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La présente invention concerne un nouvel antibiotique solubles dans l'eau qui, dans ce qui va suivre, sera désigné par la dénomination "grisonomycine" ses dérivés, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés.
L'invention concerne également un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" se forme lors de la culture d'une nouvelle souche d'actinomycètes qui a été isolée à partir d'une prise d'es- sai faite dans le sol à Bergün, canton de Graubünden (Suisse) et qui est conser- vée dans les Laboratoires de la Demanderesse ainsi qu'à l'Ecole Polytechnique Férérale, (Zurich, Suisse), Institut de Botanique Spéciale, sous la dénomination A 10073.
La souche d'actynomycètes A 10073 appartient à la catégorie du Strep- tomyces griseus. Elle forme un mycélium aérien verdâtre-jaunâtre. Les chaînes de spores sont irrégulièrement ramifiées et ne forment pas de spirales. Les diver- ses spores sont lisses. Si l'on cultuve l'organisme sur des milieux nutritifs peptonés, on n'observe pas de décoloration mélanoïdique en brun-noir. La crois- sance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe parfaitement, aussi bien à 18 qu'à 40 ; -toutefois la croissance optimum se si- tue entre 25 et 32 C
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va sui- vre la croissance du Streptomyces griseus A 10073 sur différents milieux nutri- tifs. Les milieux nutritifs 1 à 7, ainsi que 10, ont été préparés suivant W.
Lindenbein, "Arch. Mikrobiol.",17, 361 (1952).
1) Gélose synthétique: Croissance grêle au début, voilée et jaune-clair, plus tard rugueuse et brun-clair à rouge cuivre. Mycélium aérien velouté, jaune-clair à gris verdâtre.
2) Milieu synthétique liquide : Sédiments, flocons, blanc laiteux. Pellicule jaunâtre au début, brun-rougeâtre au bout de
9 jours. Mycélium aérien velouté, gris-blanc.
3) Gélose-glucose : Croissance peu abondante, grêle, voilée, jaune- clair.
4) Gélose-glucose à l'asparagine: Croissance grêle, voilée, jaune-clair. Mycélium aérien farinacé jaune-clair.
5) Gélose au malate de calcium : Croissance voilée, brun-clair. Mycélium aérien velouté, jaune-clair à grisverdâtre. Substra- tum brun châtaigne.
6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 : Croissance superficielle, voilée, jaune-brunâ- tre, substratum brun-rougeâtre. Liquéfaction au bout de 18 jours :0,8-1,2 cm.
7) Gélose à l'amidon : Croissance grêle, voilée, incolore à jaune- clair. Mycélium aérien peu développé, jaune- clair. Substratum bleu-gris. Hydrolyse au bout de 14 jours : 1,6 cm.
8) Pomme de terre: Croissance voilée, brun-clair à gris-blanc.
Mycélium aérien peu abondant, jaune-clair à gris-verdâtre. Substratum brun-clair.
9) Carotte : Croissance très lente, jaune-clair.
10) Lait de tournesol : Pellicule brun-clair. Mycélium aérien velouté, incolore à jaune-clair, finalement gris-verdâ- tre. Substratum rouge. Lente coagulation et hydrolyse.
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Les caractéristiques les plus importantes de la souche A 10073 con- cordent avec celles du Streptomyces griseus (Krainsky) de Waksman, de sorte qu'on l'apparente pour l'instant à cette catégorie.
On sait que quelques représentants de la famille du Streptomyces gri- seus produisent des antibiotiques tels que la Streptomycine (Waksman S.A., "Strep- tomycin", édition Williams et Wilkings, 1949), la rhodomycétine (Shockman G. et Waksman S.A. "Antibiotics and Chemotherapy" 1, 68-75 [1951 7) l'actidione (Leach B.B., Ford H.J. et Whiffer A.J., "Journ. Am. Chem. Society" 69, 474 {1947] la candicidine (Le chevalier H., Acker R.F., Corke C.T., Haenseler C.M. et Waks- man S.A. "Mycologia" 45, 155-171 [19537), la griséine (Reynolds D.M. et Waksman S.A., "J.Bacteriol." 55, 739-752 {19487) et la streptocine (Waksman S.A. Harris D.A., Kupferberg A.B., Singher H.O. et-Styles H., "Proc. Soc. Exp. Biol. Med." 70, 308-312 [19497).
On montrera plus bas que le nouvel antibiotique dénommé "grisono- mycine" se différencie de manière caractéristique de ces antibiotiques déjà connus .
La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la pré- paration de l'antibiotique dénommé "grisonomycine", à l'utilisation du Streptomy- ces griseus A 10073 ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir l'antibiotique dénommé "grisonomyoine", on cultive de manière aérobie une souche de streptomycètes présentant les propriétés du Strep- tomyces griseus A 10073, par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfer- mant une source de carbone et d'azote ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente une activité antibiotique notable, puis on isole ensuite l'antibiotique dénommé "grisonomycine".
Comme source de carbone, on envisage par exemple des hydrates de carbone comme le glucose, le saccharose, le lactose, la mannite, l'amidon ainsi que la glycérine. Comme substances nutritives azotées et, le cas échéant, comme substances favorisant la croissance, on citera : acides aminés, des peptides et des protéines, ainsi que leurs produits de dégradation comme les peptones ou les tryptones, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le mais et le froment, des résidus de distil- lation provenant de la préparation d'alcools, des levures, des feves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, etc..., mais aussi des sels d'ammo- nium et des nitrates.
Comme autres sels inorganiques, la solution nutritive peut renfermer, par exemple, des chlorures, des carbonates, des sulfates des métaux alcalins, des métaux alcalino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc et du man- ganèse.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en cul- ture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, s'avère appropriée une température com- prise entre 18 et 40 . En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet antibiotique notable en général au bout d'un jour et demi.
. Pour isoler l'antibiotique dénommé "grisonomycine", on peut, par exemple, faire appel aux procédés suivants: On sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve la majeure partie de l'antibiotique dans le filtrat de culture. Il reste toutefois des quantités notables de l'antibiotique qui ad- hèrent par adsorption au mycélium. Il est par suite avantageux de bien laver le- dit mycélium. A cet effet, sont appropriés l'eau et des solvants organiques aqueux comme des alcools, par exemple du méthanol aqueux.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" est une substance soluble dans
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l'eau, mais insoluble dans les solvants organiques, notamment d a n s l e s
EMI3.1
's o l' y a t S. l', i ' p 0 ï des. ' . K ' u n pH n we u t r b on ne peut le précipiter ni des filtrats de culture ni des solutions enrichies, avec les agents de précipitation usuels pour l'isolement des antibiotiques hydrophiles basiques comme par exemple l'acide picrique, le reineckat e d'ammonium, l'hélianthine, l'a= cide picrolonique. D'après son comportement lors du titrage électrométrique, lors de l'électrophorèse sur papier et lors de l'adsorption à des échangeurs d'ions, il est possible qu'il s'agisse d'une substance emphotère présentant des proprié- tés essentiellement basiques.
D'après ces propriétés, différentes méthodes sont appropriées pour obtenir, à partir du filtrat de culture, l'antibiotique dénommé "grisonomycine" et pour le purifier, lesdites méthodes pouvant être utilisées seules ou en combi- naison. C'est ainsi qu'on peut utiliser différents agents d'adsorption, par ex- emple des charbons actifs comme la norite, des terres activées comme l'oxyde d'aluminium, la terre à foulon ou la floridine, des adsorbants à base de résine, comme l'asmite.
L'affinité de l'antibiotique dénommé "grisonomycine" pour la norite notamment est très forte dans un large domaine de pH et pour l'asmite elle l'est dans un domaine de pH neutre et alcalin. 'En outre, l'antibiotique dénommé "grisonomycine" peut être adsorbé du filtrat de culture ou de solutions aqueuses à l'aide d'échangeurs d'ions fortement acides, par exemple à l'aide de "Dowex 50".
L'élution des adsorbats a lieu avantageusement avec des mélanges d'eau et de solvants organiques, par exemple avec des mélanges binaires d'eau et d'un solvant organique miscible à l'eau, par exemple avec des mélanges d'eau et de méthanol, d'eau et d'acétone, d'eau et d'alcool, d'eau et de propanol, d'eau et de pyridine, ou à l'aide de systèmes à plusieurs composantes, par exemple avec des mélanges d'eau, d'un solvant organique non miscible à l'eau et d'un ou plu- sieurs solvants organiques miscibles à l'eau servant de répartiteurs de mélange, par exemple des systèmes butanol-méthanol-eau, butanol-pyridine-méthanol-eau, phénol-méthanol-eau.
Ces mélanges de solvants servant pour l'élution peuvent être utilisés avec ou sans addition d'acides inorganiques ou organiques, par exemple l'acide chlorhydrique, sulfurique, formique, acétique, ou bien avec ou sans ad- dition d'agent basiques, par exemple d'ammoniaque, d'amines aliphatiques infé- rieures.
Lorsqu'on utilise de la norite comme agent d'adsorption, des mélanges de butanol, de méthanol et d'eau dans le rapport volumétrique 2:1:2, de butanol, de méthanol, de pyridine et d'eau dans le rapport volumétrique 2:1:1:2 ou d'al- cool et d'eau dans le rapport volumétrique de 3:2, se sont avérés particulière- ment appropriés pour l'élution de l'antibiotique. Les adsorbats à un mélange d'asmite et d'une résine phénolique sont, de préférence, élués avec un mélange de méthanol, d'eau et d'acide chlorhydrique normal dans le rapport volumétrique de 75:15:10 et les adsorbats aux échangeurs d'ions mentionnés, avantageusement avec des agents basiques, par exemple avec des solutions aqueuses d'ammoniaque.
A partir des éluats présentant une activité antibiotique, on peut obtenir l'antibiotique sous la forme d'une poudre sèche en éliminant le solvant sous vide, ou l'obtenir également sous la forme d'une solution fortement concen- trée à partir de laquelle l'antibiotique peut être précipité sous la forme d'une poudre jaune-brun, par addition d'une volume quadruple à sextuple d'acétone ou d'un mélange de méthanol et d'acétone.
Si l'agent d'élution renferme des solvants non-miscibles à l'eau, par exemple dans le cas d'une adsorption à la norite, le mélange mentionné de butanol, de méthanol et d'eau (2:1:2), on peut alors aussi ajouter avantageusement, à ce dernier, un autre solvant non-miscible à l'eau, par exemple de l'éther, du chloroforme, de l'acétate d'éthyle, de l'acétate de n-butyle, dans une quantité telle qu'il se forme deux phases. L'antibiotique se trouve alors presque exclusivement dans la phase aqueuse, à partir de laquelle il est à nouveau obtenu soit par une évaporation ménagée directe jusqu'à dessi- cation, soit par concentration jusqu'à obtention d'une solution concentrée et précipitation subséquente sous la forme d'une poudre.
Si l'agent d'élution ren- ferme des acides ou des bases, par exemple dans le cas de l'adsorption à l'asmi-
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te, le mélange mentionné de méthanol, d'eau et d'acide chlorhydrique normal, il est alors avantageux, avant de concentrer, de neutraliser l'acide ou la base présent dans l'éluat en ajoutant de la lessive ou de l'acide, ou de l'éliminer de l'agent d'élution par filtration à travers un échangeur d'anions faible comme l'Amberlite IR4B ou à travers un échangeur de cations faible comme l'Amberlite IRC50, sur lesquels l'antibiotique dénommé "grisonomyoine" n'est pas adsorbé.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" est, en outre, soluble dans le phénol et dans des mélanges de phénol avec des solvants organiques, par exemple dans des mélanges de phénol et de chloroforme. On peut l'extraire des solutions aqueuses avec de tels mélanges. Si l'on répartit l'antibiotique entre des solu- tions aqueuses d'acide chlorhydrique et des solutions de chloroforme renfermant du phénol, on peut alors à la demande ajuster le coefficient de répartition dans un large domaine, en faisant varier la concentration en phénol dans la phase aqueuse.
Si l'on entend, par coefficient de répartition de l'antibiotique, le rapport de la concentration dans la phase organique à la concentration dans la phase aqueuse, il s'avère alors que le coefficient de répartition augmente au fur et à mesure que la teneur en phénol augmente et qu'il décroit au fur et à mesure que la teneur en acide chlorhydrique augmente. En combinant un petit nom- bre d'opérations de répartition dans de tels solvants, on peut obtenir un enrichis sement notable. L'antibiotique peut être précipité sous la forme d'une poudre des mélanges de phénol et de chloroforme, par addition de solvants organiques lypophiles, comme l'acétone, l'éther ou l'éther de pétrole par exemple.
Une autre possibilité d'isolement consiste à précipiter l'antibiotique du mélange de phé- nol et de chloroforme en ajoutant des solvants de ce genre sur un auxiliaire de filtration, comme par exemple de l'Hyflo- Supercel, et à bien laver avec les mêmes solvants le résidu bien filtrable. Le résidu antibiotique précipité sur l'auxiliaire de filtration peut être extrait par dissolution avec un petit volume d'eau et la solution concentrée d'antibiotique que l'on obtient de cette manière peut être transformé en poudre à l'aide d'un séchage par réfrigération. Finale- ment, il est également possible d'extraire directement en retour avec peu d'eau l'antibiotique de la solution de phénol et de chloroforme, après addition de mélanges d'éther et d'éther de pétrole.
La quantité du mélange d'éther de pétro- le et d'éther dépend dans ce cas de la quantité de phénol.
Les procédés d'adsorption, d'élution et d'extraction qui ont été décrits peuvent être mis en oeuvre individuellement ou en combinaison. S'avère particulièrement approprié le procédé combiné suivant lequel l'antibiotique est d'abord adsorbé sur de l'asmite et est ensuite élué, après quoi suit une adsorp- tion sur de la norite, avec élution subséquente. Le concentrat d'antibiotique que l'on obtient dans ce cas est ensuite enrichi davantage par quelques réparti- tions entre des solutions de phénol et de chloroforme et une solution d'acide chlorhydrique.
Les procédés d'adsorption et d'élution peuvent avoir lieu suivant le procédé de "Batch" ou sur la colonne. Préalablement à l'élution des adsorbats, on peut, en vue d'éliminer les substances accompagnatrices inactives du point de vue antibiotique, laver avec des solvants appropriés les agents d'adsorption recouverts par l'antibiotique. Dans le cas d'un adsorbat à la norite, l'eau, le méthanol à 30% et l'acétone sèche se sont avérés appropriés comme agents de la- vage.
Un enrichissement de l'antibiotique dénommé "grisonomycine" à partir des concentrats obtenus suivant les procédés précédemment décrits peut avoir lieu en ajoutant, à des solutions de tels concentrats, des agents de précipitation comme l'acide picrique ou l'hélianthine, par exemple, les substances accompagna- trices de l'antibiotique, qui présentent en partie in vitro également une acti- vité antibiotique, étant précipitées alors que l'antibiotique proprement dit reste en solution.
Après avoir séparé ces précipités par filtration, on élimine à nouveau du filtrat l'agent de précipitation en excès par passage sur un échan-
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geur d'ions approprié, dans le cas de l'hélianthine ou de l'acide picrique par exemple par passage sur de l'amberliteIRA400 sous la forme des ions chlorure, après quoi l'antibiotique enrichi peut être isolé des solutions suivant les pro- cédés décrits.
Pour enrichir davantage l'antibiotique, on le soumet, de préférence, à une chromatographie par adsorption sur une colonne. Comme adsorbants, sont appropriés les agents d'adsorption déjà mentionnés pour le procédé d'isolement.
Par ailleurs, on peut également chromatographier l'antibiotique sur de la cel- lulose. Pour le développement des chromatogrammes, on utilise les mêmes mélanges solvants que ceux qui sont indiqués pour l'élution des adsorbats dans les pro- cédés d'isolement précédemment décrits, et à savoir suivant une composition con- stante ou variable. Un bon procédé d'enrichissement est constitué par une chro- matographie sur des colonnes de norite, le charbon actif étant, en vue d'augmenter la vitesse de migration de l'agent d'élution,dilué de préférence avec un auxili- aire de filtration, par exemple avec de l'Hyflo Supercel ou de la célite, dans un rapport pondéral de 1:1 à 1:2, En outre, une chromatographie sur des colonnes de cellulose est particulièrement bien appropriée pour l'enrichissement de l'anti- biotique.
Comme agent d'élution, on se sert dans ce cas d'un mélange de butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion volumétrique de 4:1:2.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" est ainsi obtenu sous la forme d'une poudre jaune-pâle ayant un fort effet antibiotique, qui se caractérise par ses propriétés de solubilité, par sa chromatographie sur papier, par son électro- phorèse, ainsi que par son comportement vis-à-vis des réactifs colorés et des réactifs de précipitation. L'antibiotique dénommé "grisonomycine" est très bien soluble dans l'eau. Il se dissout, en outre, dans des mélanges d'eau et d'alcools inférieurs, dans le phénol ainsi que dans des mélanges de phénol et de solvants organiques. Il est insoluble dans les solvants organiques usuels, notamment dans les solvants lipoïdes.
Le comportement de l'antibiotique dénommé "grisonomyoine" lors d'une chromatographie sur papier avec du papier Whatman N 1 ressort du tableau suivant, par comparaison avec le sulfate de streptomycine (1), avec la ristocétine A (2) et avec la ristocétine B (3):
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<tb> Valeur <SEP> de <SEP> Rf
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<tb> Mélange <SEP> solvant <SEP> Grisonomycine <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP>
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<tb> A <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
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<tb> B <SEP> 0 <SEP> 0,12 <SEP> 0 <SEP> 0
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<tb> C <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 19 <SEP>
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<tb> D <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
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<tb> E <SEP> 5,15 <SEP> 1 <SEP> 5,15 <SEP> 11,
4
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<tb> F <SEP> 0,65 <SEP> 0, <SEP> 07 <SEP> 0,69 <SEP> 0, <SEP> 69 <SEP>
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<tb> G <SEP> 0, <SEP> 92 <SEP> 0,13 <SEP> 0,41 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
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<tb> H <SEP> 0,90 <SEP> 0,29 <SEP> 0,38 <SEP> 0,17
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<tb> I <SEP> 0, <SEP> 11 <SEP> 0,15 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
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A = butanol saturé d'eau B = butanol saturé d'eau + 2% d'acide p-toluène-sulfonique C = solution aqueuse à 80% d'éthanol, renfermant 1,5% de chlorure de sodium, imprégnation sur papier Whatman N 4 avec une solution 0,95 molaire de sul- fate de sodium et une solution 0,05-molaire de bisulfate de sodium (NaHSO4' H20).
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D = solution aqueuse à 80% de méthanol, renfermant 1,5 % de chlorure de sodium.
E = mélange de butanol, de méthanol et d'eau 3 1/2/1:2 F = mélange de butanol, d'éthanol et d'eau 1:1:2 G = eau saturée de méthylisobutylcétone H = 75% d'eau + 25% d'un mélange de 3 parties de méthanol et d'une partie d'acé- tone, ajusté à un pH de 10 avec de l'ammoniaque et réajusté à un pH de 7,5 avec de l'acide phosphorique.
I = butanol secondaire, saturé d'eau + 0,2% d'acide trichlor-acétique.
(Dans le cas du système solvant E, il s'agit d'un chromatogramme par traversée.
Les chiffres indiqués représentent, dans ce cas, le rapport de la zone de migra- tion de l'antibiotique à la zone de migration du sulfate de streptomycine).
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" se comporte, dans une chromato- graphie sur papier, tout comme la griséine. La griséine migre toutefois plus vite que la grisonomycine dans la plupart des systèmes, par exemple dans le système butanol - acide acétique glacial - eau (4:1:5) dans le rapport 1,4 et dans le système C dans le rapport 1,3.
Lors d'une électrophorèse sur du papier Whatman N 1, l'antibiotique dénommé "grisonomycine" migre sur la cathode et à savoir de 4,2 cm au cours de 5 heures, pour une tension de 110 volts, dans une solution-tampon 0,03 molaire de phosphate de potassium et de sodium d'un pH de 5,5. Dans les mêmes conditions, le sulfate de streptomycine, la ristocétine A et la ristocétine B présentent des zones de migration qui sont respectivement de 8,3, 5,0 et 3,9 cm. Dans une solu- tion 0,2 molaire d'un borate-tampon d'un pH de 8,13, l'antibiotique dénommé "grisonomycine" migre, les conditions étant quant au reste les mêmes, de 2,9 cm vers la cathode. Dans ce cas, la streptomycine et les ristocétines A et B migrent dans le même sens de 6,7 et de 3,4 cm, respectivement.
En solution aqueuse neutre à 10 % et lorsqu'on ajoute goutte-à-goutte une solution aqueuse saturée d'acide picrique, de reineckate d'ammonium, l'héli- anthine ou une solution saturée d'acide picrolonique dans de l'alcool à 90 %, l'antibiotique ne donne pas de précipité et, dans le cas de l'hélianthine, il donne au plus un léger louche. Les tests de Sackaguchi, au maltol, d'Elson-morgan, au biuret et le test de Benedict sont en outre négatifs.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" se différencie des antibio- tiques également produits par des représentants de la famille du Streptomyces griseus, à savoir de la streptomycine, de la rhodomycétine, de l'aesidione, de la streptocine, de la griséine et de la candicidine, par ses propriétés de so- lubilité, par sa couleur propre, par les réactions colorées et par son comporte- ment lors d'une chromatographie sur papier.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" possède une forte activité vis-à-vis de différents microorganismes. Si l'on utilise comme méthode-test in vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucosé, on a alors au bout de 2 heures d'incubation à 37 , avec les différents organismes- tests, les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes:
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<tb> Organismes-tests <SEP> Concentration <SEP> 3 <SEP>
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<tb> inhibante <SEP> ug/cm3
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.aureus <SEP> 1
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<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
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<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 1
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<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1
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<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 1
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<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> streptomycino-résistant <SEP> 1
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<tb> Escherichia <SEP> coli,
<SEP> chloromycétino-résistant <SEP> 1
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<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 1
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<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 1
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<tb> Klebsiella <SEP> type <SEP> A <SEP> 1
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<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 1
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<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 1
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<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 1
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Si l'on utilise pour les tests in vitro la méthode par plaques avec des rondelles de papier de 6 mm de diamètre, on obtient alors, avec une solution à 1% de 1'-'antibiotique dénommé "grisonomycine', les zones inhibantes suivantes:
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<tb> Organismes-tests <SEP> Zone <SEP> inhibante <SEP> en <SEP> mm
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 21
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.aureus,
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<tb> pénicillino-résistant <SEP> 20
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<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 18
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<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> streptomycino-résistant <SEP> 18
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<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> chloromycétino-résistant <SEP> 18
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<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 12
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<tb> Klebsiella <SEP> type <SEP> A <SEP> 17
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<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 19
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L'antibiotique dénommé "grisonomycine" est également actif in vivo.
Lors d'une application de 20 mg par kg effectuée à deux reprises par voie sous cutanée à des souris infectées avec du Kelbsiella type A, on observe 100% de survivantes. Ces doses sont supportées sans dommage par des souris non-infectées.
L'antibiotique dénommé "grisonomycine" ou ses dérivés peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparation pharmaceu- tiques. Celles-ci renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une applica- tion entérale, parentérale ou locale. Pour la formation de cette matière de sup- port, on envisage les substances ne réagissant pas sur les nouveauxcomposés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyal-
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coylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, à l'état de com- primés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, 'ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas éché- ant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants ou émul- sifiants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'autres substances thérapeutique- ment précieuses.
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nou- veaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades.
EXEMPLE 1
La culture du Streptomyces A 10073 est effectuée suivant le procédé de culture immergée. On utilise une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, 20 g de Distillers Solubles, 20 g d'extrait de malt, un gramme de nitrate de sodium et 5 g de chlorure de sodium. La solution nutritive est stérilisée pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère effective, dans les ballons d'ensemencement ou dans les fermenteurs. La solution nutritive stérilisée présente un pH de 7,5 à 8,0. L'ensemencement a lieu avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporulante, de l'organisme. On incube en secouant bien ou en agitant à 27 , les cultures étant aérées dans les fermen- teurs avec environ un volume d'air stérile par volume de solution et par minute.
Après 48 à 120 heures d'incubation, la solution de culture a atteint la valeur maximum d'inhibition vis-à-vis des organismes-tests (Bacillus subtilis, Micro- coccus pyogenes, var. aureus, Escherichis coli, Klebsiella). On sépare par fil- tration ou centrifugation le mycélium ainsi que d'autres composantes solides de la solution renfermant la majeure partie de l'antibiotique, en ajoutant le cas échéant à la solution de culture, avant la filtration, environ 1% d'un auxiliaire de filtration, par exemple de l'hyflo Supercel. On lave les résidus de filtra- tion à l'eau et au méthanol aqueux, puis réunit les liquides de lavage avec le filtrat de culture actif du point de vue antibiotique.
Si l'on utilise, à la place de la solution nutritive indiquée ci- dessus, une solution nutritive renfermant, par litre d'eau du robinet, les sub- stances nutritives suivantes, on obtient alors, après une culture et un traite- ment analogue, des filtrats de culture qui présentent une activité antibiotique aussi élevée.
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<tb> a) <SEP> Lactose <SEP> 20 <SEP> g <SEP>
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<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
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<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
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<tb> b) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
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<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 10 <SEP> g
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<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
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<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<SEP> Mannite <SEP> 20 <SEP> g
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<tb> Distillers <SEP> solubles <SEP> 20 <SEP> g
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<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium, <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
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<tb> d) <SEP> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
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<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
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<tb> Carbone <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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<SEP> Glucose <SEP> 20 <SEP> g
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<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
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<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
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<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g <SEP>
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<tb> Carbone <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
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EXEMPLE 2
A travers une couche de 700 cm3 d'asmite, d'une hauteur de 40 cm, on fait passer, avec une vitesse de traversée de 4 litres par heure, 7 litres du filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1. L'antibiotique est, dans ce cas, complètement adsorbé. Ensuite, avec une vitesse de traversée de 7 à 8 litres par heure, on lave la colonne avec 2 litres d'eau et ensuite avec un mélange de métha- nol, d'eau et d'acide chlorhydrique normal dans la proportion volumétrique de 75:15:10. L'agent d'élution est recueilli par fractions d'un litre.
Les fractions 2 à 4 qui renferment jusqu'à 80% de l'activité antibiotique présentes dans le filtrat de culture sont réunies (environ 3 litres). L'acide chlorhydrique présent dans l'éluat est neutralisé avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium, la quantité d'hydroxyde de sodium nécessaire à cet effet étant préalablement évaluée par titrage d'une partie aliquote diluée à l'eau au double de son volume. La so- lution neutre est concentrée à l'évaporateur rotatif, à 35 , jusqu'à un volume de 200 cm3, puis elle est ensuite filtrée à travers un papier filtre et lavée alors avec peu d'eau. En procédant à un séchage par réfrigération, on obtient, à partir du filtrat, l'antibiotique brut sous la forme d'une poudre brune. Le rendement est d'environ 7 g par litre de filtrat de culture.
EXEMPLE 3
Avec 2 kg de norite, on agite pendant une heure 100 litres du filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1, la totalité de l'activité antibiotique étant adsorbée sur le charbon actif. On sépare ce dernier, avantageusement en ajoutant un auxiliaire de filtration, par exemple de l'Hyflo Supercel, et le lave ensuite à trois reprises avec chaque fois 20 litres d'eau distillée, en agitant chaque fois mécaniquement pendant 30 minutes et en filtrant ensuite. La solution de lavage est inactive du point de vue antibiotique. On agite ensuite le charbon pendant 30 minutes avec 20 litres d'une solution aqueuse à 30 % d'alcool et sé- pare à nouveau par filtration.
Cette opération est répétée avec 20 litres et finalement encore avec 10 litres d'alcool à 30% Une fois réunis, les filtrats alcooliques aqueux renferment de 0,5 à 0,6 g de substance sèche par litre, avec simplement une activité antibiotique minime. Le charbon actif est alors élué de la même manière avec 3 portions (2 x 20 litres, 1 x 10 litres) d'alcool à 60% Ces éluats renferment une forte activité antibiotique. On les réunit et, à 30 au plus, les concentre à un petit volume, dans un évaporateur en couche mince.
La solution aqueuse concentrée obtenue de cette manière est versée dans un vo- lume quintuple d'acétone, l'antibiotique dénommé "grisonomyoine" étant alors précipité principalement sous la forme d'une poudre jaune-pâle. Après avoir laissé reposer pendant plusieurs heures à 0 , on sépare la solution qui surnage du résidu par décantation et lave le résidu au méthanol sec. Le résidu qui reste est bien séché sous vide. On obtient ainsi à l'état brut 7 à 8 g de l'antibio- tique dénommé "grisonomyoine", sous la forme d'une poudre jaune-pâle (fraction 1).
Après avoir été réunies, les solutions acétoniques et méthanoliques renferment 12 à 13 autres grammes de substance qu'on isole en éliminant le solvant sous vide.
Cette substance présente une activité antibiotique spécifique plus petite (frac- tion 2).
EXEMPLE 4
Avec 15 g de norite, on agite pendant une heure un litre du filtrat de culture obtenu suivant l'exemple 1. Le charbon actif est séparé par filtration
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de ]la solution inactive du point de vue antibiotique, avantageusement en ajoutant un auxiliaire de filtration, comme de l'Hyflo Supercel par exemple. En secouant pendant une demi-heure avec 200 cm d'eau, on lave le charbon actif, et ensuite filtre. De la même manière, on lave avec 200 cm3 de méthanol à 30% et essore ensuite fortement le charbon sur un entonnoir à filtre de verre. Les liquides de lavage sont inactifs du point de vue antibiotique. L'adsorbat de charbon lavé de cette manière est élué par secouage pendant une heure avec 200 cm3 d'un mélan- ge de butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion volumétrique de 2:1:2.
La solution foncée, débarrassée du charbon par filtration, renferme environ 70% de l'activité antibiotique présente dans le filtrat de culture. On secoue la'so- lution avec 100 cm3 d'acétate de n-butyle. Les deux phases qui se forment alors sont séparées. La phase aqueuse, de teinte foncée, d'un volume de 140 cm3. ren- ferme pratiquement la totalité de l'activité antibiotique présente dans l'éluat et elle est ensuite soumise à un séchage par réfrigération. On obtient à l'état brut l'antibiotique dénommé "grisonomycine", sous la forme d'une poudre foncée.
Le rendement est de 0,93 g.
EXEMPLE 5
Avec 200 cm3 d'un mélange de butanol, de méthanol, de pyridine et d'eau dans la proportion volumétrique de 2:1:1:2' on secoue pendant une heure 15 g de l'adsorbat au charbon obtenu suivant l'exemple 4 et lavé à l'eau et avec du méthanol à 30%. L'éluat de couleur brun-foncé, qui est débarrassé du charbon par filtration sur un entonnoir à filtre de verre, renferme jusqu'à 80 % de l'ac- tivité antibiotique présente dans le filtrat de culture. On secoue la solution avec 100 cm3 d'acétate de n-butyle. La phase aqueuse d'un volume de 110 cm3 en- viron qui se forme alors et renferme l'activité antibiotique est concentrée à 35 et à un petit volume, dans un évaporateur rotatif.
A partir do cette solution concentrée, et à l'aide d'un séchage par réfrigération, on obtient à l'état brut l'antibiotique dénommé "grisonomycine", sous la forme de 1,01 g d'une poudre jaune-pâle.
EXEMPLE 6
Sur une colonne de 5,5 cm de hauteur, formée d'un mélange de 10 g de norite et de 20 g d'Hyflo Supercel, on chromatographie 5 g d'un concentrat d'antibiotique (fraction 2) obtenu suivant l'exemple 3, la substance étant déli- vrée à la colonne sous la forme d'une solution aqueuse à 10% On recueille des fractions allant jusqu'à un demi-litre. Les fractions 1 à 6, qui sont éluées à l'eau, sont évaporées et elles renferment 4,3 g d'une matière inactive du point de vue antibiotique. A partir des fractions 7 à 10, qui sont éluées avec de l'al- cool à 10%. on obtient 155 mg d'une substance sèche qui est également inactive du point de vue antibiotique.
Les fractions 11 à 14, éluées avec de l'alcool à 30 %, et la fraction 15, éluée avec deux litres d'alcool à 60 %, renferment en- semble 140 mg de l'antibiotique dénommé "grisonomycine", à l'état enrichi, que l'on obtient sous la forme d'une poudre beige en concentrant les solutions à 35 dans l'évaporateur rotatif et en procédant ensuite à un séchage par réfrigéra- tion.
EXEMPLE 7
Dans 100 cm3 d'eau, on dissout 10 g d'un concentrat d'antibiotique (fraction 2) obtenu suivant l'exemple 3 et ajoute 5 g d'hélianthine cristalline (Orange III, sel de sodium de l'acide 4'-diméthylamino-azobenzène-4-sulfonique).
La suspension est agitée de façon intense pendant une heure au mélangeur à vi- breur et elle est ensuite filtrée sur 10 g d'Hyflo Supercel. Le filtrat est débarrassé de l'excès d'hélianthine, par un passage à travers 50 cm3 d'Amberlite IRA400 sous la forme des ions chlorure. On lave l'échangeur d'ions avec 200 cm d'eau et, après avoir réuni les filtrats au liquide de lavage, concentré à un petit volume à 35 sous vide. A partir de la solution concentrée, on obtient par un séchage par réfrigération, sous la forme d'une poudre (6g), l'antibiotique
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enrichi par rapport à la matière de départ.
Le mélange d'hélianthate qui se trouve dans le résidu séparé par filtration renferme en petite quantité une sub- stance active du point de vue antibiotique dont le spectre d'activité biologique se différencie de celui de l'antibiotique dénommé "grisonomycine".
EXEMPLE 8
Sur 647 g de poudre de cellulose exempte de cendre, du type Whatman Standard Grade, on chromatographie 8,1 g d'une préparation d'antibotique (fraction 1) obtenue suivant l'exemple 3. A cet effet, on verse la poudre de cellulose par- portions dans une colonne en verre et comprime le plus fortement possible à l'ai- de d'une capsule en acier inoxydable s'adaptant exactement à l'intérieur de la colonne, de sorte qu'il se forme chaque fois des couches ayant environ 5 cm d'é- paisseur. Il en résulte alors une colonne homogène de cellulose de 70 cm dé hau- teur et de 5,5 cm de diamètre. On lave cette colonne pendant 2 x 24 heures, avec une vitesse de passage de 70 cm3 par heure, avec un mélange de butanol, de métha- nol et d'eau dans la proportion volumétrique de 4:1:2.
La substance à chromato- graphier est dissoute dans 100 cm3 d'eau et additionnée de 50 cm3 de méthanol ainsi que de 50 cm3 de butanol. Avant que cette solution puisse être apportée sur la colonne, on "acclimate" ladite colonne, c'est-à-dire qu'on apporte sur la colonne de petites portions du mélange de butanol, de méthanol et d'eau en faisant décroître la teneur en butanol et en ne fournissant une nouvelle portion, tout en évitant la turbulence, que lorsque la portion précédente s'est complètement infiltrée dans la cellulose. On apporte.dans ce cas 20 cm d'un mélange de butanol, de méthanol et d'eau (3:1:2), 20 cm3 d'un mélange (2:1:2) et 20 cm3 d'un mélange (1:1:2).
Ensuite, on laisse les 200 cm3 de solution s'infiltrer dans la colonne et commence alors à apporter de petites portions du mélange de butanol, de méthanol et d'eau, d'une teneur croissante en butanol. On utilise à cet effet 10 cm3 du mélange 1 1/2:1:2, 20 cm3 du mélange 2:1:2 et 20 cm3 du mélange 3:1:2.
On développe -ensuite la colonne avec le mélange 4 :1:2. On recueille des fractions allant jusqu'à 135 à 140 cm . A chaque fraction active du point de vue antibio- tique, on ajoute 50 cm3 d'éther et l'extrait à trois reprises avec 20 cm3 d'eau.
Après avoir réuni les phases aqueuses, on les lave en les secouant avec 50 cm3 d'éther et l'on obtient ensuite une poudre beige en procédant à un séchage par réfrigération. Les fractions 7 à 26 renferment une matière active du point de vue antibiotique, le maximum d'activité se trouvant dans les fractions 11 à 20.
On réunit ces fractions et l'on obtient à l'état enrichi, 1,45 g de l'antibioti- que dénommé "grisonomycine".
EXEMPLE 9
Sur 154 g de poudre de cellulose exempte de cendre, du type Whatman Standard Grade, on chromatographie 780 mg d'un concentrat d'antibiotique enrichi, obtenu suivant l'exemple 8. Suivant les prescriptions fournies dans l'exemple 8, on obtient, dans un tube de chromatàgraphie d'un diamètre intérieur de 3 cm, une colonne de cellulose de 62 cm de hauteur. On lave cette colonne pendant 4 x 24 heures, avec une vitesse de traversée de 20 cm3 par heure, avec un mélange de butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion volumétrique de 4:1:2. La substance est dissoute dans 5 cm d'eau et additionnée de 2,5 cm de méthanol et de 4 cm3 de butanol.
Avant l'apport de la solution, la colonne est, comme indiqué dans3l'exemple 8, "acclimatée" et à savoir, avec32 cm3 d'un mélange 3:1:2, avec 2 cm d'un mélange 2 :1:2 finalement avec 2 cm d'un mélange 1:6:1:2. On verse ensuite la solution et charge la colonne de cellulose avec des portions, de 2 cm3 chacune, des mélanges de butanol, de méthanol et d'eau 2:1:2, 2 1/2:1:2,3:1:2 et31/2:1:2. Ensuite, la colonne est développée avec le mélange 4:1:2, à une tem- pérature constante de 25 .On recueille des fractions allant chacune jusqu'à 40 cm . Les fractions 14 à 33 qui sont actives du point de vue antibiotique sont extraites individuellement avec 50 cm3 d'un mélange d'éther et de chloroforme (4:1).
La phase aqueuse qui se forme alors et qui renferme l'activité antibioti- que est séparée, et la phase organique est ensuite extraite à deux reprises avec
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5 cm3 d'eau. Après avoir réuni les phases aqueuses (environ 20 cm3) on les lave avec 20 cm3 d'un mélange d'éther et de chloroforme (4:1) et les transforme en une poudre jaune pâle par un séchage par réfrigération. Les fractions 19 à 21 sont les plus fortement actives du point de vue antibiotique. On les réunit et l'on obtient à l'état pur au total 75 mg de l'antibiotique dénommé "grisonomycine" qui, comparé à la matière présente dans le filtrat de culture, possède une acti- vité antibiotique environ 300 fois plus forte. L'antibiotique pur dénommé "gris- onomycine" se dissout très facilement dans l'eau.
Il est difficilement soluble à insoluble dans les solvants organiques, notamment dans les solvants lipoides.
Lors d'une chromatographie sur papier, il se comporte d'une façon unitaire dans les mélanges solvants A à I (voir le tableau dans la description) et il se dif- férencie également dans ces systèmes des autres antibiotiques connus qui sont solubles dans l'eau, comme par exemple la streptomycine, la néomycine, la ris- tocétine A et la ristocétine B, et la viomycine. L'antibiotique dénommé "grisonomy cine" ne peut pas être précipité de solutions aqueuses neutres concentrées avec l'acide picrique, l'hélianthine, le reineckate d'ammonium et l'acide picroloni- que. Il n'est pas adsorbé de telles solutions par des échangeurs d'ions faible- ment acides ou faiblement basiques. Il ne donne pas de réaction colorée suivant Sackaguchi, Erlich, Benedict et Elson-Morgan. La réaction du biuret est négative.
EXEMPLE 10
Dans 100 cm3 d'eau, on dissout 10 g d'une préparation d'antibiotique obtenue suivant l'exemple 4 et ajuste à un pH voisin de 1 à l'aide d'acide chlor- hydrique pentanormal. On extrait cette solution à deux reprises avec 100 cm3 d'un mélange de 100 g de phénol dans 100 cm3 de chloroforme. L'extrait organique ne renferme que peu d'activité antibiotique, et on le jette. On ajuste la solution à un pH de 6,5 en ajoutant du bicarbonate de potassium solide et extrait en 3 portions avec au total 150 cm d'une solution de 300 g de phénol dans un litre de chloroforme. On jette le raffinat aqueux.
On filtre l'extrait obtenu avec le mélange de phénol et de chloroforme à travers une petite couche de célite et extrait le filtrat à trois reprises avec 20 cm3 d'acide chlorhydrique décinormal L'extrait chlorhydrique qui renferme l'antibiotique est ajusté à un pH de 2, puis extrait en six portions avec au total 100 cm3 d'un mélange de 100 g de phénol dans 100 cm3 de chloroforme. L'extrait phénolique est à nouveau filtré à travers de la célite, additionné de 50 cm3 d'eau, de 300 cm3 d'éther et de 300 cm3 d'éther de pétrole, puis bien secoué. Après séparation de la phase aqueuse, on lave en- suite la phase organique à plusieurs reprises avec de petites portions d'eau.
Après avoir réuni les phases aqueuses, on les secoue à plusieurs reprises avec de l'éther en vue d'éliminer le phénol, puis lyophilise ensuite. On obtient 85 mg d'une poudre beige d'une forte activité antibiotique.
REVENDICATIONS
I. Un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, caractérisé par le fait qu'on cultive dans des conditions aérobies, dans une solution nutri- tive, une souche d;actinom ycètes présentant les propriétés du Streptomyces gri- seus A 10073, ou une mutation de cette souche, jusqu'à ce que la solution nutri- tive présente un effet antibiotique notable et qu'on isole ensuite de la solution nutritive l'antibiotique dénommé "grisonomycine".
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants:
1) La culture a lieu de manière immergée.
2) La culture est effectuée dans un milieu aqueux renfermant une source de carbone et d'azote, des sels inorganiques ainsi que, le cas échéant, des substances favorisant la croissance.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.