zweitens eine wasserlösliche Fraktion erhält. Wenn das wasserunlösliche
01 mit Petroläther extrahiert wird, erhält man einen Niederschlag mit 25oo
Verdünnungseinheiten/mg. Die wasserlösliche Fraktion ergibt nach dein Trocknen durch
Ausfrieren und der Umkristallisation aus 6o' heißem Isopropanol ein reines Produkt
mit einer Wirksamkeit von etwa 7 bis io ooo Verdünnungseinheiten/mg. Beispiel
II Herstellung des Inoculums I. Stadium: Das Verfahren ist dasselbe wie im Beispiel
I, Stadium I.
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II. Stadium: Einer der im ersten Stadium nach 72stündiger Inkubationszeit
erhaltenen Kolben wird verwendet, um eine 18,9 1 fassende, belüftete, 12
1 desselben Keimmediums wie im ersten Stadium enthaltende Flasche zu impfen.
(Das Medium war vor der Impfung bei 121' C dampfsterilisiert worden.) Das
Medium wird mit 1.2 n-Na OH auf einen p_H-Wert von 6,8 bis
7,2 eingestellt und dann 11/2 Stunden bei 1:21' dampfsterilisiert. Man läßt
dann weitere 48 Stunden bei 2,5' keimen, wobei man mit einer Geschwindigkeit
von 1 1 je Liter Medium je Minute belüftet.
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Gärung: Zu 189 1 eines Gärungsmediums, bestehend aus: Soj abohnenmehl
3 1/o, Dextrose 2,2 O/o, Natriumchlorid o,il/o, Calciumcarbonat o,:25%, Cobaltchlorid
o,ooo5"/o, Schweineschma,1z-0,4'/o und Leitungswasserq.s. In einen 3801 fassenden
Behälter aus kohlenstoffhaltigem Stahl wird der Inhalt einer der Flaschen des zweiten
Stadiums zugegeben. Man läßt dann die Gärung bei 25' C unter mechanischer
Rührung bei i2o Umdrehungen/Minute und einer Belüftungsgeschwindigkeit von
368 l/Minute (Oberflächengeschwindigkeit 31 Cm/
Sekunde) fortschreiten.
Es wird ein positiver Behälterdruck von 0,70 kg/qcm aufrechterhalten, wobei
man Schweineschmalz oder Brennöl wenn nötig als Antischaummittel zugibt. Nach 84stündiger
Gärung wird das Medium mit konzentrierter H2 S 04 auf einen pli-Wert von
2 bis 3 eingestellt und dann unter Verwendung von Hyflo als Filtrierhilfe
filtriert. Das filtrierte Medium wird dann wie im Beispiel I zur Erzielung des Konzentrats
und des kristallinen Antibiotikums behandelt. Das kristalline- Antibiotikum kann
auch auf die folgende Weise aus dem filtrierten Medium gewonnen werden: etwa
2630 1 des filtrierten Mediums werden auf einen pli-Wert von etwa
7 neutralisiert und mit Amylacetat in einem zweistufigen Gegenstromsystem
extrahiert (4: 1 Volumenverminderung). Die erhaltene Amylacetatlösung (681
1) wird auf die gleiche Weise mit Wasser mit einem pi-Wert von 2 bis
2,5 extrahiert (4:1 Volumenverminderung). Die wäßrige Lösung (170
1) wird dann mit etwa 35 1 neutralem Benzol (pli-Wert etwa
7 bis 7,5) unter Umrühren extrahiert. Nach Konzentrierung auf etwa
4,5 1 wird der Benzolextrakt mit einem gleichenVolumenWasser mit einem pli-Wert
von etwa 2 bis 2,5 extrahiert, und die erhaltene wäßrige Lösung wird
zur Erzielung der kristallinen Base neutralisiert. Die kristalline Base wird dann
abfiltriert. Beim Trocknen erzielt man 144 g
der Base mit einer Wirksamkeit
von 5ooo Verdünnungseinheiten/mg. Bei der Neutralisation des Wasserextrakts des
Amylacetats und des Wasserextrakts des verbrauchten Benzols erzielt man noch einmal
etwa 2o g des kristallinen Antibiotikums. Die Umkristallisation des Antibiotikums
durch Lösen der Kristalle in heißem 7o'/oigem wäßrigem Isopropanol und Zugabe von
Wasser bis zum Verschwinden der Trühung ergibt 114g reines Antibiotikum mit einer
Wirksamkeit von 7000 Verdünnungseinheiten/mg.
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Die folgende Tabelle zeigt die Gärungswerte, wie man sie bei den Gärungen
von Beispiel I und II erzielte.
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Das erändungsgemäße Antibiotikum kann zur Behandlung verschiedener
Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier verwendet werden, unter an-
| io-I-Ansatz (i) io-i-Ansatz (z) i89-1-Ansatz |
| S. aureus S. aureus S. aureus |
| Ver- Ver- Ver- |
| Std. dünnungs- pli dünnungs- Std. PH dünnungs- |
| P. ein- ein- ein- |
| heiten/CM2 ileiten/CM2 heiten/cm2 |
| 0 7,4 - 7,3 0 7,2' - |
| 36 7,5 480 7,5 56o 48 6,5 35 |
| 6o 7,4 560 7,5 400 72 6,7 70 |
| 84 7,5 56o 7,3 48o 84# 6,6 140 |
| Filtrat 7,7 560 7,5 56o 149 |
| (von |
| 84 Std- |
| Gär- |
| medium) |
derem bei Infektionen durch die vorstehend in Verbindung mit dem
antibiotischen Wirksamkeitsbereich genannten Mikroorganismen. Das Antibiotikum kann
als solches in einer der üblichen Arzneimittel- oder Rezeptformen oral parenteral
oder lokal verwendet werden. Das Antibiotikum kann auch neben oder in geeigneter
Mischung mit verschiedenen anderen Antibiotika (z. B. Neornyein) oder Chemotherapeutika
(z. B. N-oxy-2-pyridinäthion) verwendet werden.
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Die Erfindung kann weitgehende Abänderungen erfahren, ohne daß dadurch
ihr Rahmen verlassen wird.