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La présente invention concerne un nouvel antibiotique soluble dans l'eau, présentant des propriétés basiques, Qui sera désigné dans ce qui va suivre par la référence 11 7907, ses sels, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés; l'invention concerne également un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
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L'antibiotique A 7907 se forme lors de la culture
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d'un actinomycète du genre des Streptomycese souche A 7907.
Cette souche a été isolée à partir d'une prise d'essai faite
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dans le sol de Zuoz, Canton de GraubUnden (Suisse) et a été conservée, sous cette désignation, dans les Laboratoires de la Demanderesse ainsi qu'àd l'Ecole Polytechnique Fédérale de Zurich, Institut de Botanique Spéciale.
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Le Streptoayces A 7907 forme un mycélium aérien brun d'étain à gris-rougeâtre et porte des chaînes de conidies qui constituent une caractéristique typique de la famille des Streptomyces. Le mycélium aérien présente de courtes spirales bien développées, comportant peu de spires. Les spores sont
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lisses. Il ne se forme pour ainsi dire pas doexopîgmerit.
Les milieux peptonéa ne subissent pas de décoloration méla-noMique La croissance dépend relativement peu de la température et le
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champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32 Suivant la méthode de T.G. Pridham et de Gottlieb (Journal Bacteriology
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6 107 (19481), on observe une assimilation des composés carbonés comme le glucose, le L-arabinose, le L-xylose, le L-rhamnose, le fructose, le saccharose, l'inuline, la Dmannite, la D-sorbite, la taéso-inosite et la salleine, tandis que le raffinose n'est pas exploité.
Les caractéristiques morphologiques et physiolo- giques de la souche A 7907 sont analogues à celles du Strep-
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tosayces fradiae (a.k3Bisn et OUrtis)o Waksman et Henrioi.
La px'ësent'3 intention ngert pas limitée, en ce qui a trait a la pi?éparation ti= l'antibiotique A 7907, à l'utilisation du SiIreptainyces A 7907 ou d'autres souches correupoiidant à la description mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces ogan1smeE, telles qu'elles sont obte3M'ss par exemple par sélection ou mutation, notamment nous l'influence ultra-vîolet ou des rayons X. ou BOUS l'action de moutarde à l'azote.
Pour la production de 1'antibiotique A 7907, on
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CMli'?c <3'3 manlère aérobie une souche de streptomycètas présentant les Proprlétéa du StroPtom7ces A 7907, par exemple a?:s une colution nutritive aqueuse renterrg-ant des hydrates de carbone, des composés azotés ainsi que des sels inorgani-
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qt;Q1, ju5qu'à ce que cette solution nutritive présente une ' action antibactériel1e notables puis on isole ensuite Ilantl- biotique A 7907.
La culture a lieu de manière aérobies c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, en culture immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus. Comme température s'avèr appropriée une tem-
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pârature comprise entre 18 et 40 . na solution nutritive accuse, dans ce cas, un effet aiitibactérlal notable en gé- néral au bout d'un jour et demi à cinq jours.
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Comme hydrates de carbone assimilables, on envisage, par exemple, le glucose, le saccharose, le lactose, l'amidon ainsi que la glycérine. Comme substances nutritives azotées et, le cas échéant, comme substances favorisant la croissance, on citera les acides aminés, les peptides et les protéines ainsi que leurs produits de dégradation comme le peptone ou le tryptone, ainsi que des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, de résidus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, de levure, de fèves, notamment du soja, de graines, par exemple de coton, etc., mais aussi des nitrates.
Parmi les autres sels inorganiques, la solu- . tion nutritive peut, par exemple, renfermer des chlorures, des carbonates, des sulfates de métaux alcalins, alcalinoterreux, du magnésium, du fer, du zinc et du manganèse.
L'antibiotique A 7907 préparable suivant la présente invention est une substance soluble dans l'eau qui, d'après des examens chromatographiques sur papier, est constituée par environ quatre composés très voisins. Ce produit est absolument insoluble dans les solvants organiques, surtout dans les solvants lipoïdes. L'antibiotique est basique et forme des sels qui sont en partie solubles, comme par exemple le chlorhydrate, dans certains solvants organiques tels que des alcools aliphatiques inférieurs. L'antibiotique se trouve presque complètement dans la solution
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nutritive, lors de la culture dans des milieux aqueux, tandis que le mycélium sékparé de ladite solution nutritive n'accuse pratiquement pas d'activité biologique.
Suivant ces propriétés, on peut, en vue d'obtenir l'antibiotique A 7907 à partir d'une solution de culture, ne pas extraire cet antibiotique avec des solvants organiques.
On peut, par contre, l'extraire de cette solution de culture dans le ces d'une réaction neutre ou faiblement alcaline à l'aide d'agents d'adsorption et l'extraire des adsorbats avec des liquides d'élution acides présentant avantageusement un pH inférieur a 4.Comme agents d'adsorption on envisage d'une part du charbon actif, par exemple de la norite, et d'autre part des échangeurs de cations, notamment ceux renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple la résine échangeuse connue dans le commerce sous le nom d'amberlite IRC-50.
Si l'on emploie du charbon actif comme agent d'ad sorption, 11 est approprié d'utiliser comme liquides d'élution aussi bien des solutions aqueuses acides que des solvants miscibles à l'eau renfermant des acides,, comme des alcools aliphatiques inférieurs et des cétones Un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'acide formique normal s'est avéré particulièrement avantageux.
Etant donné qu'en dehors de l'antibiotique, le charbon actif adsorbe encore de la solution de cultures des quantités assez grandes
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d'impuretés en partie colorées, on lave avant l'élution de l'antibiotique la oolonne d'adsorption avec de l'éthanol, les autres conditions demeurant quant au reste inchangées, ce qui fait qu'on élimine une grande partie des substances accompagnatrices, l'antibiotique n'étant toutefois pas extrait.
A partir de l'éluat acide, on peut obtenir sous la forme d'une poudre blanche une préparation d'antibiotique fortement enrichie, en concentrant l'éluat sous vide à un petit volume, le solvant organique ainsi que la majeure partie de l'acide formique étant élimines, puis on ajoute ensuite de l'acétone au concentrât aqueux, avantageusement après avoir dilué avec 4 à 5 volumes de méthanol, lave le précipité formé avec ce solvant, puis finalement le sèche.
Etant donné que l'éluat obtenu au charbon actif, notamment celui des solutions nutritives renfermant des cultures avec du carbonate de calcium, contient des quantités notables d'ions Ca, on sépare le calcium du concentrât, avant précipitation de l'antibiotique, avantageusement avec de l'acide oxalique.
Pour l'adsorption de l'antibiotique avec un éohangeur de cations, on utilise avantageusement ce dernier sous la forme H. L'élution a lieu avec une solution aqueuse diluée d'acide, le cas échéant après avoir préalablement lavé la colonne à l'eau distillée, les substances accompagnatrices inaotives étant éliminées. Comme agent d'élution, l'acide
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chlorhydrique O,2-normal est particulièrement apprQP1ê. LOantlblotlque est renrermë dans l'éluat sous la forme d'un sel. les élyats obtenus avec les échangeurs de cations
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peuvent, comme tels ou après concontratlon sous vide, le cas êehdant après avoir été neutralisés, j, servir pour l'obtention <!'autres éparat1ons enrichies de 10antlblotlque.
Pour la préparation à l'état pur de ltant1b1ot1qua A 7907 à partir de p#dparat10na préalablement purifiées par adsorption à l'aide de charbon ou échangeur d'ions, on ajoute
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à leurs solutions aqueuses ajustées à un pH de 6e5 à 7,0, un volume tout juste suffisant pour la précipitation complets
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d'une solution aqueuse du sol d'un colorant asoyque renfermant des groupes sultonlquoop puis isole de l'antibiotique le sel de colorant diffieile!3@nt soluble qui 6@ forme. Si 1 on utilise comme sel de colorant azoxquop le sel de sodium de l'acide 4'-diiùé%hylawino-azobenzèns-4-1Sulfonique connu dans le commerce sous le nom d'Héllanthlne ou dzorange Illo il se sépare alors le sel de colorant (Hélianthate) de l'antibiotique A 7907, sous
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une forme totalement ou partiellement orlotalllsêe.
On peut recristalliser 1lh6llanthate de l'antibiotique dans l'eau ou le méthanol, ou dans des mélanges de ces solvants, mais aussi dans du formamide et de l'eau. Une fois recristallisé, il constitue une poudre brun-rouge Macroscopique. Examine au
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m1roscope# il forme dee paillettes Jaunes empilées ou des bâtonnets qui fondent à 186-1880 en se décomposant.
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Pour récupérer l'antibiotique du sel de colorant on fait réagir celui-ci en milieu aqueux ou alcoolique sur le sel d'un acide inorganique ou organique et d'une base organique, ce qui fait qu'il se forme le sel de l'antibiotique de l'acide correspondant et le sel de colorant de la base. Si pour cette récupération on utilise, par exemple., du sulfate de triéthylamine et qu'on effectue ladite réaction avec une suspension aqueuse de l'hélianthate de l'antibiotique, on obtient alors le sulfate de l'antibiotique qui est soluble dans l'eau ainsi que l'hélianthate de triéthylamine insoluble.
En ajoutant suffisamment de méthanol à la solution réactionnelle, cette dernière passe en solution tandis que le sulfate de l'anti- biotique seulement soluble dans l'eau, mais par contre complètement insoluble dans les alcools inférieurs, se sépare et peut être isolé, par exemple par filtration. On peut toutefois entreprendre aussi la réaction en solution alcoolique ou dans une solution formée d'un mélange d'alcool et d'eau, le sulfate précipitant aussitôt et pouvant être séparé de la solution de colorant.
Le sulfate ainsi obtenu de l'antibiotique A 7907 constitue une poudre incolore facilement soluble dans l'eau et le formamide, mais par contre totalement insoluble dans les solvants organiques tels que les alcools et les cétones, poudre qui présente une haute activité antibiotique.
A partir du sulfate, on peut, par exemple, obtenir
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le chlorhydrate de l'antibiotique par réaction en solution aqueuse sur du chlorure de baryum et isolement à partir de la solution débarrassée du sulfate de baryum ce chlorhydrate étant obtenu sous forme d'une poudre à peine colorée, facilement soluble dans l'eau ainsi que dans le méthanol, mais plus difficilement soluble dans l'éthanol. Par ailleurs,
il est également possible de préparer un chlorhydrate directement à partir de l'hélianthate de l'antibiotique en ajoutant à une solution ou suspension méthanolique dudit antibiotique un excès d'acide chlorhydrique concentré ou d'une solution d'acide chlorhydrique gazeux dans la méthanol, en précipitant le chlorhydrate forméd avec de l'éther et en isolant..
Pour éliminer de minimes impuretés colorées du chlorhydrate préparé suivant cette méthode, on filtre la solution méthanolique dudit chlorhydrate à travers une colonne de charbon actif, de préférence de noir de gaz,, le chlorhydrate étant obtenu après évaporation du solvant du filtrat sous la forme d'une poudre d'un blanc pur, qui,lors d'une évaporation très lente de sa solution aqueuse ou méthanolique, se sépare en partie sous forme cristalline;
ces cristaux se décomposent à 188 - 190 c
La préparation de l'antibiotique A 7907 sous forme pure peut avoir lieu aussi en précipitant celui-ci de ses solution aqueuses au moyen d'un acide organique par exemple du typa de l'acide picrique, tel que l'acide picrique lui-même
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ou l'acide et7phnique ou au moyen d'acide pkrolon1que, nous torme d'un sel difficilement soluble.
Tandis que le picrate et le styphnate précipités sont à l'état amorphe et n'ont pas
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pu Otre amenés à l'état cristallin jusqu'à, présent - à tempéra- ture ordinaire, le styphante est liquide - , le picrolonate
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est obtenu à l'état oristallin, sous forme d'aiguilles réunies en faisceaux, de couleur jaune, qui fondent., après suintement, à 213 '- Sl4 Cs avec décomposition. Ces sels peu solubles peuvent être transformas par traitement avec des acides, par exemple avec de l'acide chlorhydrique ou de l'acide sulfurique, en milieu aqueux ou dans un solvant organique
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miscible à l'eau tel que le méthanol ou Itacdtonee en sels correspondants qu'on isole comme tels.
Suivant ce procédé d'enrichissement, on peut obtenir l'antibiotique par exemple
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à partir du sulfate purifia par llintermédlair# de lDhé11anthate., mais aussi à partir des éluats des sdsorbata obtenus avec du charbon et des échangeurs de cations.
D'autres sels cristallins, difficilement solubles
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dans l'eau, de 1'antibiotique A 7907 sont le relneekate* cristallisant en plaques irrégulières et se décomposant à
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1890 01 ainsi que le dili%urate (sel de l'acide 5-nitro- barbiturique). Ce dernier est à l'état de cristaux polyédri-
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ques OU d'aiguilles réunies en falaceauxj ces cristaux chauffes au-dessus de 1900 C Si agglomèrent en suintant et en noircissant peu à peu sans présenter un point de fusion
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ou Ce déacmpos1tian popms 'Sit.
La blàc@ Ilbeo dO 2.'astiblotlqM's A 7907 est facllement a,cù;5l'ôle à parflxlz. do se3 Gel%, h partir du sulfata pae exemple rm-r rés.ct1ol1 6'11 milieu elueux cirir de 3.hy<rode de baryum. ne1xtPà-lioéàtion de la baryte en exés par du dloxydo de carbone, alial qne séparation du péc1p1t de carbonate et de sulfate do baryump et 1olement de lOantibiot1que= be-3o à l'aide d'un sous un froid poussé. La prépara- tion à partis* des sels avec utilisation d'un êchangour dOan1o ..,.:; baulque a lieu plus faellemontp par exemple en t:tiliàJ<nt la fcrste 1.13.rdloxy]Se du profit connu d8.Ha le com..
ZC'f.';( 1>ou? la dénomination "Dox-8".
LSant1biotlqua A 7907 est une base amorphe incolore iB11 est àc11mant soluble dans l'eau et dans les milieux a.MOx mais par contre est insoluble dans les solvant organlses Ln solution wzueuse de la baBo prdaente une réct1on s1câl1nGw Une solution à 1% d'une préparation obtenue à Icalde dudehanseurs datons prg3nte un pH de 10,5.
Avec les a1deaJl 1 antibiotique A 7907 tozome des a-,Ise parmi lesquels par exemple le sulfate et le chlorhydrate 1ncolorc sont trèm f&cl1emnt solublea dans 1 eau Le chlor-
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hydrate se dissout, en outre, dans les alcools aliphatiques
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1nrériur, notamncnt dn3 le m6thptnol. En espérant très lentement les solutions aqueuses ou méthano11quea, on peut aus8l obtenir, sous forma orlatallinex le chlorhydrate de
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l'antibiotique. Ces cristaux se décomposent, après suintement à 188 - 190 C. La chlorhydrate de l'antibiotique A 7907 présente la composition élémentaire suivante : C - 39,5%, H . 7,2% N 15,5%, O 19,8%, cl 17,2%, 20 21 0,8 dans l'eau).
Le sulfate de cet antibiotique n'a pas pu être obtenu à l'état cristallin jusqu'à présent
Le sel coloré de la base avec l'acide 4'-diméthyl-d amino-azobenzene-4-sulfonique (Hélianthate) est difficilement soluble, aussi bien dans les milieux aqueux que dans les milieux alcooliques. Ce sel se sépare de telles solutions saturées chaudes en paillettes qui, sous le microscope, ont un aspect stratifié et sont coloria en jauneo après recristalli nations elles se décomposent à 186 - 188 .
D'autres sels de l'antibiotique A 7907 dérivent, pas exemple, des acides acétique, palmitique, succinique, citrique ou pantothénique.
L'antibiotique A 7907 a le caractère d'un polypeptide ainsi que le montrent le spectre infra-rouge, les réactions de coloration ainsi que la composition élémentaire.
Le spectre infra-rouge du chlorhydrate de cet antibiotique, dans le nujol, présente des bandes entre autres à 3,0 , 3,45 4,95 , 5,85 , 6,05 6,40 6,87 7,28 7,65 8,10 , 8,90 9,37 Comme le montre un examen comparatif effectué par chromatographie sur papier, cet antibiotique est différent des antibiotiques incolores, solubles dans l'eau,
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COMIU3# actifs vis-à-vis def3 bsctdrlea gram-positives et grcm-ngties, tels que la Streptomycine# la Streptothrlolne et la Eéorc1ne.
Malgré Igenalogle de la souche de Strepto- ïsyoes A 7907 qui produit le nouvel antibiotique, avec le Streptomyee xanthophaaut3., Lindssbeia, orfanimme qui forme l'antibiotique dénommé "GéÔwycifl@" @t la composition élémentaire très voisine des chlor-hlrdrates de lgantlblotlque A 7907 et de la Géomyoine (cf. H.. Brockmann et H. Musse "rJa:turw1ssenschaftenSf, Volume 41, page 451 (1954 h "Chcm:1schs Berichte" Voltime 87, page 1779 (1954) ). l'en%1biotique A 7907 n'est pas identique 8 la géoniyolne, car à
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l'encontre de cette dernière, il ne fournit pas de réaction
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à la nlnhydrîne et ne fournit aussi qu'une réaction de coloration 0xtrmement faible suivant Scaguch1. Par ailleurs, a la différence do Géonyoine, il montre une intense réaction au b1uret, qui fait défaut chez cette dernière. La réaction avec le multol est négative.
L'antibiotique A 7907 noect cependant pas non plus identique à la Cimmmicine polypeptide soluble dans l'eau produit par le Streptomyces cinnemoneue, Danodict, Pridham et Llndontelzer, qui est également semblable au Streptomyces A 7907# car la Cinnamyoîne renferme du soufre dans sa molé-
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cule et n'est par ailleurs efficace que contre les bactéries gram-positives, mais pas contre les bactéries grain-négatives.
L'antibiotique A 7907 possède une haute activité
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antibiotique vis-à-vis de divers organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode-test in-vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucosé, incubées à 37 pendant 24 heures, on obtient alors les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes
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Concsntl.'ation
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<tb>
<tb> Organismes-tests <SEP> inhibante <SEP> en
<tb> g/cm3
<tb>
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irococcu3 pyogen@s, varo aureus '],0 ttlcrococcus pjogonoop var. aueU5 100 pdniolllino-réalstant Streptococous pyosenez 100 ï 3t;;X"eptococcus vir1de.nrn 100 i Corynebact0riú'm dipter1ai!t 1 1 Ezcher1ch1a coli 100 1 E,chGI'1chia colle streptomycino- 100 résistant - E.:
Jah"t'ich1a collp chlovomycét1no- 100
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<tb>
<tb> résistant
<tb> Salmonella <SEP> typhose <SEP> 10
<tb>
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. Ba.3.!aonella 6chottmueller1 10 hlgs3.1a. sonnel 100 1 Paeudomonas aeruginosa 100 1 !Clel>sj,e1ls. type A 100
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<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> pastis <SEP> 100
<tb> Vibrio <SEP> cholerse <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherlum <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> ' <SEP> 10
<tb>
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L'antibiotique A 7907 est également actif in vivo.
Lors d'une administration sous-cutanée de 50 mg/kg effectuée à 6 reprises sur des souris infeotées à l'Escherichie colle on a observé 100% de survivantes.Lors d'une application identique, on observe le même effet chez des souris infeo- tées au Klebaiella type A, de même qu'un effet chez des souris infectées au Salmonella typhi murium
La toxicité de cet antibiotique est minime. Ainsi par exemple une application sous-cutanée de 50 mg/kg répétée six fois est supportée sans dommages par les souris. Des doses plus élevées n'on pas encore été essayées.
Cet antiblitque ou ses sels peuvent être utilisés comme médicaments, par exemple soue la forme de préparations pharmaceutiques renfermant les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou Inorganique,, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale. Comme substances pour cette matière de support, on envisage celle ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliquea, des gommes, des polyalcoylène- glycols, la vaseline, la cholsestérine, ou d'autres excipients connus.
Ces préparations pharmaceutiques peuvent se présen- ter, par exemple, sous la forme de tablettes, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes de suppositoires, ou sous forme
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liquide àd l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsion le cas échéant elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires telles que des agents de consevation de stabilisation, des agents mouillants ou Elles peuvent encore aussi d'autres substandes précieuses en thérapeutique
L'invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les composés obtenus par la mise en oeuvre du procédé défini ci-dessus.
L'intention est décrite plus en détail dans les exemple non limitatifs qui suivent dans lesquels les tempéra- teres sont indiquées en degrés centigrades.
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Exemple 1 ------- --- la culture du Streptomyces A 7907 est effectuée @ vant le procédé de culture immergée On utilise une solution nutritive renfermant par litre d'eau du robinet les substances additionnelles suivantes
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<tb>
<tb> Lactose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
La solution nutritive est stérilisée pendant 20 à 30 minutes sous 1 atmosphère effective dans les récipients d'ensemencement ou dans les fermenteurs.
La solution nutritive stérilisée présente un pH de 75 à 8,0. L'ensemencement a lieu dans une proportion allant jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement spouelante, de l'organismes envissgé On incube en secouant bien ou en agitant à 27 les cultures étant sérées dans les fermenteurs avec environ un volume d'air stérile par volume de solution et par minute.
Après 70 à 120 heures d'incubation, la solution de culture atteint la valeur d'inhibition maximum par rapport aux organismes-tests (B-Subtilis B.megatherium, Staph.aureus, Esch. coli Candida vulgaris) On interrompt la culture et sépare le mycélium Inactif ainsi que d'autres composantes solides de la solution renfermant l'antibiotique, cela à l'aide d'une filtra-
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tion ou d'une centrifugation, en ajoutant; le cas échétant à la, solution de culture, avant la filtration; environ 1% d'un auxi liaire de filtration, par exemple de l'Hyflo Supercel. Le PH eu filtrat de culture est, en général, inchangé ou seulement: peu modifie par rapport à la solution nutritive stérilisée.
Si l'on utilise, à la place de la solution nutritive Indiquée ci-dessus des solutions renfermant par litre d'eau du robinet les Mélanges de substances nutritives sont indiquas ci-après sous a) à f), on obtient alors, après une culture analogue et un traitement analogue; des filtrats de culture présentant une activité antibiotique aussi 41cvée Au lieu d'obtenir une rapide filtration des cultures par additon d'Hyflo-supercel ou d'un autre auxiliaire de iltration on peut ajuster ladite solution de culture avant le filtration à un pH de 5 à l'aide d'acide chlorhydrique et eusuite en ajoutant une solution aqueuse de sulfate l'ajuster à une concentration de 0,5% en ce sel.
Mélanges de substances nutritives renfermant par litre d'eau les substances additionnelles suivantes :
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<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
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<tb>
<tb> b) <SEP> Glycérine <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> 20g
<tb> (eau <SEP> de <SEP> gonflement
<tb> du <SEP> maïs)
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5g
<tb> Nitrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 1g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> d) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Peptone <SEP> 5g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> viande <SEP> 3g
<tb> (oxo <SEP> Lab <SEP> Lemoo)
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 10g
<tb> e) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Caséine <SEP> 3g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> 2g
<tb> de <SEP> potassium
<tb> f) <SEP> Amidon <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> g
<tb> Levure <SEP> séchée <SEP> 1g
<tb> phosphate <SEP> secondaire <SEP> 2g
<tb> de <SEP> potassium
<tb>
Un filtrat ou centrfugat obtenu suivant les in- dications ci-dessus, d'une culture de Streptomyces A 7907 présente, en gênerai, un pH de 7,5 à 8.
Lorsque cela n'est pas
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le ces on ajuste le PH à cette valeur à l'aide d'une solution décanormal d'hydroxyde de sodium avant l'enrchisse ment du nouvel antibiotique. On ajoute ensuite au filtrat faiblement alcalin 1% de charbon actif (Norite) en vue de l'adsorption de l'antibiotique, puis agite mécaniquement la masse pendant une heure, la totalité de la substance active du point de vue antibiotique étant adsorbée par le charbon, On débarrasse ce dernier par filtration de la solution complètement inactive ayant presque la limpidité de l'eau, avantageusement en ajoutant un peu d'un auxiliaire de filtration par exemple de l'Hyflo Supercel
En dehors de l'antibiotique,
le charbon adsorbe encore de la solution nutritive de grandes quantités d'autres substances organiques n'ayant pas d'activité antibiotique, surtout des produits de dégradation forement colorés, mais . aussi des sels inorganiques. Ces substances accompagnatrices sont avantageusement éliminées du charbon, avant l'élution de l'antibiotique. A cet effet la niasse de charbon filtrée encore humide est introduite dans une quantité quintuple d'éthanol à 95% et la suspension est agitée pendant une demilieurs. Le charbon ainsi soumis à un lavage préalable peut être facilement sépare par filtration du liquide de lavage.
Le filtrat coloré en brun ne montre pas d'activité antibiotique . l'élution du nouvel antibiotique a lieu avec du
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méthanol aqueux acidifia avantageusement avec un mélange à parties égales en volume de méthanol et d'asile formique normal, en utilisant pour 1 g d'agent d'adsorption 2 cm3 de liquide dilution. la suspension est bien agitée mécaniquement pendant une demi-heure, puis filtrée après quoi on sépare encore à trois reprises de la même manière le résidu charbon- neux. Les éluats au nombre desquels seul le premier est faiblement colore en jaunâtre alors que les autres sont incolores, montrent la totalité de l'activité antibiotique.
On réunit ces éluats et les concentre sous vide à basse température de bain, par exemple à 40-60 jusque 1/100 du volume initial, la majeure partie de l'acide formique étant aussi.éliminée en dehors du méthanol et de beaucoup d'eau. la pH du concentrât coloré en Jaunâtre, mais toutefois fluide, se situe en général à 4.
Le concentrât renverme notamment lorsque la culture a été effectuée suivant le premier paragraphe ou suivant b) à d) d'assez grandes quantités de calcium.On élimine ce dernier sous forme de l'oxalate difficilement poluble, en ajoutant au concentrait tout en agitant, une so- lution aqueuse à 10% d'acide oxalique. La quantité de la solution d'acide oxalique qui est nécessaire pour une préoi- pitation complète est exactement déterminéd dans une partie aliquote.
Pour les concentrats à partir des cultures suivant la premier paragraphe ou suivant b)à d), on a en général
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besoin de 300 à 500 cm3 de solution d'acide oxalique par litre de concentrat ce qui correspond à 3 à 5 cm3 par litre du filtrat de culture initiale alors que les concentrais obtenus à partir des solution de culture sans addition de carbonate de calcium nécessitont des quantités moindres.
A partir du concentrât débarrassé du calcium on obtient l'antibiotique sous la forme d'une poudre blanche fortement enrichie, en diluant la concentrât aqueux d'abord avec 4 à 5 parties en volume de méthanol et en précipitant ensuite la matière active avec 20 volumes d'acétone. On sépare le précipité par filtratin le lave à deux reprises à , l'acétone et finalement le débarrasse sous vide des restes de solvant. On obtient une poudre d'un blanc pur qui montre pratiquement la totalité de l'activité antibiotique du ' filtrat de culture. la rendement se situe entre 300 à 500 mg par litre de filtrat de culture.
Exemple 2
On peut obtenir un enrichissement de l'antibiotique A 7907 notablement plus fort que dans la cas de la précipi- tation à l'acétone décrite dans l'exemple 1 en préparant son sel d'hélianthine oristallisé. A cet effet, on dilue avec 2 parties en volume d'eau le concentrât exempt de calcium que l'on obtient suivant l'exemple 1 ajuste la solution à un Ph de 6,7 à 7 à l'aide d'une solution déoanormale d'hydroxyde
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de sodium, puis tout en agitant vigoureusement, on ajoute en un fin jet le volume, nécessaire pour une précipitation complète, d'une solution aqueuse d'hélianthine pratiquement saturée,.renfermant par litre 3,5 g d'hélianthine (Orange III,
sel de sodium de l'aoide 4-diméthylamino-azobenzène 4-sulfonique), la solution de précipitation étant avantageusement introduite directement dans la solution d'antibiotique.
Le volume de solution d'hélianthine nécessaire pour la précipitation complète est déterminé à l'aide d'une partie aliqucte dans un essai préalable. Ce volume varie, suivant la teneur en antibiotique, en général entre 50 à 150 fois la quantité du concentrât non dilué utilisé, l'hélianthate qui se forme (sel d'hélianthine de l'antibiotique) précipite en majeure partie à l'état cristallin, sous la forme de minces bâtonnets et/ou de paillettes. On laisse la solution de précipitation reposer quelques heures à basse température, à o le précipité se déposant complètement. On sépare ensuite du précipité, par décantation, la majeure partie de la solution limpide qui surnage, et le reste par centrifugation.
En vue d'être lavé, le précipité est agité une fois avec environ la même quantité d'eau glacée, puis il est ensuite isolé sur un entonnoir-séparateur. Le lavage est répété à deux reprises de la même manière, mais toutefois à l'acétone.
L'hlianthate ainsi lavé du nouvel antibiotique est ensuite séché sous vide. Le rendement est compris entre 40 et 70 mg
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d'héllanthate par cm '5 de concn,t #-at, 13* produit Elec constitue une poudre brun-rousc. Il est assez difficilement soluble dans l'eau ainsi que dans le méthanolp mais par contre plus facilement: soluble datis le fonsssl<3<s mais insoluble ou très peu soluble dans les so3"OEaiatiJ lipoÏ-Ses coe-rle Ilacétenop .l'êtherp le benzène, le oialO' oiotùie e'ù analogues. On peut le cristalliser aussi bien Gan l'eau et dans le méthanol que dans des mélanges de ces solvans auquel cas il précipite en paillettes Igches jeunes au mieroncopet qui forant 186--880 en se cosiposat.
Pour*la prépa#a±#nn. tlu sulfate du nouvel antibio%;ique à partir de lUhéliantbute, on met par exemple on Ë;'i\z::'JienSi#i dans 50 (Jm) 3'àau> 10 g de la poudre 6ch0 11 a . 1 t 1, 4t a t e ajoute à la suspension 16 0 M5 dU0 solution a.iùzise à 60% de sulfate de puis agite la 1;:i=sx> 1)el1.6Jan' uns heUl"f.1, ce qui fait qu'elle se colore peu à pcu en par suite de la formation du sel de tri-thYlam1ne; difficilement soluble, de llhélianthate. La réaction peut être notablement acodlérde par chauffage. On ajoute ensuite au mélange réactionnel 20 volumes de méthanol, le sulfate de l'antibiotique prdeipitant sous forme d'un précipité blanc, alors que 11hélianthate de trlêthylamîne passe en solution.
Le sulfate d tan:i::lb1ot1Q,Uê obtenu par
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centrifugation ou filtration est, après une double précipitation
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dans l'eau, débarrassé au mdtlîidnol 6u colorant adhérant,,
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puis est finalement lave encore avec du méthanol pur, puis est ensuite séché. Il constitue une poudre amorphe d'un bland pur qui est insoluble dans les solvants organiques, mais par contre est facilement soluble dans l'eau. A partir de 10 g d'hdlianthate brut., on obtient environ 1 g de sulfate .
Exemple 3
Dans le but de transformer le sulfate en chlor- hydrate du nouvel antibiotique qui est facilement soluble aussi bien dans l'eau que dans le méthanol, on dissout ledit chlor- hydrate dans une quantité décuple d'eau et traite la solution aqueuse jusqu'à précipitation complète avec une solution à 20% de chlorure de baryum, ce qui fait qu'on a besoin d'environ 2 cm3 par gramme de sulfate. On élimine par centrifugation de précipité de sulfate de baryum et isole le chlorhydrate de la solution incolore qui surnage en procédant à un séchage sous un froid poussa. On obtient ainsi environ 0,8 g de chlorhydrate par gramme de sulfate.
Pour obtenir une autre purification du chlorhydrate, on dissout celui-ci dans peu de méthanol, verse la solution concentrée sur une colonne de chromatographie constituée par de la suie de gaz et lavée au méthanol, puis élue avec le même solvant. Le résidu d'évapo- ration de l'éluat constitue une poudre d'un blanc pur qui est facilement soluble dans le méthanol et dans l'eau et se sépare de ces solvants partiellement sous forme cristalline lorsqu'on
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évapore très lentement. Les cristaux se décomposent à 188-190 après avoir suinté.
Au lieu de préparer le chlorhydrate en passant par le sulfate, on peut prépare:? aussi ce dernier directement à partir de l'hélianthate A cet effet on met ce dernier en suspension à l'état sec et finement divisé dans une quantité environ décuple de méthanol absolu, ajoute encore à la sus- pension 2 volumes d'un mélange d'acide chlorhydrique décanorma et de méthanol, puis fait ensuite bouillis? brièvement.
Après décoloration avec un peu de norite on filtras concentre sous vidé le filtrat limpide comem de l'eau Jusqu'au quart environ du volume initiale et précipite le chlorhydrate du conddcodntrat avec 10 à 20 voumes d'éther ou d'acétoe,
Exemple 4
L'antibiictique obtenu suivant l'exemple 2 à l'état de sulfate brut, est purifié davantage comte suit en passant par le picrate ;
A une solution bien agitée de 1 g de sulfate dans 20 cme d'eau, on ajoute lentement 130 cme d'une solution aqueuse saturée d'acide picrique, quantité qui est juste suffisante pour une precipitation complète.
Il se forme un précipité huileux qui est centrifugée lavé une fois avec un peu d'une solution saturée diacide picrique et une fois avec de l'eau, puis séché dans un dessicateur à vide; le picrate
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se transforme en une masse solide qui n'est toutefois pas cristallisée. Le rendement est de 1,3 g. Pour transformer le picrate de l'antibiotique en son chlorhydrate, on dissout le premier dans du méthanol chaud acidifia avec de l'acide chlorhydrique concentra et verse la solution dans 10 volumes d'éther le chlorhydrate insoluble précipitant sous la forme d'une masse blanche.
On débarrasse ce chlorhydrate des restes d'acide picrique adhérant encore en le dissolvant dans la quantité de méthanol bouillant nécessaire pour la dissolution et en répétant à nouveau la préoipitation à l'éther. On obtient ainsi environ 0,7 g d'un chlorhydrate pulvérulent, d'un blanc pur.
Exemple 5 @
Le nouvel antibiotique pur peut être obtenu par exemple sous forme de chlorhydrate, en passant par son picro lonate cristalline au lieu de passer par son picrate qui n'a pas pu être cristallisé jusqu'à présenta on opère alors de la manière suivante:
A une solution de 5,0 g du sulfate obtenu selon l'exemple 2, dans 500 car d'eau., on ajoute goutte a goutte en 1 heure, en remuant, 2500 cm3 d'une solution aqueuse à peu près saturée d'aoide picrolonique contenant 2,7 g d'acide picrolonique par litre.
Le précipité amorphe de picrolonate qui s'est séparé est essorée pour le cristalliser,
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on le dissout dans 1700 cm3 d'eau bouillante puis on filtre la solution à chaud. Par refroidissement lent jusqu'à la 'température ordinaire, le picrolonate se sépare sous forme en partie cristalline. On essore le précipita sur filtre à plaque perforée, le lave avec un peu d'eau glace puis on la redissout dans 1500 cme d'eau bouillante pour le recristal- liser.
Après avoir filtre la solution chaude, le piorolonate se sépare complètement sous Òrne de fines aiguilles jaunes réunies en durses Aprs avoir été lavds avec un peu d'eau froide et sèches dans le vide sur du pentoxyde de phosphore, ces cristaux montrent un point de décompositin net à 213 à 214 après suintement à 205-208 d On obtient ainsi 5,2 g de picrolonate recristallisé deux fois.
Du picrolcnate ainsi obtenue,on obtient le chlor hydrate pur en ajoutant par portions 3,5 cm3 d'une solution
10 fois normale de Gaz ohlorhydrique dans du méthanol absolu, à une fine suspension de 5,0 g de picrolonate dans 80 cm3 de méthanol glacé en remuant fortement et, lorsque la réaction est comlète, en précipitant complètement le chlorhydrate de l'antibiotique qui s'est partiellement séparé, par addition de 10 fois \ le volume de mélange réactionnel d'éther absolu.
On essore le chlorhydrate le lave une fois sur le filtre avec un peu d'éther pour éliminer le reste d'acide picolonique adhérant encore, on dissout le chlorhydrate dans 20 cm3 de .méthanol, le reprécipite avec de l'éther, le filtre et le lave.
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Le chlorhydrate pur de l'antibiotique ainsi obtenu,séché dans le vide, est une poudre amorphe d'un blanc pur. On obtient ainsi 2,2 g de chlorhydrate.
Exemple 6
La préparation de la base libre du nouvel antibiotique peut avoir lieu aussi bien à partir de son sulfate
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avec de lqhydroxyde de baryum, qu'en utilisant un échangeur dilons faiblement basique. Dans le premier cas, on ajoute, par coumplc à une solution de 1 g du sulfate de l'antibiotique obtenu suivant l'exemple 2 dans 5 cm3 d'eau un excès minime 4'une solution saturée chaude d'hydroxyde de baryun, et est-
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il-6:J.ro juequtà ce que le mélange réectionrtel présente un pH de ? environ. On neutralise ensuite aussitôt l'hydroxyde de baryum en excès en faisant passer du dioxyde de carbone !;.tans la solution.
En vue de transformer le bicarbonate de baryum formé, on maintient ensuite le mélange réactionnel pendant quelques minutes au bain marie à 60 , après quoi on élimine par centrifugation le carbonate de baryum précipité, conjointement avec le sulfate de baryum. A partir de la solution de oentrifugation alcaline, limpide comme de l'eau, qui surnage, on isole la base libre du nouvel antibiotique à l'aide d'un séchage sous un froid poussé. Elle constitue une poudre blanche soluble dans l'eau en donnant une réaction fortement alcaline, mais insoluble dans les solvants organiques.
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Le rendement est de 0,4 g.
Pour obtenir la base libre à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement; basique, on procède coasse suit
On peroole à travers une colonne d'un éohangeur
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<3'ions faiblement basique constitué par du "Do'tqex-2ft une solution aqueuse, à 20% environ; de 1 g du sulfate brut du nouvel antibiotique obtenu suivant l'exemple 2,, en utilisant environ une quantité trentuple de l'échangeur d'ions préalablement lavé avec de facile chlorhydrique dilué, avec de l'eau, avec une solution diluée d'hydroxyde de sodium et à nouveau à l'eau, dans cet ordre. La colonne chargée avec une solution de sulfate est ensuite lavée à l'eau, la base étant facilement éluée.
En vue d'obtenir la base, on lyophilise avanta-
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geusement l'éluat comrae précédeIIl1llant. Le rendement est de Cette base est une poudre blanche, amorphe. Exemple 7
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..,n.......... . ....
Une solution de culture de l'antibiotique A 7907 obtenue suivant l'exemple 1 et débarrassée du mycélium est lentement filtrée à travers une colonne d'une résine échan- geuse d'ions faiblement acide renfermant des groupes carboxyliques, comme par exemple de l'Amberlite IRO-50; en utilisant par litre de la solution d'antibiotique 100 g de la forme H de l'échangeur la vitesse de traversée étant réglée à 5-10 litres par heure.
L'antibiotique A 7907 est adsorbé
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conjointement avec des substances accompagnatrices inactives partiellement colorées en brun fonc la solution qui s'écoula et qui présente un pH de 3 à 3,5 ne possède qu'une très faible activité antibiotique.. On lave ensuite la colonne d'amberlite avec un volume d'eau distillée égal au cinquième du volume de la solution de culture filtrée, ce qui fait qu'une partie des substances accompagnatrices inactives colorées est éliminée, mais toutefois l'antibiotique formé n'est pas élué. Pour obtenir ce dernier de l'adsorbat on fait passer à travers la colonne préalablement lavée une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 0,2-normale et à savoir au total 1/4 du volume de la solution de culture utilisée.
On recueille l'éluat en 5 fractions identiques. L'examen de ces fractions indique que la majeure partie de la matière active, notamment 80 à 90% est présente dans les deux premiers éluats, tandis que les autres éluats, encore également colorés,ne présentent qu'une activité antibiotique relativement minime.
On réunit les deux éluats acides, fortement actifs, et les neutralise soit avec une solution concentrée d'hydroxyde de sodium, soit à l'aide d'un échangeur d'ions faiblement basique sous la forme hydroxylée. La solution d'antibiotique ainsi obtenue peut, comme telle ou après concentration sous vide à basse température, être utilisée comme solution de départ pour préparer, par exemple suivant les procédés décrits dans les exemples 2-3 ou 4, d'autres préparations enrichies en antibiotique A 7907.
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The present invention relates to a novel water-soluble antibiotic exhibiting basic properties, which will be designated in what follows by the reference 11 7907, its salts, as well as pharmaceutical preparations containing these compounds; the invention also relates to a process for preparing such substances and mixtures of substances.
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Antibiotic A 7907 is formed during culture
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of an actinomycete of the genus Streptomycese strain A 7907.
This strain was isolated from a test sample made
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in the soil of Zuoz, Canton of GraubUnden (Switzerland) and has been stored, under this designation, in the laboratories of the Applicant as well as at the Federal Polytechnic School of Zurich, Institute of Special Botany.
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Streptoayces A 7907 forms a tin-brown to reddish-gray aerial mycelium and carries chains of conidia which are a typical feature of the Streptomyces family. The aerial mycelium has short, well-developed spirals with few turns. The spores are
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smooth. It does not form, so to speak, doexopîgmerit.
Peptonea media do not undergo melanonomic discoloration. Growth is relatively unaffected by temperature and
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fungus thrives at 18 as well as at 40; however the optimum growth is between 25 and 32 According to the method of T.G. Pridham and Gottlieb (Journal Bacteriology
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6 107 (19481), we observe an assimilation of carbon compounds such as glucose, L-arabinose, L-xylose, L-rhamnose, fructose, sucrose, inulin, Dmannite, D-sorbite, taeso-inosite and salleine, while raffinose is not exploited.
The morphological and physiological characteristics of strain A 7907 are analogous to those of Strep-
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tosayces fradiae (a.k3Bisn and OUrtis) o Waksman and Henrioi.
The intention is not limited, as regards the preparation ti = the antibiotic A 7907, to the use of SiIreptainyces A 7907 or other strains corresponding to the description, but it also relates to the use of varieties of these organisms, as they are obtained for example by selection or mutation, in particular we influence ultra-violet or X-rays. or BOUS the action of nitrogen mustard.
For the production of antibiotic A 7907,
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CMli '? C <3'3 aerobic produces a strain of streptomycetes exhibiting the properties of StroPtom7ces A 7907, for example a?: S an aqueous nutrient colution containing carbohydrates, nitrogen compounds as well as inorganic salts.
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qt; Q1, until this nutrient solution exhibits a notable antibacterial action and then isolates the anti-biotic A 7907.
The culture takes place aerobically, that is to say for example in surface culture at rest or, preferably, in submerged culture with shaking or agitation with air or oxygen in the shaken flasks or in known fermenters. As the temperature is appropriate, a
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parature between 18 and 40. The nutritive solution shows, in this case, a noticeable bacterial effect, generally after one and a half to five days.
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As assimilable carbohydrates, for example, glucose, sucrose, lactose, starch as well as glycerin are envisaged. As nitrogenous nutrients and, where appropriate, as growth promoting substances, we can cite amino acids, peptides and proteins as well as their degradation products such as peptone or tryptone, as well as meat extracts, soluble fractions in the water of grains of cereals such as corn and wheat, of distillation residues from the preparation of alcohol, of yeast, of beans, especially soybeans, of seeds, for example of cotton, etc., but also nitrates.
Among other inorganic salts, the solu-. The nutrient may, for example, contain chlorides, carbonates, alkali metal sulphates, alkaline earth metal, magnesium, iron, zinc and manganese.
Antibiotic A 7907 preparable according to the present invention is a water soluble substance which, according to chromatographic examinations on paper, consists of about four closely related compounds. This product is absolutely insoluble in organic solvents, especially in lipoid solvents. The antibiotic is basic and forms salts which are partly soluble, such as for example the hydrochloride, in certain organic solvents such as lower aliphatic alcohols. The antibiotic is almost completely in the solution
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nutrient, when cultured in aqueous media, while the mycelium separated from said nutrient solution shows practically no biological activity.
Depending on these properties, it is possible, in order to obtain the antibiotic A 7907 from a culture solution, not to extract this antibiotic with organic solvents.
On the other hand, it is possible to extract it from this culture solution in the form of a neutral or weakly alkaline reaction using adsorption agents and to extract it from the adsorbates with acidic elution liquids advantageously exhibiting a pH less than 4. As adsorption agents are envisaged on the one hand activated carbon, for example norite, and on the other hand cation exchangers, in particular those containing carboxylic groups, such as for example the exchange resin known commercially as amberlite IRC-50.
If activated carbon is employed as an adsorption agent, it is suitable to use as elution liquids both acidic aqueous solutions and water-miscible solvents containing acids, such as lower aliphatic alcohols. and ketones A mixture of equal parts by volume of methanol and normal formic acid has been found to be particularly advantageous.
Since apart from the antibiotic activated charcoal still adsorbs fairly large amounts from the culture solution
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partly colored impurities, the adsorption column is washed before elution of the antibiotic with ethanol, the other conditions remaining unchanged, which means that a large part of the accompanying substances is eliminated , however, the antibiotic is not extracted.
From the acidic eluate a highly enriched antibiotic preparation can be obtained in the form of a white powder by concentrating the eluate in vacuo to a small volume, the organic solvent and most of the. formic acid being removed, then acetone is then added to the aqueous concentrate, advantageously after having diluted with 4 to 5 volumes of methanol, the precipitate formed is washed with this solvent, then finally dried.
Given that the eluate obtained with activated carbon, in particular that of the nutrient solutions containing cultures with calcium carbonate, contains significant amounts of Ca ions, the calcium is separated from the concentrate, before precipitation of the antibiotic, advantageously with oxalic acid.
For the adsorption of the antibiotic with a cation exchanger, the latter is advantageously used in the H form. Elution takes place with a dilute aqueous acid solution, if necessary after having previously washed the column with water. distilled water, the inaotive accompanying substances being removed. As an eluting agent, the acid
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O, 2-normal hydrochloric acid is particularly suitable. The antilblot is contained in the eluate in the form of a salt. the elyates obtained with the cation exchangers
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can, as such or after vacuum concontratlon, the case ehdant after having been neutralized, j, be used for obtaining <! 'other 10antlblotlque enriched spares.
For the preparation in the pure state of ltant1b1ot1qua A 7907 from p # dparat10na previously purified by adsorption using carbon or ion exchanger, one adds
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to their aqueous solutions adjusted to a pH of 6e5 to 7.0, a volume just sufficient for complete precipitation
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an aqueous solution of the soil of an alkaline dye containing sultonlquoop groups and then isolating from the antibiotic the difficult soluble dye salt which forms. If the azoxquop dye salt is used as the sodium salt of 4'-diiù% hylawino-azobenzèns-4-1Sulfonic acid known commercially as Hellanthlne or Orange Illo then the dye salt will separate. (Helianthate) of the antibiotic A 7907, under
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a fully or partially orlotalllsêe form.
The antibiotic h6llanthate can be recrystallized from water or methanol, or from mixtures of these solvents, but also from formamide and water. Once recrystallized, it constitutes a macroscopic red-brown powder. Examine at
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Microscope # it forms stacked Yellow flakes or sticks which melt at 186-1880 as they decompose.
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To recover the antibiotic from the dye salt, the dye is reacted in an aqueous or alcoholic medium with the salt of an inorganic or organic acid and of an organic base, which causes the salt of the dye to form. antibiotic of the corresponding acid and dye salt of the base. If for this recovery, for example, triethylamine sulfate is used and said reaction is carried out with an aqueous suspension of the helianthate of the antibiotic, then the sulfate of the antibiotic is obtained which is soluble in the antibiotic. water as well as insoluble triethylamine helianthate.
By adding sufficient methanol to the reaction solution, the latter goes into solution while the sulfate of the antibiotic which is only soluble in water, but on the other hand completely insoluble in lower alcohols, separates and can be isolated, by example by filtration. However, the reaction can also be carried out in an alcoholic solution or in a solution formed from a mixture of alcohol and water, the sulfate precipitating immediately and being able to be separated from the dye solution.
The sulfate thus obtained from antibiotic A 7907 constitutes a colorless powder which is easily soluble in water and formamide, but on the other hand completely insoluble in organic solvents such as alcohols and ketones, a powder which exhibits high antibiotic activity.
From sulphate, we can, for example, obtain
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the hydrochloride of the antibiotic by reaction in aqueous solution with barium chloride and isolation from the solution freed from barium sulphate, this hydrochloride being obtained in the form of a barely colored powder, easily soluble in water as well as in methanol, but more difficult to soluble in ethanol. Otherwise,
it is also possible to prepare a hydrochloride directly from the helianthate of the antibiotic by adding to a methanolic solution or suspension of said antibiotic an excess of concentrated hydrochloric acid or of a solution of gaseous hydrochloric acid in methanol, by precipitating the hydrochloride formed with ether and isolating.
In order to remove minimal colored impurities from the hydrochloride prepared according to this method, the methanolic solution of said hydrochloride is filtered through a column of activated carbon, preferably gas black, the hydrochloride being obtained after evaporation of the solvent from the filtrate in the form of a pure white powder which, upon very slow evaporation of its aqueous or methanolic solution, partly separates in crystalline form;
these crystals decompose at 188 - 190 c
The preparation of the antibiotic A 7907 in pure form can also take place by precipitating it from its aqueous solutions by means of an organic acid, for example of the type of picric acid, such as picric acid itself.
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or et7phnic acid or by means of petroleum acid, we torme a salt which is hardly soluble.
While the precipitated picrate and styphnate are in the amorphous state and do not have
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been brought to the crystalline state until now - at ordinary temperature, the styphante is liquid - the picrolonate
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is obtained in the oristalline state, in the form of needles united in bundles, of yellow color, which melt., after oozing, at 213 '- Sl4 Cs with decomposition. These poorly soluble salts can be transformed by treatment with acids, for example with hydrochloric acid or sulfuric acid, in aqueous medium or in an organic solvent.
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miscible with water such as methanol or Itacdtonee in corresponding salts which are isolated as such.
According to this enrichment process, the antibiotic can be obtained for example
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from sulphate purified by llintermédlair # de lDhé11anthate., but also from eluates of sdsorbata obtained with carbon and cation exchangers.
Other crystalline salts, hardly soluble
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in water, antibiotic A 7907 is the relneekate * crystallizing in irregular plaques and decomposing in
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1890 01 as well as dili% urate (salt of 5-nitro-barbituric acid). The latter is in the state of polyhedral crystals.
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ques OR needles united in falaceauxj these crystals heated above 1900 C Si agglomerate by oozing and darkening little by little without presenting a melting point
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or Ce déacmpos1tian popms' Sit.
The blàc @ Ilbeo dO 2.'astiblotlqM's A 7907 is easily a, cù; 5l'ôle à parflxlz. do se3 Gel%, from the sulphate pae example rm-r res.ct1ol1 6'11 elueux medium cirir of 3.hy <rode of barium. ne1xtPà-lioéàtion of the barite in exes by dloxydo of carbon, alial qne separation of the péc1p1t of carbonate and sulphate of baryump and lolement lOantibiot1que = be-3o using a under intense cold. The preparation from salts with the use of an Oan1o exchanger ..,.:; baulque takes place more faellemontp for example in t: tiliàJ <nt la fcrste 1.13.rdloxy] Se of the known profit d8.Ha le com ..
ZC'f. '; (1> or? The name "Dox-8".
LSant1biotlqua A 7907 is a colorless amorphous base iB11 is soluble in water and in a.MOx media but, on the other hand, is insoluble in organic solvents The wzuous solution of the baBo presents a s1câl1nGw reaction A 1% solution of a preparation obtained in Icalde dudehanseurs datons prg3nte a pH of 10.5.
With the a1deaJl 1 antibiotic A 7907 tozome of the a-, Ise among which for example the sulphate and the hydrochloride 1ncolorc are very soluble in 1 water The chlor-
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hydrate dissolves, moreover, in aliphatic alcohols
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1nériur, in particular in methptnol. Hoping very slowly for aqueous or methane solutions, we can also obtain, in the form of orlatallinex hydrochloride of
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the antibiotic. These crystals decompose, after seepage at 188-190 C. The hydrochloride of antibiotic A 7907 has the following elemental composition: C - 39.5%, H. 7.2% N 15.5%, O 19.8%, cl 17.2%, 20 21 0.8 in water).
Sulfate of this antibiotic could not be obtained crystalline so far
The colored salt of the base with 4'-dimethyl-d-amino-azobenzene-4-sulfonic acid (helianthate) is hardly soluble, both in aqueous media and in alcoholic media. This salt separates from such hot saturated solutions into flakes which, under the microscope, have a stratified appearance and are colored yellow after recrystallization they decompose at 186 - 188.
Other salts of the antibiotic A 7907 are derived, for example, from acetic, palmitic, succinic, citric or pantothenic acids.
Antibiotic A 7907 has the character of a polypeptide as shown by the infrared spectrum, the coloring reactions as well as the elemental composition.
The infra-red spectrum of the hydrochloride of this antibiotic, in nujol, shows bands among others at 3.0, 3.45 4.95, 5.85, 6.05 6.40 6.87 7.28 7, 65 8.10, 8.90 9.37 As shown by a comparative examination carried out by chromatography on paper, this antibiotic is different from colorless, water-soluble antibiotics,
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COMIU3 # active vis-à-vis gram-positive bsctdrlea and grcm-ngties, such as Streptomycin # Streptothrlolne and Eorcine.
Despite Igenalogle of the strain of Strepto- ïsyoes A 7907 which produces the new antibiotic, with Streptomyee xanthophaaut3., Lindssbeia, an organism which forms the antibiotic called "GéÔwycifl @" @t the elemental composition very similar to the chlor-hydrates of lgantlblotlque A 7907 and Geomyoine (cf. H .. Brockmann and H. Musse "rJa: turw1ssenschaftenSf, Volume 41, page 451 (1954 h" Chcm: 1schs Berichte "Voltime 87, page 1779 (1954)). A 7907 is not identical 8 the geoniyolin, because at
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against the latter, it does not provide a reaction
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with nlnhydrin and also only gave an extremely weak staining reaction according to Scaguch1. Moreover, unlike Geonyoine, it shows an intense reaction to b1uret, which is lacking in the latter. The reaction with multol is negative.
Antibiotic A 7907 however is also not identical to the water soluble polypeptide Cimmmicine produced by Streptomyces cinnemoneue, Danodict, Pridham and Llndontelzer, which is also similar to Streptomyces A 7907 # because Cinnamyoin contains sulfur in its molé -
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cule and is otherwise only effective against gram-positive bacteria, but not against grain-negative bacteria.
Antibiotic A 7907 has high activity
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antibiotic against various test organisms. If one uses as in-vitro test method dilution series (by power of 10) in glucose broth, incubated at 37 for 24 hours, then the following concentrations are obtained which are still inhibiting
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Concsntl.'ation
EMI15.2
<tb>
<tb> Test organisms <SEP> inhibiting <SEP> in
<tb> g / cm3
<tb>
EMI15.3
irococcu3 pyogen @ s, varo aureus'], 0 ttlcrococcus pjogonoop var. aueU5 100 pdniolllino-realstant Streptococous pyosenez 100 ï 3t ;; X "eptococcus vir1de.nrn 100 i Corynebact0riú'm dipter1ai! t 1 1 Ezcher1ch1a coli 100 1 E, chGI'1chia glue streptomycino- 100 resistant - E .:
Jah "t'ich1a collp chlovomycét1no- 100
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<tb>
<tb> resistant
<tb> Salmonella <SEP> typhosis <SEP> 10
<tb>
EMI15.5
. Ba.3.! Aonella 6chottmueller1 10 hlgs3.1a. sonnel 100 1 Paeudomonas aeruginosa 100 1! Clel> sj, e1ls. type A 100
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<tb>
<tb> Pasteurella <SEP> pastis <SEP> 100
<tb> Vibrio <SEP> cholerse <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> Bacillus <SEP> megatherlum <SEP> 1
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 10
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> '<SEP> 10
<tb>
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The antibiotic A 7907 is also active in vivo.
During a subcutaneous administration of 50 mg / kg carried out 6 times on mice infested with Escherichie glue, 100% survivors were observed; during an identical application, the same effect was observed in mice infeo - Klebaiella type A, as well as an effect in mice infected with Salmonella typhi murium
The toxicity of this antibiotic is minimal. Thus, for example, a subcutaneous application of 50 mg / kg repeated six times is tolerated without damage by the mice. Higher doses have not yet been tried.
This antiblitque or its salts can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations containing the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or local application. As substances for this carrier material, those which do not react with the new compounds, such as, for example, gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums, are envisaged. , polyalkylene glycols, petrolatum, cholsesterin, or other known excipients.
These pharmaceutical preparations may be presented, for example, in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories, or in the form of tablets.
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liquid in the form of solutions, suspensions or emulsion where appropriate they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as stabilizing preservatives, wetting agents or They can also also other valuable substances in therapeutic
The invention also relates, as new industrial products, to the compounds obtained by carrying out the process defined above.
The intention is described in more detail in the following non-limiting examples in which the temperatures are indicated in degrees centigrade.
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Example 1 ------- --- the culture of Streptomyces A 7907 is carried out before the immersed culture process A nutrient solution is used containing per liter of tap water the following additional substances
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<tb>
<tb> Lactose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Sodium <SEP> <SEP> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g
<tb>
The nutrient solution is sterilized for 20 to 30 minutes under 1 effective atmosphere in the seed containers or in the fermenters.
The sterilized nutrient solution has a pH of 75 to 8.0. Seeding takes place in a proportion of up to 10% of a partially spooling vegetative culture of the desired organism. The cultures are incubated by shaking well or by shaking at 27 the cultures being serated in the fermenters with about a volume of sterile air per volume of solution and per minute.
After 70 to 120 hours of incubation, the culture solution reaches the maximum inhibition value compared to the test organisms (B-Subtilis B. megatherium, Staph.aureus, Esch. Coli Candida vulgaris) The culture is interrupted and separated the Inactive mycelium as well as other solid components of the solution containing the antibiotic, this using a filter
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tion or centrifugation, adding; if applicable, the culture solution, before filtration; about 1% of a filter aid, for example Hyflo Supercel. The pH of the culture filtrate is, in general, unchanged or only: little changes compared to the sterilized nutrient solution.
If we use, instead of the nutrient solution Indicated above solutions containing per liter of tap water the Mixtures of nutrients are indicated below under a) to f), then we obtain, after a like culture and like treatment; culture filtrates also exhibiting antibiotic activity. Instead of obtaining rapid filtration of the cultures by adding Hyflo-supercel or another filter aid, said culture solution can be adjusted before filtration to a pH of 5 using hydrochloric acid and then adding an aqueous sulfate solution to adjust it to a concentration of 0.5% of this salt.
Mixtures of nutrients containing the following additional substances per liter of water:
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<tb>
<tb> a) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Sodium <SEP> <SEP> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<Desc / Clms Page number 20>
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<tb>
<tb> b) <SEP> Glycerin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> <SEP> soy flour <SEP> <SEP> 10g
<tb> Sodium <SEP> <SEP> Chloride
<tb> Sodium <SEP> Nitrate <SEP>
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> c) <SEP> Glucose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> liquor <SEP> 20g
<tb> (water <SEP> from <SEP> swelling
<tb> from <SEP> corn)
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> 5g
<tb> Nitrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> 1g
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> d) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Peptone <SEP> 5g
<tb> Extract <SEP> of <SEP> meat <SEP> 3g
<tb> (oxo <SEP> Lab <SEP> Lemoo)
<tb> <SEP> sodium <SEP> chloride <SEP> 5g
<tb> Carbonate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> 10g
<tb> e) <SEP> Glucose <SEP> 10g
<tb> Casein <SEP> 3g
<tb> phosphate <SEP> secondary <SEP> 2g
<tb> of <SEP> potassium
<tb> f) <SEP> Starch <SEP> 10 <SEP> g <SEP>
<tb> Peptone <SEP> g
<tb> Dried <SEP> yeast <SEP> 1g
<tb> phosphate <SEP> secondary <SEP> 2g
<tb> of <SEP> potassium
<tb>
A filtrate or centrfugate obtained according to the above indications, from a culture of Streptomyces A 7907 has, in general, a pH of 7.5 to 8.
When it is not
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The pH is adjusted to this value using a decanormal solution of sodium hydroxide before the embedding of the new antibiotic. 1% activated carbon (Norite) is then added to the weakly alkaline filtrate for the adsorption of the antibiotic, then the mass is mechanically stirred for one hour, all of the antibiotically active substance being adsorbed by the substance. carbon, The latter is removed by filtration of the completely inactive solution having almost the clarity of water, advantageously by adding a little of a filter aid, for example Hyflo Supercel
Apart from the antibiotic,
charcoal still adsorbs from the nutrient solution large quantities of other organic substances which have no antibiotic activity, especially strongly colored degradation products, but. also inorganic salts. These accompanying substances are advantageously removed from the charcoal, before the elution of the antibiotic. For this purpose, the still moist filtered mass of charcoal is introduced into a quintuple quantity of 95% ethanol and the suspension is stirred for half a century. The carbon thus subjected to a preliminary wash can be easily separated by filtration from the washing liquid.
The brown colored filtrate does not show antibiotic activity. elution of the new antibiotic takes place with
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aqueous methanol is advantageously acidified with a mixture of equal parts by volume of methanol and normal formic asylum, using for 1 g of adsorption agent 2 cm3 of dilution liquid. the suspension is stirred well mechanically for half an hour, then filtered, after which the carbonaceous residue is separated three more times in the same way. The eluates, in which only the first is weakly yellowish in color while the others are colorless, show all of the antibiotic activity.
These eluates are combined and concentrated under vacuum at a low bath temperature, for example at 40-60 to 1/100 of the initial volume, most of the formic acid also being eliminated apart from the methanol and a lot of water. the pH of the yellowish colored concentrate, which is nevertheless fluid, is generally at 4.
The concentrate returns in particular when the culture has been carried out according to the first paragraph or following b) to d) of rather large quantities of calcium. The latter is eliminated in the form of the hardly soluble oxalate, by adding to the concentrate while stirring, a 10% aqueous solution of oxalic acid. The amount of the oxalic acid solution which is required for complete preparation is exactly determined in an aliquot.
For the concentrates from the cultures according to the first paragraph or following b) to d), we generally have
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need 300 to 500 cm3 of oxalic acid solution per liter of concentrate which corresponds to 3 to 5 cm3 per liter of the initial culture filtrate whereas the concentrates obtained from the culture solutions without addition of calcium carbonate will require smaller quantities.
From the calcium-free concentrate, the antibiotic is obtained in the form of a strongly enriched white powder, by diluting the aqueous concentrate first with 4 to 5 parts by volume of methanol and then precipitating the active material with 20 volumes. acetone. The precipitate is filtered off, washed twice with acetone and finally freed from the residue of solvent under vacuum. A pure white powder is obtained which shows substantially all of the antibiotic activity of the culture filtrate. the yield is between 300 to 500 mg per liter of culture filtrate.
Example 2
A significantly greater enrichment of the antibiotic A 7907 can be obtained than in the case of the acetone precipitation described in Example 1 by preparing its oristallized helianthine salt. To this end, the calcium-free concentrate obtained according to Example 1 is diluted with 2 parts by volume of water and the solution is adjusted to a pH of 6.7 to 7 using a deoanormal solution. hydroxide
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sodium, then, while stirring vigorously, is added in a fine stream the volume, necessary for complete precipitation, of an aqueous solution of helianthine practically saturated, containing per liter 3.5 g of helianthine (Orange III,
sodium salt of 4-dimethylamino-azobenzene 4-sulfonic acid), the precipitation solution being advantageously introduced directly into the antibiotic solution.
The volume of helianthine solution required for complete precipitation is determined using an aliqucte in a preliminary test. This volume varies, depending on the antibiotic content, generally between 50 to 150 times the amount of the undiluted concentrate used, the helianthate which forms (helianthine salt of the antibiotic) precipitates mainly in the crystalline state. , in the form of thin sticks and / or flakes. The precipitation solution is left to stand for a few hours at low temperature, with the precipitate settling completely. The majority of the clear solution which floats on the surface is then separated from the precipitate by decantation and the remainder by centrifugation.
In order to be washed, the precipitate is stirred once with about the same amount of ice water, and then it is isolated on a separatory funnel. The washing is repeated twice in the same way, but however with acetone.
The hianthate thus washed from the new antibiotic is then dried under vacuum. The yield is between 40 and 70 mg
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of hellanthate per cm 5 of concn, t # -at, 13 * product Elec constitutes a brown-rousc powder. It is quite difficult to soluble in water as well as in methanolp but on the other hand more easily: soluble in fonsssl <3 <s but insoluble or very slightly soluble in so3 "OEaiatiJ lipoÏ-Ses coe-rle Ilacétenop .l'étherp it can be crystallized both in water and in methanol and in mixtures of these solvans, in which case it precipitates in young Igches flakes in mieroncopet which pierces 186--880 in cosiposate.
For * the preparation # a ± # nn. the sulphate of the new antibiotic%; ic from heliantbute, for example one puts Ë; 'i \ z ::' JienSi # i in 50 (Jm) 3 'to> 10 g of the powder 6ch0 11 a. 1 t 1, 4t ate added to the suspension 16 0 M5 dU0 solution a.iùzise at 60% sulphate of then stirred the 1;: i = sx> 1) el1.6Jan 'uns heUl "f.1, which makes which gradually becomes colored as a result of the formation of the sparingly soluble tri-thylamine salt of helianthate. The reaction can be appreciably acidified by heating. 20 volumes of methanol are then added to the reaction mixture. the antibiotic precipitates in the form of a white precipitate, while the trlethylamine helianthate goes into solution.
The sulphate of tan: i :: lb1ot1Q, Uê obtained by
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centrifugation or filtration is, after a double precipitation
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in water, freed with mdtlîidnol 6u adherent dye ,,
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then is finally washed again with pure methanol, then is then dried. It constitutes an amorphous powder of a pure bland which is insoluble in organic solvents, but on the other hand is easily soluble in water. From 10 g of crude dlianthate, approximately 1 g of sulphate is obtained.
Example 3
In order to convert the sulfate into the hydrochloride of the new antibiotic which is easily soluble in both water and methanol, said hydrochloride is dissolved in a tenfold amount of water and the aqueous solution is treated to complete precipitation with a 20% solution of barium chloride, so that about 2 cm3 per gram of sulfate is needed. Barium sulphate precipitate is removed by centrifugation and the hydrochloride is isolated from the colorless solution which supersedes by drying under high pressure. In this way approximately 0.8 g of hydrochloride is obtained per gram of sulfate.
To obtain a further purification of the hydrochloride, the latter is dissolved in a little methanol, the concentrated solution is poured onto a chromatography column consisting of gas soot and washed with methanol, then eluted with the same solvent. The evaporation residue of the eluate constitutes a pure white powder which is readily soluble in methanol and in water and separates from these solvents partially in crystalline form when
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evaporates very slowly. Crystals decompose at 188-190 after oozing.
Instead of preparing the hydrochloride through the sulfate, we can prepare :? also the latter directly from the helianthate For this purpose the latter is suspended in the dry state and finely divided in a quantity of about tenfold absolute methanol, further added to the suspension 2 volumes of a mixture of hydrochloric acid decanorma and methanol, then made then boiled? briefly.
After decolourization with a little norite, the clear filtrate is concentrated under vacuum as water up to about a quarter of the initial volume and the hydrochloride from the conddcodntrat is precipitated with 10 to 20 voumes of ether or acetate,
Example 4
The antibiotic obtained according to Example 2 in the form of crude sulfate, is further purified after passing through the picrate;
To a well stirred solution of 1 g of sulfate in 20 cc of water is slowly added 130 cc of a saturated aqueous solution of picric acid, an amount which is just sufficient for complete precipitation.
An oily precipitate forms which is centrifuged washed once with a little saturated picric diacid solution and once with water, then dried in a vacuum desiccator; the picrate
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turns into a solid mass which, however, is not crystallized. The yield is 1.3 g. To transform the picrate of the antibiotic into its hydrochloride, the first is dissolved in hot methanol acidified with concentrated hydrochloric acid and the solution is poured into 10 volumes of ether the insoluble hydrochloride precipitating in the form of a white mass. .
This hydrochloride is freed from the remaining adhering picric acid residues by dissolving it in the quantity of boiling methanol necessary for the dissolution and by repeating the preipitation with ether again. In this way approximately 0.7 g of a pure white powdered hydrochloride is obtained.
Example 5 @
The new pure antibiotic can be obtained, for example, in the form of hydrochloride, passing through its crystalline picro lonate instead of passing through its picrate which has not been able to be crystallized up to now, the operation is then as follows:
To a solution of 5.0 g of the sulphate obtained according to Example 2 in 500 car of water is added dropwise over 1 hour, with stirring, 2500 cm 3 of an approximately saturated aqueous solution of picrolonic acid containing 2.7 g of picrolonic acid per liter.
The amorphous precipitate of picrolonate which separated is drained to crystallize it,
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it is dissolved in 1700 cm3 of boiling water and then the solution is filtered hot. On slow cooling to room temperature, the picrolonate separates out in part crystalline form. The precipitate is filtered off with a perforated plate, washed with a little ice-water and then redissolved in 1500 cc of boiling water to recrystallize it.
After having filtered the hot solution, the piorolonate separates completely under fine yellow needles joined together in hards. After having been washed with a little cold water and dried in vacuum over phosphorus pentoxide, these crystals show a decomposition point. net at 213 to 214 after oozing at 205-208 d This gives 5.2 g of twice recrystallized picrolonate.
From the picrolcnate thus obtained, pure chlor hydrate is obtained by adding in portions 3.5 cm3 of a solution
10 times normal hydrochloric gas in absolute methanol, to a fine suspension of 5.0 g of picrolonate in 80 cm3 of ice-cold methanol with vigorous stirring and, when the reaction is complete, completely precipitating the hydrochloride from the antibiotic which s is partially separated by addition of 10 times the volume of the reaction mixture of absolute ether.
The hydrochloride is filtered off, washed once on the filter with a little ether to remove the remainder of picolonic acid still adhering, the hydrochloride is dissolved in 20 cm3 of methanol, reprecipitated with ether, the filter and the lava.
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The pure hydrochloride of the antibiotic thus obtained, dried in a vacuum, is a pure white amorphous powder. 2.2 g of hydrochloride are thus obtained.
Example 6
The preparation of the free base of the new antibiotic can take place both from its sulfate
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with barium hydroxide than using a weakly basic dilon exchanger. In the first case, a minimal excess of a hot saturated solution of baryun hydroxide is added by coumplc to a solution of 1 g of the sulfate of the antibiotic obtained according to Example 2 in 5 cm3 of water, and is-
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il-6: J.ro until the réectionrtel mixture has a pH of? about. The excess barium hydroxide is then immediately neutralized by passing carbon dioxide through the solution.
In order to convert the barium bicarbonate formed, the reaction mixture is then maintained for a few minutes in a water bath at 60, after which the precipitated barium carbonate is removed by centrifugation, together with the barium sulfate. From the water-clear alkaline centrifuge solution which floats on the surface, the free base of the new antibiotic is isolated by drying under extreme cold. It constitutes a white powder soluble in water, giving a strongly alkaline reaction, but insoluble in organic solvents.
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The yield is 0.4 g.
To obtain the free base using a weak ion exchanger; basic, we proceed croak follows
We percolate through a column of an exchanger
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<3 'weakly basic ions consisting of "Do'tqex-2ft an aqueous solution, at about 20%; of 1 g of the crude sulphate of the new antibiotic obtained according to Example 2, using about a threefold amount of the ion exchanger previously washed with easy dilute hydrochloric acid, with water, with dilute sodium hydroxide solution and again with water, in that order. The column loaded with sulfate solution is then washed with water, the base being easily eluted.
In order to obtain the base, one lyophilizes before
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carefully the eluate comrae preceIIl1llant. The yield is This base is a white, amorphous powder. Example 7
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..,not.......... . ....
A culture solution of the antibiotic A 7907 obtained according to Example 1 and freed of the mycelium is slowly filtered through a column of a weakly acidic ion-exchange resin containing carboxylic groups, such as for example. Amberlite IRO-50; using per liter of the antibiotic solution 100 g of form H of the exchanger, the flow rate being set at 5-10 liters per hour.
Antibiotic A 7907 is adsorbed
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together with inactive accompanying substances partially colored dark brown the solution which flowed and which has a pH of 3 to 3.5 has only very low antibiotic activity. The amberlite column is then washed with one volume. of distilled water equal to one-fifth of the volume of the filtered culture solution, so that a part of the colored inactive accompanying substances is eliminated, but however the antibiotic formed is not eluted. To obtain the latter from the adsorbate, an aqueous solution of 0.2-normal hydrochloric acid is passed through the previously washed column, namely a total of 1/4 of the volume of the culture solution used.
The eluate is collected in 5 identical fractions. Examination of these fractions indicates that the major part of the active material, in particular 80 to 90%, is present in the first two eluates, while the other eluates, still also colored, exhibit only relatively minimal antibiotic activity.
The two highly active acid eluates are combined and neutralized either with a concentrated solution of sodium hydroxide or with the aid of a weakly basic ion exchanger in the hydroxylated form. The antibiotic solution thus obtained can, as such or after concentration under vacuum at low temperature, be used as a starting solution for preparing, for example according to the methods described in Examples 2-3 or 4, other preparations enriched in antibiotic A 7907.