**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un antibiotique dit TM-743, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver la souche de microorganisme Bacillus circulans TM-743 (FERM-P- No. 2633) dans un milieu de culture, à extraire le TM-743 ainsi produit à partir du milieu de culture, sous forme d'une solution, et à séparer le TM-743 de la solution d'extrait.
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que le
Bacillus circulans TM-743 est cultivé dans un milieu de culture aqueux contenant des sources de carbone et d'azote assimilables, à une température de 30-350C, pendant 72120 heures.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on effectue l'extraction de l'antibiotique TM-743 à l'aide d'un alcool inférieur non miscible à l'eau.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le
TM-743 est séparé de la solution extraite par évaporation sous vide du solvant d'extraction.
La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'un antibiotique dit TM-743, en cultivant une souche de
Bacillus circulans TM-743 (FERM-P No. 2633).
Comme antibiotiques qui sont fortement efficaces contre les bactéries Gram-négatives et qui ont une faible toxicité, les substances suivantes ont été préalablement mises au point ou utilisées en pratique: la colistine: J. Biochem, 54, 25 (1963), la polymyxine: Antibiotics, 2, 255 (1967), la circuline: Experientia, 24, 656 (1968), la polypeptine: J. Biol. Chem., 198,405 (1952) le produit dit BN-7: Demande de brevet japonais
no. 56 895/7 et le produit dit EM-49: J. Antibiotics, 26,444 (1973).
Ces antibiotiques sont des substances de la série des polypeptides et, plus particulièrement, certains de ces antibiotiques
sont appelés antibiotiques du type polymyxine en se basant sur
leurs constituants d'aminoacides et d'acides gras.
Ces antibiotiques possèdent la thréonine en tant qu'un de
leurs constituants d'aminoacides, sauf le produit dit EM-49 qui
est produit par une souche de Bacillus circulans.
L'antibiotique dit TM-743, est également produit par un
microorganisme du groupe des Bacillus circulans et il lui man
que la thréonine. En outre, le TM-743 a les mêmes consti
tuants d'aminoacides que le EM-49, c'est-à-dire qu'il contient
de l'acide 2,4-diaminobutyrique, de la leucine et de la phényla
lanine suivant un rapport moléculaire de 5:2:1. Cependant,
leurs constituants d'acides gras diffèrent. Ainsi le TM-743
contient des acides gras en C8 et Cs, alors que l'EM-49 con
tient des acides gras en Cio et Cl respectivement. En consé
quence, on peut dire que l'antibiotique, dit TM-743, est une
nouvelle substance.
Il s'est avéré que cet antibiotique possède
une forte activité antibactérienne contre des microorganismes
pathogènes, particulièrement contre les bactéries Gram-négati
ves.
La présente invention vise notamment à fournir un procédé
pour la production de l'antibiotique dit TM-743 avec une
grande pureté.
L'antibiotique dit TM-743 peut être obtenu sous forme de
son chlorhydrate constitué par une poudre blanche.
Le TM-743 est un genre d'antibiotique de la série des poly
peptides, plus spécifiquement il peut être appelé antibiotique
du type polymyxine.
La souche de microorganismes, appartenant au Bacillus circulans et produisant l'antibiotique TM-743, a été isolée à partir d'un échantillon de sol et a été désignée par Bacillus circulans TM-743 (ATCC no 31 154) par la titulaire.
La présente invention sera maintenant décrite en relation avec les dessins ci-joints dans lesquels:
La fig. 1 représente le spectre d'absorption dans l'ultraviolet du chlorhydrate de TM-743 dans le méthanol.
La fig. 2 représente le spectre d'absorption dans l'infrarouge du chlorhydrate de TM-743 avec une tablette de KBr; et
la fig. 3 représente le spectre de résonance magnétique nucléaire du chlorhydrate de TM-743 dans le diméthylsulf oxyde-di.
L'antibiotique dit TM-743 est préparé par culture, dans des conditions contrôlées, d'une nouvelle souche de Bacillus circulans qui a été identifiée selon Manual of Determinative Bacteriology de Bergey, 7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (publié par A. I. Laskin et H. A. Lechevalier).
Les propriétés microbiologiques de la nouvelle souche, le
Bacillus circulans TM-743 (ATCC no. 31 154), sont les suivantes:
1. Caractéristiques au microscope
1) Cellules végétatives: tiges à extrémités rondes, 0,81,0 sur 3-7 microns (en moyenne 0,9 sur 4,5 microns); motilité active; une chaîne n'est pas formée, aérobies, de manière facultative anaérobies; Gram-négatives; non résistantes vis-àvis des acides.
2) Spores: ellipsoïdales; 0,7 à 0,1 sur 1,2 à 1,5 micron (en moyenne 0,8 sur 1,3 micron); placés centralement ou paracentralement.
3) Sporanges: gonflés et en forme de fuseau.
2. Caractéristiques de colonies
Croissance sur de l'agar-agar nutritif contenant un extrait de viande, de la peptone et NaCI: une lente expansion est observée. La colonie isolée est de dimension petite ou moyenne et non ronde (rebord non entier); colonie mince, translucide ou transparente, lustrée et fortement visqueuse.
3. Croissance sur certains milieux typiques
1) Agar-agar nutritif avec du glucose: plus importante que sur de l'agar-agar nutritif normal.
2) Bouillon nutritif: Mauvais aspect trouble, mais une pellicule épaisse et visqueuse se forme. Riche sporulation dans la pellicule.
3) Agar-agar-soja-produit dit Trypto, contenant de la tryptone, de la peptone de soja et du NaCI, agar-agar-jus de tomate contenant du jus de tomate, de la peptone et du lait peptonisé ou agar-agar-dextrose-pomme-de-terre: ordinairement pas de croissance.
4. Propriétés physiologiques
1) Hydrolyse de l'amidon +
2) Utilisation de: Caséine +
Citrate
Azote minéral
3) Formation de: Catalase +
Uréase +
Oxydase +
Indole +
Dihydroxyacétone
Pigment
H2S
Acétoïne (test de Voges-Proskauer)
4) Liquéfaction de la galatine +
5) Réduction de nitrates +
6) Coagulation de la caséine +
7) Rougissement de: Lait de tournesol +
Rouge méthyle
8) Acide à partir de: Amidon +
Lactose +
Glucose +
Galactose +
Mannitol
Arabinose
Xylose
Fructose
Saccharose
Inositol
Glycérol 9) Gaz à partir d'hydrates de carbone
10) Température de croissance 20-37"C 11) Croissance: dans NaCI à 7%
à pH 5,7
Ces caractéristiques de la présente souche sont semblables à celles du Bacillus polymixa, du Bacillus circulans, du Bacillus alvei, du Bacillus macerance et du Bacillus stearothermophilus selon Manual of Determinative Bacteriology de Bergey,7ème édition, et Handbook of Microbiology, volume 1 (par A. I.
Laskin et collaborateurs). Spécialement, elle ressemble intimement au Bacillus circulans par diverses propriétés morphologiques et physiologiques. Il y a cependant, une légère différence entre les deux microorganismes, c'est-à-dire que le Bacillus circulans produit de l'acide à partir d'arabinose et de xylose.
D'après ces caractéristiques, on conclut que la présente souche appartient à l'espèce Bacillus circulans et, ainsi, cette souche a été désignée par Bacillus circulans TM-743.
Cette souche a été déposée au Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Image,
Chiba City, Japon, sous la désignation FERM-P-2633, le 9 juillet 1974, et à l'American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, sous la désignation
ATCC no. 31154.
L'antibiotique TM-743 peut être ordinairement obtenu en inoculant la souche de Bacillus circulans TM-743 dans un bouillon nutritif, en cultivant cette souche par le procédé de culture par secouage et en séparant l'antibiotique TM-743 ainsi produit du bouillon de culture. Cette séparation est réalisée en extrayant le TM-743, sous forme de solution, à partir du milieu de culture, et ensuite en séparant le TM-743 de la solution d'extrait.
Le bouillon nutritif pour cultiver la souche TM-743 contient des sources d'azote et de carbone assimilables et certains éléments peu importants. L'amidon, le glycérol et divers genres de saccharides peuvent être utilisés comme sources de carbone.
Surtout, le glucose et le saccharose sont ordinairement utilisés.
La peptone, des aminoacides, la caséine, de la farine de poisson et de la farine de soja peuvent être utilisés comme sources d'azote. Un extrait de viandé, un extrait de levure, de la liqueur de maïs macéré, et d'autres extraits d'origines végétales et animale peuvent être utilisés comme éléments peu importants. Des lipides, des graisses, des huiles et divers composés d'azote minéral peuvent être aussi utilisés de manière subsidiaire. Dans certains cas, on peut également employer des sels minéraux tels que le chlorure de sodium et le carbonate de calcium. Une résine de silicone peut être ajoutée, si cela est nécessaire, comme agent s'opposant à la formation de mousse.
La solution de milieu est neutralisée avant la stérilisation par passage à l'autoclave à 1200C pendant 15 minutes. La culture est réalisée à 30-350C avec aération. Le développement de cellules bactériennes est plutôt lent et la substance active, la TM-743, apparaît à l'extérieur des cellules après environ 50 heures à partir de l'inoculation. La production maxima de la substance dite TM-743 est ordinairement obtenue après 72-120 heures dans le milieu de culture.
Après la culture, les cellules bactériennes sont retirées par centrifugation et la partie surnageante est chargée sur des résines échangeuses de cation, telles que celles dite Amberlite
IRC-50, et éluées avec un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique ou un mélange d'un solvant organique soluble dans l'eau et d'un acide minéral. L'éluat contenant la substance active est décoloré par du charbon activé et concentré sous vide. La substance active peut être aussi extraite de la partie surnageante du bouillon ou de l'éluat avec un alcool inférieur non miscible avec l'eau, tel que le n-butanol. L'extrait est alors concentré sous vide et additionné d'un solvant organique tel que l'acétone pour obtenir le précipité de la substance recherchée. Le séchage du précipité sous vide donne une poudre brute de la substance recherchée.
La poudre brute peut être en outre purifiée par une combinaison efficace de filtration par du gel sur le produit dit Sephadex, la chromatographie avec échange d'ions sur de la carboxyméthylcellulose, la chromatographie sur colonne sur du gel de silice et par un procédé de distribution à contre-courant. Par exemple, l'éluat actif passant à travers le produit dit Sephadex
LH-20 avec de l'eau est concentré, réglé à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionné d'acétone. Le précipité résultant est rassemblé par centrifugation et séché sous vide pour donner le chlorhydrate de TM-743 sous forme de poudre blanche.
La poudre obtenue, le chlorhydrate de TM-743, présente les propriétés physicochimiques suivantes:
1. Valeurs d'analyse élémentaire
C H N Cl 49,31% 8,19% 14,57% 12,10%
2. Point de fusion 2002200C (coloration brunâtre)
3. Pouvoir rotatoire optique [a] j'z3= -52" (C = 1%,eau)
4. Spectre d'absorption dans l'ultraviolet (fig. 1)
La solution méthanolique de l'antibiotique présente les maxima d'absorption suivants (E'lcm) : 251 m- 1,69, 257 mll- 1,85, 263 m- 1,46 et 266 mF (0,94) (épaulement)
5.
Spectre d'absorption dans l'infrarouge (fig. 2)
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge déterminé avec une tablette de KBr présente des bandes caractéristiques à 3400, 3220, 3030, 2960, 1640-1650, 1520-1540, 1465, 1440, 1385, 1370, 1330, 1280, 1240, 1170, 1080, 1030, 920, 865, 745 et 700 cm-l.
6. Spectre de résonance magnétique nucléaire (fig. 3)
Le spectre de résonance magnétique nucléaire, à 60 MHz, du chlorhydrate de TM-743 dans une solution de diméthylsulf oxyde-ds présente les signaux caractéristiques suivants à o4,0- 4,9 (8H, - NCHCO), 728 (5H,C6Hs) et 7,5-9,2 (-NH3+ et -CONH-).
7. Solubilité
Soluble dans l'eau, dans le méthanol, dans l'éthanol, dans le n-butanol contenant de l'eau et dans le diméthylsulfoxyde mais insoluble dans l'acétate, dans l'acétate d'éthyle, dans le chloroforme, dans l'éther éthylique, dans le benzène et dans l'éther de pétrole.
8. Réaction colorée
Réactions positives avec la ninhydrine et le biuret
9. Composition
Une comparaison par chromatographie sur papier et une analyse quantitative des aminoacides de l'hydrolysat de chlorhydrate de TM-743 avec de l'acide chlorhydrique 6N, à 105 C, pendant 6 heures avec certains échantillons authentiques indiquent l'existence d'acide 2,4-diamino-butyrique, de leucine et de phénylalanine suivant le rapport moléculaire 5:2:1.
L'hydrolyse du chlorhydrate de TM-743 avec de l'acide chlorhydrique 6N à 90OC pendant 30 minutes fournit, en plus d'un mélange d'aminoacides, une fraction huileuse non miscible, qui peut être séparée de la solution hydrolysée par extraction avec de l'éther. La solution éthérée est traitée par un excès de diazométhane à la température ambiante. Le mélange résultant est examiné par chromathographie en phase gazeuse sur une colonne d'acier inoxydable (1000 mm x 3 mm) remplie de 15% du produit dit PEGS (traité par le produit dit Chromosorb W-AW passant au tamis dont l'ouverture de maille est 0,177 à 0,149 mm soit 80 à 100 mesh), He gazeux étant utilisé comme gaz porteur à 1 kg/cm2. Deux pics substantiels, avec un temps de rétention de 3,6 et 5,2 minutes, respectivement sont détectés.
La spectrométrie de masse révèle des pics de masses maxima (M+-H20) pour m/e = 156 pour le premier pic de chromatographie en phase gazeuse et m/e = 170 pour le dernier pic. Les pics d'ions fragmentaires des deux composants m/e = 82 et 96 sont considérés comme étant M+- (H20 +
CH2 = C (OH) OCH3). En conséquence, on peut éventuellement dire que les deux composants sont des esters méthyliques d'acides gras ss-hydroxylés. Ultérieurement, l'analyse couplée par chromatographie en phase gazeuse et une spectrométrie de masse des esters méthyliques triméthylsilylés révèlent les pics de masse maxima m/e = 231 et 254.
De plus, un pic d'ion fragmentaire commun pour les deux composants de chromatographie en phase gazeuse est détecté pour m/e = 175 et on estime que c'est le fragment à terminaison carboxylique dérivé de la scission entre le carbone ss et le carbone y de ces composants. En outre, deux pics d'ions fragmentaires sont également détectés pour m/e = 173 et 187, respectivement dont on estime que ce sont les fragments y-terminaux dérivés de la coupure entre le carbone a et le carbone ss.
D'après ces faits, on peut conclure que les acides gras contenus dans le TM-743 sont CsHllCH(OH)CH2COOH et C6Hl3CH(OH)CH2COOH. Le rapport des teneurs de ces acides gras diffère pour chaque lot d'échantillon de TM-743, alors que la teneur en acides ras totale conserve une bonne valeur constante par rapport à la teneur en aminoacides. Ceci peut suggérer que l'antibiotique TM-743 est constitué de deux composants, qui sont identiques au point de vue constituants d'aminoacides mais qui diffèrent légèrement au point de vue des constituants d'acides gras.
L'antibiotique constitué par le chlorhydrate de TM-743 présente une bonne activité antibactérienne contre des microorganismes pathogènes, spécialement contre les bactéries
Gram-négatives. Ainsi, ordinairement le chlorhydrate de TM743 présente une activité suffisante contre diverses souches de
Pseudomonas, comprenant des souches isolées par voie clinique, à une concentration de 1,6 à 6,25 11 g/ml. De plus, son activité élevée contre l'Escherichia coli résistant à la polymyxine B est le point le plus remarquable. De nombreuses bactéries Grampositives, de nombreuses levures et de nombreux champignons sont également fortement sensibles à cet antibiotique.
L'activité antibactérienne a été déterminée par le procédé suivant: divers microorganismes ont été inoculés dans des plaques d'agar-agar-infusion de coeur (ou, partiellement, milieu de Sabouraud) contenant l'antibiotique formé par le chlorhydrate de TM-743 suivant des concentrations graduelles et la concentration minima pour laquelle la croissance des microbes a été totalement inhibée a été déterminée. Le spectre antibactérien de l'antibiotique TM-743 ainsi obtenu est présenté dans le tableau suivant.
La toxicité aiguë (DL5o) du chlorhydrate de TM-743 vis-àvis des souris, par injection intraveineuse, était 16 mg/kg.
Tableau
Spectre antibactérien du TM-743
Microorganismes testés Concentration
minima d'inhibi-
tion (!lg/ml)
Escherichia coli 055 6,25
E. Coli B 1,6
E. Coli SC 8600 (résistant à la polymyxine B) 3,2
Klebsiella pneumoniae 6,25
Proteus vulgaris HX-19 > 100
Pseudomonas aeruginosa 171-3 1,6
Ps. aeruginosa GNB 1-1 1,6
Ps. aeruginosa GNB 1-2 3,2
Ps. aeruginosa GNB 1-3 6,25
Ps. aeruginosa GNB 1-4 6,25
Ps. aeruginosa KB-1 3,2
Ps. aeruginosa P-32 6,25
Ps. fluorescens ATCC 27 6.25
Ps. ovalis IAM 1236 12,5
Salmonella enteritidis 6,25
Shigella sonnei 6,25
Staphylococcus aureus 209 P 25
St. aureus Smith 12.5
Bacillus subtilis PCI 219 12.5 Micrococcus lysodeikticus 0,8
Candida albicans 25
Les exemples suivants présentent des procédés pratiques pour réaliser le présent antibiotique, sans aucune limitation.
Exemple 1
Le Bacillus circulans TM-743, conservé sur une partie inclinée d'agar-agar-infusion de coeur, a été inoculé dans un bouillon d'infusion de cceur traité à l'autoclave, en quantité de
100 ml dans un ballon de Sakaguchi de 500 ml bouché par du coton. Après 24 heures de culture sur un agitateur à mouvement de va-et-vient à 30 C, 5 ml de la culture ont été retirés et placés dans un ballon de Sakaguchi de 2 litres, bouché par du coton, contenant 500 ml du bouillon traité à l'autoclave à ph 7, qui se composait de 20 g de glycérol, de 5 g de farine d'avoine, de 7,5 g de peptone, de 1,25 g d'extrait de levure, de 2 g de
NH4CI, de 2,5 g de CaCO et d'eau distillée pour remplir jusqu'à 500 ml.
La culture a été réalisée sur un agitateur à mouvement de va-et-vient, pendant 120 heures à 300C.
Exemple 2
10 litres du bouillon cultivé obtenu dans l'exemple 1 ont été centrifugés pour retirer les cellules bactériennes. La partie surnageante à pH 7,0-7,4 a été introduite dans une colonne de 200 ml de produit dit Amberlite IRC-50, de type H+, lavée à l'eau distillée et éluée avec HCl 0,2N. Les fractions actives ont été neutralisées à travers le produit dit Amberlite IR-45 (type
OH-), décolorées avec 1 % (en poids/volume) du produit dit
Norit A, et concentrées jusqu'à 60 ml sous vide, en dessous de 500C. Par addition de 900 ml d'acétone au concentré, le préci pité de la substance active a été obtenu. Le précipité a été rassemblé par centrifugation et séché sous vide. On a obtenu environ 4 g de poudre brute de TM-743.
Exemple 3
1 gramme de la poudre brute du produit TM-743 obtenu dans l'exemple 2 a été dissous dans 10 ml d'eau distillée et soumis à une filtration sur du gel, à travers une colonne de 2 litres du produit dit Sephadex LH-20 avec de l'eau distillée. La substance active a été éluée en plusieurs fractions au point correspondant à environ 1,3 litre. L'activité des fractions a été vérifiée par la réaction à la ninhydrine et par un test microbiologique. Pour confirmer la pureté des fractions actives, la chromatographie sur couche mince a été réalisée sur du gel dit
Kiesel (Merck) avec la couche supérieure du mélange de nbutanol, d'acide acétique et d'eau (4:1:3).
Les fractions actives exemptes d'impuretés ont été concentrées en dessous de 50OC sous vide jusqu'à 10 ml, réglées à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique et additionnées de 150 ml d'acétone. Le précipité résultant a été rassemblé par centrifugation, lavé à l'acétone et à l'éther éthylique, successivement, et séché sous vide à 500C. On a obtenu environ 750 mg de poudre blanche amorphe de chlorhydrate de TM-743.
** ATTENTION ** start of DESC field can contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Process for preparing an antibiotic known as TM-743, characterized in that it consists in cultivating the strain of the microorganism Bacillus circulans TM-743 (FERM-P- No. 2633) in a culture medium, in extracting the TM-743 thus produced from the culture medium, as a solution, and to separate the TM-743 from the extract solution.
2. Method according to claim 1 characterized in that the
Bacillus circulans TM-743 is grown in an aqueous culture medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, at a temperature of 30-350C, for 72120 hours.
3. Method according to claim 1, characterized in that the extraction of the antibiotic TM-743 is carried out using a lower alcohol immiscible with water.
4. Method according to claim 1, characterized in that the
TM-743 is separated from the extracted solution by vacuum evaporation of the extraction solvent.
The present invention relates to a method of manufacturing an antibiotic known as TM-743, by cultivating a strain of
Bacillus circulans TM-743 (FERM-P No. 2633).
As antibiotics which are highly effective against Gram-negative bacteria and which have low toxicity, the following substances have been previously developed or used in practice: colistin: J. Biochem, 54, 25 (1963), polymyxin: Antibiotics, 2, 255 (1967), circulin: Experientia, 24, 656 (1968), polypeptin: J. Biol. Chem., 198,405 (1952) the product called BN-7: Japanese patent application
no. 56,895/7 and the so-called EM-49: J. Antibiotics, 26,444 (1973).
These antibiotics are substances of the polypeptide series and, more particularly, some of these antibiotics
are called polymyxin antibiotics based on
their constituents of amino acids and fatty acids.
These antibiotics possess threonine as one of
their amino acid constituents, except the product called EM-49 which
is produced by a strain of Bacillus circulans.
The antibiotic known as TM-743 is also produced by a
microorganism of the Bacillus circulans group and it man
than threonine. Furthermore, the TM-743 has the same consti
amino acid killers than EM-49, i.e. it contains
2,4-diaminobutyric acid, leucine and phenyla
lanin in a molecular ratio of 5: 2: 1. However,
their fatty acid constituents differ. Thus the TM-743
contains C8 and Cs fatty acids, while EM-49 con
holds Cio and Cl fatty acids respectively. In consequence
quence, we can say that the antibiotic, known as TM-743, is a
new substance.
It turned out that this antibiotic has
strong antibacterial activity against microorganisms
pathogens, particularly against Gram-negative bacteria
ves.
The present invention aims in particular to provide a method
for the production of the antibiotic known as TM-743 with a
great purity.
The antibiotic known as TM-743 can be obtained in the form of
its hydrochloride consisting of a white powder.
TM-743 is a kind of poly series antibiotic
peptides, more specifically it may be called an antibiotic
polymyxin type.
The strain of microorganisms, belonging to Bacillus circulans and producing the antibiotic TM-743, was isolated from a soil sample and was designated as Bacillus circulans TM-743 (ATCC No. 31,154) by the holder.
The present invention will now be described in relation to the accompanying drawings in which:
Fig. 1 shows the ultraviolet absorption spectrum of TM-743 hydrochloride in methanol.
Fig. 2 shows the infrared absorption spectrum of TM-743 hydrochloride with a KBr tablet; and
fig. 3 shows the nuclear magnetic resonance spectrum of TM-743 hydrochloride in dimethylsulf oxide-di.
The antibiotic known as TM-743 is prepared by culturing, under controlled conditions, a new strain of Bacillus circulans which has been identified according to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition, and Handbook of Microbiology, volume 1 (published by AI Laskin and HA Lechevalier).
The microbiological properties of the new strain, the
Bacillus circulans TM-743 (ATCC no. 31 154), are as follows:
1. Microscope characteristics
1) Vegetative cells: stems with round ends, 0.81.0 by 3-7 microns (average 0.9 by 4.5 microns); active motility; a chain is not formed, aerobic, optionally anaerobic; Gram-negative; not resistant to acids.
2) Spores: ellipsoidal; 0.7 to 0.1 by 1.2 to 1.5 microns (on average 0.8 by 1.3 microns); placed centrally or paracentrally.
3) Sporangia: swollen and spindle shaped.
2. Characteristics of colonies
Growth on nutrient agar containing meat extract, peptone and NaCl: slow expansion is observed. The isolated colony is small or medium in size and not round (rim not entire); thin, translucent or transparent colony, glossy and highly viscous.
3. Growth in certain typical environments
1) Nutrient agar with glucose: more important than normal nutrient agar.
2) Nutrient broth: Poor cloudy appearance, but thick viscous film forms. Rich sporulation in the skin.
3) Agar-agar-soybean-product called Trypto, containing tryptone, soy peptone and NaCI, agar-agar-tomato juice containing tomato juice, peptone and peptonized milk or agar-agar -dextrose-potato: usually no growth.
4. Physiological properties
1) Starch hydrolysis +
2) Use of: Casein +
Citrate
Mineral nitrogen
3) Formation of: Catalase +
Urease +
Oxidase +
Indole +
Dihydroxyacetone
Pigment
H2S
Acetoin (Voges-Proskauer test)
4) Liquefaction of galatine +
5) Reduction of nitrates +
6) Casein + coagulation
7) Reddening of: Sunflower milk +
Methyl red
8) Acid from: Starch +
Lactose +
Glucose +
Galactose +
Mannitol
Arabinose
Xylose
Fructose
Sucrose
Inositol
Glycerol 9) Gas from carbohydrates
10) Growth temperature 20-37 "C 11) Growth: in 7% NaCl
at pH 5.7
These characteristics of the present strain are similar to those of Bacillus polymixa, Bacillus circulans, Bacillus alvei, Bacillus macerance and Bacillus stearothermophilus according to Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition, and Handbook of Microbiology, volume 1 (by A. I.
Laskin et al). In particular, it closely resembles Bacillus circulans in various morphological and physiological properties. There is, however, a slight difference between the two microorganisms, i.e. Bacillus circulans produces acid from arabinose and xylose.
From these characteristics, it is concluded that the present strain belongs to the species Bacillus circulans and, thus, this strain was referred to as Bacillus circulans TM-743.
This strain has been deposited with Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Image,
Chiba City, Japan, under the designation FERM-P-2633, July 9, 1974, and in the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, United States of America, under the designation
ATCC no. 31154.
Antibiotic TM-743 can be ordinarily obtained by inoculating Bacillus circulans strain TM-743 in nutrient broth, growing this strain by the shake culture method and separating the TM-743 antibiotic thus produced from the broth of culture. This separation is carried out by extracting the TM-743, as a solution, from the culture medium, and then separating the TM-743 from the extract solution.
The nutrient broth for cultivating strain TM-743 contains available nitrogen and carbon sources and some minor elements. Starch, glycerol and various kinds of saccharides can be used as carbon sources.
Mainly, glucose and sucrose are commonly used.
Peptone, amino acids, casein, fishmeal and soybean meal can be used as sources of nitrogen. Meat extract, yeast extract, macerated corn liquor, and other plant and animal extracts can be used as unimportant elements. Lipids, fats, oils and various compounds of inorganic nitrogen can also be used in a subsidiary manner. In some cases, mineral salts such as sodium chloride and calcium carbonate can also be employed. Silicone resin can be added, if necessary, as an anti-foaming agent.
The medium solution is neutralized before sterilization by autoclaving at 1200C for 15 minutes. The culture is carried out at 30-350C with aeration. The development of bacterial cells is rather slow and the active substance, TM-743, appears outside the cells after about 50 hours from inoculation. The maximum production of the so-called TM-743 substance is usually obtained after 72-120 hours in the culture medium.
After the culture, the bacterial cells are removed by centrifugation and the supernatant part is loaded on cation exchange resins, such as those called Amberlite
IRC-50, and eluted with a mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or a mixture of a water soluble organic solvent and a mineral acid. The eluate containing the active substance is decolorized with activated carbon and concentrated in vacuo. The active substance can also be extracted from the supernatant part of the broth or from the eluate with a lower alcohol immiscible with water, such as n-butanol. The extract is then concentrated under vacuum and added with an organic solvent such as acetone to obtain the precipitate of the desired substance. Drying the precipitate in vacuo gives a crude powder of the desired substance.
The raw powder can be further purified by an efficient combination of gel filtration on the product called Sephadex, ion exchange chromatography on carboxymethylcellulose, column chromatography on silica gel and by a dispensing method. against a current. For example, the active eluate passing through the product called Sephadex
LH-20 with water is concentrated, adjusted to pH 2 with hydrochloric acid and added with acetone. The resulting precipitate is collected by centrifugation and dried in vacuo to give TM-743 hydrochloride as a white powder.
The powder obtained, TM-743 hydrochloride, exhibits the following physicochemical properties:
1. Elemental analysis values
C H N Cl 49.31% 8.19% 14.57% 12.10%
2. Melting point 2002200C (brownish color)
3. Optical optical rotation [a] j'z3 = -52 "(C = 1%, water)
4. Ultraviolet absorption spectrum (fig. 1)
The methanolic solution of the antibiotic has the following absorption maxima (E'lcm): 251 m- 1.69, 257 mll- 1.85, 263 m- 1.46 and 266 mF (0.94) (shoulder )
5.
Infrared absorption spectrum (fig. 2)
The infrared absorption spectrum determined with a KBr tablet has characteristic bands at 3400, 3220, 3030, 2960, 1640-1650, 1520-1540, 1465, 1440, 1385, 1370, 1330, 1280, 1240, 1170, 1080, 1030, 920, 865, 745 and 700 cm-l.
6. Nuclear magnetic resonance spectrum (fig. 3)
The nuclear magnetic resonance spectrum, at 60 MHz, of TM-743 hydrochloride in a solution of dimethylsulfoxide-ds shows the following characteristic signals at o4.0-4.9 (8H, - NCHCO), 728 (5H, C6Hs ) and 7.5-9.2 (-NH3 + and -CONH-).
7. Solubility
Soluble in water, in methanol, in ethanol, in n-butanol containing water and in dimethyl sulfoxide but insoluble in acetate, in ethyl acetate, in chloroform, in l ethyl ether, in benzene and in petroleum ether.
8. Color reaction
Positive reactions with ninhydrin and biuret
9. Composition
Comparison by paper chromatography and quantitative amino acid analysis of TM-743 hydrochloride hydrolyzate with 6N hydrochloric acid, at 105 C, for 6 hours with some genuine samples indicates the existence of acid 2, 4-diamino-butyric acid, leucine and phenylalanine in the molecular ratio 5: 2: 1.
Hydrolysis of TM-743 hydrochloride with 6N hydrochloric acid at 90OC for 30 minutes provides, in addition to a mixture of amino acids, an immiscible oily fraction, which can be separated from the hydrolyzed solution by extraction with ether. The ethereal solution is treated with an excess of diazomethane at room temperature. The resulting mixture is examined by gas chromathography on a stainless steel column (1000 mm x 3 mm) filled with 15% of the product known as PEGS (treated with the product known as Chromosorb W-AW passing through a sieve whose opening of mesh is 0.177 to 0.149 mm or 80 to 100 mesh), He gas being used as carrier gas at 1 kg / cm2. Two substantial peaks, with a retention time of 3.6 and 5.2 minutes, respectively, are detected.
Mass spectrometry reveals maximum mass peaks (M + -H20) for m / e = 156 for the first peak of gas chromatography and m / e = 170 for the last peak. The fragmentary ion peaks of the two components m / e = 82 and 96 are considered to be M + - (H20 +
CH2 = C (OH) OCH3). Therefore, it can optionally be said that both components are methyl esters of ss-hydroxy fatty acids. Subsequently, analysis coupled by gas chromatography and mass spectrometry of methyl trimethylsilyl esters reveal the maximum mass peaks m / e = 231 and 254.
In addition, a common fragmentary ion peak for both gas chromatography components is detected for m / e = 175 and is believed to be the carboxyl terminated fragment derived from the cleavage between ss carbon and carbon. y of these components. In addition, two fragmentary ion peaks are also detected for m / e = 173 and 187, respectively which are estimated to be the γ-terminal fragments derived from the cleavage between the a carbon and the ss carbon.
From these facts, it can be concluded that the fatty acids contained in TM-743 are CsH11CH (OH) CH2COOH and C6Hl3CH (OH) CH2COOH. The ratio of the contents of these fatty acids differs for each sample lot of TM-743, while the total ras acid content keeps a good constant value relative to the amino acid content. This may suggest that the TM-743 antibiotic consists of two components, which are identical in amino acid constituents but which differ slightly in fatty acid constituents.
The antibiotic consisting of TM-743 hydrochloride exhibits good antibacterial activity against pathogenic microorganisms, especially against bacteria
Gram-negative. Thus, ordinarily TM743 hydrochloride shows sufficient activity against various strains of
Pseudomonas, comprising strains isolated clinically, at a concentration of 1.6 to 6.25 11 g / ml. In addition, its high activity against polymyxin B resistant Escherichia coli is the most remarkable point. Many Gram-positive bacteria, many yeasts and many fungi are also highly sensitive to this antibiotic.
The antibacterial activity was determined by the following method: various microorganisms were inoculated into agar-agar-infusion plates of heart (or, partially, Sabouraud's medium) containing the antibiotic formed by the hydrochloride of TM-743 following gradual concentrations and the minimum concentration at which the growth of microbes was totally inhibited was determined. The antibacterial spectrum of the antibiotic TM-743 thus obtained is presented in the following table.
The acute toxicity (LD50) of TM-743 hydrochloride to mice, by intravenous injection, was 16 mg / kg.
Board
Antibacterial spectrum of TM-743
Microorganisms tested Concentration
minimum inhibi-
tion (! lg / ml)
Escherichia coli 055 6.25
E. Coli B 1.6
E. Coli SC 8600 (polymyxin B resistant) 3.2
Klebsiella pneumoniae 6.25
Proteus vulgaris HX-19> 100
Pseudomonas aeruginosa 171-3 1.6
Ps. Aeruginosa GNB 1-1 1.6
Ps. Aeruginosa GNB 1-2 3.2
Ps. Aeruginosa GNB 1-3 6.25
Ps. Aeruginosa GNB 1-4 6.25
Ps. Aeruginosa KB-1 3.2
Ps. Aeruginosa P-32 6.25
Ps. Fluorescens ATCC 27 6.25
Ps. Ovalis IAM 1236 12.5
Salmonella enteritidis 6.25
Shigella sonnei 6.25
Staphylococcus aureus 209 P 25
St. aureus Smith 12.5
Bacillus subtilis PCI 219 12.5 Micrococcus lysodeikticus 0.8
Candida albicans 25
The following examples show practical methods for making the present antibiotic, without any limitation.
Example 1
Bacillus circulans TM-743, stored on an agar-agar-heart infusion slant, was inoculated into an autoclaved heart infusion broth, in an amount of
100 ml in a 500 ml Sakaguchi flask stoppered with cotton. After 24 hours of culture on a reciprocating shaker at 30 C, 5 ml of the culture was removed and placed in a 2 liter Sakaguchi flask, capped with cotton, containing 500 ml of the treated broth. autoclaved at ph 7, which consisted of 20 g of glycerol, 5 g of oatmeal, 7.5 g of peptone, 1.25 g of yeast extract, 2 g of
NH4Cl, 2.5g of CaCO and distilled water to fill up to 500ml.
Culture was carried out on a reciprocating shaker for 120 hours at 300C.
Example 2
10 liters of the cultured broth obtained in Example 1 were centrifuged to remove the bacterial cells. The supernatant part at pH 7.0-7.4 was introduced into a column of 200 ml of product known as Amberlite IRC-50, of H + type, washed with distilled water and eluted with 0.2N HCl. The active fractions were neutralized through the product called Amberlite IR-45 (type
OH-), discolored with 1% (w / v) of the so-called product
Norit A, and concentrated to 60 ml under vacuum, below 500C. By adding 900 ml of acetone to the concentrate, the precipitation of the active substance was obtained. The precipitate was collected by centrifugation and dried in vacuo. About 4 g of crude powder of TM-743 was obtained.
Example 3
1 gram of the crude powder of the product TM-743 obtained in Example 2 was dissolved in 10 ml of distilled water and subjected to gel filtration, through a column of 2 liters of the product called Sephadex LH-20 with distilled water. The active substance was eluted in several fractions at the point corresponding to about 1.3 liters. The activity of the fractions was checked by reaction with ninhydrin and by a microbiological test. To confirm the purity of the active fractions, thin layer chromatography was performed on so-called gel.
Kiesel (Merck) with the top layer of the mixture of nbutanol, acetic acid and water (4: 1: 3).
The active fractions free of impurities were concentrated below 50 ° C. under vacuum to 10 ml, adjusted to pH 2 with hydrochloric acid and added with 150 ml of acetone. The resulting precipitate was collected by centrifugation, washed with acetone and ethyl ether, successively, and dried under vacuum at 500C. About 750 mg of white amorphous powder of TM-743 hydrochloride was obtained.