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Nouveaux antibiotiques.
La présente invention concerne une nouvelle substance antibiotique et sa préparation.
L'invention a pour objet une substance antibiotique comprenant un complexe de ténébrimycines ou les antibiotiques distincts de ce complexe,de Mène que les mélanges de ces anti- biotiques distincts ou de leurs sels d'addition d'acides avec des acides pharmaceutiquement acceptables.
L'invention procure également un procédé de préparation d'un complexe antibiotique de ténébrimycines,de ténébrimycine I; I',II,III,IV, V, VI ou de leurs mélanges,suivant lequel on mot en culture une souche de Streptomyces tenebrarius dans un milieu de culture contenant des souches do carbone et d'azote assimi- labiés et des sels inorganiques en milieu aérobie en submersion' jusqu'à formation d'une quantité sensible de l'antibiotique re- cherché par le micro-organisme dans ce milieu de culture.
Le nouvel complexe antibiotique visé par la présente in- vention concerne au moins sept facteurs ayant chacun une acti- vité antibiotique. Le complexe sous forme de base libre, est soluble dans l'eau et le diméthylsulfoxyde lentement soluble dans le méthanol et insoluble dans la plupart des autres solvants organiques tels que acétone, alcools
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supérieurs , dioxane, acétate d'éthyle, diéthyléther, acét trile, méthylisobutylcétone et solvants hydrocarbonés. La @ libre du oomplexe est stable aux températures du réfrigérâmes , à la température ambiante et à 37 C pendant au moins huit se- maines dans une gamme de pH de 1 à 11.
Le spectre d'absorption infrarouge du complexe antibiotique, obtenu à partir d'une bouillie dans , l'huile minérale, est représenté dans la figure 1 du dessin an- nexé, Les bandes discernables dans le spectre d'absorption in- frarouge dans là gamme de 2 à 15 microns sont les suivantes:
3,02 (large), 3,15 , 5,82 , 6,26/u, 7,43 , 8,8/u (large), et 9,7/U (très large).
Dans une série d'essais chimiques ef- feotués avec le complexe, on a obtenu des réactions positives aux tests de la ninhydrine, de l'anthrone et à l'essai Elson-
Morgan. L'essai à la protéine de Lowry donne une réaction légère- ment positive. Les tests au biuret et de Sakaguohi sont néga- tifs,
Comme on l'a indiqué ci-dessus, le complexe antibiotique comprend au moins sept facteurs distincts.
Dans la nomenclature employée dans la'présente description, on utilisera le terme ténébrimyoine pour désigner le complexe an- tibiotique, tandis que les divers facteurs constituant le com- plexe seront désignés sous les noms de ténébrimyoine I, ténébri- myoine I', ténébrimycine II, ténébrimyaine III, ténébrimycine IV, ténébrimycine V et ténébrinyaine VI.
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Dans le complexe tel qu'on l'aboient couramment, la ténébrimy- cine I, la ténébrimycine I' et la ténébrimycine III sont pré- sentes en faibles quantités, Parmi les ténébrimycines restantes, la plus abondante apparaît être la ténébrimycine II, qui cons- titue environ 45 à 50% du complexe, et la ténébrimycine V, qui constitue environ 30% du complexe. La ténébrimyoine IV est pré- sente en quantités d'environ 15 à 20% tandis que la tnbrimy.. cine VI constitue environ 10% du complexe. Les ténébrimycines les plus abondantes ont été séparées et caractérisées, les des- criptions de leurs propriétés étant contenues dans les para- graphes qui suivent.
La ténébrimyoine II est une substance solide blanahe. Le titrage éleotrométrique dans l'eau indique la présence de groupes titrables ayant des valeurs de pK'a d'environ 5,7; 6,7; 7.7; et 8,7. La rotation spécifique de la lumière jaune du sodium à une température de 25 C pour ce fac 25 teur est [[alpha]]D + 159 lorsque la concentration de l'antibio- tique est de 1% en poids par volume en solution aqueuse. La micro-analyse indique que la ténébrimyoine II a sensiblement la composition centésimale suivante C:44,90; H:8,20; N;12,53; 0:33,24 (dosage direct),Le poids moléculaire apparent, tel qu'il est fourni par le titrage est d'environ 454, La formule 'empirique s'accordant le mieux avec ces données est C16H36N4O9.
Le spectre d'absorption d'infrarouge de la ténébrimyoine II, en bouillie dans l'huile minérale, est indiqué dans la figure 2 du dessin annexé. Les bandes discer- nables dans la gamme de 2 à 15 microns du spectre d'absorption
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infrarouge sont les suivantes : 3,02 ; 3,14 ; 6,05/u: 6,23 ; 7,4 ; 8,5 ; 8,75 , 9,17 , 9,65 , 10,11 , 15 , 11,7 et 12,6/u.
La ténébrimyoine II forme un dérivé 25 acétylé qui a une rotation spécifique [[alpha]]D25 = environ + 130 , lorsque la concentration du composé est de 1% en poids par vo- lume en solution aqueuse. Le dérivé n'a pas de groupes titrables restants. La oomposition élémentaire déterminée par microanaly- se indique que quatre groupes acétyles ont été ajoutés par subs- titution dans la structure de la ténébrimyoine II.
La ténébrimycine IV est une substance basique ayant des groupes titrables dont les valeurs de pK'a sont d'environ 5,3; 6,8; et 9,0, déterminées par titrage élec- trométrique dans l'eau. La rotation spécifique de la ténébrimy- oine IV, déterminée sur une solution aqueuse à 1% à une tempé- rature de 25 C est de +114 . La micro-analyse indique la com- position centésimale suivante pour la ténébrimyoine IV: C:41,66; H:7,78; N:15,02; 0:34,93 (dosage direct). Le poids moléculaire apparent déterminé d'après le titrage est d'environ 478. Ces données suggèrent pour la ténébrimyoine IV la formule empirique C16H36N5010.
Le spectre d'absorption infrarouge de la ténébrimycine IV, en bouillie dans l'huile minérale, est indiqué dans la figure 3 du dessin annexé, Les bandes discer- nables dans le spectre d'absorption infrarouge dans la gamme de 2 à 15 microns sont les suivantes ; 3,05 , ,17u, 5,85 ; 6,27/u; 7,46/u, 8,75/u; 9,7 ; 10,5 , 11,1 et 12,85/u.
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Le dérivé tétra-aoétylé de la ténébri- myoine IV est un solide cristallisé fondant à environ 265-267 C.
La rotation spécifique est de [[alpha]]D25 = +109 lorsque la oonoen. tration du dérivé est de 1% en solution aqueuse,
Le titrage électrométrique de la téné- brimycine V indique des groupes titrables ayant des valeurs de pK'a @ environ 5,5; 7,0; 8,0; et 9,1. La rotation spécifique de la lumière Jaune du sodium en solution aqueuse à 1% pour ce 25 faoteur, déterminée à la température de 25 C, est de [[alpha]]D@ = + 118 . La composition élémentaire déterminée par microanalyse est la suivante ; C:41,05; H:7,60; N: 23,62; 0:36,76 (dosage direct).
Les données analytiques et le poids moléculaire apparent de 424, déterminé d'après les données du titrage, suggèrent pour la ténébrimycine V une formule empirique C14H32N4O10,
La figure 4 du dessin annexé repré- sente le spectre d'absorption infrarouge de la ténébrimyoine V en bouillie dans une huile minérale, ce spectre présentant dans la gamme de 2 à 15 microns les bandes discernables suivantes 3,05/u: 3,19 ; 6,32 ; 7,45 ; 8,75 ;
9,7/u; 11,15/u ot 12,25 ,
Comme la ténébrimyoine IV, la téné- brimyoine V forme un dérivé tétra-aoétylé cristallisé, Le déri- vé fond aveo décomposition à environ 260 C etdonne uno rotation 25 spécifique [[alpha]]D@ = environ+109 , lorsque la concentration du composé est de 0,42 % dans l'eau.
La ténébrimyoine VI possède des groupes titrables ayant des valeurs de pK'a d'environ 5,6; 7.2; 8.2; et
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9,3 déterminées par titrage éleotrométrique dans l'eau. Les données du titrage suggèrent un poids moléculaire apparent de
396. La rotation spécifique de la lumière jaune du sodium par une solution aqueuse à 1% de ténébrimyoine VI à une température
25 de 25 C est de [[alpha]]D = environ +127 . La mioroanalyse indique la composition centésimale approchée suivante C:44,04,H;8,40;
N;13,78; 0:33,62 (dosage direct). La formule empirique la plus en accord avec les données ci-dessus est C16H36N4O9.
Le speotre d'absorption infrarouge de la ténébrimyoine.VI est indiquée dans la figure '5:du dessin annexé. Les bandes discernables dans la gamme de 2 à 15 microns sont les suivantes : 3.05 ; 3,19 ; 6,35 ; 7,47/u; 8,75/u;
9,8 ; 12,3 et 12,95 .
Une solution aqueuse à 1% du dérivé tétraacétylé de la ténébrimycine VI a une rotation spécifique d'environ +95 , à 25 C.
Les sels d'addition d'acide de la téné- brimyoine ou de ses constituants antibiotiques individuels peu- vent être préparés par des méthodes classiques, On peut utiliser des acides organiques ou minéraux pour la formation de sel, Une méthode appropriée pour la préparation de ces sels consiste à ajouter une solution de l'acide formateur de sel à une solution aqueuse de l'antibiotique, Dans le cas de sels d'addition d'a- aide insolubles, le sel précipite de la solution et on le sépare faoilement par des techniques classiques telles que filtration ou centrifugation. Dans le cas où le sel d'addition d'aoide
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1ABLEAUt CI,-ror-iat(izra.-14e Alt- IELR des ténébrirny es et d"antibiotilues connus a,3rant
EMI8.2
des propriétés semblables
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% Système solvant et valeur de ne -
EMI8.4
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G
<tb>
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Tenébrilcycine coaplexe - 0,65 0,32 0 0 Ténébri::3ycine I 0,20 Ténébrîmycïne 1' 0,27 Ténébrimycine II 0.40 o,17 0,32 tténébrimycine III 0,40 '0,,}4 0,41 - Tênébrlmycïne IV o,49 0120 0.32 TénibrimYc1ne V 0.55 0122 0.35 !"n'brimyc1ne VI 0,71 0131 0,38 - xana.myc1ne 0,35 0,35 o.41 0,65 0,42 0 0 X.c1n. B 0,57 o,2É ' 0,32 0170 0329 0 0.65 0,51 0,39 04tntamyo1ne 0.83 0,75 0,62 - 0151 0 0,.
0,95 c-Unu11ne o,44 0.25 0,34 0,65 0,35 0 0 , Jl4omyo1De 0,60 0,12 oig 0 0.05
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Le complexe ténébrimyoine et les fac- teura individuela qui constituent le dit complexe ont une action inhibitrice contre la croissance de microorganismes qui sont pathogènes à la vie animale et végétale, Les concentrations Inhibitrices du complexe et des ténébrimycines individuelles contre un certain nombre d'organismes sont indiquées dans le tableau suivante Lea concentrations Inhibitrices minimales sont déterminéea par la méthode de dilution de la gélose.
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1 A BLE A-.!L.JI
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03 R-A .RjH-naj. çoncentratio/ìbitrice minimale ¯¯Qzuy±1 Tnébrimycinea Ténébrimycine II Ténébrimycine IV Ténébrinycine V Ténébrimycine VI Stapbylococeus aureus 3055 6,25 6,25 6,25 6,25 3,12Bâ fus subtilis 1,56 .c 1,56 < 1,56 < 1,56 G ' .56 M3ib.eterium avium -<'L,56 <1,56 =-1,56 6,25 1,56 Sr2ococcus faecalis 6,25 3,12 1,56 3112 >,12 Lactobacillus case! 25 50 25 ^25 32;
5
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<tb> Leuconostoo <SEP> citrovorum <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 12,5
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 1 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 12,5
<tb> Proteus <SEP> sp. <SEP> No. <SEP> 1 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 50 <SEP> 25
<tb> Proteus <SEP> sp. <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 12,5 <SEP> 25 <SEP> 12,5
<tb> Pseudomonas <SEP> sp. <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 6,25
<tb>
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Pseudomonas sp. Nc. 5 6,25 12,5 6,25 3,12 C -1,56
EMI11.5
<tb> Klebsiella-Aerobacter <SEP> No. <SEP> 14 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 3,12 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> Klebsiella-Aerobacter <SEP> no, <SEP> 15 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb>
EMI11.6
Salmonella sp.
No. 1 '25 25 25 25 12,5
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TABLEAU II (suite)
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yibrio metschnikovii 12,5 12,5 12,5 6,25 6,25 -Agrobacterium tumefaciens 50 25 25 50 50 Erwinia amylovora < 1,56 4 1,56 - 1,56 . 1,56 < 1,56 àPseudomonas solanacearum 25 25 12,5 12,5 .2,5 .DLanthomonas phaseoli z 12,5 12,5 6,25 3,12 Les concentrations inhibitrices minimales pour les ténébrimycines individuelles sont déterminées avec les bases libres. Le complexe ténébrimycine est utilisé sous forme de sulfaté.
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On détermine la toxicité aiguë du complexe ténébrimyoine et de ses constituants relativement plus abondants chez la souris. Les valeurs de DL50 du sulfate ,le ténébrimycine sont d'environ 300 mg/kg lorsque l'antibio- tique est injecté par vole intraveineuse et environ 350 mg/kg lorsque le médicament est administré par voie intrapéritonéale.
A des doses sous-cutanées de 750 mg/kg ou des doses orales de 5 600 mg/kg, toutes les souris survivent. On n'observe pas d'irritation notable lorsque l'on traite quatre lapins avec chacun une goutte d'une solution aqueuse à 50 % de sul- fate de ténébrimyoine dans un oeil trois fois par jour pendant cinq jours $ Les valeurs de DL50, exprimées en mg/kg de la base libre, pour les ténébrimycines individuelles administrées par voie intraveineuse aux souris sont les suivantes ; téné- brimyoine II, environ 385; ténébrimycines IV, environ 220; ténébrimycine V,. environ 140;
et ténébrimycine VI, environ 120,
Le nouveau complexe antibiotique selon la présente invention est produit en cultivant une souche appropriée d'un organisme de la @classe des actinemycères dans des conditions aérobies dans un Milieu de culture approprié jusqu'à ce que le milieu de culture renferme une activité an- tibiotique notable. On peut récupérer la ténébrimyoine en utilisant diverses techniques d'isolement et de purifioation connues de l'homme de l'art.
Le complexe antibiotique peut être utilisé tel que ou être soumis à d'autres processus de purification pour Isoler ses divers constituants dans un état de pureté plus élevé,
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En raison de l'incertitude des études taxinomiques aveo les organismes du groupe Streptomyces, il . y a toujours un élément de doute associé à la classification d'un organisme nouvellement découvert. Cependant, pour autant qu'on puisse le déterminer, l'organisme qui produit le complexe antibiotique de l'invention ne ressemble pas suffisamment à aucune des espèces de Streptomyoes décrites par Waksman dans The Aotinomyoetes, Vol. II, The Williams and Wilkens Company (1961), pour garantir une comparaison des cultures. L'organisme est donc décrit et caractérisé comme une espèce nouvelle.
L'organisme produisant le complexe antibiotique de l'invention est un Streptomyoes formant des spirales,thermorésistant, aérobie à mioroaérophile, avec des spores oblongs à parois lisses. Il est le seul à être inhibé par des intensités relativement faibles de lumière artificielle, En raison de cette dernière propriété, on a choisi pour cet organisme la nouvelle dénommination d'espèce Stres-
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tommees tenebrar1us SPI n.
L'organisme a été isolé d'un échan- tillon de sol en mettant celui-ci en suspension dans l'eau distillée stérile et en étalant les suspensions sur de la gélose nutritive, Les plaques de gélose nutritive ensemenoées sont inoubées à 25-35 C jusqu'à ce que l'on soit assuré de la croissance. A la fin de la période d'inaubation, on transfère des colonies des organismes producteurs d'antibiotiques sur géloses inclinées au moyen d'une boucle de platine.
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Les géloses inolinées sont ensuite incubées pour fournir des 'quantités convenables d'inooulum pour la produotion de l'an- tibiotique, La souche de l'organisme utilisée pour la produc- tion du complexe antibiotique est placée en dépôt permanent à l'Amerioan Type Sulfure Collection à Washington, et on lui a attribué le n de culture ATCC 17920.
La dite souche produit tous les facteurs du complexe antibiotique, Mais dans des con- ditions préférées de fermentation, les ténébrimycines II, IV, V et VI sont prédominantes,
Les méthodes employées dans les études taxinomiques de S. tenebrarius ATCC 17920 sont oellos oouram- ment Utilisées dans la taxinomie des actinomycètes. Les carac- téristiques de culture sont observées après 14 jours d'inou- bation. La morphologie est déterminée sur gélose à la peptone de Czapek et sur gélose de Bennett pendant une incubation de 2 à 7 jours.
On observe l'action sur le lait et la réduction du nitrate à 7 et 14 jours, la production d'hydrogène sulfuré à 24 et 48 heures,et l'utilisation du carbone à 10 jours.
Sauf Indication contraire , les cultures sont incubées à 37 C.
Les tests d'utilisation du carbone sont effectués conformément à la méthode décrite par Pridham et Gottlieb, dans J. Bact., 56, 107 (1948).
Les résultats des études taxinomiques sont résumées dans les paragraphes suivants. Les nombres entre parenthèses se rapportent aux blocs de oouleurs définies par Maerz et Paul, dans Dictionary of ColQr,McOrax Book Company (1950). Les oouleurs représentées par les blocs de couleurs
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ont été traduites en noms de couleurs ISCC-NBS que l'on trouve dans la Circulaire n 553. U.S. Department of Commerce, National Bureau of Standards, 1955.
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Morphologie mJypsop.ueJyoaactr1stiQues eulture et h siolo ie de S tenebrarius ATCC 1 920
Morphologie'- Sur un milieu gélosé peptone-Czapek il se forme au hasard des formations de spores ramifiés en touffes sur le mycélium aérien. Les spores isolés sont rares.
Le myoélium aérien intact est facilement détaché du substrat, Les chaînes de .spores mars forment ordinairement 5 à 6 spirales ouvertes. Les spores sont oblongs à cylindriques. Lorsqu'on les observe à l'aide du microscope éleotronique, les spores apparaissent lisses et mesurent de 0,7 à 1,3 microns sur 2,0 à 2,1 microns. On observe des amas d'hyphes sur milieu de Bennett,
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Caractéris-tiques des colonies m111$u êJose - Czapek - Croissance peu dense; my- célium aérien peu abondant, jaune-orange pâle (11-A2); bonne sporulation; envers jaune-orange pâle (11-A2); pigment soluble légèrement rose (l-Bl).
Milieu Peptone-Czapek - oroissanoe abondante ; mycélium aérien abondant, brun-jaunâtre clair avec des zones blanches (11-A4);sporulation abondante; envers rouge-grisâtre clair (4-Hl); pigment soluble rose-grisâtre (4-Bl).
Gélose au malate de calcium - croissance modérée, mycélium aérien modéré, jaune-orange pâle (11-A2); sporulation
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modérée, envers rosé-grisâtre (4-D1); pigment soluble rosegrisâtre (4-Bl).
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Gélose à la tyrosine - croissanoe peu abondante; mycélium aérien peu abondant, jaune-orange pale (9-B2); sporulation peu abondante; envers jaune-orange pale (10-B3); pas de p'gment soluble.
Gélose aux sels minéraux - amidon - croissance modé- 'rée, mycélium aérien modéré, rosé-brunâtre aveo des zones blanches (11-A4); sporulation abondante; envers jaune-pâle (11-B2); pigment soluble jaune-pâle (11-B2).
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Gélose-glucose-aspara1ne- oroissanoe modérée, my- célium aérien modéré, jaune pâle (9-D2) aveo zones blanohes (10-A1); sporulation modérée ; jaune pâle (11-B2); pas de pigment soluble.
Pâte de tomate-farine d'avoine - croissance abondante, mycélium aérien abondant, brun-jaunâtre clair (12-B5); sporulation abondante ; envers brun-rouge grisâtre foncé (48J2); pigment soluble rouge pourpre foncé (47-H1).
Extrait de levure - croissance abondante, mycélium aérien abondant, jaune-orange pâle (11-A2) aveo zones blanches; sporulation abondante; envers jaune modéré (11-J6); pas de pigment soluble,
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g4]p.a,Q,flg±àojàw±,,,- croissance peu abondante, yod- lium aérien peu abondant blanc (10-Al); sporulation peu abondante ; envers jaune-vert grisâtre (12-12);pas de pigment soluble.
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MiliéiM-Bennett - croissance modérée, myaéliut aérien modéré blano (10-Al à 10-Bl); sporulation modérée; envers jaune pâle (11-C2) ; pas de pigment soluble,
Action sur le lait - anneau de croissance jaune fonoé sur la surface. Coagulation et peptonisation observées.
Réductiondu nitrate - Positive
Production de H2S - négative,
Gélatine nutritive - Liquéfaction totale après 14 jours,
Températures nécessaires sur milieugélosé peptoneCzapek -
20 - pas de croissance,
26 - bonne croissance, pas de mycélium aérien.
30 - croissance et mycélium aérien modérés mais de sporulation.
37 - oroissanoe, mycélium aérien et sporulation, abondante.
EMI18.2
43* - croissance# mycélium et sporulation abondants.
50 - croissance, mycélium aérien et sporulation abondants.
55 - croissance peu abondante.
60 - pas de croissance.
Température léthale .. Les spores d'une suspension de spores ohauffée à 75 C pendant 15 minutes restent viables. Lorsque la suspension de spores est ohauffée à 100 C pendant 15 minutes, il ne reste pas de spores viables,,
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Tension d'oxygène - La croissance est aérobie ou microaérophile en cultures repiquées.
Effet de l'ion ferrique - Il se produit un pigment soluble rouge, seulement en présence d'ion ferrique, et l'intensité de la pigmentation est proportionnelle à la concentration de l'ion ferrique dans une certaine gamme.
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Effet observé-du-ph sur milieu Zélose-peptone-Czapek
Pas de croissance en-dessous de pH 5,0; de pH 5,0 à 6,0 bonne croissance et bon mycélium aérien. Croissance et sporulation abondantes à pH 7,0; de pH 8,0 à 8,6, bonne crois- sance et bon mycélium aérien. Le pigment soluble est le plus intense à pH 5,0-6,0 et léger à nul entre pH 6,5 et pH 8,6.
Réaction à la lumière, observée sur milieu gélose-Czapek
Croissance et sporulation sont abondantes à l'obs- ourité, Lorsque des oultures sur plaques sont incubées à 38,1 cm d'une source de lumière fluorescente blanc-froid standard de 15 watts, la croissance est peu abondante et le mycélium aérien est absent. La croissance et le mycélium aérien sont modérés lorsque les cultures sur plaques sont Incubées à 38,1 cm d'une ampoule dépolie à filament de tungstène de 60 watts,
Les résultats de l'essai de l'utilisation du carbone effectués avec S. tenebrarius ATCC 17920 sont résumés dans le tableau III suivant. Dans ce tableau, les symboles sont interprétés de la manière suivante + = positive .
(+)= probable (-)-douteuse - - nulle
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TABLEAU III
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Utilisation du carbone par S tenebrarius souche ATCC N 7. 20
EMI20.2
...,...",:, " 't', ;w.
Srou::("&.e 9a:r.!o n 80ucce je¯carbonj, Réponse
EMI20.3
<tb>
<tb> L(+) <SEP> Arabinose <SEP> - <SEP> D(+) <SEP> Tréhalose <SEP> +
<tb> L <SEP> (+) <SEP> Rhamnose <SEP> - <SEP> L(+) <SEP> Raffinose <SEP> D(-) <SEP> Ribose <SEP> + <SEP> Cellulose
<tb> D <SEP> (+) <SEP> Xylose- <SEP> Inuline <SEP> (-)
<tb> D(-) <SEP> Fructose <SEP> + <SEP> i-Inositol <SEP> +
<tb> D(+) <SEP> Mannose <SEP> + <SEP> MannitolD(+) <SEP> Glucose <SEP> + <SEP> d-Sorbitol <SEP> (-)
<tb> Lactose <SEP> (-) <SEP> Salicine <SEP> ' <SEP> (+)
<tb> Saccharose
<tb> Maltose <SEP> + <SEP> témoin <SEP> (sans <SEP> carbone) <SEP> (-)
<tb>
S, tenebrarius ATCC 17920 produit, en plus de la ténébrimyoine, un antibiotique et antifungique connu, la oaerulomyoine qui est également produite par Streptomyces
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caerullus -Cano J. Microb101., , 31?(959)",/.
Une étude d'une culture de ce dernier organisme a révélé qu'il ne produit pas de ténébrimyoine dans les conditions décrites pour sa culture, et qu'il ne peut pas être induit à la produire dans diverses conditions.
Une seconde source de la nouvelle espèce
EMI20.5
Streptomyces tenebrarius SJ2, n-,,, source qui produit seulement trois des facteurs du oomplexe antibiotique, a également été isolé et caractérisé, On l'a attribué à cette source de S, te-
EMI20.6
nebrarius qui produit seulement les ténébrimyoines 1,'1' et
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II, le numéro d'ordre ATCC 17921. La source ATCC 17921 dit, fère de la source ATCC 17920 principalement en ce qu'elle ne produit pas de Mycélium aérien ni de spores, et elle ne pro- duit pas de pigment soluble sur la plupart des milieux, Les
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do5aaée de ca.,,'actt:('i8atiorl pour cette source de l'organisme tir question xonl résumées dans les paragraphes suivants.
Les méthQu-., employées dans les études taxln.cm1ques de S.tenebrarLLB ATCC 17921 sont les cernes que celles auxquelles on s'est référé plus haut pour la description de la caractérisation de S, tene-
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brar3.us ATCC 1.'324, et les symboles employés ont la m6me signification que ci-dessus.
Mprhologie m1croscop19ue. oaractér1st19ues de cuture et phs1010gie de S. tenebrarlus ATCC 1J9Ql¯ Morphologie. Il n'y a ni mycélium aérien ni spores ; lemycélium ' végétatif se Fragmente en petites quantités, Caractéristiques des colonies.
EMI21.3
Milieu-Zélose-Cza2ek- Bonne croissance végéta- tive, blano jaunâtre (9-Bl); pas de myoélium aérien, pas de pigment soluble,
EMI21.4
Milieu,peptone-Czapek - Croissanoe végétative abon- dante, jaune grisâtre (12-B3); pas de mycélium aérien, léger pigment soluble bruhâtre.
EMI21.5
Gélose-au malate de ce,u - Croissanoe végétative modérée,jaune grisâtre (12-B2); pas de mycélium aérien;
léger pigment soluble brun-grisâtre, ,
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Gélose à la tyrosine croissance végétative modérée, jaune grisâtre (11-B2); ni myoélium aérien ni pigment soluble.
Gélose aux sels minéraux-amidon-. Bon mycélium végé- tatif, brun-jaune clair (13-c6); pas de mycélium aérien; pigment soluble brun clair.
Gélose-glucose-asparagine - Croissance végétative modérée, jaune grisâtre (11-D2); pas de mycélium aérien ni de pigment soluble.
Pâte de tomate-farine d'avoine - Mycélium végétatif modéré, jaune pâle (10-B2); pas de myoélium aérien ni de pigment soluble.
Extrait de levure - Mycélium végétatif modéré, brun- jaune clair (12-E5); pas de mycélium aérien ou de pigment so- luble,
Gélose nutritive - Croissance végétative modérée, jaune clair (9-K4); pas de myoélium aérien ou de pigment so- luble,
Milieu gélose Benhett - Croissance végétative mo- dérée jaune grisâtre (12-E4) pas de mycélium aérien ou de pigment soluble.
Action sur le lait- Anneau de croissance de cou- leur chamois sur la surface. Coagulation et peptonisation.
Réduction du nitrate - Positive
Productionde H2S - Négative
Gélatine nutritive - Liquéfaotion totale en 7 jours,
Tension d'oxygène - La croissance est aérobie ou microaérophile en cultures repiquées.
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Températures requises sur Milïeu de Bennett - La croissance est modérée à 26, 30, 43# 49 et 5500 et elle est le plus abon- dante à 37 C; pas de croissance à 60 C. Le mycélium végétatif est brun-jaune pâle à 37 C et en dessous et légèrement brunrougeâtre à 43 C et au-dessus. Ni mycélium aérien ni pigment soluble à aucune température,
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p,%jÀisà,%iOjà±,b¯±QnOE%t8R,%%µ¯µg0e0,fie.,Àgcgl,79#1..µg..parbon9,
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a9lle ÔC,bWI MSËMâ ê de 1lrJ? ;.
Ré ie L(+) Arâb1no!ê Saûchapose (*) bzz+ ) Rhamnose iii 'l'l"dhl11ose (+) D(-) Ribosë 4- itAtt'1nose D(+) 7ßoe <.) cellulose ne..) Fï'U6t666 + 1.tfios1tol +
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<tb>
<tb> D(+) <SEP> Mannose <SEP> (+) <SEP> Mannitol <SEP> (-)
<tb>
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L(+) Glucose + dmsorbitol (-)
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<tb>
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> Salicine
<tb> Maltase <SEP> + <SEP> témoin <SEP> (sana <SEP> carbone) <SEP> - <SEP>
<tb>
Bien que la présente invention soit décrite en détail en référence particulière aux organismes récemment dé- couverts S.
tenebrarius ATCC 17920 et ATCC 17921, il est bien entendu que la production du complexe ténébrimyoine ou des divers faoteurs oonstituant ledit complexe par d'autres souches ou des mutants des dits organismes, entrent dans le cadre de l'invention.
Les proportions des divers facteurs ténébrimycine
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pMducM par aes autres souches ou mutants ne sonts pas néces-
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sairement les mêmes que.celles indiquées dans la présente des- cription. D'autres souches ou mutants peuvent être produits ou obtenus par des procédés connus, par exemple en soumettant un organisme producteur de ténébrimycine à une irradiation par rayons X ou ultraviolets ou à des agents chimiques tels que par exemple les isothiocyanates:
Le milieu de culture que l'on peut utiliser pour la production de ténéprimyoine peut être choisi parmi plusieurs milieux puisque, comme il apparatt d'après les tests d'utilisation décrits ci-dessus, les organismes producteurs de ténébrimyoine sont capables d'utiliser diverses souroes d'énergie.
Cependant, pour l'économie de la production , le rendement maximum en an- tibiotiques et la facilité d'isolement, certains milieux de cul- ture oontenant des sources nutritives relativement simples sont préférés. Par exemple, les milieux qui sont utiles pour la pro- duction de la ténébrimyoine comprennent une source assimilable de carbone telle que glucose, fruotose, mannose, maltose, amidon et les analogues. En outre, les milieux que l'on peut utiliser renferment une source d'azote assimilable telle que peptones, caséine hydrolysée, levure , amino-aoides et les analogues. Les sources d'azote actuellement préférées sont les peptones, la oa- séine hydrolysée et la glutamine.
On peut incorporer dans les milieux de culture des sels minéraux, par exemple ceux fournissant des ions olaoium, magnésium, sodium,potassium, ohlorure, sulfate, phosphate et carbonate, aveo des résultats favorables, bien que l'on doive éviter un excès de phosphate car il semble diminuer les rendements
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de l'antibiotique. On pourra également incorporer avantageusement dans le milieu des facteurs de croissance tels que la levure ou l'extrait de levure.
Comme il est nécessaire pour la croissance et le développement d'autres microorganismes, le milieu de croissance utilisé pour faire pousser les mioroorganismes utilisés dans la présente invention doit également cnntenir les éléments traces essentiels. Les éléments traces sont couramment présents sous forme d'impuretés accidentelles au moment de l'addition d'autres constituants du milieu.
Les conditions .de culture aérobie submergée sont les conditions de choix pour la production de ténébrimyoine.' Pour la préparation de quantités relativement faibles, on peut utiliser des flacons à secousses et la culture de surface, mais pour la préparation de grandes quantités, la culture aérobie submergée dans des réservoirs stériles est préférée. Le milieu oontenu dans le réservoir stérile peut être inoculé aveo une suspension sporulée, mais en raison du retard à la croissance qui se présente lorsqu'on utilise une suspension sporulée comme inoouium, on préfère la forme végétative de la culture. En évitant ainsi le retard à la croissance, on réalise une utilisation plis efficace de l'appareillage de fermenta- tion.
En conséquence; il est souhaitable de produire d'abord un inoculum végétatif des organismes en inoculant une quantité relativement faible de milieu de culture avec la forme spore de l'organisme été lorsque l'on a obtenu un inoculum végétatif
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jeune actif, de transférer l'inoculum végétatif en conditions aseptiques dans le grand réservoir, Avantageusement, on utilise une partie aliquote de l'inooulum végétagif, égale à environ 4% du volume du milieu dans lequel l'inooulum est induit. Le milieu de fermentation dans lequel on produit l'inoculum végétatif peut être identique ou différent du milieu utilisé pour la production de ténébrimycine à grande échelle.
Comme il est évident d'après les détails des températures nécessaires à l'organisme indiqués ci-dessus, l'organisme poussera dans une gamme relativement large de températures, Cependant, il apparatt que les organismes croissent mieux à des températures situées dans la gamme d'environ 30 à 50 C.
Il apparaît que la production optimale de ténébrimycine se situe à une température d'environ 37 à 43 C. Les organismes qui produisent la ténébrimyoine sont sensibles à la lumière et ne poussent pas bien en sa présence. En oonséquenoe, les fermentations employant.les organismes sont avantageusement effectuées en l'absence de lumière visible.
' Conformément à la pratique habituelle dans-les procédés de culture aérobie submergée, on introduit de l'air stérile dans le milieu de oulture, Pour une oroissanoe effioaoe des organismes et une bonne production de ténébrimycine, le volume d'air employé dans la production en réservoir de ténébrimyoine est de plus de 0,1 volume d'air par minute et par volume de milieu de culture, et de préférence notablement plus élevé.
Une croissance efficace des organismes et des rendements
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optima de ténébrimyoine sont obtenus lorsque le volume d'air utilisé est d'au moins un volume d'air par minute et par vo- lume de milieu de culture,
La concentration de l'activité de ténébrimyoine dans le milieu de fermentation peut être facilement suivie au cours de la fermentation en dosant l'activité inhibitrice d'échan- tillons du milieu de culture vis-à-vis de la croissance d'or- ganismes connus comme étant inhibés en présence de ténébrimy- cine. Deux des organismes ainsi employés pour suivre la pro- duction de ténébrimycine sont Xlebsiella pneumoniae etMyco- bacterium butyricum.
Le premier organisme est généralement utilisé dans la technique turbidimétrique bien connue, tandis que le dernier est utilisé dans la méthode de la plaque à godets,
En général, la production maxima de l'antibiotique
1 se produit au bout d'environ 4 à 7 jours après/inoculation du milieu de culture lorsqu'on utilise la culture aérobie sub- mergée, ou la culture en flacons à secousses et en un temps un peu plus long lorsqu'on utilise la culture en surface.
On sépare le mycélium et les résidus non diaaoua du bouillon de fermentation par des mpyens classiques tels que filtration ou centrifugation, L'activité antibiotique est con- tenue dans le bouillon filtré et peut être récupérée en uti- lisant des techniques d'adsorption. Les adsorbants que l'on peut utiliser le plus avantageusement sont les résines échan-. geuses de cations, par exemple celles disponibles dans le com- merce sous le nom de "IRC-50".
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En général, le procédé pour récupérer la ténébrimyoine du bouillon de fermentation est le suivant. On filtre la totalité du bouillon à l'aide d'un adjuvant de filtration, après avoir abaissé le pH du milieu à environ pH 2 par addition d'un acide, comme l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide chlorhydrique et les analogues. On ajuste le pH du filtrat à'environ pH 5,5 par addition d'une base concentrée et 'on filtre à nouveau le mélange. On fait passer le filtrat à travers une colonne d'échange d'ions garnie d'une résine telle que IRC-50 sous la forme ammonium. On lave ensuite la colonne à l'eau distillée et l'activité antibiotique est éluée par un acide dilué. Les fractions contenant l'activité antibiotique sont réunies et concentrées à environ 1/20 du volume original.
On élève le pH du concentrât à environ pH 11 par addition d'une base concentrée et le concentrat basique est versé dans environ 6 volumes d'acétone, bien mélangé et refroidi. Le pré- cipité microbiologiquement inaotif qui se sépare est éliminé par filtration, On abaisse le pH du filtrat à environ pH 3,5 par addition d'aoide sulfurique à 20% en agitant vigoureusement,
Le complexe ténébrimycine est précipité sous forme du sulfate, tandis que la caerulomycine obtenue comme sous-produit dans la fermentation rente dans la couche surnageante, qui est jetée.
On dissout le sulfate de ténébrimyoine dans une quantité mi- nimale d'eau et on fait passer la solution aqueuse sur une colonne Dowex 1x1. La solution aqueuse de sulfate de ténébri- mycine est suivie sur la colonne par de l'eau distillée et on
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recueille l'affluent de la colonne en diverses fractions. Les fractions actives sont réunies et concentrées en un sirop épais et ensuite séchées pour donner la base libre de la ténébrimyaine.
Les facteurs principaux constituant le complexe ténébrimycine peuvent être obtenus si on le désire sous forme d'antibiotiques simples par fractionnement ultérieur de la ténébrimyoine obtenue ci-dessus sur des colonnes échangeuses d'ions. Pour le fraotionnement, la ténébrimyoine est employée sous forme d'un sel d'addition d'acide, de préférence le sulfate. On obtient de façon appropriée une solution de sulfate de ténébrimycine en préparant une solution aqueuse à 20% de ténébrimycine et en ajustant le pH de la solution à environ pH 4,5 par addition d'acide sulfurique. Les impuretés oolorées peuvent être éliminées en agitant la solution ainsi préparée avec environ 5% (poids/volume) d'un oharbon aotivé tel que par exemple "Darco G-60".
On obtient ordinairement une décolo- ration efficace en agitant le mélange contenant le oharbon pendant environ une heure. Le mélange est ensuite filtré et le filtrat qui contient le sulfate de ténébrimyoine est chargé sur une colonne garnie avec de la résine IRC-50 sous forme ammonium. On lave la colonne avec de l'eau et on élue les an- tibiotiques individuels constituant le oomplexe ténébrimycine par de l'ammoniaque 0,1N. D'une façon générale, l'élution est effectuée extrêmement lentement et il faut ordinairement un très grand nombre de fraotions pour effeotuer le fractionne- ment du oomplexe, Ainsi par exemple, le fractionnement total
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d'environ 250 g de ténébrimyaine nécessite environ 700 fractions, chacune d'environ 900 ml d'éluat.
. Les premières fractions actives obtenues contiennent les ténébrimycines I, I' et II, Celles-ci sont suivies par une série de fractions actives dans lesquelles la ténébrimyoine II est le seul antibiotique présent. Un certain nombre de fractions inactives suit l'élution de la ténébrimyoine II avant que les fractions contenant la ténébrimyoine IV soient éludes. Il apparaît que les premières fractions contenant la ténébrimyoine IV contiennent des traces de ténébrimycine III.
La ténébrimycine V est obtenue hors de la colonne dans les fractions actives qui suivent la ténébrimyoine IV. Pour ob= tenir la ténébrimyoine VI, la colonne est ultérieurement éluée par une solution d'ammoniaque plus concentrée après qu'on a recueilli toute la ténébrimycine V hors de la colonne. Un éluant approprié pour la séparation de la ténébrimyoine VI est l'ammoniaque 0,3 N.
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en limiter la portée : Exemple 1 .
Préparation de la ténébrimyoine
On produit une culture sporulée de S. tenebrarius ATCC 17920 en faisant pousser l'organisme sur une gélose inolinée de Bennet modifiée, ayant la composition suivante :
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Dextrine 10 g Extrait de levure (Dit- oo) 1 g Caséine hydrolysée ("NZ-Amine A", de Sheffield Farms) 2 g Extrait de viande de boeuf (Difoo) 1 g
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CoCl,6t0 001 g
Gélose lavée 20 g
Eau déionisée, q,s,p, 1 000 ml.
On ajuste le milieu à pH 7 avant passage à l'au* t oolave,
Le milieu est inooulé aveo des spores de S. tene- brarius ATCC 17920 et incubé en l'absenoe de lumière visible en @ oinq jours à 37 C La culture en croissance est recouverte d'eau et la gélose doucement grattée pour éliminer les spores et fournir une suspension aqueuse de spores.
La suspension¯de spores ainsi obtenue est utilisée pour inoouler 800 ml d'un milieu ayant la oomposition suivante
Dextrose 0,05 %
Farine "Nutrisoy" (Archer -Daniels-Midland Company contenant 35-45% de protéine dispersable 1,5 % "Dextrine 700" (dextri- ne de pomme de terre à faible teneur en chlorure de Morningstar-Paisley
Company 1 %
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chlorure de potassium 0,1 % "NZ-Amine A" 0,3 % KH2PO4 0,05 % MgSO4,7H2O 0,5 % CaCl2, 2H2O 0,025 Eau déionisée q.s.p.
Le milieu végétatif inoculé est incubé à environ 37 C pendant 16 heures sur une seooueuse rotative fonctionnant à 250 tours par minute et ayant une course de 6,35 om.
On utilise une potion de 50 ml de la culture végé- tative pour inoculer un réservoir d'ensemencement de 44 litres contenant un milieu aqueux ayant la composition suivante : Dextrose ' 1 % moutures de Soja 1,5 % KH2PO4 0,05 % MgS04 0,5 %
KCl 0,1 %
CaCl2,2H2O 0,025 % agent antimousse 0,025 %
Le milieu du réservoir d'ensemencement est stéri- lisé à 120 C pendant environ 30 minutes, Le milieu inooulé étant inoubé à 3700 pendant 12 heures, On commence l'agitation à 370 tours par minutes immédiatement après l'inoculation et on maintient l'aération à un débit de 22,65 litres par minute au cours de la période d'incubation.
A la fin de la période d'incubation, on utilise le contenu du réservoir d'ensemencement
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pour inocula une cuve de fermentation de 945 litres contenant
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un milieu ayant la oomoe1t1on eut vante Dextrose 4 % huile de Soja raffinée 3 % farine de Soja 3 % NH4Cl 0,5 % CaCl2 0,3 % MgSO 0,2 % NH4NO3 0,1 % "NZ(Amine A" 0,5 % agent antimousse 0,2
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Eau d1onséc q.s.P.
Avant l'inoculation, le milieu de fermentation est stérilisé pendant 30 minutes à 120 C. La fermentation est
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efteotuée à 37*0 aveo aération à un débit de 522,16 litres/ minute dans la période comprise entre l'inoculation et la ré-
EMI33.4
oaltej On commence l'agitation à 125 tours/minute et on l'aug. mente jusqu'à 180 tours/minute après 12 heures. On continue la fermentation pendant cinq joutât
On filtre le bouillon de sulfure fermenté pour séparer le mycélium et les autres solides non dissous.
Le
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bouillon filtré aantient la tdtimai5 une concentration d'environ 680 unités par millilitre.. Exemple 2
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h"ré,bAnààÀ aa4#AlSà-àni#"xi">UlLààà bTàX' On êu1t le procédé ddorit dans 1exemple 1; en
<Desc/Clms Page number 34>
utilisant comme organisme producteur d'antibiotique S. tene- brarius ATCC 17921. Le bouillon de fermentation filtré ainsi obtenu oontient principalement de la ténébrimycine II avec de plus faibles proportions de ténébrimyoines 1 et I'.
Exemple 3
Isolement du complexe ténébrimyoine
On abaisse à environ pH 2 le pH de 880 litres de bouillon de fermentation d'antibiotique obtenu comme décrit dans l'exemple 1, par addition d'environ 10 à 15 litres d'acide sulfurique aqueux à 20%. Après avoir ajouté 45 kg d'un. adjuvant de filtration du commerce au bouillon aoidifié, on mélange vi- et goureusement / on filtre. Le gâteau de filtration est lavé 'à l'eau et la solution de lavage est ajoutée au filtrat.
On ajuste le pH du filtrat à 5,5 par addition de soude aqueuse à 50%. On ajoute environ 4 kg d'un adjuvant de filtration du oommeroe et on agite vigoureusement le mélange et on filtre; On fait passer le filtrat sur une colonne de résine IRC-50 de 10,16 om x 1,83 m. La colonne est garnie aveo la résine sous forme ammonium jusqu'à unehauteur de 111 à 114 cm Lorsque tout le filtrat a passé sur la colonne, on lave la colonne avec environ 200 litres d'eau distilléeOn élue en- suite l'activité antibiotique en une période d'environ 12 à 15 heures aveo environ 150 à 175 litres d'acide sulfurique 0,1 N, l'éluat étant recueilli en fractions de 10 litres. L'ac- tivité antibiotique devient décelable dans l'éluat lorsque son pH s'abaisse à environ pH 4 ou une valeur légèrement inférieure.
A mesure que l'élution avance le pH de l'éluat oontinu à baisser
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jusque ce qu'il atteigne une valeur d'environ pH 1,5. Les fractions contenant l'activité antibiotique sont réunies et concentrées sous pression réduite à environ 1/20 du volume ,initial,
On ajuste le pH de l'éluat concentre à pH 11 par addition de soude aqueuse à 50% et on ajoute ensuite le oonoentrat basique à environ 6 volumes d'acétone. On refroidit le mélange et on le laisse reposer pour séparer un précipité exempt d'activité antibiotique, On filtre le mélange et le gâteau de filtration oontenant le précipité inaotif est lavé à l'eau et jeté.
On ajuste le pH du filtrat à pH 3,5, par addition en mélangeant vigoureusement, d'aoide sulfurique aqueux à 20%.
Le complexe ténébrimyoine précipite sous forme de sulfate pendant ce traitement et il est sensiblement totalement précipité lorsque le pH atteint environ pH 4 ou une valeur légèrement inférieure. On filtre le mélange et on jette le filtrat contenant la ooerulomyoine produite conjointement dans la fermen- tation.
On dissout dans le minimum d'eau le gâteau de filtration constitué de sulfate de ténébrimyoine et on le refroidit ; Qh jette les substances solides qui ne se dissolvent pas facilement, ainsi que les solides qui précipitent ou cris- tallisent pendant le refroidissement. On fait passer la solu- tion claire de sultate de ténébrimycine sur un lit de résine de la,16 cm x 2,17 m de résine owex 1 x 1 sous forme basique,
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La solution d'antibiotique est suivie sur la colonne par en- viron 40 à 50 litres d'eau distillée,
On recueille l'effluent en fraction de 10 litres et on oombine les fractions aotives et on les concentre sous vide en un sirop épais qui est séché dans un bassin plat pour donner la ténébrimycine sèche,
Exemple 4
Séparation des facteurs de la ténébrimycine
On obtient le sulfate de ténébrimycine en ajoutant le pH d'une solution aqueuse à 20% contenant 258 g du complexe . de ténébrimyoine sous forme de base libre à pH 7,5 par addi- tion d'acide concentré", La solution de sulfate de ténébrimy- cine ainsi préparée est décolorée par agitation à environ 1 heure avec 5% (poids/volume) de Darco G-60. On filtre la solu- tion et on fait passer le filtrat sur une colonne de 9 x 1050m garnie avec environ 7 litres de résine IRC-50 sous forme ammonium.
Lorsque le filtrat contenant le sel d'antibiotique a passé sur la oolonne ou commence l'élution de l'antibiotique retenu par la oolonne avec une solution d'ammoniaque 0,1 N à un débit d'environ 20 ml par minute. On recueille l'éluat en fractions d'environ 900 ml et on dose l'activité miorobiolo- gique dans chaque fraction, Les fractions contenant le même facteur antibiotique sont réunies et lyophilisées pour obtenir
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les t6ndbrimyoines individuelles séohées.
Les ténébr1myo1nes individuelles sont distribuées parmi les fractions aotives de la manière suivante,
<Desc/Clms Page number 37>
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Fta1(9n nti.19Qve "ése,,t 1-34 Inactives 35-53 Ténébrimyoine I, I' et II 54-77 Ténébrimyoine II 78-153 Inactives 154-172 Ténébrimycine IV avec une trace@ de
Ténébrimyoine III 173-249 Ténébrimyoine IV 250-256 Inaotives 257-634 Ténébrimyoine V 635-6681 Inaotives 669-698 Ténébrimyoine VI 1) à ce moment, l'éluat est remplace par de l'ammoniaque 0,3 N,
Exemple
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PréRaration des héllanthates de ténébr1myoines
La préparation des hélianthates des ténébrimyoines individuelles est illustrée par le procédé suivant pour la préparation de l'hélianthate de ténébrimycine II.
. On prépare une solution de 2 g de té-, nébrimyoine II dans 22 ml d'eau et on l'ajuste à pH 5 par addition d'acide sulfurique à 50%. On ajoute ensuite à la solution d'antibiotique une solution aqueuse chaude à 10% de méthyl-orange. L'hélianthate de ténébrimyoine II se sépare sous forme d'un précipité et on le sépare par filtration. On lave le sel solide vigoureusement par l'eau chaude et on le sèche
<Desc/Clms Page number 38>
sous vide pour donner 3,5 g d'hélianthate de ténébrimyoine II.
Exemple 6
Purification finale des facteurs de la ténébrimycine
La purification finale des facteurs individuels de la ténébrimyoine est illustrée par le procédé suivant pour la purification de la ténébrimyoine VI.
On prépare l'hélianthate de ténébri- , myoine VI selon un procédé analogue à celui décrit dans l'exem- ple 5, On délaie 4 g du sel ainsi préparé avec environ 200 ml d'eau ajustée à pH 2 par addition d'acide sulfurique. On agite le mélange pendant environ,4 heures et ensuite on filtre sur un verre fritté de porosité moyenne pour séparer l'acide hé- lianthique, On décolore le filtrat par passage sur une mince couche de charbon actif et ensuite on le fait passer sur une colonne de 1 x 32 cm garnie de résine Dowex 1 x 2 sous forme hydroxyle. Le filtrat est suivi sur la oolonne par de l'eau distillée pour compléter l'élution de l'aotivité antibiotique.
On recueille l'effluent en fractions et on réunit les frac- tions actives et on les lyophilise pour donner un résidu sec constitué par l'antibiotique. On dissout le résidu dans en- viron 15 ml d'eau et on le fait ensuite passer sur une colonne de 1, x 25 cm garnie de résine Bio Rad AG11A8 (résine du type à retard d'ion préparée par polymérisation d'acide acrylique dans une résine Dowex 1, vendue par Bio Rad Laboratories,
Richmond, Californie). L'activité antibiotique est éluée de la colonne par de l'eau distillée et les fractions actives sont à nouveau réunies et lyophilisées pour donner environ 700 mg de ténébrimyoine VI de pureté élevée.