DE1792817C2 - Tenebrimycin-Antibiotikum II und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das Tenebrlmycln-Antibiotikum Tenebrimycin Il mit der In Anspruch 1 angegebenen Kennzeichnung 'und ein Verfahren zu dessen Herstellung (Anspruch 2).

Tenebrimycin II kann als Faktor eines neuartigen antiblotischen Komplexes hergestellt werden, der die sieben Faktoren Tenebrimycin 1, Γ, 1!, Ill, IV, V und VI umfaßt, von denen jeder antlbiotlsche Aktivität aufweist. Der Komplex Ist als freie Base In Wasser und in Dimethylsulfoxid löslich, langsam löslich In Methanol und unlöslich in Aceton, höheren Alkoholen, Dioxan, Äthylacetat, Dläthyläther, Acetonitril, Methylisobutylkcton und Kohlenwasserstoff-Lösungsmitteln. Der freie Basen-Komplex Ist stabil bei Gefriertemperaturen, bei Zimmertemperatur und bei 37° C für die Dauer von wenigstens 8 Wochen innerhalb eines pH-Bereiches von

I bis 11, die unterscheidbaren Banden Im Infrarot-Absorptionsspektrum über einen Bereich von 2 bis 15 um sind folgende: 3,02 (breit), 3,15, 5,82, 6,26, 7,43, 8,8 (breit) und 9,7 (sehr breit) um, positive Reaktion bei den Ninhydrin-, Anthron- und Elson-Morgan-Tests, beim Lowry-Proteln-Test geringe positive Reaktion und negative Reaktion beim Biuret- und Sakaguchl-Test. Dieser Antibiotika-Komplex ist in der DE-PS 16 17 451 beschrieben.

Tenebrimycin II ist eine weiße feste Substanz. Elektrometrische Titration in Wasser läßt titrierbare Gruppen mit pK'a-Werten von etwa 5,7, 6,7, 7,7 und 8,7 erkennen.

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Tenebrimycin

II als ein Mineralöl-Mull wird In der Figur gezeigt. Die unterscheidbaren Banden Im infraroten Absorptionsspektrum über den Bereich von 2 bis 15 um sind folgende: 5,02, 3,14, 6,05, 6,23, 7,4, 8,5, 8,75, 9,17, 9,65, 10,11, 11,15, 11,7 und 12,6 um.

Tenebrimycin II bildet ein Acetyl-Derlvat, das eine spezifische Drehung \z]j) von etwa +130° aufweist, wenn die Konzentration der Verbindung 1 Gew.-% auf das Öl bezogen In wäßriger Lösung beträgt. Das Derivat hat keine restlichen titrierbaren Gruppen. Die Elementar-Zusammensetzuing zeigt, wie durch Mikroanalyse festgestellt wurde, daß 4 Acetylgruppen zur Struktur von Tenebrimycin Il hinzugekommen sind.

Säure-Additlonssalze von Tenebrimycin II können durch herkömmliche Verfahren zubereitet werden. Es können entweder organische oder anorganische Säuren zur Salzbildung verwendet werden. Ein bequemes Verfahren zur Herstellung solcher Salze besteht in der Hinzufügung einer Lösung der salzbildenden Säure zu einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums. Im Falle von unlösliehen Säure-Addltionssalzen scheidet sich das Salz aus der Lösung ab und läßt sich leicht trennen mittels der herkömmlichen Arbeltsweisen, wie Filtration oder Zentrifugieren.
Sollte es vorkommen, daß das erwünschte Additionssalz nicht ohne weiteres ausfällt, kann man die Ausfällung fördßrn. Indem man entweder die Lösung auf kleineres Volumen konzentriert oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel zugibt, wie Aceton oder dergleichen. Das Säure-Addltionssalz kann bequem wieder zur freien Basenform des Antibiotikums umgewandelt werden, indem man eine wäßrige Lösung des Salzes über ein anionisches Austauscherharz im Hydroxylkreislauf führt. Tenebrimycin II kann von den verschiedenen Faktoren, die den erwähnten Tenebrimycin-Komplex bilden.

und von anderen Antibiotika mit ähnlichen Eigenschaften durch paplerchromatographische Verfahren unterschieden werden, wie z. B. durch das folgende: Die Chromatographie wurde In der herkömmlichen absteigenden Weise durchgeführt bei 23⁰C ± 1 auf Whatmann Nr. 1 Papier vom Format 190x464 mm.

Die Ergebnisse werden in Tabelle I gezeigt. Die Wanderungskonstante für jedes der angeführten Antibiotika drückt man besser mit einer R_f-Konstante aus, als durch den herkömmlichen R,-Wert. Der R,.-Wert drückt das Verhältnis der Entfernung, die vom Antibiotikum durchmessen wurde, in bezug auf das Blattende und nicht auf die Lösungsmittelfront aus.

Dieses Verfahren, die Konstante auszudrücken, wurde gewählt im Hinblick auf die Talsache, daß die Lösungsmittelfront über das Blattende hinaus, während des Zeitraumes, der für die meisten Lösungsmittelsysteme ungewandt wurde, vorgedrungen war.

Tabelle I

Papier-Chromatographie der Tenebrimycine

und bekannter Antibiotika 'nit ähnlichen Eigenschaften

Losungsmittel-System 1 und R^-Werte ABCD

Tenebrimycin-Komplex	-	-	-	0,65	0,32	0	0
Tenebrimycin I	0,20	-	-	-	-	-	-
Tenebrimycin Γ	0,27	-	-	-	-	-	-
Tenebrimycin II	0,40	0,17	0,32	-	-	-	-
Tenebrimycin III	0,40	0,34	0,41	-	-	-	-
Tenebrimycin IV	0,49	0,20	0,32	-	-	-	-
Tenebrimycin V	0,55	0,22	0,35	-	-	-	-
Tenebrimycin VI	0,71	0,31	0,38	-	-	-	-
Kanamycin	0,35	0,35	0,4 i	0,65	0.42	0	0
Kanamycin B	0,57	0,26	0,32	0,70	0,29	0	0,05
		0,51	0,39
Gentamycin	0,83	0,75	0,62	-	0,51	0	0,1
		0,95
Catenulin	0,44	0,25	0,34	0,65	0,35	0	0
Neomycin	0,60	0,12	0,19	_		0	0,05

Die angewandten Lösungsmittelsysteme und die Dauer der Chromatographie sind unten angegeben.

A = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2% p-Toluol-

sulfonsäure, für 40 Stunden
B = 80% wäf3ilges Äthanol, plus 1,5% Natriumchlorid, für 40 Stunden, auf Papier gepuffert, mit 0,95 SuI-

fat-Bisulfat
C = Propanol, Pyrldln, Essigsäure und Wasser

(15: 10:3: 12) für 40 Stunden
D = Wasser mit Methylisobutylketon gesättigt, plus 1%

p-Toluolsulfonsäure für 6 Stunden
E = Propanol und Wasser (1:1) für 24 Stunden auf

Papier gepuffert mit 0,75 m Phosphat, pH 4,0
F = n-Butanol mit Wasser gesättigt, für 18 Stunden
G = n-Butanol mit Wasser gesättigt, plus 2% p-Toluolsulfonsäure und 2% Piperidin, für 18 Stunden.

Diese chromatographischen Daten zeigen folgendes: Während bei jedem einzelnen Lösungsmittelsystem einige der Faktoren, die den Tenebrimycin-Komplex ausmachen, als untereinander identisch oder identisch mit anderen bekannten Antibiotika erscheinen, beweist die Chromatographie mit einer Vielzahl von Lösungsmittelsystemen deutlich Ihre Nicht-Identität.

Tenebrimycin II besitzt eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen, die tierischem oder pflanzlichem Leben gegenüber pathogen sind. Die Hemm-Konzentratlonen des Tenebrlmycins II gegen eine Anzahl von Organismen werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Die Minimal-Hemm-Konzentratlonen wurden ciurch das Agar-Verdünnungsverfahren bestimmt.

Tabelle II

Test-Organismus	minimale Hemmkonzentration") ^g/ml.) Tenebrimycin II
Staphylococcus aureus 3055	6,25
Bacillus subtilis	< 1,56
Mycobacterium avium	< 1,56
Streptococcus faecalis	3,12
Lactobacillus casei	50
Leuconostoc citrovorum	50
Escherichia coli No. 1	25
Escherichia coli No. 2	50
Proteus sp. No. 1	100
Proteus sp. No. 2	25
Pseudomonas sp. No. 2	25
Pseudomonas sp. No. 5	12,5
Klebsiella-Aerobacter No. 14	12,5
KJebsiella-Aerobacter No. 15	12,5
Salmonella sp. No. 1	25
Vibrio metschnikovii	12,5
Agrobacterium tumefaciens	25
bfwinia amylovora	< 1,56
Pseudomonas solanacearum	25
Xanthomonas phaseoli	12,5

') Die minimale Hemmkonzemration wurde bestimmt mi! der freien Base.

Die akuie Toxlzltät des Tenebrimycin II wurde an Mäusen bestimmt.

Der LD₅i)-Wert, ausgedrückt in mg/kg der freien Base, für Tenebrimycin II, das Mäusen Intravenös verabreicht wurde, ist 385.

Der Tenebrimycin H enthaltende antlblotlsche Komplex wird hergestellt durch Züchtung eines bestimmten Actinomyceten-Stammes unter aeroben Bedingungen In einem geeigneten Züchtungsmedium, so lange, his dieses Medium wesentliche antibiotische Aktivität enthält. Das Tenebrimycin II kann gewonnen werden durch Anwendung bestimmter Isollerungs- und Reinigungsmaßnahmen (vgl. Anspruch 2).

Wegen der Unsicherheit taxonomlscher Untersuchungen bezüglich der Galtung Sireptornyccs, bleibt immer ein Element des Zweifeis an der Klassifizierung eines neuentdeckten Organismus haften. Dennoch - soweit es bewiesen werden kann - gleicht der Organismus, der zur Herstellung des Antibiotikums verwendet wird, nicht einer Streptomyces-Gattung, die von Waksman in »The Actinomycetes«, Vol. II, The Williams and Wllkens Company (1961), beschrieben sind, um kultur-Vergleiche zu garantleren.

Der Organismus Ist ein spiralförmiger, hitzeertragender, aerober bis mlkroaerophiler Streptomyces mit länglichen glattwandigen Sporen. Er ist Insofern einmalig, als er durch verhältnismäßig niedrige Intensitäten künstlichen Lichts gehemmt wird. Wegen dieser seiner Eigenschaft wurde der Name Slreptomyces tenebrarlus sp. n. für diesen Organismus gewählt.

Der Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert, indem Teile der Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähr-Agar ausgestrichen wurden. Die Einsaat-Nähr-Agarplatten wurden bei 25 bis 35 C inkubiert, bis Wachstum sichergestellt war. Am Ende der Inkubationszeit wurden Kolonien der Antibiotikum produzierenden Organismen mit einer sterilen Impföse aus Platin auf Schrägagar übertragen. Der Schrägagar wurde dann inkubiert, um geeignete Impfmengen für die Herstellung des Antibiotikums zu erhalten. Der Stamm des Organismus, der für die Herstellung des antiblotischen Komplexes verwendet wurde, ist bei der American Type Culture Collection in Washington, D.C. hinterlegt worden unter der Kultur-Nummer: ATCC 17920.

Die bei den taxonomischen Versuchen über S. tenebrarius ATCC 17920 angewandten Verfahren sind die gleichen, wie sie gewöhnlich bei der Taxonomie von Actinomyceten gehandhabt werden. Züchtungsmerkmale wurden nach 14tägiger Inkubation beobachtet. Die Morphologie wurde besiimmi auf Ctapek's-Peptonagar und Bennetfs-Agar während einer 2- bis 7tägigen Inkubation. Wirkung auf Milch und die Reduzierung von Nitrat wurde nach 7 und 14 Tagen beobachtet, Schwefelwasserstoffproduktion nach 24 bis 48 Stunden und Kohlenstoff-Verwertung nach 10 Tagen. Wenn nicht anders angegeben, wurden die Züchtungen bei 37° C inkubiert. Kohlenstoff-Verwertungsuntersuchungen wurden durchgeführt gemäß dem Verfahren, das von Pridham und Gottlieb, J. Bact., 56, 107 (1948) beschrieben wurde.

Die Ergebnisse der taxonomischen Versuche sind In den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die Farbblocks nach Maerz und Paul, »Dictionary of Color«, McGraw Book Company (1950). Die Farben, welche durch die Farbblocks versinnbildlicht werden, sind in die ISCC-NBS Farbnamen abertragen worden, wie sie im »Circular 553«, U.S. Department of Commerce, National Bureau of Standards, 1955, enthalten sind.

Mikroskopische Morphologie, Züchtungscharakteristika und Physiologie von S. tenebrarlus ATCC 17920 Morphologie:

Auf Czapek's Peptonagar bilden sich verzweigte Sporenformen in unregelmäßigen Klümpchen auf dem Luftmycel. Isolierte Sporen sind selten. Das intakte

ίο Luftmycel kann leicht vom Substrat gelöst werden. Reife Sporenketten bilden gewöhnlich 5 bis 6 offene Spiralen. Die Sporen sind länglich bis zylindrisch. Unter dem Elektronenmikroskop betrachtet erscheinen die Sporen glatt und messen 0,7 bis 1,3 zu 2,0 bis 2,1 Mikron. ScIerollen wurden auf Bennett's-Medium beobachtet.

Kolonie Merkmale auf:

Czapek's-Agar:

Wachstumsmenge gering, Luftmycel dürftig; blaß orangegelb (11-A2); Sporulatlon gut; Rückseite blaß orangegelb (11-A2); lösbares Pigment leicht rosa (1-Bl)
CzapekVPepton:

Wachstum reichlich; Luftmycel reichlich; hellgelblichbraun mit weißen Stellen (11-A4); Sporulatlon reichlich; Rückseite hellgraurot (4-Hl); lösbares Pigment graurosa (4-Bl)
Calclummalat-Agar:

Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig; blaß orangegelb (11-A2); Sporulatlon mäßig; Rückseite graurosa

(4-Dl); lösliches Pigment graurosa (4-Bl). Tyrosin-Agar:

Wachstum spärlich, Luftmycel spärlich; blaß orangegelb (9-B2); Rückseite blaß rotgelb (10-B3); spärliche Sporulatlon; kein lösliches Pigment. Anorganlsche-Salze-Stärke-Agar:

Wachstum maßig, Luftmycei mäßig, bräuniichrosa mit weißen Stellen (11-A4); Sporulatlon reichlich; Rückseite blaß gelb (1Ί-Β2); lösliches Pigment blaß ■to gelb (11-B2).

Glucose- Aspa>-agin-Agar:

Wachstum mäßig, Luftmycel mäßig, blaß gelb (9-D2) mit weißen Stellen (10-Al); mäßige Sporuiation; Rückseite blaß gelb (11-B2); kein lösliches Pig-5 ment.

Tomatenmark-Hafermehl:

Wachstum reichlich, Luftmycel reichlich, hellgelblichbraun (12-B5); reichliche Sporulatlon; Rückseite dunkel graurötlichbraun (40-J2); lösliches Pigment dunkelpurpurrot (47-H1).
Hefeextrakt:

Reichliches Wachstum, reichliches Luftmycel, blaß orange-gelb (11-A2) mit weißen Stellen; reichliche Sporulatlon; Rückseite mäßig gelb (11-J6); kein lösliches Pigment.
Nähragar:

Wachstum dürftig, dürftiges weißes (10-Al) Luftmycel; dürftige Sporulation; Rückseite graugrünlichgelb (12-12); kein lösliches Pigment. Bennefs Agar:

Wachstum mäßig; mäßig weißes (10-Al bis 10-Bl) Luftmycel; mäßige Sporulatlon; Rückseite blaß gelb (10-C2); kein lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch:
Dunkelgelber Wachstumsring an der Oberfläche;

Koagullerung und Peptonisatlon beobachtet. Nitratreduktion:
Positiv.

37 C

Wachstum

reichlich
43' C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr

reichlich
50 C Wachstum, Luftmycel und Sporulation sehr reichlich

55 C Spärliches Wachstum
60 C Kein Wachstum
Thermaler Totpunkt:

Sporen von einer Sporen-Suspension auf 75° C erhitzt bleiben 15 MIn. lang lebensfähig. Wurde die Sporen-Suspension auf 100° C 15 Min. lang erhitzt, waren keine Sporen mehr lebensfähig.
Sauerstoff-Spannung:

Wachstum entweder aerob oder mlkroaerophll In Stickkulturen.
Elsenlonen-Effekt:

Ein rotes lösliches Pigment wird nur bei Vorhandensein von EisendIDlonen produziert und die Intensität der Pigmentation Ist proportional zur Konzentration der EisendIDlonen in einem gegebenen Bereich.

H;S-Produktion:
Negativ.

Nährgelatine - völlige Verflüssigung nach 14 Tagen. Temperatur-Erfordernisse für Czapek's Peptonagar:
20 C kein Wachstum
26 C gutes Wachstum, kein Luftmycel
30' C Wachstum und Luftmycel mäßig, aber keine Sporulation

Luftmycel und Sporulation sehr

20

25 Effekt der Wasserstoff-Ionenkonzentration auf Czapek's Peptonagar beobachtet:

Kein Wachstum unter pH 5,0; von pH 5,0 bis 6,0 Wachstum und Luftmycel gui; Wachstum und Sporulation sind bei pH 7,0 reichlich; von pH 8,0 bis 8,6 sind Wachstum und Luftmycel gut. Das lösliche Pigment Ist am intensivsten bei pH 5,0 bis 6,0 und ist gering bis nicht vorhanden von pH 6,5 bis 8,6.

Lichtreaktion, beobachtet aul Czapek's-Agar:

Wachstum und Sporulation sind im Dunkel reichlich. Wenn Platten-Züchtungen 48 cm entfernt von einer 15-WaU-Standard-Fluorescenz-Kaltlichtquelle inkubiert werden. Ist das Wachstum spärlich und kein Luftmycel vorhanden. Wachstum und Luftmycel sind mäßig, wenn die Züchtungen 38 cm von einer gekühlten mattierten 60-Watt-Wolfram-Glühlampe inkubiert werden.

In der Tabelle, welche die Ergebnisse der Kohlenstoff-Verwertungs-Versuche zusammenfaßt, die mit S. tenebrarius ATCC 17920 durchgeführt wurden, haben die verwendeten Zeichen folgende Bedeutung:

+ = positiv

(+) — wahrscheinlich

(-) = fraglich

— = keine (nichts)

Tabelle III

Kohlenstoffverwertung von S. tenebrarius Stamm ATCC 17920

Kohlenstoffquelle

Ansprechen

Kohlenstoffquelle

Ansprechen

L(+) Arabinose -

L(+) Rhamnose —

D(-) Ribose +

D(+) Xylose -

D(—) Fructose +

D(+) Mannose +

D(+) Glucose +

Lactose (—)

Maltose +

Saccharose (+)

S. ienebrarlus ATCC 17920 erzeugt auch das bekannte anlifungale Antibiotikum Caerulomycin, das auch erzeugt wird von Streptomyces caeruleus (Cand. J. Microbiol. 5, 317 [1959]). Untersuchung einer Züchtung des letztgenannten Organismus ergäbe, daß er kein Tenebrimycin erzeugt unter den Bedingungen, die für seine Züchtung beschrieben wurden; auch unter veränderten Bedingungen kann er nicht dazu Induziert werden.

Ein zweiter Stamm der neuen Art Streptomyces tenebrarius sp. n. wurde ebenfalls isoliert und charakterisiert. Dieser Stamm von S. tenebrarius, der nur die Tenebrlmycine 1, T und 11 erzeugt, erhielt die ATCC Nummer 17921. Stamm ATCC 17921 unterscheidet sich vom Stamm ATCC 17920 prinzipiell dadurch, daß er kein Luftmycel oder Sporen erzeugt, auf den meisten Medien auch kein lösliches Pigment. Die Charakterisierungsdaten für diesen Stamm des Organismus sind in den folgenden Abschnitten zusammengefaßt. Die Verfahren, die

D(+) Trehalose +

L(+) Raffinose -

Cellulose -

inulin (■-)

i-inosit +

Mannit —

d-Sorbit (-)

Salicin (+)

Kontrolle (—)

(kein Kohlenstoff)

bei den iaxoncfn'schen Versuchen mit S. tenebrarius ATCC 17921 angewendet wurden, sind die gleichen wie die vorstehend bei der Beschreibung der Charakterisierung von S. tenebrarius ATCC 17920 erwähnten; die angewandten Zeichen haben die gleiche Bedeutung wie oben.

Mikroskopische Morphologie, Kulturcharakteristika und Physiologie von S. tenebrarius ATCC 17920

Morphologie:

Weder Luftmycel noch Sporen sind vorhanden; die Vegetations-Mycelfragmente in geringer Menge.

Kolonle-Charakteristika auf: Czapek's-Agan

Vegetatives Wachstum gut, gelblichweiß (9-Bl); kein Luftmycel; kein lösliches Pigment.

Czapek's-Pepton:

Vegetatives Wachstum reichlich, graugelb (12-B3); kein Luftmycel; leicht bräunliches lösliches Pigment.

Calclummalat-Agiir:

Vegetatives Wachstum mäßig, graugelb (12-B2); kein Luftmycel; leicht graubraunes lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar:

Vegetatives Wachstum mäßig, graugelb (11-B2); weder Luftmycel noch lösliches Pigment.

Anorganische-Salze-Stärke-Agar:

Vegatatlvmycel gut, hell gelbbraun (13-C6); kein Luftmycel; hellbraunes lösliches Pigment.

Glucose-Asparagln-Agar:

Vegetativwachsium mäßig, graugelb (11-D2); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.

Tomatenmark-Hafermehl:

Vegetatlvmycel mäßig, blaß gelb (10-B2); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.

Hefe-Extrakt:

Vegetatlvmycel mäßig, hellgelbbraun (12-E5); kein Luftmycel oder lösliches Pigment.

Nähragar:

Vegetativwachstum mäßig, hellgelb (9-K4); kein

Luftmycel oder lösliches Pigment.
Bennett's-Agar:

Vegetativwachstum mäßig, graugelb (12-E4). kein

Luftmycel oder lösliches Pigment.
Wirkung auf Milch:

Rötlichgelber Wachstumsring an der Oberfläche.

Koagullerung und Peptonisation beobachtet.
Nitrat-Reduktion:

Positiv
H.S-Produktion:

Negativ
Nährgelatine:

Völlige Verflüssigung in 7 Tagen
Sauerstoff-Spannung:

Wachstum entweder aerob oder mikroaerophil in

Stickkulturen
Temperaturerfordernisse für Benett's-Medium:

Wachstum ist mäßig bei 26. 30, 43, 49 und 55 C und sehr reichlich bei 37^; C. Kein Wachstum bei 60 C. Das Vegetatlvmycel ist blaß gelbbraun bei unter 37' C und leicht rötlichbraun bei und über 43 C. Weder Luftmycel noch lösliches Pigment wurde bei irgend einer Temperatur beobachtet.

Tabelle IV

Kohlenstoff-Verwertung durch S. tenebrarius Stamm ATCC 17921

Kohlenstoffquelle

Ansprechen

KohlenstolTquelle

Ansprechen

L(+) Arabinose
L(+) Rhamnose
D(-) Ribose
D(+) Xylose
D(—) Fructose
D(+) Mannose
D(+) Glucose
LacKose
Maltose

Zur Herstellung des Tenebrimycin II dienen zweckmäßigerweise Züchtungsmedien, die relativ einfache Nährquellen enthalten. Zum Beispiel enthalten Medien, die für die Produktion von Tenebrimycin brauchbar sind, eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Glucose. Fructose, Mannose. Maltose. Starke und dergleichen. Eine besonders be\ orzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose. Außerdem enthalten die verwendbaren Medien eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie Peptone, hydrolysiertes Casein, Hefe, Aiminosäuren und dergleichen. Im vorliegenden Falle werden als Stickstoffquellen bevorzugt: Pepton, hydrolisliertes Casein und Glutamin.

Mineralsalze, z. B. diejenigen, welche Calcium-, Magnesium-, Nairium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat-, Phosphat- und Carbonat-Ionen liefern, können mit gutem Erfolg den Medien einverleibt werden, wenngleich ein Überschuß an Phosphat vermieden werden sollte, da er die Ausbeute an Antibiotikum herabzusetzen scheint. Eine Quelle von Wachstumsfaktoren, wie Hefe oder Hefeextrakt, kann ebenfalls mit guter Wirkung dem Me- *>5 dium zugefügt werden.

Wie es für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen nötig ist, sollten auch wichtige SpuSaccharose (—)

Trehalosc (+)

Raffinose —

Cellulose —

i-Inosit +

Mannit (—)

d-Sorbit (-)

Salicin (—)

Kontrolle —

(ohne Kohlenstoff)

renelemente dem Züchtungsmedium zugesetzt werden zur Förderung des Wachstums der erfindungsgemäß angewendeten Organismen. Solche Spurenelemente sind meistens als Verunreinigungen vorhanden, als zufällige Begleitstoffe beim Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums.

Submerse aerobe Züchtungsbedingungen sind tür die Produktion von Tenebrimycin speziell bevorzugt. Für die Herstellung relativ kleiner Mengen können Schüuelkolben und Oberflächenkulturen verwendet werden. Für die Herstellung großer Mengen jedoch ist die submerse aerobe Züchtung in sterilen Behältern vorzuziehen. Das Medium im sterilen Behälter kann mit einer sporulierten Suspension beimpft werden, aber wegen der Wachstumsverzögerung, die man bei Verwendung einer sporulierten Suspension als Inoculum festgestellt hat, wird die vegetative Form der Kultur bevorzugt. So vermeidet man die Wachstumsverzögerung und erreicht eine wirkungsvollere Ausnutzung der Fermentationsvorrichtungen. Dementsprechend Ist es ratsam, zuerst ein vegetatives Inoculum des Organismus durch Beimpfung einer verhältnismäßig geringen Menge des Züchtungsmediums mit der Sporenform des Organismus herzustellen, und

dann, wenn ein junges aktives Vegetativ-Inoculum erhalten wurde, dieses vegetative Inoculum steril in den großen Behälter zu überführen. Zweckmäßig wird ein Bruchteil des vegetativen Inoculums, etwa 4% der Masse des Mediums, in das es eingeführt wird, verwendet. Das Fermentationsmedium, in dem das vegetative Inoculum hergestellt wird, kann entweder gleich oder verschieden von dem Medium sein, welches für die großtechnische Produktion von Tenebrimycin verwendet wurde.

Der Organismus wächst Innerhalb eines relativ weiten Temperaturbereichs. Dennoch scheinen die Organismen am besten bei Temperaturen zwischen 30 und 50° C zu wachsen. Eine optimale Produktion von Tenebrimycin erfolgt bei Temperaturen zwischen 37 und 43^D C. Die Organismen, die Tenebrimycin erzeugen, sind lichtempfindlich und wachsen bei dessen Vorhandensein nur schlecht.

Somit sind Fermentationen, bei welchen die Organismen verwendet werden, möglichst ohne sichtbares Licht auszuführen. Übereinstimmend mit der bei submersen Züchtungsvorgängen gebräuchlichen Praxis wird sterile Luft über das Züchtungsmedium geleitet. Zu einem wirkungsvollen Wachstum der Organismen und Tenebrlmyclnherstellung beträgt das Luftvolumen bei der Tank-Produktion von Tenebrimycin über 0,1 Volumen Luft pro Minute pro Volumen des Züchtungsmediums, liegt aber vorzugsweise wesentlich höher. Wirkungsvolles Wachstum der Organismen und optimale Ausbeuten an Tenebrimycin erhält man, wenn die verwendete Luftmenge wenigstens ein Volumen Luft pro Minute pro Volumen Züchtungsmedium beträgt.

Die Konzentration von Tenebrimycln-Aktlvität im Fermentationsmedium kann bequem verfolgt werden während des Ablaufs der Fermentation, indem man Proben des Züchtungsmediums auf ihre hemmende Aktivität gegenüber dem Wachstum von Organismen hin prüft, die dafür bekannt sind, daß sie In Gegenwart von Tenebrimycin gehemmt werden. Zwe! der Organismen, die so bei der Verfolgung der Produktion von Tenebrimycin angewandt wurden, sind Klebsieila pneumoniae und Mycobacterium butyricum.

Der erstere Organismus wird hauptsächlich bei der wohlbekannter. Trübungsmessung verwandt, während der letztere beim Schalen-Platten-Verfahren verwertet wird.

Im allgemeinen tritt Maximaiproduktion des Antibiotikums innerhalb von 4 bis 7 Tagen nach der Beimpfung des Züchtungsmediums ein, wenn submerse aerobe Züchtung oder Schüttelkolben-Züchtung angewandt wird, und nach einer etwas längeren Zeit, wenn Oberflächenkulturen benutzt werden

Das Mycel und unaufgelöste Rückstände werden von der Fermentationsflüssigkeit durch herkömmliche Mittel, wie Filtration oder Zentrifugierung, entfernt. Die antlbiotische Aktivität ist in der gefilterten Flüssigkeit enthalten und kann daraus gewonnen werden durch Anwendung von Adsorptionsverfahren. Die Adsorptionsmittel sind die Kationen-Austauscherharze vom Typ »IRC-50« (schwach saures Polymethacrylatcarbonsäure-Harz).

Im allgemeinen ist das Verfahren zur Gewinnung des Tenebrimycins aus der Fermentationsflüssigkeit folgendes: Die gesamte Flüssigkeit wird filtriert mit einem Filterhilfsmittel, nachdem der pH-Wert der Mischung auf etwa pH 2 gesenkt wurde durch Zusatz einer Säure, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Chlorwasserstoff und dergleichen. Der pH-Wert des Flltrats wird auf einen Wert von etwa 5,5 eingestellt durch Zusatz einer konzentrierten Base, und dann wird die Mischung noch einmal filtriert. Das Flltrat wird durch eine Ionenaustauschersäule geführt, die mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf gepackt ist. Die Säule wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen und die antlbiotische Aktivität mit verdünnter Säure eluierl. Die Fraktionen, welche die antiblotlsche Aktivität enthalten, werden vereinigt und auf ungefähr 1/20 des ursprünglichen Volumens konzentriert. Der pH-Wert des Konzentrats wird erhöht auf etwa 11 durch Zusatz von konzentrierter Base, und das basische Konzentrat wird dann in etwa 6 Volumen Aceton gegossen, gut gemischt und gekühlt. Der mikrobiologisch inaktive Niederschlag, der sich abtrennt, wird durch Filtration entfernt. Der pH-Wert des Filtrats wird auf etwa 3,5 gesenkt durch Zusatz von 20%iger Schwefelsäure unter gründlichem Mischen. Der Tenebrimycin-Komplex fällt aus in Form des Sulfatsalzes, während das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation in der überstehenden Schicht zurückbleibt, die verworfen wird.

Tenebrimycin Il wird gewonnen durch weitere Fraktionierung des Tenebrimycin-Komplexes. Für die Fraktionierung wird das Tenebrimycin als ein Säure-Addltionssalz verwendet, vorzugsweise In der Form des Sulfates. Gefärbte Verunreinigungen können entfernt werden, indem man die Lösung mit etwa 5% (Gewicht/Volumen) Aktivkohle verrührt. Wirksame Entfärbung erhält man gewöhnlich, indem man die Mischung, welche die Kohle enthält, ungefähr eine Stunge lang rührt. Dann wird die Mischung filtriert, und mit dem Flltrat, welches das Tenebrlmycinsulfat enthält, wird eine Säule, gepackt mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf, beladen. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und die einzelnen Antibiotika, die den Tenebrimycin-Komplex bilden, werden nach und nach mit 0,1 η Ammoniumhydroxid eluier'.

Allgemein geht die Elution äußerst langsam vor sich, und eine sehr große Anzahl von Fraktionen ist gewöhnlich nötig, um die Fraktionierung des Komplexes zu bewerkstelligen. So erfordert z. B. die vollständige Fraktionierung von etwa 250 g Tenebrimycin-Komplex etwa 700 Fraktionen, von denen jede etwa 900 ml des Eluats ausmacht. Die ersten aktiven Fraktionen, die man erhält, enthalten die Tenebrimycin I, Γ und II. Darauf folgt eine Reihe aktiver Fraktionen, in denen Tenebrimycin II das einzige Antibiotikum ist.

Beispiel 1

Herstellung des Tenebrimycin-Komplexes durch Fermentation von S. tenebrarius ATCC 17920

Eine sporulierte Kultur von S. tenebrarius ATCC 17920 wird erzeugt, indem man den Organismus auf einem modifizierten Bennett^s-Schräg-Agar-Medium wachsen läßt, das die folgende Zusammensetzung hat:

55	Dextrin	1	g
	Hefe-Extrakt	2	g
	hydrolysiertes Casein	1	g
	Fleischextrakt	0,01	g
60	CoCl2 · 6H2O	20	g
	ausgewaschener Agar	1000	g
	deionisiertes Wasser auf	ml

Der pH-Wert des Mediums wird vor dem Autoklavieren auf pH 7 eingestellt. Der Schrägagar wird beimpft mit Sporen von S. tenebrarius ATCC 17920 und fünf Tage lang bei 37° C und ohne sichtbares Licht inkubiert. Das Wachstum auf dem Schrägagar wird mit Wasser bedeckt

und vorsichtig abgeschabt, um die Sporen zu entfernen und eine wäßrige Sporensuspsnsion zu erhalten.

Die so erzleite Sporeniuspension wird zur Beimpfung von 800 ml eines Mediums verwendet, das folgende Zusammensetzung hat:

Dextrose 0,05 %

Nährmehl (enthält 35-45% dispergier- 1,5 %

bares Protein)

Dextrin 700 1

(Kartoffeldextrin mit

niedrigem Chlorgehalt)

Kaliumchlorid 0,1 %

hydrolysiertes Casein 0,3 %

KH₂PO₄ 0,05 %

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 %

CaCl₂ · 2H₂O 0,025% deionisiertes Wasser

Das beimpfte vegetative Medium wird bei 37° C Stunden lang auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung inkubiert, die mit 250 U.p.M. arbeitet und einen Hub von 63,5 mm hat.

Ein 50-ml-Anteil der vegetativen Züchtung wird verwendet, um einen 44-l-Einsatzbehälter z-u beimpfen, der ein wäßriges Medium der folgenden Zusammensetzung enthält:

10

15

20

Dextrose

Sojabohnenkörner

KH₂PO₄

MgSO₄

KCl

CaCl₂ · 2H₂O

Antischaummittel

Dextrose

raffiniertes Sojabohnenöl

Sojamehl

NH₄Cl

CaCl₂

MgSO₄

NH₄NO₃

hydrolysiertes Casein

Antischaummittel

deionisiertes Wasser

4,0% 3,0% 3,0% 0,5% 0,3% 0,2% 0,1% 0,5% 0,2%

25

30

1 % 1,5 % 0,05 %

0,5 %

0,1 % 0,025% 0,025%

40

Das Medium des Einsaatbehälters wird bei 120^D C etwa Min. lang sterilisiert. Das Rühren mit einer Geschwindigkeit von 370 U.p.M. beginnt man unmittelbar nach der Beimpfung, und eine Belüftung mit einem Durchsatz von 0,0226 m' pro Min. wird während der ganzen Inkubationszeit aufrechterhalten. Nach Beendigung der Inkubationsperiode wird der Inhalt des Einsaatbehälters dazu verwendet, einen 1130-Liter-Fermenter zu beimpfen, der ein Medium folgender Zusammensetzung enthält:

⁵⁰

55

Vor der Bclnipfung wird das Fermentationsmedium Min. lang bei 120° C sterilisiert. Die Fermentation wird durchgeführt bei 37^ C unter Belüftung mit einem Durchsatz von 0,48 m¹ pro Min. während der gesamten Zelt von der Beimpfung an bis zur Ernte. Das Rühren wird mit 125 U.p.M. begonnen und bis zu 180 U.p.M. nach 12 Stunden gesteigert. Die Fermentation wird

5 Tage lang fortgesetzt. Die fermentierte Züchtungsflüssigkeit wird abfiltriert, um das Mycel und andere unaufgelöste Feststoffe zu entfernen. Die filtrierte Flüssigkeit enthält Tenebrimycin in einer Konzentration von 680 Einheiten pro ml.

Beispiel 2

Herstellung von Tenebrimycin I, Γ und II
durch Fermentation von S. tenebrarius ATCC 17921

Nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 wird S. tenebrarius ATCC 17921 als Antibiotikum-erzeugender Organismus benutzt. Die abfiltrierte Fermentationsflüssigkeit, die man gewinnt, enthält vorwiegend Tenebrimycin H nut geringeren Anteilen der Tenebrimycine I und Γ.

Beispiel 3
Isolierung des Tenebrimycin-Komplexes

Der pH-Wert '/on 880 Litern antlblotlscher Fermentationsflüssigkeit, wie In Beispiel 1 beschrieben, gewonnen, wird auf etwa pri 2 gesenkt durch Zusatz von ungefähr 10 bis 20 Litern 20%iger wäßriger Schwefelsäure.

Nachdem 45 kg eines handelsüblichen Flltrlerhllfsmittels der angesäuerten Flüssigkeit zugesetzt wurden, wird gründlich durchgemischt und filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen und die Waschlösung dem Flltrat zugesetzt.

Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 5,5 eingestellt durch Zusatz von 509blgem wäßrigen Natriumhydroxid. Etwa 4 kg eines handelsüblichen Flltrierhllfsmlttels wird zugesetzt und die Mischung gründlich gerührt und filtriert. Das Filtrat wird durch eine lRC-50-Säule mit den Abmessungen von 10,2 cm zu 1,83 m geschickt. Die Säule wird mit dem Harz im Ammonium-Kreislauf bis zu einer Betthöhe von 112 bis 114 mm gepackt. Nachdem das gesamte Flltrat die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 200 Litern destillierten Wassers gewaschen. Die antlblotlsche Aktivität wird dann während eines Zeltraumes von 12 bis 15 Stunden mit etwa 150 bis 175 Litern 0,1 η Schwefelsäure eluiert und das Eluat in 10-Llter-Fraktlonen abgenommen. Antiblotische Aktivität ist Im Eluat erkennbar, wenn dessen pH-Wert auf etwa pH 4 oder wenig darunter absinkt.

Während die Elutlon fortschreitet, fällt der pH-Wert des Eluats welter, bis er einen Wert von etwa pH 1,5 erreicht. Die Fraktionen, welche antlbiotlsche Aktivität enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 1/20 des Originalvolumens konzentriert.

Der pH-Wert des konzentrierten Eluats wird auf pH 11 eingestellt durch Zusatz von 50%lgem wäßrigen Natriumhydroxid, und das basische Konzentrat wird dann zu

6 Volumeneinheiten Aceton hinzugefügt. Die Mischung wird gekühlt und abgestellt, damit sich der Niederschlag ohne antlblotlsche Aktivität abtrennt. Die Mischung wird filtriert und der Filterkuchen, der Inaktiven Niederschlag enthält, wird mit Wasser gewaschen und verworfen. Der pH-Wert des Filtrats wird auf pH 3,5 unter gründlicher Vermischung des Zusatzes von 20%lger wäßriger Schwefelsäure eingestellt. Der Tenebrimycln-Komplex scheidet sich als Sulfat während der Behandlung aus und wird praktisch völlig abgeschieden, wenn der pH-Wert de- Lösung 4 oder einen geringfügig darunter liegenden Wert erreicht. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat, das Caerulomycin als Nebenprodukt der Fermentation enthält, wird verworfen. Der Filterkuchen, der

das Tenebrimycinsulfat enthalt, wird in einer möglichst geringen Menge Wasser gelöst und gekühlt. Alle Festbestandteile, die sich nicht leicht auflösen, werden verworfen, wie z. B. sämtliche Feststoffe, die während des Abkühlens ausfallen oder auskristallisieren. Die klare Lösung des Tenebrimycinsulfats wird über ein Dowex 1 χ I-Harz-Bett von 10,2 cm zu 2,13 mm im basischen Kreislauf geführt. Die antibiotische Lösung wird auf die Säule gegeben und nachfolgend 40 bis 50 Liter destillierten Wassers. Der Abfluß wird in 10-Liter-Fraktionen abgenommen, die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben und unter Vakuum zu einem dicken Syrup konzentriert, der getrocknet wird und den trockenen Tenebrimycin-Komplex ergibt.

Beispiel 4
Abtrennung der Tenebrimycln-Faktoren

Tenebrimycinsulfat wird erhalten durch Einstellen des pH-Wertes einer 20%lgen wäßrigen Lösung, die 258 g des Tenebrimycinkomplexes in freier Basenform enthält, auf 4,5, indem man konzentrierte Schwefelsäure hinzusetzt. Die Lösung des so hergestellten Tenebrimycinsulfats wird durch etwa einstündiges Rühren mit 5%lger (Gew./Volumen) Aktivkohle entfärbt. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat durch eine Säule von 9 χ 105 cm geschickt, die mit etwa 7 Liter lRC-50-Harz im Ammonium-Kreislauf gepackt worden ist. Nachdem das Flltrat, das das antibiotische Salz enthält, die Säule durchlaufen hat, wird diese mit etwa 17 Litern deionisiertem Wasser ausgewaschen. Die Elution der auf der Säule zurückgehaltenen antibiotischen Aktivität beginnt mittels 0,1 η Ammoniumhydroxidlösung bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 20 ml pro Min. Das Eluat wird in Fraktionen von etwa 900 ml aufgefangen, und jede Fraktion wird hinsichtlich ihrer mikrobiologischen Aktivität geprüft. Die den gleichen antibiotischen Faktor enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert, um die einzelnen getrockneten Tenebrlmycine zu erhalten. Dabei erscheint das Tenebrimycin Il wie folgt:

Fraktionen	vorliegendes Antibiotikum
1-34	inaktiv
35-53	Tenebrimycin I, Γ und Il
54-77	Tenebrimycin II
	Beispiel 5

Herstellung des Hellanthats des Tenebrimycin Il

Selbstverständlich kann man auch das Tenebrimycln-II-Helianthat herstellen:

Eine Lösung von 2 g von Tenebrimycin 11 in 22 ml Wasser wird hergestellt und durch Zusatz von 50% Schwefelsäure auf pH 5 eingestellt. Eine heiße 10%ige wäßrige Lösung von Methylorange wird dann der antibiotischen Lösung zugesetzt. Das Hellanthat von Tenebrimycin II trennt sich als Niederschlag ab und wird durch Filtration entfernt. Das feste Salz wird gründlich mit heißem Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und ergibt 3,5 g Tenebrimycin-11-Hellanthat.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche: IO

1. Tenebrimycln-Antiblotlkum II, gekennzeichnet durch folgende Parameter:

weiße Festsubstanz,

titrierbare: Gruppen, bestimmt durch elektrometrlsche Titration in Wasser, mit pK„-Werten von etwa 5,7:, 6,7; 7,7 und 8,7,
IR-Absorptlonsspektrum wie in der Figur, die Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Verfahren zur Herstellung von Tenebrimycin II gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tenebrarius ATCC 17920 oder ATCC 17921 in einem Medium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen submers züchtet, dann die auf pH 2 eingestellte Fermentationsflüssigkeit mit einem Filterhilfsmittel filtriert, das auf pH 5,5 eingestellte Filtrat nach einer Filtration durch eine Ionenaustauschersäule führt, die mit IRC-50 im Ammonium-Kreislauf gepackt ist, dann mit verdünnter Säure eluiert, die die antlbiotlsche Aktivität enthaltenden Fraktionen vereinigt und konzentriert, den pH-Wert des Konzentrats auf 11 einstellt und das basische Konzentrat In Aceton gießt und kühlt, den entstandenen inaktiven Niederschlag durch Filtration entfernt und den pH-Wert des Filtrats auf 3,5 senkt durch Zusatz von 20%iger Schwefelsäure zur Ausfällung des Antibiotika-Komplexes als Sulfatsalz, mit dem Sulfatsalz oder einem anderen Säure-Addltionssalz des Antibiotika-Komplexes, gegebenenfalls nach Entfernung von gefärbten Verunreinigungen, eine Säule, gepackt mit IRC-50 im Ammoniumkreislauf, belädt, mit Wasser wäscht und das Tenebrimycin II mit 0,1 η Ammoniumhydroxid eluiert.