BE572449A - - Google Patents

Description

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   La présente invention concerne un nouvel antibiotique qui, dans ce qui va suivre, sera dénommé "danubomycine", ses composantes Bl, B2, B3 et B4 et les sels et mélanges de celles-ci, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés; l'invention concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances. 



   L'antibiotique dénommé "danubomycine" se forme lors de la culture d' une souche de streptomycètes du genre de Streptomyces griseus, qui a été isolé suivant des procédés connus à partir d'une prise d'essai faite dans le sol à côté de Donaueschingen (République Fédérale d'Allemagne). Elle est conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et dans ceux de l'Ecole Polytechnique Fédé- rale (Zurich, Suisse) Institut de Botanique Spéciale sous la dénomination "Danu- bomycine", 
La souche de streptomycètes A 9990 forme un mycélium aérien jaunâtre à gris-verdâtre. Elle comporte des chaînes de conidies qui constituent une carac- téristique typique de la famille des Streptomyces et qui, dans cette souche, ne montrent pas la formation de spirales, mais sont irrégulièrement ramifiées. Les diverses spores sont lisses.

   En outre, les milieux nutritifs peptonés de la souche A 9990 ne subissent pas de décoloration   mêlanoidique   en brun-noir. La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se   dévelop-   pe aussi bien à 18    qu'à   36 ; toutefois la croissance optimum sé situe entre 25 et 32 . 



   Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance de la souche A 9990 sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7, ainsi que 10, ont été préparés suivant W. Lindenbein, "Arch Mikrobiol" 17, 361   (1952).   



  1) Gélose synthétique : Croissance grêle, voilée. Mycélium aérien velouté, blanc crayeux au début, plus tard jaunâtre à gris-verdâtre. 



   Substratum non décoloré. 



  2) Milieu synthétique liquide Sédiment, flocons blanc-laiteux à jaune-verdâtre. 



   Pellicule punctiforme au début, plus tard rugueuse, jaune clair ou en partie brun châtaigne. Mycélium aérien peu abondant, jaune-clair. Substratum non décoloré au début, brun-rougeâtre au bout de 2 semaines. 



  3) Gélose-glucose Croissance grêle, voilée, jaune d'oeuf. Mycélium aérien peu abondant, velouté, jaune-clair à jaunâtre-gris verdâ- tre. Substratum décoloré en jaune-clair. 



  4) Gélose-glucose à l'asparagine Croissance grêle, voilée, jaune d'oeuf à jaune foncé. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris verdâtre. 



  5) Gélose au malate de calcium : Croissance grêle, voilée, brun-clair à jaune brunâtre, plus tard jaune-foncé, au bout de 14 jours brunâtre, rouge cuivre. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris-verdâtre. 



  6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C Croissance bonne. Pellicule jaune-clair à brun-rougeâtre. Mycélium aérien velouté, jaune-blanc à gris-verdâtre. Substratum jaune d'or à brun-rougeâtre. 



   Liquéfaction au bout de 27 jours : 10 à 12 mm. 



  7) Gélose à l'amidon Croissance grêle, voilée, jaune-blanc. Mycélium aérien velouté, jaune-clair, gris-verdâtre à l'état mûr. Hydro- lyse au bout de 10 jours : 1,4 cm. 



  8) Pomme de terre : Croissance bonne, brunâtre à brun-rouille. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris-verdâtre, en partie mi- roitant en rouge-jaune-clair par suite de la couleur du substratum. Substratum non décoloré,mais en   partie   carmin. 

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  9) Carotte : Croissance seulement très peu abondante, avec un mycélium aérien jaune-blanc. 



  10) Lait de tournesol : Croissance sous la forme d'une pellicule comportant un mycélium aérien velouté, jaune-clair. Substratum rouge. 



   Peptonisation et lente coagulation. 



   La souche A 9990 croît de la façon suivante, d'après la méthode de T.G. Pridham et D.   Gottlieb,   "J. Bacteriology" 56 107 (1948), lorsqu'on utilise diverses sources de carbone : 
 EMI2.1 
 
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Raffinose <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> L-xylose <SEP> - <SEP> Inuline <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite <SEP> +
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbite <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> D-fructose <SEP> + <SEP> Mésoinosite <SEP> (+)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> Salicine <SEP> +
<tb> 
 
Les signes ont la signification   suivante :   + : bonne croissance, utilisation certaine de la source de carbone mentionnée,   (+): croissance   faible, utilisation douteuse de la source de carbone mentionnée, - :

   pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée. 



   Les caractéristiques les plus importantes de la souche A 9990, no- tamment le contour des spores, la couleur du mycélium aérien, la morphologie des chaînes de spores et la chromogénéité, concordent avec elles du Streptomyces griseus (Krainsky) de Waksman. Par contre, la souche A 9990 forme, à l'encontre du Streptomyces griseus, un pigment brun-rouge qui se diffuse mal. Malgré cette différence,on classera cette souche A 9990 provisoirement dans la famille du Streptomyces griseus. 



   On sait que quelques représentants de la famille du Streptomyces griseus produisent des antibiotiques,ainsi la streptomycine (Waksman S.A., "Streptomycin", éditions Williams and Wilkins, 1949), la rhodomycétine (Shockman G. et Waksman S.A., "Antibiotics and Chemotherapy", 1, 68-75 [1951], l'actidione (Leach B.B., Ford H.J. and Whiffer A.J., "Journ.   Am. Chem.   Society" 69, 474 [1947]) la candicidine   (LechevaliBr   H., Acker R.F., Corke C.T., Haenseler C.M. et Waksman S.A., "mycologia" 45, 155-171 [1953]), la griséine (Reynolds D. M. et Waksman S.A.,   "J.   Bacteriol." 55, 739-752 [1948] et la streptocine (Waksman S.A., Harris D.A., Kupferberg A.B., Singher H.0. et Styles H., "Proc. Soc. Exp.

   Biol. mED 70, 308-312 [1949] On montrera plus loin ci-dessous que le nouvel anti- biotique dénommé "danubomycine" se distingue de façon caractéristique de ces antibiotiques déjà connus. 



   La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la pré- paration de l'antibiotique dénommé   "danubomycine",   à l'utilisation de la souche A 9990 ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote. 



   Pour obtenir l'antibiotique dénommé "danubomycine", on cultive de manière aérobie une souche présentant les propriétés du Streptomyces griseus A 9990, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle et/ou fongicide notable, puis on isole ensuite l'anti- biotique dénommé "danubomycine" du filtrat de culture et/ou du mycélium. 



    @   
La solution nutritive renferme, comme sels inorganiques, par exemple des chlorures, des nitrates, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc, du manganèse. 

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  Les sources de carbone sont surtout des hydrates de carbone comme -.Le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon, et des alcools comme la glycérine et la mannite. Comme composés azotés et comme substances favorisant la croissance, on citera par exemple: des acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines, ainsi que leurs hydrolysats comme les peptones ou les tryptones, des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales, comme le maïs et le froment, des résidus de distillation provenant de la prépara- tion d'alcools, des levures, des fèves, notamment de sojà, des graines, par exem- ple de coton. 



   La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, s'avère appropriée une température compri- se entre 20 et 36 . En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet an- tibiotique notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours. 



   Pour isoler l'antibiotique dénommé "danubomycine", on peut, par exemple, se servir des procédés suivants ; on sépare le mycélium du filtrat de culture a un pH inchangé, après quoi la majeure partie de l'antibiotique se trouve dans le filtrat de culture. Il reste toutefois malgré tout des quantités notables d'antibiotique qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien laver ce dernier. A cet effet, sont appropriés notamment des solvants organiques au moins partiellement solubles dans l'eau, comme des alcools, par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones, par exemple l'acétone et la   méthyléthylcétone,   ou toutefois des acides organiques ou des acides inorganiques dilués comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique. 



  Ces extraits de mycélium sont ajoutés au filtrat de culture, soit directement, soit après concentration préalable sous vide. On extrait ensuite le mélange, avan- tageusement à un pH supérieur à 7, de préférence à un pH compris entre 8 et 10, avec un solvant organique non miscible à l'eau, comme les esters d'acides gras inférieurs, par exemple l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle, des hydrocarbu- res, par exemple le benzène, des hydrocarbures chlorés, par exemple le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, des cétones, par exemple la méthylpropylcétone, la méthylamylcétone ou la di-isobutylcétone, des alcools, comme les alcools butyliques ou les alcools amyliques, des éthers, par exemple l'éther éthylique, l'éther di-isopropylique, des éthers dibutyliques ou des éthers glycoliques, et analogues.

   Si l'on ajuste à un pH de 4 le bouillon de culture qui se forme et sépare ensuite le mycélium, la totalité de la substance active du point de vue antibiotique passe alors dans le filtrat de culture que l'on extrait alors de la manière indiquée ci-dessus, à un pH compris entre 8 et 10. L'extrait de mycélium est pratiquement inactif.

   A la place de l'extraction des cultures à l'aide d'un solvant, ou en combinaison avec une telle extraction? comme opération de purification complémentaire, on peut aussi obtenir l'antibio- tique par adsorption, par exemple à du charbon actif, à des terres activées, comme la terre à foulon ou la floridine, ou à des échangeurs d'ions appropriés comme celui dénommé IRC-50, et par extraction subséquente de l'adsorbat, par exemple à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans 1 eau, comme l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone, le cas échéant en ajou- tant des acides organiques ou inorganiques de bas poids moléculaire. 



   On peut aussi extraire les cultures directement de la manière indi- quée, sans séparation préalable du mycélium. 



   On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques renfermant l'antibiotique, à l'aide d'une solu- tion acide aqueuse d'un pH inférieur à 5, la majeure partie de l'activité anti-. biotique passant alors dans la phase aqueuse. Une quantité moindre d'acitivité reste dans la phase organique. Les solutions aqueuses acides réunies sont alors extraites à nouveau de la manière décrite, à un pH supérieur à 7, avec un solvant 

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 organique non miscible à l'eau. Cette façon d'opérer peut être répétée à plusieurs reprises. Comme solutions acides aqueuses, sont appropriés des acides dilués, comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique, ou des solutions-tampons, comme les tampons à base de citrates ou de phosphates. 



   Les bases brutes ainsi obtenues sont à nouveau avantageusement repri- ses dans un solvant organique, par exemple dans le méthanol, l'éthanol, l'acéto- ne ou le chloroforme, et elles sont séparées des substances insolubles qui sont inactives du point de vue antibiotique. Après élimination du solvant, on obtient à l'état brut l'antibiotique dénommé "danubomycine" sous la forme d'une poudre amorphe, colorée en brun-rouge. Cette poudre est bien soluble dans la plupart des solvants organiques comme les alcools, les cétones, les esters, les hydro- carbures chlorés, les hydrocarbures aromatiques, mais elle est par contre pra- tiquement insoluble dans l'éther de pétrole et dans l'eau. Lors du traitement avec des acides, il se forme des sels jaunes, bien solubles dans l'eau. Dans les milieux alcalins, on observe un virage vers une teinte allant du rouge- orange au violet.

   Dans le spectre ultra-violet, l'antibiotique présente une bande d'absorption à 243 m  avec un épaulement à 260m  
Le comportement de la substance lors d'une chromatographie sur pa- pier avec différents systèmes solvants ressort du tableau ci-après, les valeurs de Rf ayant été déterminées à l'aide de l'activité antibactérielle (Bacterium megatherium et Micrococcus pyogenes var. aureus):

   
 EMI4.1 
 
<tb> Systèmes <SEP> solvants <SEP> @ <SEP> Rf
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> 0,65
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 2%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> + <SEP> 2%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> de <SEP> pipéridine <SEP> 0,90
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Méthylisobutylcétone <SEP> saturée <SEP> d'eau <SEP> 0,00
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 80% <SEP> d'éthanol <SEP> avec <SEP> 1,5% <SEP> de <SEP> chlorure
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> de <SEP> sodium, <SEP> papier <SEP> imprégné <SEP> avec <SEP> une <SEP> so-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> lution <SEP> 0,95-molaire <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> de <SEP> sodium
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> et <SEP> avec <SEP> une <SEP> solution <SEP> 0,

  05-molaire <SEP> de <SEP> bi-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Mélange <SEP> de <SEP> butanol, <SEP> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'eau
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> (4:1:2) <SEP> 0,67
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,70
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> + <SEP> 1%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> 0,80
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 75% <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 25% <SEP> d'un <SEP> mélange <SEP> de <SEP> 3 <SEP> parties
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'une <SEP> partie <SEP> d'acétone, <SEP> amené
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 10,

  5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'ammoniaque, <SEP> puis
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tamponné <SEP> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7,5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'acide
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> phosphorique <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,70
<tb> 
 
L'antibiotique brut dénommé "danubomycine" peut être séparé en plusieurs composantes à l'aide de diverses méthodes, par exemple par chromato- graphie sur de la cellulose, sur de l'oxyde d'aluminium et analogues, ou par répartition entre de l'eau et un solvant organique non miscible ou seulement partiellement miscible à l'eau, le cas échéant avec addition d'acides solubles dans l'eau, d'alcools, de cétones et analogues.

   Les systèmes solvants suivants, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison, se sont avérés particulière- ment appropriés pour la répartition à contre-courant : 

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 a) 5 parties en volume d'éther de pétrole (domaine d'ébullition 40-70 ), 5 par- ties en volume de benzène, 8 parties en volume de méthanol, 2 parties en volume d'eau; b) 7,5 parties en volume d'éther de pétrole, 2,5 parties en volume de benzène, 7,5 parties en volume d'éthanol absolu et 2,5 parties en volume d'eau. 



   La répartition a lieu avantageusement suivant le procédé à contre- courant, dans des appareillages appropriés. Les diverses composantes se diffé- rencient par leurs propriétés   physico-chimiques   et biologiques. Elles peuvent être obtenues sous forme pure par cristallisation ou précipitation dans des solvants organiques, par exemple dans l'acétone, le méthanol, l'acétate d'éthyle, dans des mélanges d'acétone et de méthanol, dans des mélanges d'acétone et d' éther, dans des mélanges d'acétone et d'éther de pétrole, dans des mélanges d' acétate d'éthyle et d'éther, dans des mélanges d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, ou dans des solutions organiques aqueuses comme les alcools dilués, l'acétone diluée,   etc...   



   L'antibiotique brut dénommé "danubomycine" peut dans le système a), en 10 stades, être décomposé en une composante active et en une composante pra- tiquement inactive. La composante active se trouve dans les stades 4 à 10 et elle peut, dans le système b), en 375 stades, être séparée en quatre composantes au moins, qui sont désignées par "danubomycine"   Bl,   B2, B3 et B4. Les maxima des quatre composantes se trouvent aux stades 40,64, 124 et 164. La composante Bl cristallise dans l'acétate d'éthyle, les composantes B2 et B3 dans l'acétone. 



   L'antibiotique dénommé "danubomycine" ne présente aucune analogie avec les autres antibiotiques produits par le,Streptomyces griseus. A l'encontre de l'antibiotique dénommé "danubomycine", la streptomycine et la griséine sont bien solubles dans l'eau, tandis que la rhodomycétine est insoluble dans les acides dilués. La candicidine est insoluble dans la plupart des solvants organi- ques et présente une absorption différente dans le spectre ultra-violet. 



  D'autres différences distinguent l'antibiotique dénommé "danubomycine" de la streptomycine, de l'actidione et de la streptocine en ce qui a trait à la cou- leur propre, de   l'actidione   neutre et de la rhodomycétine acide etde lat streptocne en ce qui a trait au caractère chimique. La griséine renferme de plus du fer et du soufre, éléments qu'on ne peut pas déceler dans l'antibiotique dénommé "danubo- mycine". 



   Les sels de l'antibiotique dénommé   "danubomycine"   et de ses compo- santes Bl, B2, B3 et B4 dérivent des acides inorganiques et organiques connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuriques, des acides acétique, propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, citrique, mandélique, pantothénique, ascorbique, ou des acides aminés comme l'acide gluta- rique, la cystéine et analogues. Ils constituent des sels neutres ou acides. 



  Leur préparation a lieu en faisant agir les acides correspondants sur la base libre, ou par double décomposition de sels, par exemple de sulfate de danubomyci- ne avec du pantothénate de calcium. 



   L'antibiotique dénommé   "danubomycine"   présente une activité anti- biotique vis-à-vis de différents organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode- test in vitro des séries de dilutions (par puissances de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37  pendant 24 heures, on a les concentrations suivantes qui sont encore   inhibantes   

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 EMI6.1 
 
<tb> Organismes-tests <SEP> Concentration <SEP> inhibante
<tb> 
<tb> 
<tb> ug/cm3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.

   <SEP> aureus
<tb> 
<tb> 
<tb> péniaillino-résistant <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,

  1
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Klebsiella <SEP> type <SEP> A <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 100
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> < <SEP> 0,

  1 <SEP> 
<tb> 
 + Cultivé dans le milieu synthétique de   Kirchner   avec 5% d'albumine bovine ; détermination de la croissance au bout de 2 semaines. 



  ++ dans du bouillon avec 10% de sérum de cheval. 



   Le développement du virus de l'influenza sur des membranes isolées du chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours d'incubation est encore inhibé par l'antibiotique dénommé "danubomycine" à une concentration in- férieure à 10 ug/cm3 
L'antibiotique dénommé "danubomycine" est également actif in vivo. 



  Si l'on infecte intravaginalement avec du Trichomonas foetus des Hamsters fe- melles adultes et traite l'infection trichomonadénique chronique qui en résulte, localement pendant 3 semaines avec une suspension aqueuse à 0,3% de l'antibioti- que dénommé   "danubomyoine",   l'infection trichomonadénique disparait alors chez quatre animaux sur quatre. 



   En dehors du procédé de préparation de l'antibiotique dénommé   "danu-   bomycine", de ses composantes et de ses sels neutres et acides, l'invention con- cerne également les composés indiqués proprement dits, notamment les sulfates, les chlorhydrates, les acétates et les pantothénates, ainsi que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse. 



   L'antibiotique dénommé   "danubomycine",   ses composantes Bl, B2, B3 et B4, leurs sels et dérivés, les produits de scission indiqués ci-dessus ou les 

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 mélanges correspondants peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques. Ces préparations renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application   entérale,   parentérale ou locale.

   Pour la formation de cette matière de support, on envisage les substances ne réagis- sant pas sur les nouveaux composés comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus. Les préparations pharmaceutiques peuvent se pré- senter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renfer- ment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabili- sation, des agents mouillants ou émulsifiants. Elles peuvent aussi renfermer en- core d'autres substances thérapeutiquement précieuses. 



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades. 



   EXEMPLE 1 
On prépare une solution nutritive de la composition: 20 g de glycéri- ne, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, un gramme de nitrate de sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,3. On place cette solution ou un multiple de celle-ci dans des fioles coniques de 500 cm3 (renfermant chacune 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fermenteurs de 500 litres (renfermant chacun 300 litres de solution nutritive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère.

   On ensemence alors avec   jusqu'à   10% d'une culture végétative, partiellement sporu- lente de la souche de streptomycètes A 9990 et incube tout en secouant bien ou en agitant, et en faisant passer   de,l'air   dans les fermenteurs (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute) à 27 . Au bout de 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures à travers un entonnoir filtrant ou à travers un filtre-presse ou à travers un filtre rotatif suivant le volume, en ajoutant un auxiliaire de filtration, et débarrasse ainsi du mycé- lium et des autres composantes solides la solution aqueuse active du point de vue antibiotique. 



   EXEMPLE 2 
Si l'on utilise, à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c, d, e ou f décrites ci-après, on obtient alors, après stérilisation analogue, après ensemencement avec une souche de streptomy- cètes A 9990, après incubation à 27  et filtration, des solutions aqueuses qui sont actives du point de vue antibiotique. - a) 10 g de glucose brut, 5 g de peptone, 3 g d'extrait de viande (Oxo Lab Lemco), 5 g de chlorure de,sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet; le pH -avant la stérilisation est de 7,5. b) 20 g de lactose, 20 g de Distillers solubles, un gramme de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium et un litre d'eau du robinet, le pH avant la stérilisation est de 7,5. c) 20 g de mannite, 20 g de farine de soja et un litre d'eau du ro- binet ;

   le pH avant la stérilisation est de 7,5 d) 10 g de lactose, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium, un gramme de   nitrate   de sodium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5. 

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 e) 20 g de mannite, 20 g de "Distillers solubles", 3 g de chlorure de sodium, un gramme de nitrate de sodium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5. f) 10 g de glucose, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de   so=   dium, un gramme de nitrate de sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5. 



   EXEMPLE 3 
On agite avec 25 litres d'acétone le résidu de filtration d'une charge de 150 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis filtre à nouveau. 



  On répète cette opération à deux reprises, après quoi on réunit les solutions acétoniques renfermant l'antibiotique, les concentre sous vide jusqu'à 5 litres et les réunit au filtrat de culture. On extrait alors cette solution dans un extraoteur Westphalia, à un pH de 8,5, avec 70 litres d'acétate d'éthyle, ce qui fait que la totalité de l'activité antibiotique passe dans la phase organique. 



  L'extrait rouge-orange est lavé à l'eau, évaporé sous vide jusqu'à 5 litres et ensuite extrait à plusieurs reprises avec de l'acide acétique demi-normal. La solution d'acétate d'éthyle présente une'faible activité antibiotique, tandis que la majeure partie de l'activité se trouve dans les solutions acétiques. 



  On réunit ces solutions, les amène à un pH de 8,5 à l'aide d'une solution binor- male de carbonate de sodium, ce qui fait que la teinte vire du jaune au rouge- orange, puis on extrait au chlorure d'éthylène. L'extrait obtenu au chlorure d'éthylène est à nouveau soumis à une extraction avec de l'acide acétique demi- normal, après quoi, comme décrit, on alcalinise et extrait. Finalement, on sèche la solution de chlorure d'éthylène sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide. On obtient ainsi sous la forme d'une poudre amorphe les bases brutes, de couleur rouge-brun, qui sont actives du point de vue antibiotique. Cette poudre est bien soluble dans le méthanol,   l'éthanol,     l'acétone,   l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le chlorure d'éthylène, le   benzèae   et les acides aqueux dilués. 



  Elle est à peine soluble dans l'eau et dans l'éther de pétrole. Son spectre ultra-violet présente un maximum à 243 m  avec un épaulement à 260 m  
Son comportement dans un chromatogramme sur papier dans différents systèmes solvants est le suivant : 
 EMI8.1 
 
<tb> Systèmes <SEP> solvants <SEP> Rf
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> 0,65
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 2%
<tb> 
<tb> 
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> + <SEP> 2%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> de <SEP> pipéridine <SEP> 0,90
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Méthylisobutyloétone <SEP> saturée <SEP> d'eau <SEP> 0,00
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 80% <SEP> d'éthanol <SEP> avec <SEP> 1,5% <SEP> de <SEP> chlorure <SEP> de
<tb> 
<tb> 
<tb> sodium,

   <SEP> papier <SEP> imprégné <SEP> avec <SEP> une <SEP> solution
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,95-molaire <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> et <SEP> avec
<tb> 
<tb> 
<tb> une <SEP> solution <SEP> 0,05-molaire <SEP> de <SEP> bisulfate <SEP> de
<tb> 
<tb> 
<tb> sodium <SEP> 0,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Mélange <SEP> de <SEP> butanol, <SEP> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'eau
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> (4:1:

  2) <SEP> 0,67
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,70
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> + <SEP> 1%
<tb> 
<tb> 
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> 0,80
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 75% <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 25% <SEP> d'un <SEP> mélange <SEP> de <SEP> 3 <SEP> parties <SEP> de
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> méthanol <SEP> et <SEP> d'une <SEP> partie <SEP> d'acétone, <SEP> amené <SEP> à <SEP> un
<tb> 
<tb> 
<tb> pH <SEP> de <SEP> 10,5 <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'ammoniaque, <SEP> puis <SEP> tamponné <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb> 
<tb> 
<tb> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7,5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'acide <SEP> phosphorique <SEP> 0,70
<tb> 
 

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EXEMPLE 4 
On soumet,

   à une répartition à contre-courant en 10 stades, 32 g des bases brutes obtenues suivant les exemples 1 et 3, en utilisant le système solvant suivant : 5 parties en volume d'éther de pétrole (bouillant à   40-70 ),   5 parties en volume de benzène, 8 parties en volume de méthanol et 2 parties en volume d'eau. Après avoir évaporé sous vide à 30  le contenu des divers récipients de répartition, on trouve dans les stades 4 à 10 un maximum d'activité et de sub- stance, tandis que la majeure partie des substances accompagnatrices inactives se trouvent dans les stades 0 à 3. Après avoir réuni les stades 4 à 10, on obtient à l'état enrichi 8,5 g de l'antibiotique dénommé "danubomycine" sous la forme d' une poudre rouge-orange. 



  Absorption en ultra-violet :maximum à 243m  avec un épaulement à 260 m  
EXEMPLE 5 
On soumet à une répartition à contre-courant en 375 stades 8,5 g du produit enrichi obtenu suivant l'exemple 4, en utilisant le système solvant suivant : 7,5 parties en volume d'éther de pétrole, 2,5 parties en volume de benzène, 7,5 parties en volume d'éthanol absolu et 2,5 parties en volume d'eau. 



  Le contenu des divers récipients de répartition est évaporé sous vide à 30 . 



  Les maxima d'activité et de substance se trouvent dans les stades 35 à 45 (com- posante Bl), 60 à 70 (B2), 115 à 135 (B3) et 155 à 175 (B4). Les solutions pro- venant de ces récipients sont réunies et évaporées à sec sous vide à 30 . 



   On obtient ainsi, sous la forme d'une poudre rouge à rouge-orange, les composantes Bl, B2, B3 et B4 de l'antibiotique dénommé "danubomycine", compo- santes qui peuvent être cristallisées par un traitement à l'acétate d'éthyle ou à l'acétone. 



   EXEMPLE 6 
Tout en ajoutant de   l'Hyflo   comme auxiliaire de filtration, on dé- barrasse du mycélium une solution de culture d'une charge de 950 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis traite ensuite séparément le filtrat et le résidu de filtration. a) Le filtrat de culture est refroidi, ajusté à un pH de 8,5 à 9,0 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium, puis soumis dans un extracteur à   une extraction à l'acétate d'éthyle dans le rapport 3 :1, totalité de l'activi-   té antibiotique passant dans la phase organique. L'extrait est directement adsor- bé sur une colonne chargée d'un litre d'Amberlite IRC-50 (forme acide, deshydra- tée au méthanol et acclimatée à l'acétate d'éthyle). La fraction qui passe est inactive du point de vue antibiotique.

   On peut, par lavage avec du méthanol, extraire d'autres substances accompagnatrices inactives. L'antibiotique dénommé "danubomycine" est alors élué avec une solution méthanolique 0,4-normale d'acide chlorhydrique. La moitié environ des éluats actifs possède un pH compris entre 4 et 6, tandis que l'autre moitié présente un pH de 1,5 environ. On desacidifie cette dernière moitié sur une colonne d'Amberlite IR-45. Après avoir réuni les éluats méthanoliques, on les ajuste alors à un pH de 3,5 à l'aide d'une solution méthanolique normale d'acide chlorhydrique et les concentre dans un évaporateur rotatif, à 30  au maximum, jusqu'à un petit volume (200 à 300 om3), et les délaye dans un volume décuple d'acétate d'éthyle. On essore le précipité, le lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther, puis le sèche sous vide à 20-25 .

   Rende- ment 5 g du chlorhydrate brun-jaune de l'antibiotique dénommé "danubomycine". b) Le résidu de filtration humide, constitué par le mycélium et   l'Hyflo   (environ 170 kg) est agité à deux reprises avec 170 litres d'acétone. 



  L'activité antibiotique est adsorbée sur une colonne   d'Amberlite   IRC-50 (forme acide, acclimatée sur de l'acétone à 70%) Le chlorhydrate (obtenu comme sous a)) de l'antibiotique dénommé "danubomycine" est souillé d'une quantité assez forte de sels inorganiques. Le rendement est de 29,4 g d'une poudre jaune. 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 



     EXEMPLE   7 
A l'aide d'acide chlorhydrique, on ajuste, à un pH de 4, 6700 litres d'une solution de culture d'une charge obtenue suivant l'exemple 1 ou 2. Lorsque le pH ne varie plus au bout d'une demi-heure, on filtre après avoir ajouté 2%   d'Eyflo.   On soumet le filtrat de culture, à un pH de 8,5 à 9,0, dans un extrac- teur, à une extraction à l'acétate d'éthyle dans le rapport 3:1. Comme décrit sous a) dans l'exemple 6, l'activité antibiotique est adsorbée sur 4 litres d'Amberlite IRC-50, puis éluée. Le rendement est de 85 g de chlorhydrate brun- jaune de l'antibiotique dénommé "danubomycine". A partir du gâteau de filtration, on ne peut plus, par extraction à l'acétone, obtenir de matière active. 



   REVENDICATIONS. 



   I. Un procédé de préparation du nouvel antibiotique dénommé "danu- bomycine", caractérisé par le fait qu'on cultive dans des conditions aérobies une souche présentant les propriétés du Streptomyces griseus A 9990 jusqu'à ce que la solution nutritive présente une activité antibiotique notable et qu'on isole ensuite le nouvel antibiotique dénommé   "danubomycine".   



   Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants : 
1) La culture a lieu de manière   immergée.   



   2) La solution nutritive renferme des substances favorisant la croissance. 



   3) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température comprise entre 20 et 40 . 



   4) L'antibiotique dénommé   "danubomycine"   est extrait du filtrat de culture, à un pH supérieur à 7, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau. 



   5) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est extrait du mycélium séparé à l'aide d'un solvant organique au moins en partie miscible à l'eau. 



   6) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est extrait du mycélium à l'aide d'un acide organique ou inorganique. 



   7) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est purifié par adsorption, de préférence à du charbon actif, à de l'oxyde d'aluminium ou à des résines échangeuses d'ions, et par extraction de l'adsorbat avec un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, le cas échéant avec addition d'acides. 



   8) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est purifié par une répar- tition entre une solution aqueuse et un solvant organique non-miscible à l'eau, le cas échéant avec addition d'acides dilués, et il est séparé en ses composantes Bl, B2, B3 et B4. 



   9) La répartition a lieu suivant le procédé à contre-courant. 



   10) Les composantes   Bl,   B2, B3 et B4 sont obtenues sous forme cris- talline dans un solvant organique. 



   Il) L'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses composantes Bl, B2, B3 et B4 sont préparés sous la forme de leurs sels cristallins avec un acide inor- ganique ou organique en faisant agir cet acide sur les bases libres des anti- biotiques ou par double décomposition d'un sel des antibiotiques avec un sel de l'acide correspondant. 

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims (1)

1. II. A titre de produits industriels nouveaux : 12) Le nouvel antibiotique dénommé "danubomycine" qui présente en ultra-violet une absorption à 243 m avec un épaulement à 260 m , ainsi que ses sels. <Desc/Clms Page number 11>

   13) La composante B1 de l'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses sels.

   14) La composante B2 de l'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses sels.

   15) La composante B3 de l'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses sels.

   16) La composante B4 de l'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses sels.

   17) Les préparations pharmaceutiques renfermant l'antibiotique dénom- mé "danubomycine", ses composantes B1 B2 B3 et B4, leurs sels ou mélanges de ces substances.