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La présente invention concerne un nouvel antibiotique qui, dans ce qui va suivre, sera dénommé "danubomycine", ses composantes Bl, B2, B3 et B4 et les sels et mélanges de celles-ci, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés; l'invention concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
L'antibiotique dénommé "danubomycine" se forme lors de la culture d' une souche de streptomycètes du genre de Streptomyces griseus, qui a été isolé suivant des procédés connus à partir d'une prise d'essai faite dans le sol à côté de Donaueschingen (République Fédérale d'Allemagne). Elle est conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et dans ceux de l'Ecole Polytechnique Fédé- rale (Zurich, Suisse) Institut de Botanique Spéciale sous la dénomination "Danu- bomycine",
La souche de streptomycètes A 9990 forme un mycélium aérien jaunâtre à gris-verdâtre. Elle comporte des chaînes de conidies qui constituent une carac- téristique typique de la famille des Streptomyces et qui, dans cette souche, ne montrent pas la formation de spirales, mais sont irrégulièrement ramifiées. Les diverses spores sont lisses.
En outre, les milieux nutritifs peptonés de la souche A 9990 ne subissent pas de décoloration mêlanoidique en brun-noir. La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se dévelop- pe aussi bien à 18 qu'à 36 ; toutefois la croissance optimum sé situe entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance de la souche A 9990 sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7, ainsi que 10, ont été préparés suivant W. Lindenbein, "Arch Mikrobiol" 17, 361 (1952).
1) Gélose synthétique : Croissance grêle, voilée. Mycélium aérien velouté, blanc crayeux au début, plus tard jaunâtre à gris-verdâtre.
Substratum non décoloré.
2) Milieu synthétique liquide Sédiment, flocons blanc-laiteux à jaune-verdâtre.
Pellicule punctiforme au début, plus tard rugueuse, jaune clair ou en partie brun châtaigne. Mycélium aérien peu abondant, jaune-clair. Substratum non décoloré au début, brun-rougeâtre au bout de 2 semaines.
3) Gélose-glucose Croissance grêle, voilée, jaune d'oeuf. Mycélium aérien peu abondant, velouté, jaune-clair à jaunâtre-gris verdâ- tre. Substratum décoloré en jaune-clair.
4) Gélose-glucose à l'asparagine Croissance grêle, voilée, jaune d'oeuf à jaune foncé. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris verdâtre.
5) Gélose au malate de calcium : Croissance grêle, voilée, brun-clair à jaune brunâtre, plus tard jaune-foncé, au bout de 14 jours brunâtre, rouge cuivre. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris-verdâtre.
6) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C Croissance bonne. Pellicule jaune-clair à brun-rougeâtre. Mycélium aérien velouté, jaune-blanc à gris-verdâtre. Substratum jaune d'or à brun-rougeâtre.
Liquéfaction au bout de 27 jours : 10 à 12 mm.
7) Gélose à l'amidon Croissance grêle, voilée, jaune-blanc. Mycélium aérien velouté, jaune-clair, gris-verdâtre à l'état mûr. Hydro- lyse au bout de 10 jours : 1,4 cm.
8) Pomme de terre : Croissance bonne, brunâtre à brun-rouille. Mycélium aérien velouté, jaunâtre à gris-verdâtre, en partie mi- roitant en rouge-jaune-clair par suite de la couleur du substratum. Substratum non décoloré,mais en partie carmin.
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9) Carotte : Croissance seulement très peu abondante, avec un mycélium aérien jaune-blanc.
10) Lait de tournesol : Croissance sous la forme d'une pellicule comportant un mycélium aérien velouté, jaune-clair. Substratum rouge.
Peptonisation et lente coagulation.
La souche A 9990 croît de la façon suivante, d'après la méthode de T.G. Pridham et D. Gottlieb, "J. Bacteriology" 56 107 (1948), lorsqu'on utilise diverses sources de carbone :
EMI2.1
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Raffinose <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> L-xylose <SEP> - <SEP> Inuline <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbite <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> D-fructose <SEP> + <SEP> Mésoinosite <SEP> (+)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Saccharose <SEP> + <SEP> Salicine <SEP> +
<tb>
Les signes ont la signification suivante : + : bonne croissance, utilisation certaine de la source de carbone mentionnée, (+): croissance faible, utilisation douteuse de la source de carbone mentionnée, - :
pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée.
Les caractéristiques les plus importantes de la souche A 9990, no- tamment le contour des spores, la couleur du mycélium aérien, la morphologie des chaînes de spores et la chromogénéité, concordent avec elles du Streptomyces griseus (Krainsky) de Waksman. Par contre, la souche A 9990 forme, à l'encontre du Streptomyces griseus, un pigment brun-rouge qui se diffuse mal. Malgré cette différence,on classera cette souche A 9990 provisoirement dans la famille du Streptomyces griseus.
On sait que quelques représentants de la famille du Streptomyces griseus produisent des antibiotiques,ainsi la streptomycine (Waksman S.A., "Streptomycin", éditions Williams and Wilkins, 1949), la rhodomycétine (Shockman G. et Waksman S.A., "Antibiotics and Chemotherapy", 1, 68-75 [1951], l'actidione (Leach B.B., Ford H.J. and Whiffer A.J., "Journ. Am. Chem. Society" 69, 474 [1947]) la candicidine (LechevaliBr H., Acker R.F., Corke C.T., Haenseler C.M. et Waksman S.A., "mycologia" 45, 155-171 [1953]), la griséine (Reynolds D. M. et Waksman S.A., "J. Bacteriol." 55, 739-752 [1948] et la streptocine (Waksman S.A., Harris D.A., Kupferberg A.B., Singher H.0. et Styles H., "Proc. Soc. Exp.
Biol. mED 70, 308-312 [1949] On montrera plus loin ci-dessous que le nouvel anti- biotique dénommé "danubomycine" se distingue de façon caractéristique de ces antibiotiques déjà connus.
La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la pré- paration de l'antibiotique dénommé "danubomycine", à l'utilisation de la souche A 9990 ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir l'antibiotique dénommé "danubomycine", on cultive de manière aérobie une souche présentant les propriétés du Streptomyces griseus A 9990, dans une solution nutritive aqueuse renfermant une source de carbone et d'azote, ainsi que des sels inorganiques, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle et/ou fongicide notable, puis on isole ensuite l'anti- biotique dénommé "danubomycine" du filtrat de culture et/ou du mycélium.
@
La solution nutritive renferme, comme sels inorganiques, par exemple des chlorures, des nitrates, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc, du manganèse.
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Les sources de carbone sont surtout des hydrates de carbone comme -.Le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon, et des alcools comme la glycérine et la mannite. Comme composés azotés et comme substances favorisant la croissance, on citera par exemple: des acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines, ainsi que leurs hydrolysats comme les peptones ou les tryptones, des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales, comme le maïs et le froment, des résidus de distillation provenant de la prépara- tion d'alcools, des levures, des fèves, notamment de sojà, des graines, par exem- ple de coton.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température, s'avère appropriée une température compri- se entre 20 et 36 . En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet an- tibiotique notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Pour isoler l'antibiotique dénommé "danubomycine", on peut, par exemple, se servir des procédés suivants ; on sépare le mycélium du filtrat de culture a un pH inchangé, après quoi la majeure partie de l'antibiotique se trouve dans le filtrat de culture. Il reste toutefois malgré tout des quantités notables d'antibiotique qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien laver ce dernier. A cet effet, sont appropriés notamment des solvants organiques au moins partiellement solubles dans l'eau, comme des alcools, par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones, par exemple l'acétone et la méthyléthylcétone, ou toutefois des acides organiques ou des acides inorganiques dilués comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique.
Ces extraits de mycélium sont ajoutés au filtrat de culture, soit directement, soit après concentration préalable sous vide. On extrait ensuite le mélange, avan- tageusement à un pH supérieur à 7, de préférence à un pH compris entre 8 et 10, avec un solvant organique non miscible à l'eau, comme les esters d'acides gras inférieurs, par exemple l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle, des hydrocarbu- res, par exemple le benzène, des hydrocarbures chlorés, par exemple le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène ou le chloroforme, des cétones, par exemple la méthylpropylcétone, la méthylamylcétone ou la di-isobutylcétone, des alcools, comme les alcools butyliques ou les alcools amyliques, des éthers, par exemple l'éther éthylique, l'éther di-isopropylique, des éthers dibutyliques ou des éthers glycoliques, et analogues.
Si l'on ajuste à un pH de 4 le bouillon de culture qui se forme et sépare ensuite le mycélium, la totalité de la substance active du point de vue antibiotique passe alors dans le filtrat de culture que l'on extrait alors de la manière indiquée ci-dessus, à un pH compris entre 8 et 10. L'extrait de mycélium est pratiquement inactif.
A la place de l'extraction des cultures à l'aide d'un solvant, ou en combinaison avec une telle extraction? comme opération de purification complémentaire, on peut aussi obtenir l'antibio- tique par adsorption, par exemple à du charbon actif, à des terres activées, comme la terre à foulon ou la floridine, ou à des échangeurs d'ions appropriés comme celui dénommé IRC-50, et par extraction subséquente de l'adsorbat, par exemple à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans 1 eau, comme l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone, le cas échéant en ajou- tant des acides organiques ou inorganiques de bas poids moléculaire.
On peut aussi extraire les cultures directement de la manière indi- quée, sans séparation préalable du mycélium.
On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques renfermant l'antibiotique, à l'aide d'une solu- tion acide aqueuse d'un pH inférieur à 5, la majeure partie de l'activité anti-. biotique passant alors dans la phase aqueuse. Une quantité moindre d'acitivité reste dans la phase organique. Les solutions aqueuses acides réunies sont alors extraites à nouveau de la manière décrite, à un pH supérieur à 7, avec un solvant
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organique non miscible à l'eau. Cette façon d'opérer peut être répétée à plusieurs reprises. Comme solutions acides aqueuses, sont appropriés des acides dilués, comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique, ou des solutions-tampons, comme les tampons à base de citrates ou de phosphates.
Les bases brutes ainsi obtenues sont à nouveau avantageusement repri- ses dans un solvant organique, par exemple dans le méthanol, l'éthanol, l'acéto- ne ou le chloroforme, et elles sont séparées des substances insolubles qui sont inactives du point de vue antibiotique. Après élimination du solvant, on obtient à l'état brut l'antibiotique dénommé "danubomycine" sous la forme d'une poudre amorphe, colorée en brun-rouge. Cette poudre est bien soluble dans la plupart des solvants organiques comme les alcools, les cétones, les esters, les hydro- carbures chlorés, les hydrocarbures aromatiques, mais elle est par contre pra- tiquement insoluble dans l'éther de pétrole et dans l'eau. Lors du traitement avec des acides, il se forme des sels jaunes, bien solubles dans l'eau. Dans les milieux alcalins, on observe un virage vers une teinte allant du rouge- orange au violet.
Dans le spectre ultra-violet, l'antibiotique présente une bande d'absorption à 243 m avec un épaulement à 260m
Le comportement de la substance lors d'une chromatographie sur pa- pier avec différents systèmes solvants ressort du tableau ci-après, les valeurs de Rf ayant été déterminées à l'aide de l'activité antibactérielle (Bacterium megatherium et Micrococcus pyogenes var. aureus):
EMI4.1
<tb> Systèmes <SEP> solvants <SEP> @ <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> 0,65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> pipéridine <SEP> 0,90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Méthylisobutylcétone <SEP> saturée <SEP> d'eau <SEP> 0,00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 80% <SEP> d'éthanol <SEP> avec <SEP> 1,5% <SEP> de <SEP> chlorure
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> sodium, <SEP> papier <SEP> imprégné <SEP> avec <SEP> une <SEP> so-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lution <SEP> 0,95-molaire <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> de <SEP> sodium
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> et <SEP> avec <SEP> une <SEP> solution <SEP> 0,
05-molaire <SEP> de <SEP> bi-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mélange <SEP> de <SEP> butanol, <SEP> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'eau
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (4:1:2) <SEP> 0,67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> + <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> 0,80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75% <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 25% <SEP> d'un <SEP> mélange <SEP> de <SEP> 3 <SEP> parties
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'une <SEP> partie <SEP> d'acétone, <SEP> amené
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 10,
5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'ammoniaque, <SEP> puis
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> tamponné <SEP> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7,5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'acide
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> phosphorique <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,70
<tb>
L'antibiotique brut dénommé "danubomycine" peut être séparé en plusieurs composantes à l'aide de diverses méthodes, par exemple par chromato- graphie sur de la cellulose, sur de l'oxyde d'aluminium et analogues, ou par répartition entre de l'eau et un solvant organique non miscible ou seulement partiellement miscible à l'eau, le cas échéant avec addition d'acides solubles dans l'eau, d'alcools, de cétones et analogues.
Les systèmes solvants suivants, qui peuvent être utilisés seuls ou en combinaison, se sont avérés particulière- ment appropriés pour la répartition à contre-courant :
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a) 5 parties en volume d'éther de pétrole (domaine d'ébullition 40-70 ), 5 par- ties en volume de benzène, 8 parties en volume de méthanol, 2 parties en volume d'eau; b) 7,5 parties en volume d'éther de pétrole, 2,5 parties en volume de benzène, 7,5 parties en volume d'éthanol absolu et 2,5 parties en volume d'eau.
La répartition a lieu avantageusement suivant le procédé à contre- courant, dans des appareillages appropriés. Les diverses composantes se diffé- rencient par leurs propriétés physico-chimiques et biologiques. Elles peuvent être obtenues sous forme pure par cristallisation ou précipitation dans des solvants organiques, par exemple dans l'acétone, le méthanol, l'acétate d'éthyle, dans des mélanges d'acétone et de méthanol, dans des mélanges d'acétone et d' éther, dans des mélanges d'acétone et d'éther de pétrole, dans des mélanges d' acétate d'éthyle et d'éther, dans des mélanges d'acétate d'éthyle et d'éther de pétrole, ou dans des solutions organiques aqueuses comme les alcools dilués, l'acétone diluée, etc...
L'antibiotique brut dénommé "danubomycine" peut dans le système a), en 10 stades, être décomposé en une composante active et en une composante pra- tiquement inactive. La composante active se trouve dans les stades 4 à 10 et elle peut, dans le système b), en 375 stades, être séparée en quatre composantes au moins, qui sont désignées par "danubomycine" Bl, B2, B3 et B4. Les maxima des quatre composantes se trouvent aux stades 40,64, 124 et 164. La composante Bl cristallise dans l'acétate d'éthyle, les composantes B2 et B3 dans l'acétone.
L'antibiotique dénommé "danubomycine" ne présente aucune analogie avec les autres antibiotiques produits par le,Streptomyces griseus. A l'encontre de l'antibiotique dénommé "danubomycine", la streptomycine et la griséine sont bien solubles dans l'eau, tandis que la rhodomycétine est insoluble dans les acides dilués. La candicidine est insoluble dans la plupart des solvants organi- ques et présente une absorption différente dans le spectre ultra-violet.
D'autres différences distinguent l'antibiotique dénommé "danubomycine" de la streptomycine, de l'actidione et de la streptocine en ce qui a trait à la cou- leur propre, de l'actidione neutre et de la rhodomycétine acide etde lat streptocne en ce qui a trait au caractère chimique. La griséine renferme de plus du fer et du soufre, éléments qu'on ne peut pas déceler dans l'antibiotique dénommé "danubo- mycine".
Les sels de l'antibiotique dénommé "danubomycine" et de ses compo- santes Bl, B2, B3 et B4 dérivent des acides inorganiques et organiques connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuriques, des acides acétique, propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, citrique, mandélique, pantothénique, ascorbique, ou des acides aminés comme l'acide gluta- rique, la cystéine et analogues. Ils constituent des sels neutres ou acides.
Leur préparation a lieu en faisant agir les acides correspondants sur la base libre, ou par double décomposition de sels, par exemple de sulfate de danubomyci- ne avec du pantothénate de calcium.
L'antibiotique dénommé "danubomycine" présente une activité anti- biotique vis-à-vis de différents organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode- test in vitro des séries de dilutions (par puissances de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37 pendant 24 heures, on a les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes
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EMI6.1
<tb> Organismes-tests <SEP> Concentration <SEP> inhibante
<tb>
<tb>
<tb> ug/cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus
<tb>
<tb>
<tb> péniaillino-résistant <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,
1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> type <SEP> A <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> < <SEP> 0,
1 <SEP>
<tb>
+ Cultivé dans le milieu synthétique de Kirchner avec 5% d'albumine bovine ; détermination de la croissance au bout de 2 semaines.
++ dans du bouillon avec 10% de sérum de cheval.
Le développement du virus de l'influenza sur des membranes isolées du chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours d'incubation est encore inhibé par l'antibiotique dénommé "danubomycine" à une concentration in- férieure à 10 ug/cm3
L'antibiotique dénommé "danubomycine" est également actif in vivo.
Si l'on infecte intravaginalement avec du Trichomonas foetus des Hamsters fe- melles adultes et traite l'infection trichomonadénique chronique qui en résulte, localement pendant 3 semaines avec une suspension aqueuse à 0,3% de l'antibioti- que dénommé "danubomyoine", l'infection trichomonadénique disparait alors chez quatre animaux sur quatre.
En dehors du procédé de préparation de l'antibiotique dénommé "danu- bomycine", de ses composantes et de ses sels neutres et acides, l'invention con- cerne également les composés indiqués proprement dits, notamment les sulfates, les chlorhydrates, les acétates et les pantothénates, ainsi que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse.
L'antibiotique dénommé "danubomycine", ses composantes Bl, B2, B3 et B4, leurs sels et dérivés, les produits de scission indiqués ci-dessus ou les
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mélanges correspondants peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques. Ces préparations renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale.
Pour la formation de cette matière de support, on envisage les substances ne réagis- sant pas sur les nouveaux composés comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus. Les préparations pharmaceutiques peuvent se pré- senter, par exemple, à l'état de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires, ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renfer- ment des substances auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabili- sation, des agents mouillants ou émulsifiants. Elles peuvent aussi renfermer en- core d'autres substances thérapeutiquement précieuses.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limita- tifs qui suivent, dans lesquels les températures sont indiquées en degrés centi- grades.
EXEMPLE 1
On prépare une solution nutritive de la composition: 20 g de glycéri- ne, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, un gramme de nitrate de sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,3. On place cette solution ou un multiple de celle-ci dans des fioles coniques de 500 cm3 (renfermant chacune 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fermenteurs de 500 litres (renfermant chacun 300 litres de solution nutritive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère.
On ensemence alors avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporu- lente de la souche de streptomycètes A 9990 et incube tout en secouant bien ou en agitant, et en faisant passer de,l'air dans les fermenteurs (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute) à 27 . Au bout de 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures à travers un entonnoir filtrant ou à travers un filtre-presse ou à travers un filtre rotatif suivant le volume, en ajoutant un auxiliaire de filtration, et débarrasse ainsi du mycé- lium et des autres composantes solides la solution aqueuse active du point de vue antibiotique.
EXEMPLE 2
Si l'on utilise, à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c, d, e ou f décrites ci-après, on obtient alors, après stérilisation analogue, après ensemencement avec une souche de streptomy- cètes A 9990, après incubation à 27 et filtration, des solutions aqueuses qui sont actives du point de vue antibiotique. - a) 10 g de glucose brut, 5 g de peptone, 3 g d'extrait de viande (Oxo Lab Lemco), 5 g de chlorure de,sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet; le pH -avant la stérilisation est de 7,5. b) 20 g de lactose, 20 g de Distillers solubles, un gramme de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium et un litre d'eau du robinet, le pH avant la stérilisation est de 7,5. c) 20 g de mannite, 20 g de farine de soja et un litre d'eau du ro- binet ;
le pH avant la stérilisation est de 7,5 d) 10 g de lactose, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium, un gramme de nitrate de sodium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5.
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e) 20 g de mannite, 20 g de "Distillers solubles", 3 g de chlorure de sodium, un gramme de nitrate de sodium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5. f) 10 g de glucose, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de so= dium, un gramme de nitrate de sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet; le pH avant la stérilisation est de 7,5.
EXEMPLE 3
On agite avec 25 litres d'acétone le résidu de filtration d'une charge de 150 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis filtre à nouveau.
On répète cette opération à deux reprises, après quoi on réunit les solutions acétoniques renfermant l'antibiotique, les concentre sous vide jusqu'à 5 litres et les réunit au filtrat de culture. On extrait alors cette solution dans un extraoteur Westphalia, à un pH de 8,5, avec 70 litres d'acétate d'éthyle, ce qui fait que la totalité de l'activité antibiotique passe dans la phase organique.
L'extrait rouge-orange est lavé à l'eau, évaporé sous vide jusqu'à 5 litres et ensuite extrait à plusieurs reprises avec de l'acide acétique demi-normal. La solution d'acétate d'éthyle présente une'faible activité antibiotique, tandis que la majeure partie de l'activité se trouve dans les solutions acétiques.
On réunit ces solutions, les amène à un pH de 8,5 à l'aide d'une solution binor- male de carbonate de sodium, ce qui fait que la teinte vire du jaune au rouge- orange, puis on extrait au chlorure d'éthylène. L'extrait obtenu au chlorure d'éthylène est à nouveau soumis à une extraction avec de l'acide acétique demi- normal, après quoi, comme décrit, on alcalinise et extrait. Finalement, on sèche la solution de chlorure d'éthylène sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide. On obtient ainsi sous la forme d'une poudre amorphe les bases brutes, de couleur rouge-brun, qui sont actives du point de vue antibiotique. Cette poudre est bien soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle, le chloroforme, le chlorure d'éthylène, le benzèae et les acides aqueux dilués.
Elle est à peine soluble dans l'eau et dans l'éther de pétrole. Son spectre ultra-violet présente un maximum à 243 m avec un épaulement à 260 m
Son comportement dans un chromatogramme sur papier dans différents systèmes solvants est le suivant :
EMI8.1
<tb> Systèmes <SEP> solvants <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> 0,65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> de <SEP> pipéridine <SEP> 0,90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Méthylisobutyloétone <SEP> saturée <SEP> d'eau <SEP> 0,00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 80% <SEP> d'éthanol <SEP> avec <SEP> 1,5% <SEP> de <SEP> chlorure <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> sodium,
<SEP> papier <SEP> imprégné <SEP> avec <SEP> une <SEP> solution
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0,95-molaire <SEP> de <SEP> sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> et <SEP> avec
<tb>
<tb>
<tb> une <SEP> solution <SEP> 0,05-molaire <SEP> de <SEP> bisulfate <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb> sodium <SEP> 0,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mélange <SEP> de <SEP> butanol, <SEP> de <SEP> méthanol <SEP> et <SEP> d'eau
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (4:1:
2) <SEP> 0,67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb> 0,70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Eau <SEP> saturée <SEP> de <SEP> méthylisobutylcétone <SEP> + <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb> d'acide <SEP> p-toluène-sulfonique <SEP> 0,80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75% <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 25% <SEP> d'un <SEP> mélange <SEP> de <SEP> 3 <SEP> parties <SEP> de
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> méthanol <SEP> et <SEP> d'une <SEP> partie <SEP> d'acétone, <SEP> amené <SEP> à <SEP> un
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> de <SEP> 10,5 <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'ammoniaque, <SEP> puis <SEP> tamponné <SEP> 0,05 <SEP> et
<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> un <SEP> pH <SEP> de <SEP> 7,5 <SEP> à <SEP> l'aide <SEP> d'acide <SEP> phosphorique <SEP> 0,70
<tb>
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EXEMPLE 4
On soumet,
à une répartition à contre-courant en 10 stades, 32 g des bases brutes obtenues suivant les exemples 1 et 3, en utilisant le système solvant suivant : 5 parties en volume d'éther de pétrole (bouillant à 40-70 ), 5 parties en volume de benzène, 8 parties en volume de méthanol et 2 parties en volume d'eau. Après avoir évaporé sous vide à 30 le contenu des divers récipients de répartition, on trouve dans les stades 4 à 10 un maximum d'activité et de sub- stance, tandis que la majeure partie des substances accompagnatrices inactives se trouvent dans les stades 0 à 3. Après avoir réuni les stades 4 à 10, on obtient à l'état enrichi 8,5 g de l'antibiotique dénommé "danubomycine" sous la forme d' une poudre rouge-orange.
Absorption en ultra-violet :maximum à 243m avec un épaulement à 260 m
EXEMPLE 5
On soumet à une répartition à contre-courant en 375 stades 8,5 g du produit enrichi obtenu suivant l'exemple 4, en utilisant le système solvant suivant : 7,5 parties en volume d'éther de pétrole, 2,5 parties en volume de benzène, 7,5 parties en volume d'éthanol absolu et 2,5 parties en volume d'eau.
Le contenu des divers récipients de répartition est évaporé sous vide à 30 .
Les maxima d'activité et de substance se trouvent dans les stades 35 à 45 (com- posante Bl), 60 à 70 (B2), 115 à 135 (B3) et 155 à 175 (B4). Les solutions pro- venant de ces récipients sont réunies et évaporées à sec sous vide à 30 .
On obtient ainsi, sous la forme d'une poudre rouge à rouge-orange, les composantes Bl, B2, B3 et B4 de l'antibiotique dénommé "danubomycine", compo- santes qui peuvent être cristallisées par un traitement à l'acétate d'éthyle ou à l'acétone.
EXEMPLE 6
Tout en ajoutant de l'Hyflo comme auxiliaire de filtration, on dé- barrasse du mycélium une solution de culture d'une charge de 950 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis traite ensuite séparément le filtrat et le résidu de filtration. a) Le filtrat de culture est refroidi, ajusté à un pH de 8,5 à 9,0 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium, puis soumis dans un extracteur à une extraction à l'acétate d'éthyle dans le rapport 3 :1, totalité de l'activi- té antibiotique passant dans la phase organique. L'extrait est directement adsor- bé sur une colonne chargée d'un litre d'Amberlite IRC-50 (forme acide, deshydra- tée au méthanol et acclimatée à l'acétate d'éthyle). La fraction qui passe est inactive du point de vue antibiotique.
On peut, par lavage avec du méthanol, extraire d'autres substances accompagnatrices inactives. L'antibiotique dénommé "danubomycine" est alors élué avec une solution méthanolique 0,4-normale d'acide chlorhydrique. La moitié environ des éluats actifs possède un pH compris entre 4 et 6, tandis que l'autre moitié présente un pH de 1,5 environ. On desacidifie cette dernière moitié sur une colonne d'Amberlite IR-45. Après avoir réuni les éluats méthanoliques, on les ajuste alors à un pH de 3,5 à l'aide d'une solution méthanolique normale d'acide chlorhydrique et les concentre dans un évaporateur rotatif, à 30 au maximum, jusqu'à un petit volume (200 à 300 om3), et les délaye dans un volume décuple d'acétate d'éthyle. On essore le précipité, le lave à l'acétate d'éthyle et à l'éther, puis le sèche sous vide à 20-25 .
Rende- ment 5 g du chlorhydrate brun-jaune de l'antibiotique dénommé "danubomycine". b) Le résidu de filtration humide, constitué par le mycélium et l'Hyflo (environ 170 kg) est agité à deux reprises avec 170 litres d'acétone.
L'activité antibiotique est adsorbée sur une colonne d'Amberlite IRC-50 (forme acide, acclimatée sur de l'acétone à 70%) Le chlorhydrate (obtenu comme sous a)) de l'antibiotique dénommé "danubomycine" est souillé d'une quantité assez forte de sels inorganiques. Le rendement est de 29,4 g d'une poudre jaune.
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EXEMPLE 7
A l'aide d'acide chlorhydrique, on ajuste, à un pH de 4, 6700 litres d'une solution de culture d'une charge obtenue suivant l'exemple 1 ou 2. Lorsque le pH ne varie plus au bout d'une demi-heure, on filtre après avoir ajouté 2% d'Eyflo. On soumet le filtrat de culture, à un pH de 8,5 à 9,0, dans un extrac- teur, à une extraction à l'acétate d'éthyle dans le rapport 3:1. Comme décrit sous a) dans l'exemple 6, l'activité antibiotique est adsorbée sur 4 litres d'Amberlite IRC-50, puis éluée. Le rendement est de 85 g de chlorhydrate brun- jaune de l'antibiotique dénommé "danubomycine". A partir du gâteau de filtration, on ne peut plus, par extraction à l'acétone, obtenir de matière active.
REVENDICATIONS.
I. Un procédé de préparation du nouvel antibiotique dénommé "danu- bomycine", caractérisé par le fait qu'on cultive dans des conditions aérobies une souche présentant les propriétés du Streptomyces griseus A 9990 jusqu'à ce que la solution nutritive présente une activité antibiotique notable et qu'on isole ensuite le nouvel antibiotique dénommé "danubomycine".
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points sui- vants :
1) La culture a lieu de manière immergée.
2) La solution nutritive renferme des substances favorisant la croissance.
3) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température comprise entre 20 et 40 .
4) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est extrait du filtrat de culture, à un pH supérieur à 7, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau.
5) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est extrait du mycélium séparé à l'aide d'un solvant organique au moins en partie miscible à l'eau.
6) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est extrait du mycélium à l'aide d'un acide organique ou inorganique.
7) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est purifié par adsorption, de préférence à du charbon actif, à de l'oxyde d'aluminium ou à des résines échangeuses d'ions, et par extraction de l'adsorbat avec un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, le cas échéant avec addition d'acides.
8) L'antibiotique dénommé "danubomycine" est purifié par une répar- tition entre une solution aqueuse et un solvant organique non-miscible à l'eau, le cas échéant avec addition d'acides dilués, et il est séparé en ses composantes Bl, B2, B3 et B4.
9) La répartition a lieu suivant le procédé à contre-courant.
10) Les composantes Bl, B2, B3 et B4 sont obtenues sous forme cris- talline dans un solvant organique.
Il) L'antibiotique dénommé "danubomycine" et ses composantes Bl, B2, B3 et B4 sont préparés sous la forme de leurs sels cristallins avec un acide inor- ganique ou organique en faisant agir cet acide sur les bases libres des anti- biotiques ou par double décomposition d'un sel des antibiotiques avec un sel de l'acide correspondant.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
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The present invention relates to a new antibiotic which, in what follows, will be referred to as "danubomycin", its components B1, B2, B3 and B4 and the salts and mixtures thereof, as well as the pharmaceutical preparations containing these compounds; the invention also relates to a process for the preparation of these substances and mixtures of substances.
The antibiotic called "danubomycin" is formed during the cultivation of a strain of streptomycetes of the genus Streptomyces griseus, which has been isolated according to known methods from a test sample made in the soil near Donaueschingen. (Federal Republic of Germany). It is kept in the Laboratories of the Applicant and in those of the Federal Polytechnic School (Zurich, Switzerland) Special Botanical Institute under the name "Danubomycine",
Streptomycete strain A 9990 forms a yellowish to greenish-gray aerial mycelium. It comprises chains of conidia which constitute a typical characteristic of the Streptomyces family and which, in this strain, do not show the formation of spirals, but are irregularly branched. The various spores are smooth.
In addition, peptone nutrient media of strain A 9990 do not undergo melanoidal brown-black discoloration. Growth is relatively little temperature dependent, and the fungus thrives at 18 as well as 36; however the optimum growth is between 25 and 32.
To give other characteristics, the growth of strain A 9990 on different nutrient media will be described in what follows. Nutrient media 1 to 7, as well as 10, were prepared according to W. Lindenbein, "Arch Mikrobiol" 17, 361 (1952).
1) Synthetic agar: Small, cloudy growth. Aerial mycelium velvety, chalky white at first, later yellowish to greenish-gray.
Substratum not discolored.
2) Liquid synthetic medium Sediment, milky-white to greenish-yellow flakes.
Dandruff punctiform at first, later rough, light yellow or partly chestnut brown. Light yellow aerial mycelium sparse. Substratum not discolored at first, reddish-brown after 2 weeks.
3) Agar-glucose Growth slender, cloudy, egg yolk. Aerial mycelium sparse, velvety, light yellow to yellowish-greenish gray. Substratum discolored in light yellow.
4) Asparagine Glucose Agar Growth slender, hazy, egg yolk to dark yellow. Velvety aerial mycelium, yellowish to greenish gray.
5) Calcium malate agar: Growth slender, hazy, light brown to brownish yellow, later dark yellow, after 14 days brownish, copper red. Velvety aerial mycelium, yellowish to greenish-gray.
6) Agar medium (gelatin) at 18 C Good growth. Light yellow to reddish-brown skin. Velvety aerial mycelium, yellow-white to greenish-gray. Substratum golden yellow to reddish brown.
Liquefaction after 27 days: 10 to 12 mm.
7) Starch agar Growth slender, hazy, yellow-white. Velvety aerial mycelium, light yellow, greenish-gray when ripe. Hydrolysis after 10 days: 1.4 cm.
8) Potato: Good growth, brownish to rusty brown. Aerial mycelium velvety, yellowish to greenish-gray, partly shimmering to light yellow-red due to the color of the substratum. Substratum not discolored, but partly carmine.
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9) Carrot: Growth only very scarce, with a yellow-white aerial mycelium.
10) Sunflower milk: Growth in the form of a skin with a velvety, light yellow aerial mycelium. Red substrate.
Peptonization and slow coagulation.
Strain A 9990 grows as follows, according to the method of T.G. Pridham and D. Gottlieb, "J. Bacteriology" 56,107 (1948), when various carbon sources are used:
EMI2.1
<tb> Glucose <SEP> + <SEP> Raffinose <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> L-xylose <SEP> - <SEP> Inulin <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite <SEP> +
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbit <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> D-fructose <SEP> + <SEP> Mesoinosite <SEP> (+)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Sucrose <SEP> + <SEP> Salicin <SEP> +
<tb>
The signs have the following meaning: +: good growth, certain use of the mentioned carbon source, (+): weak growth, doubtful use of the mentioned carbon source, -:
no growth, no use of the carbon source mentioned.
The most important characteristics of strain A 9990, namely spore outline, color of aerial mycelium, morphology of spore chains and chromogeneity, agree with them of Waksman's Streptomyces griseus (Krainsky). On the other hand, the A 9990 strain forms, against Streptomyces griseus, a reddish-brown pigment which diffuses poorly. Despite this difference, this strain A 9990 will be classified provisionally in the Streptomyces griseus family.
We know that some representatives of the Streptomyces griseus family produce antibiotics, such as streptomycin (Waksman SA, "Streptomycin", Williams and Wilkins editions, 1949), rhodomycetin (Shockman G. and Waksman SA, "Antibiotics and Chemotherapy", 1, 68-75 [1951], actidione (Leach BB, Ford HJ and Whiffer AJ, "Journ. Am. Chem. Society" 69, 474 [1947]) candicidin (LechevaliBr H., Acker RF, Corke CT , Haenseler CM and Waksman SA, "mycologia" 45, 155-171 [1953]), grisein (Reynolds DM and Waksman SA, "J. Bacteriol." 55, 739-752 [1948] and streptocin (Waksman SA, Harris DA, Kupferberg AB, Singher H.0. And Styles H., "Proc. Soc. Exp.
Biol. mED 70, 308-312 [1949] It will be shown later below that the new antibiotic called "danubomycin" is characteristically distinguished from these already known antibiotics.
The present invention is not limited, as regards the preparation of the antibiotic called "danubomycin", to the use of strain A 9990 or other strains corresponding to the description, but it also relates to the use of varieties of these organisms, as obtained, for example, by selection or mutation, in particular under the influence of ultra-violet radiation or X-rays, or under the action of nitrogen mustard.
To obtain the antibiotic called "danubomycin", a strain exhibiting the properties of Streptomyces griseus A 9990 is aerobically cultivated in an aqueous nutrient solution containing a source of carbon and nitrogen, as well as inorganic salts, until this solution exhibits a significant antibacterial and / or fungicidal action, then the antibiotic called “danubomycin” is then isolated from the culture filtrate and / or from the mycelium.
@
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example chlorides, nitrates, carbonates, sulphates of alkali metals, alkaline earth metals, magnesium, iron, zinc, manganese.
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The sources of carbon are mostly carbohydrates like - glucose, sucrose, lactose, starch, and alcohols like glycerin and mannite. As nitrogenous compounds and as growth-promoting substances, there may be mentioned, for example: amino acids and their mixtures, peptides and proteins, as well as their hydrolysates such as peptones or tryptones, meat extracts, soluble fractions in water from grains of cereals, such as maize and wheat, distillation residues from the preparation of alcohols, yeasts, beans, especially soybeans, seeds, for example cotton.
The culture takes place aerobically, that is to say, for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner with shaking or agitation with air or oxygen in the shaken flasks or in known fermenters. As a temperature, a temperature between 20 and 36 is suitable. By operating in this way, the nutrient solution exhibits a notable antibiotic effect, generally after one and a half to five days.
To isolate the antibiotic termed "danubomycin", for example, the following methods can be used; the mycelium is separated from the culture filtrate at unchanged pH, after which most of the antibiotic is in the culture filtrate. However, despite everything, significant amounts of antibiotic remain which are adsorbed to the mycelium. It is therefore advantageous to wash the latter well. Organic solvents at least partially soluble in water, such as alcohols, for example methanol, ethanol and butanols, or ketones, for example acetone and methyl ethyl ketone, or however organic acids or dilute inorganic acids such as acetic, hydrochloric or sulfuric acids.
These mycelium extracts are added to the culture filtrate, either directly or after prior concentration under vacuum. The mixture is then extracted, advantageously at a pH greater than 7, preferably at a pH between 8 and 10, with an organic solvent immiscible with water, such as esters of lower fatty acids, for example. ethyl acetate or amyl acetate, hydrocarbons, for example benzene, chlorinated hydrocarbons, for example ethylene chloride, methylene chloride or chloroform, ketones, for example methyl propyl ketone , methylamyl ketone or di-isobutyl ketone, alcohols, such as butyl alcohols or amyl alcohols, ethers, for example ethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ethers or glycol ethers, and the like.
If the culture broth which forms and subsequently separates the mycelium is adjusted to a pH of 4, all of the antibiotically active substance then passes into the culture filtrate which is then extracted as follows. indicated above, at a pH between 8 and 10. The mycelium extract is practically inactive.
Instead of extracting cultures using a solvent, or in combination with such extraction? as an additional purification operation, the antibiotic can also be obtained by adsorption, for example on activated carbon, on activated earths, such as fuller's earth or floridin, or on suitable ion exchangers such as that called IRC-50, and by subsequent extraction of the adsorbate, for example using an organic solvent at least partially soluble in water, such as acetone, butanol or methyl ethyl ketone, if necessary by adding low molecular weight organic or inorganic acids.
The cultures can also be extracted directly as indicated, without prior separation of the mycelium.
Further enrichment can also be achieved by re-extracting the organic extracts containing the antibiotic, with an aqueous acidic solution of pH below 5, most of the anti- activity. biotic then passing into the aqueous phase. A lesser amount of activity remains in the organic phase. The combined acidic aqueous solutions are then extracted again in the manner described, at a pH greater than 7, with a solvent.
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organic not miscible with water. This way of operating can be repeated several times. Suitable aqueous acid solutions are dilute acids, such as acetic, hydrochloric or sulfuric acids, or buffer solutions, such as buffers based on citrates or phosphates.
The crude bases thus obtained are again advantageously taken up in an organic solvent, for example in methanol, ethanol, acetone or chloroform, and they are separated from the insoluble substances which are inactive from the point of view. antibiotic. After removal of the solvent, the antibiotic called “danubomycin” is obtained in the raw state in the form of an amorphous powder, colored red-brown. This powder is well soluble in most organic solvents such as alcohols, ketones, esters, chlorinated hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, but it is, on the other hand, practically insoluble in petroleum ether and in petroleum. water. On treatment with acids, yellow salts are formed, which are well soluble in water. In alkaline media, a change to a color ranging from orange-red to purple is observed.
In the ultraviolet spectrum, the antibiotic shows an absorption band at 243 m with a shoulder at 260 m
The behavior of the substance during chromatography on paper with different solvent systems is shown in the table below, the Rf values having been determined using the antibacterial activity (Bacterium megatherium and Micrococcus pyogenes var. Aureus). ):
EMI4.1
<tb> <SEP> solvent systems <SEP> @ <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> 0.65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> p-toluenesulfonic acid <SEP> <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> piperidine <SEP> 0.90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Methyl isobutyl ketone <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> 0.00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 80% <SEP> of ethanol <SEP> with <SEP> 1.5% <SEP> of <SEP> chloride
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> sodium, <SEP> paper <SEP> impregnated <SEP> with <SEP> a <SEP> so-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> 0.95-molar <SEP> lution <SEP> sodium <SEP> sulfate <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> and <SEP> with <SEP> a <SEP> solution <SEP> 0,
05-molar <SEP> of <SEP> bi-
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> sodium <SEP> sulfate <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mixture <SEP> of <SEP> butanol, <SEP> of <SEP> methanol <SEP> and <SEP> of water
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (4: 1: 2) <SEP> 0.67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> saturated <SEP> with <SEP> methyl isobutyl ketone <SEP> 0.05 <SEP> and
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> saturated <SEP> of <SEP> methyl isobutyl ketone <SEP> + <SEP> 1%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
p-toluenesulfonic acid <tb> <SEP> <SEP> 0.80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75% <SEP> of water <SEP> + <SEP> 25% <SEP> of a <SEP> mixture <SEP> of <SEP> 3 <SEP> parts
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> methanol <SEP> and <SEP> of a <SEP> part <SEP> of acetone, <SEP> brought
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> to <SEP> a <SEP> pH <SEP> of <SEP> 10,
5 <SEP> to <SEP> using <SEP> of ammonia, <SEP> then
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> buffered <SEP> to <SEP> a <SEP> pH <SEP> of <SEP> 7.5 <SEP> to <SEP> using acid <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> phosphoric <SEP> 0.05 <SEP> and
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.70
<tb>
The crude antibiotic termed "danubomycin" can be separated into several components using various methods, for example by chromatography on cellulose, on aluminum oxide and the like, or by partitioning between water and an organic solvent which is immiscible or only partially miscible with water, optionally with the addition of water soluble acids, alcohols, ketones and the like.
The following solvent systems, which can be used singly or in combination, have been found to be particularly suitable for countercurrent distribution:
<Desc / Clms Page number 5>
(a) 5 parts by volume of petroleum ether (boiling range 40-70), 5 parts by volume of benzene, 8 parts by volume of methanol, 2 parts by volume of water; (b) 7.5 parts by volume of petroleum ether, 2.5 parts by volume of benzene, 7.5 parts by volume of absolute ethanol and 2.5 parts by volume of water.
The distribution takes place advantageously by the countercurrent process, in suitable equipment. The various components differ in their physico-chemical and biological properties. They can be obtained in pure form by crystallization or precipitation in organic solvents, for example in acetone, methanol, ethyl acetate, in mixtures of acetone and methanol, in mixtures of acetone and ether, in mixtures of acetone and petroleum ether, in mixtures of ethyl acetate and ether, in mixtures of ethyl acetate and petroleum ether, or in mixtures of ethyl acetate and petroleum ether. aqueous organic solutions such as dilute alcohols, dilute acetone, etc.
The crude antibiotic called "danubomycin" can in system a), in 10 stages, be broken down into an active component and a practically inactive component. The active component is found in stages 4 to 10 and it can, in system b), in 375 stages, be separated into at least four components, which are referred to as "danubomycin" B1, B2, B3 and B4. The maxima of the four components are found in stages 40, 64, 124 and 164. Component B1 crystallizes in ethyl acetate, components B2 and B3 in acetone.
The antibiotic called "danubomycin" does not show any analogy with the other antibiotics produced by, Streptomyces griseus. Unlike the antibiotic called "danubomycin", streptomycin and grisein are well soluble in water, while rhodomycetin is insoluble in dilute acids. Candicidin is insoluble in most organic solvents and shows different absorption in the ultraviolet spectrum.
Further differences distinguish the antibiotic termed "danubomycin" from streptomycin, actidione and streptocin with respect to its clean color, neutral actidione and rhodomycetin acid and streptocin in color. which relates to the chemical character. Grisein also contains iron and sulfur, elements that cannot be detected in the antibiotic called "danubomycin".
The salts of the antibiotic called "danubomycin" and of its components B1, B2, B3 and B4 are derived from known inorganic and organic acids, for example hydrochloric acid, sulfuric acids, acetic, propionic, valerianic acids. , palmitic or oleic, succinic, citric, mandelic, pantothenic, ascorbic, or amino acids such as glutaric acid, cysteine and the like. They are neutral or acidic salts.
Their preparation takes place by causing the corresponding acids to act on the free base, or by double decomposition of salts, for example of danubomycin sulfate with calcium pantothenate.
The antibiotic called "danubomycin" exhibits antibiotic activity vis-à-vis various test organisms. If we use as an in vitro test method series of dilutions (in powers of 10) in glucose broth, incubated at 37 for 24 hours, we have the following concentrations which are still inhibiting
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EMI6.1
<tb> Test organisms <SEP> Inhibiting <SEP> concentration
<tb>
<tb>
<tb> ug / cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus
<tb>
<tb>
<tb> peniaillin-resistant <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 0,
1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> type <SEP> A <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 10
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mycobacterium <SEP> tuberculosis <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Trichomonas <SEP> fetus <SEP> <<SEP> 0,
1 <SEP>
<tb>
+ Cultivated in synthetic Kirchner medium with 5% bovine albumin; determination of growth after 2 weeks.
++ in broth with 10% horse serum.
The development of the influenza virus on membranes isolated from chorioallantes from chickens obtained from eggs having 14 days of incubation is further inhibited by the antibiotic called "danubomycin" at a concentration below 10 ug / cm3.
The antibiotic called "danubomycin" is also active in vivo.
If one intravaginally infects fetal Trichomonas from adult female hamsters and treats the resulting chronic trichomonadenic infection, locally for 3 weeks with a 0.3% aqueous suspension of the antibiotic called "danubomyoine" , the trichomonadenic infection then disappears in four out of four animals.
Apart from the process for preparing the antibiotic called "danubomycin", its components and its neutral and acidic salts, the invention also relates to the compounds indicated proper, in particular the sulphates, hydrochlorides and acetates. and pantothenates, as well as the cleavage products as obtained, for example, by hydrolysis.
The antibiotic called "danubomycin", its components B1, B2, B3 and B4, their salts and derivatives, the cleavage products indicated above or the
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corresponding mixtures can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations. These preparations contain the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or local application.
For the formation of this carrier material, substances which do not react with the new compounds, such as, for example, gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, are considered. , gums, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterin or other known excipients. The pharmaceutical preparations can be presented, for example, in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories, or in liquid form in the form of solutions, suspensions or preparations. emulsions. Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They may also contain other therapeutically valuable substances as well.
The invention is described in more detail in the following non-limiting examples, in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
EXAMPLE 1
A nutrient solution is prepared of the composition: 20 g of glycerine, 10 g of soybean flour, 5 g of sodium chloride, one gram of sodium nitrate, 10 g of calcium carbonate and one liter of soya water. tap, then adjust it to a pH of 7.3. This solution or a multiple thereof is placed in 500 cm3 conical flasks (each containing 100 cm3 of nutrient solution) or in 500 liter fermenters (each containing 300 liters of nutrient solution), then sterilized for 20 to 30 minutes under a pressure of one atmosphere.
It is then inoculated with up to 10% of a vegetative, partially sporulating culture of the streptomycete strain A 9990 and incubated while shaking well or stirring, and passing air through the fermenters (approx. one volume of sterile air per volume of nutrient solution per minute) at 27. After 70 to 120 hours of growth, the cultures are filtered through a filter funnel or through a filter press or through a rotary filter depending on the volume, with the addition of a filter aid, and thus freed from the mycelium. and the other solid components the antibiotically active aqueous solution.
EXAMPLE 2
If, instead of the medium indicated in Example 1, the nutrient solutions a, b, c, d, e or f described below are used, then after similar sterilization, after inoculation with a strain, one obtains of streptomycetes A 9990, after incubation at 27 and filtration, aqueous solutions which are antibiotically active. - a) 10 g of raw glucose, 5 g of peptone, 3 g of meat extract (Oxo Lab Lemco), 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate and one liter of tap water; the pH before sterilization is 7.5. b) 20 g of lactose, 20 g of soluble distillers, one gram of sodium nitrate, 5 g of sodium chloride and one liter of tap water, the pH before sterilization is 7.5. c) 20 g of mannite, 20 g of soy flour and one liter of tap water;
the pH before sterilization is 7.5 d) 10 g of lactose, 10 g of soybean flour, 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate, one gram of sodium nitrate and one liter of water tap; the pH before sterilization is 7.5.
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e) 20 g of mannite, 20 g of "Soluble distillers", 3 g of sodium chloride, one gram of sodium nitrate and one liter of tap water; the pH before sterilization is 7.5. f) 10 g of glucose, 10 g of soy flour, 5 g of sodium chloride = dium, one gram of sodium nitrate, 10 g of calcium carbonate and one liter of tap water; the pH before sterilization is 7.5.
EXAMPLE 3
The filtration residue of a 150 liter charge obtained according to Example 1 or 2 is stirred with 25 liters of acetone, then filtered again.
This operation is repeated twice, after which the acetone solutions containing the antibiotic are combined, concentrated in vacuo to 5 liters and combined with the culture filtrate. This solution is then extracted in a Westphalia extruder, at a pH of 8.5, with 70 liters of ethyl acetate, which causes all of the antibiotic activity to pass into the organic phase.
The red-orange extract is washed with water, evaporated in vacuo to 5 liters and then extracted several times with semi-normal acetic acid. Ethyl acetate solution exhibits low antibiotic activity, while most of the activity is found in acetic solutions.
These solutions are combined, brought to a pH of 8.5 using a binary sodium carbonate solution, which causes the color to turn from yellow to red-orange, then extraction is carried out with d chloride. 'ethylene. The obtained ethylene chloride extract is again extracted with semi-normal acetic acid, after which, as described, it is basified and extracted. Finally, the ethylene chloride solution is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. In this way, in the form of an amorphous powder, the crude bases, of red-brown color, which are active from the antibiotic point of view, are obtained. This powder is well soluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride, benzene and dilute aqueous acids.
It is hardly soluble in water and in petroleum ether. Its ultra-violet spectrum has a maximum at 243 m with a shoulder at 260 m
Its behavior in a chromatogram on paper in different solvent systems is as follows:
EMI8.1
<tb> Systems <SEP> solvents <SEP> Rf
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> 0.65
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Butanol <SEP> normal <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb> p-toluenesulfonic acid <SEP> <SEP> + <SEP> 2%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> of <SEP> piperidine <SEP> 0.90
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Methyl isobutyloetone <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> 0.00
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 80% <SEP> of ethanol <SEP> with <SEP> 1.5% <SEP> of <SEP> chloride <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb> sodium,
<SEP> paper <SEP> impregnated <SEP> with <SEP> a <SEP> solution
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 0.95-molar <SEP> of <SEP> sulfate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> and <SEP> with
<tb>
<tb>
<tb> a <SEP> solution <SEP> 0,05-molar <SEP> of <SEP> bisulfate <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb> sodium <SEP> 0.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Mixture <SEP> of <SEP> butanol, <SEP> of <SEP> methanol <SEP> and <SEP> of water
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> (4: 1:
2) <SEP> 0.67
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> saturated <SEP> with <SEP> methyl isobutyl ketone <SEP> 0.05 <SEP> and
<tb>
<tb>
<tb> 0.70
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Water <SEP> saturated <SEP> of <SEP> methyl isobutyl ketone <SEP> + <SEP> 1%
<tb>
<tb>
p-toluenesulfonic acid <tb> <SEP> <SEP> 0.80
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 75% <SEP> of water <SEP> + <SEP> 25% <SEP> of a <SEP> mixture <SEP> of <SEP> 3 <SEP> parts <SEP> of
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> methanol <SEP> and <SEP> of a <SEP> part <SEP> of acetone, <SEP> brought <SEP> to <SEP> a
<tb>
<tb>
<tb> pH <SEP> of <SEP> 10.5 <SEP> with <SEP> of <SEP> ammonia, <SEP> then <SEP> buffered <SEP> 0.05 <SEP> and
<tb>
<tb>
<tb> to <SEP> a <SEP> pH <SEP> of <SEP> 7.5 <SEP> to <SEP> using <SEP> of <SEP> phosphoric acid <SEP> 0.70
<tb>
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EXAMPLE 4
We submit,
in a countercurrent distribution in 10 stages, 32 g of the crude bases obtained according to Examples 1 and 3, using the following solvent system: 5 parts by volume of petroleum ether (boiling at 40-70), 5 parts by volume of benzene, 8 parts by volume of methanol and 2 parts by volume of water. After evaporating in vacuo from the contents of the various distribution vessels, the maximum activity and substance is found in stages 4 to 10, while most of the accompanying inactive substances are found in stages 0 to. 3. After having combined stages 4 to 10, 8.5 g of the antibiotic called “danubomycin” are obtained in the enriched state in the form of an orange-red powder.
Ultraviolet absorption: maximum at 243m with a shoulder at 260m
EXAMPLE 5
8.5 g of the enriched product obtained according to Example 4 are subjected to a countercurrent distribution in 375 stages, using the following solvent system: 7.5 parts by volume of petroleum ether, 2.5 parts by volume. volume of benzene, 7.5 parts by volume of absolute ethanol and 2.5 parts by volume of water.
The contents of the various distribution vessels are evaporated under vacuum at 30.
The activity and substance maxima are found in stages 35 to 45 (component B1), 60 to 70 (B2), 115 to 135 (B3) and 155 to 175 (B4). The solutions from these containers are combined and evaporated to dryness under vacuum at 30.
In this way, in the form of a red to red-orange powder, the components B1, B2, B3 and B4 of the antibiotic called "danubomycin" are obtained, components which can be crystallized by treatment with acetate d. ethyl or acetone.
EXAMPLE 6
While adding Hyflo as a filter aid, a culture solution with a load of 950 liters obtained according to Example 1 or 2 is freed from the mycelium, then the filtrate and the filter residue are treated separately. a) The culture filtrate is cooled, adjusted to pH 8.5 to 9.0 with sodium hydroxide solution, then subjected in an extractor to extraction with ethyl acetate in a 3: 1 ratio, all of the antibiotic activity passing into the organic phase. The extract is directly adsorbed on a column loaded with one liter of Amberlite IRC-50 (acid form, dehydrated with methanol and acclimatized to ethyl acetate). The fraction which passes is antibiotically inactive.
Other inactive accompanying substances can be extracted by washing with methanol. The antibiotic called “danubomycin” is then eluted with a 0.4-normal methanolic solution of hydrochloric acid. About half of the active eluates have a pH between 4 and 6, while the other half have a pH of about 1.5. This latter half is deacidified on an Amberlite IR-45 column. After having combined the methanolic eluates, they are then adjusted to a pH of 3.5 using a normal methanolic solution of hydrochloric acid and concentrated in a rotary evaporator, at maximum 30, to a small amount. volume (200 to 300 om3), and dilutes them in a tenfold volume of ethyl acetate. The precipitate is filtered off, washed with ethyl acetate and with ether, then dried under vacuum at 20-25.
Yield 5 g of the yellow-brown hydrochloride of the antibiotic called "danubomycin". b) The wet filtration residue, consisting of the mycelium and Hyflo (approximately 170 kg) is stirred twice with 170 liters of acetone.
The antibiotic activity is adsorbed on a column of Amberlite IRC-50 (acid form, acclimatized on 70% acetone) The hydrochloride (obtained as under a)) of the antibiotic called "danubomycin" is soiled with a fairly large amount of inorganic salts. The yield is 29.4 g of a yellow powder.
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EXAMPLE 7
Using hydrochloric acid is adjusted to a pH of 4.6700 liters of a culture solution of a charge obtained according to Example 1 or 2. When the pH no longer varies after a half an hour, filtered after adding 2% of Eyflo. The cultured filtrate, pH 8.5-9.0, in an extractor, is extracted with ethyl acetate in the 3: 1 ratio. As described under a) in Example 6, the antibiotic activity is adsorbed onto 4 liters of Amberlite IRC-50, then eluted. The yield is 85 g of the yellow-brown hydrochloride of the antibiotic called "danubomycin". From the filter cake, it is no longer possible, by extraction with acetone, to obtain any active material.
CLAIMS.
I. A process for preparing the novel antibiotic called "danubomycin", characterized in that a strain exhibiting the properties of Streptomyces griseus A 9990 is cultivated under aerobic conditions until the nutrient solution exhibits antibiotic activity. notable and that the new antibiotic called "danubomycin" is then isolated.
The present process can be further characterized by the following points:
1) Culture takes place in an immersed way.
2) The nutrient solution contains growth promoting substances.
3) Cultivation takes place for 36 to 120 hours, at a temperature between 20 and 40.
4) The antibiotic called “danubomycin” is extracted from the culture filtrate, at a pH greater than 7, using an organic solvent immiscible with water.
5) The antibiotic called “danubomycin” is extracted from the separated mycelium using an organic solvent at least partly miscible with water.
6) The antibiotic called "danubomycin" is extracted from the mycelium using an organic or inorganic acid.
7) The antibiotic called "danubomycin" is purified by adsorption, preferably with activated carbon, with aluminum oxide or with ion exchange resins, and by extraction of the adsorbate with an organic solvent in less partially soluble in water, possibly with addition of acids.
8) The antibiotic called "danubomycin" is purified by a partition between an aqueous solution and an organic solvent immiscible with water, if necessary with the addition of dilute acids, and it is separated into its components Bl , B2, B3 and B4.
9) The distribution takes place according to the counter-current process.
10) Components B1, B2, B3 and B4 are obtained in crystalline form in an organic solvent.
II) The antibiotic called "danubomycin" and its components B1, B2, B3 and B4 are prepared in the form of their crystalline salts with an inorganic or organic acid by causing this acid to act on the free bases of the antibiotics or by double decomposition of a salt of antibiotics with a salt of the corresponding acid.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.