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L'invention concerne un nouvel antibiotique, plus particulièrement des procédés de préparation, de séparation, et de purification de l'antibiotique ou de ses sels.
Dans le présent mémoire, le nouvel antibiotique est dénommé C- 159, aucune dénomination générale n'ayant encore été adoptée jusqu'à pré- sent, mais le C-159 est clairement identifié dans la description détaillée donnée ci-après.
L'antibiotique C-159 et ses sels sont caractérisés en ce qu'ils inhibent la croissance de micro-organiques à Gram-positif, contenant les aminoacides glycine, alanine, thréonine et acide aspartique, et aucun au- tre ; ils sont hautement solubles dans l'eau alcaline, et hautement insolu- bles dans des solutions aqueuses d'un pH inférieur à 4; ils sont solubles dans le méthanol et insolubles dans l'acétone, l'éthèr diéthylique et l'a-' cétate de butyle; à l'état pur, ils contiennent sensiblement 58,7% de car- bone, 7,4 % d'hydrogène, 9,9% d'azote et 24,0% d'oxygène (dosé par diffé- rence); dissous dans l'eau, ils accusent une absorption maximum à la lu- mière ultraviolette à 345 millimicrons (E1%= 71) et un palier entre 260
1cm et 280 ;
granulésdans du bromure de potassium, ils accusent des bandes d'absorption caractéristiques dans la région infrarouge du spectre aux lon- gueurs d'onde suivantes, exprimées en microns g 2,90, 3,38, 5,85 (palier),.
6,05 (palier marqué), 6,10, 6,55, 7,23, 79509 8,00 (bande large) et 9,40 (bande large); ainsi que les sels métalliqueso
Le procédé de préparation de l'antibiotique C-f59 comprend la culture d'une souche de Streptomyces canus producteur du C-159 dans une so- lution aqueuse d'hydrate de carbone contenant un agent nutritif azoté, dans des conditions aérobies submergées, jusqu'à ce qu'une activité anti- bactérienne notable soit conférée à la solution ; on le désire, on sépa- re alors l'antibiotique ainsi produit du bouillon de fermentation.
Pour la fermentation, la solution d'hydrate de carbone renferme une source de carbone telle qu'un sucre existant dans le commerce, certains autres hydrates de carbone ou de l'huile de glycéride, et également une source d'azote telle qu'un sel inorganique, par exemple, du sulfate ammoni- que ou du nitrate de sodium, ou une substance organique, fréquemment à l'é- tat brut telle que de la liqueur de macération du maïs, des produits de distillerie solubles, de la levure, de la farine de soya. Le milieu de fermentation peut également contenir des sels minéraux, des agents tampons tels que du carbonate de calcium; ces milieux sont bien connus dans la technique de la préparation d'antibiotiques.
L'organisme producteur de l'antibiotique de la présente invention a été isolé d'échantillons de terre, et constitue une nouvelle souche de Streptomyces canus.
Des prélèvements de streptomyces canus (culture C-159) se déve- loppent convenablement à 28=30 C sur l'asparagine-dextrose, des agars de Bennett et de farine d'avoine-tomates. Le mycélium végétatif qui se déve- loppe sur des substratums d'agar, est incolore à Flax (couleur lin)o Un mycélium aérien gris se développe le second ou le troisième jour, et donne naissance, dans certains milieux, à de nombreux sporophores enroulés de façon peu serrée. Dans certains milieux, il se forme des pigments ayant des teintes variant du jaune au vert jaunâtre.
Les hydrates de carbone cités ci-après sont aisément assimilés quand ils sont inclus dans de l'agar synthétique de Pridham et Gottlieb ne contenant aucune autre source de carbones dextrine, amidon, glycérine, arabinose, rhamnose, xylose, glucose, lévulose, maltose, lactose, cellobio-
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se, galactose, mannitol, inositol, sorbitol, acétate de sodium, citrate de sodium, succinate de sodium et malate de calciumo Le sucrose, le raffi- nose, l'inuline, le dulcitol, l'oxalate de sodium, le salicylate de sodium et le tartrate de sodium n'aident pas la croissance.
Une description plus détaillée de la croissance du Streptomyces canus (culture C-159) dans un certain nombre de milieux communément utili- sés à l'étude d'éléments du genre Streptomyces, est donnée au tableau I.
On y indique le type de croissance, la production de pigment et d'autres caractéristiques. Les milieux ont été ensemencés par traînées et toutes les cultures ont été soumises à une incubation à 28 = 30 C pendant une du- rée de 21 jours. Les noms de couleurs qui sont écrits avec une initiale majuscule dans le présent mémoire, correspondent à ceux décrits dans l'ou- vrage de Maerz et Paul, A Dictionary of Color, 2e édition, MacGraw-Hill, New York, 1950.
Le Streptomyces canus (culture C-159) donne une réaction alcali- ne au lait de tournesol, sans produire de coagulationo La peptonisation se produit lentemento La gélatine se liquéfie lentement, mais il ne se produit pas de pigment soluble. L'agar du sang n'est pas hémolyse. Il ne se produit pas de noircissement d'agar fer peptoneo TABLEAU I.
Caractéristiques de culture de Streptomyces canus (culture C-159)
EMI2.1
<tb> Crois= <SEP> Couleur <SEP> Pig-
<tb>
<tb> Milieux <SEP> Crois= <SEP> sance <SEP> du <SEP> mycé- <SEP> ment <SEP> Remarques
<tb>
<tb> . <SEP> w.J. <SEP> J. <SEP> eux <SEP> sance <SEP> végé- <SEP> lium <SEP> aérien <SEP> soluble
<tb>
<tb> tative <SEP> et <SEP> des <SEP> spores <SEP> soluble
<tb>
<tb> Agar-dextrose <SEP> franche <SEP> incolore <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> Flax
<tb>
<tb> asparagine <SEP> gris <SEP> (lin)
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de <SEP> Bennett <SEP> bonne <SEP> Flax <SEP> (lin)
<SEP> gris <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> jau-
<tb>
<tb> nâtre
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> franche <SEP> incolore <SEP> légèrement <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> inco-
<tb>
<tb> blanc <SEP> lore
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> franche <SEP> Flax <SEP> (lin) <SEP> gris <SEP> franc <SEP> aucun <SEP> Verso <SEP> gris
<tb>
<tb> mince
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de <SEP> malate <SEP> franche <SEP> Amber <SEP> Whi-= <SEP> blanc <SEP> à <SEP> légère- <SEP> bien <SEP> dégagé
<tb>
<tb> de <SEP> calcium <SEP> te <SEP> (blanc <SEP> gris <SEP> ment <SEP> jau- <SEP> de <SEP> l'agar
<tb>
<tb> ambré) <SEP> nâtre
<tb>
<tb>
<tb> Agar <SEP> de <SEP> farine <SEP> bonne <SEP> Flax <SEP> (lin) <SEP> gris <SEP> vert <SEP> jau- <SEP> Verso <SEP> Bron-
<tb>
<tb> d'avoine-=tomate <SEP> nâtre <SEP> ze-sheen <SEP> (é-
<tb>
<tb> clat <SEP> bronzé)
<tb>
<tb>
<tb> Tampon <SEP> de <SEP> pom= <SEP> bonne <SEP> Cream <SEP> Woodash <SEP> Mauve=
<tb>
<tb> me <SEP> de <SEP> terre <SEP> (crème) <SEP> (cendre <SEP> taupe
<tb>
<tb> de <SEP> bois)
<tb>
<tb> à <SEP> gris
<tb>
Le spectre antibactérien in vitro de l'antibiotique C-159 a été mesuré par la technique de dilution en tube9pour déterminer les concentra- tions minima de l'antibiotique produisant une inhibition complète de la croissance de bactéries pendant 24 heures. Un bouillon d'infusion de coeur a été utilisé comme milieu pour tous les organismes essayés, sauf indica- tions contraires.
Les résultats obtenus sont les suivants g
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EMI3.1
<tb> Organisme <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb>
<tb> minimum
<tb>
<tb>
<tb> mcg/ml
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Microcossus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 52 <SEP> = <SEP> 79 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb> (résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline)
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203M <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> 8
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 12,
5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Lactobacillus <SEP> acidophilus <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Aotobacillus <SEP> casei <SEP> @ <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 31
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> varo <SEP> mycoides <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 3,
1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Neisseria <SEP> spo <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 500
<tb>
Infusion de coeur + 10% de sérum @ Bouillon de jus de tomates
Le C-159 n'est pas léthal pour une souris à laquelle on l'injec- te par voie intraveineuse à raison de 750 mg/kg dissous dans l'eau à une concentration de 2%;
une dose de 1000 mg/kg est léthaleo
Le C=159 dissous dans une solution d'éthanol à 8% protège avec succès des souris infectées par inoculation intrapéritonale d'une dose lé- thale de Diplococcus pneumoniae9 à raison de 1,75 mg/Kg quand on les traite par voie intrapéritonale, et à raison de 1395 mg/Kg quand on les traite par voie intramusculaire au moment de l'infectiono Le traitement par voie orale à raison de 500 mg/kg n'agit pas de façon effective sur l'infection expérimentale.
Il est bien entendu que pour la production de l'antibiotique, l'invention n'est pas limitée à ce micro-organisme particulier, mais com- prend particulièrement l'utilisation de microorganismes consistant en cul- tures isolées naturelles variants ou mutants produits en traitant l'orga- nisme décrit par des agents de mutation tels que des rayons X, radiations ultraviolettes et gaz moutardes azotés.
Les exemples qui suivent illustrent la préparation de bouillons de fermentation contenant l'antibiotique.
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EXEMPLE I.-
EMI4.1
On soumet du streptomyces canus (culture C509) à une fermentation aérobie pendant 72 heures à 27 C, sur un agitateur rotatif. On stérilise 100 ml de milieu dans un vase d'Erlenmeyer de 500 ml pendant 30 minutes à
EMI4.2
1905 atm., puis on lui inocule une croissance végétative de 42 heures à raison de 2%. Le milieu aqueux renferme 3% de polysaccharide (Argo; dex-
EMI4.3
trine resynthétisée), 1% de liqueur de macération du mais, 0,5% de K2HP04y 0,5% de NaCl, 0,5% de Nana3 et 1% de farine de soyao La puissance finale du bouillon antibiotique, mesurée par l'essai biologique décrit plus haut, est de 20,2 mm, à l'état non dilué, et de 18,5 mm, dilué trois fois.
EXEMPLE II.-
EMI4.4
On soumet à la fermentation une culture C509 de Stre tom ces ca- nus dans un appareil de fermentation de 1000 gallons (3785 litres), en uti- lisant le milieu de l'exemple I inoculé de semence végétative de 72 heures.
Après 60 heures, la puissance du bouillon est de 25 mm à l'état non dilué, et de 22 mm, dilué trois fois.
EXEMPLE III.-
EMI4.5
On soumet du Streptomyoes oanus (culture C159) à une fermentation sans agitation et avec aération à raison de 74 pieds cubes (2095 litres)
EMI4.6
par minute à 2995 C pendant 120 heures, dans 600 gallons (2270 litres) d'un milieu contenant 190, de cérélose, 10% de farine de soya, 0,5% de chloru- re de sodium, 0,1% de carbonate de calcium et 0,05% d'une charge Curbay
EMI4.7
BoGo de produits solubles de distillerieo Le pH est de 7,4 au début de la fermentation; il descend à 6,0 puis monte jusqu'à 8,4 pour finir à 8,00 La-puissance finale du bouillon antibiotique est de 14,7 mm, à l'état non dilué, et 12,5 mm dilué trois fois.
EXEMPLE IV.-
On fait fermenter du Streptomyces canus (culture C 159) sans agi-
EMI4.8
tation et avec aération de 74 pieds cubes (2095 litres) par minute à 2ge5OC pendant 100 heures dans 610 gallons (2309 litres) de milieu contenant 1,0% de cérélose, 190, de farine de soya, 0,5% de chlorure de sodium, 0,1% de carbonate de calcium et 0,05% d'une charge Curbay B.G. de produits solubles de distillerie. Le pH est de 7,1 au début de la fermentation, et monte graduellement jusque 799 environ. La puissance du bouillon antibiotique après 70 heures, suivant l'essai biologique décrit plus haut, est de 14e9 mm à l'état non dilué, et 12 mm, dilué trois fois.
EXEMPLE V.-
EMI4.9
On fait fermenter du Streptomyces canus (culture C 159) en milieu aérobie pendant 72 heures à 27 C dans un agitateur rotatif. On stérilise 100 ml de milieu dans un flacon d'Erlenmeyer de 500 ml, pendant 30 minutes sous 1,05 atmo puis on lui inocule une croissance végétative de 32 heures
EMI4.10
à 1a Le milieu aqueux renferme 1,0% de cérélose, 0,05% de charge Curbay de produits solubles de distillerie, 0,5% de chlorure de sodium, 0,1% de carbonate de calcium et 1,0% de farine de soya. La puissance finale du bouillon antibiotique est de 17,4 mm à l'état non dilué, et de 14,0, dilué trois foiso Le pH au moment de la récolte, est de 8,0.
On sépare l'antibiotique C 159 des bouillons de fermentation par
EMI4.11
filtration pour séparer le mycélium, réglage du pH du bouillon filtré'A 8,5 environ, et adsorption sur du silicate de magnésium de qualité chroma- tographique (par exemple 2,27 kg de Magnésol pour 453 litres de bouillon filtré). Après séparation des corps solides par filtration, on élue l'an- tibiotique du gâteau, par exemple, par un dixième de volume d'un mélange
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1:1 de méthanol et eauo On sépare ensuite l'antibiotique solide de l'élu- at, par exemple, par concentration par distillation dans le vide, suivie de lyophilisation ou de séchage par pulvérisation du concentré aqueux. On maintient le pH dans la gamme de 6,5 à 7,5 pendant cette concentration.
En variante, on effectue l'élution au moyen d'un mélange de 3 parties de n-butanol et une partie d'eau, en utilisant un dixième du volu- me du bouillon filtréo Après répétition de l'opération, on concentre les éluats réunis et on les sèche à fond par distillation dans le vide, en- maintenant le pH dans la gamme de 7 à 8, jusqu'à un dixième ou un vingtiè- me de leur volume originale Après filtration, on précipite l'antibiotique de sa solution concentrée, anhydre, limpide dans le butanol, par exemple, par addition de mélanges d'alcanes inférieurs tels que quatre ou cinq vo- lumes de Skellysolve Bo
On peut également appliquer l'extraction par solvanto On extrait par exemple, l'antibiotique du bouillon filtré au pH 2,5, 6,0 ou 9,
0 par du n-butanol mais pas par du chloroforme ni par de la méthylisobutyloéto- neo La gamme préférée de pH pour l'extraction, est d'environ 8,2 à 8,5 et on sépare l'antibiotique de l'extrait de butanol par concentration jus- qu'à ce qu'il cristallise ou par séchage azéotropique suivi de lyophilisa- tion, ou précipitation par addition de Skellysolve B.
On peut également séparer l'antibiotique C 159 par adsorption sur du charbon de bois activé (par exemple du Darco KB), à'partir de bouil- lon filtré, suivie d'élution par un mélange en parties égales de n-butanol et eau acidifiée au pH 390 par de l'acide chlorhydriqueo On sépare ensui- te les matières solides de l'éluat comme plus haut.
Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la limiter, et décrivent la séparation de l'antibiotique d'un bouillon de fermentation sous ses deux formes, brute et purifiée.
EXEMPLE VI.-
On filtre 570 gallons (2147 litres) de bouillon de fermentation obtenu suivant l'exemple III, en y mélangeant 2,4% d'un agent auxiliaire de filtration. On règle le pH du filtrat à 8,5 par addition d'hydroxyde de sodium à 50%, puis on remue pendant 30 minutes avec 5 livres (2,26 kg) de Magnésol par 100 gallons (379 litres) de filtrat. On recueille le gâteau de Magnésol et on l'élue par une solution de parties égales de méthanol et d'eau dont le volume est égal au dixième de celui du bouillon filtré. On concentre ensuite l'éluat par distillation dans le vide, pour obtenir 32 1 d'une solution aqueuse de l'antibiotique possédant une puissance de 19,7 mm à l'état non dilué, et 17,1 mm, dilué trois fois.
On lyophilise une portion de 1300 ml du concentré aqueux pour obtenir 26 g d'antibiotique C 159 ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 12,9 à l'état non dilué, et de 10,0, dilué trois fois.
On extrait une autre portion de 200 ml du concentré aqueux au pH 8,0, quatre fois par un quart de volume de n-butanol. On combine les ex- traits de butanol et on les concentre à un volume de 40 ml par distillation dans le video On ajoute vingt millilitres du concentré sec dans le butanol, à 80 ml de Skellysolve B, pour précipiter 170 mgm d'antibiotique C-159 so- lide, ayant une puissance à 1 mgm/ml de 1892 à 1 état non dilué et de 1799 mm, dilué trois fois. On distille dans le vide les autres 20 ml de concen- tré de butanol en y ajoutant de l'eau, pour obtenir 15 ml de concentré a- queux qu'on lyophilise ensuite pour obtenir 329 mgm d'antibiotique soli- de, ayant une puissance, à 1 mgm/ml de 170 mm à 1 état non dilué et de 1590 mm, dilué trois fois.
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EXEMPLE VII.-
On filtre 460 gallons (1741 litres) de bouillon de fermentation obtenu suivant l'exemple IV au pH de récolte de 7,1 environ, en y mélangeant 2,4% d'agent auxiliaire de filtration. On règle le pH du filtrat à 8,5 par addition d'hydroxyde de sodium à 50%. On remue ensuite le filtrat pendant environ 30 minutes avec du Magnésol, à raison de 2,26 kg pour 100 gallons (379 litres) de filtrat. On recueille le gâteau de Magnésol, et on l'élue en le remuant deux fois avec environ 40 gallons (151 litres) d'un mélange de trois parties de n-butanol avec une partie d'eau. On con- centre les éluats combinés par distillation dans le vide, à un volume d'en- viron 16 litres, ayant une puissance de 1790 mm, dilués dix fois.
Il se précipite également 185 g d'antibiotique solide, humide, ayant une puissan- ce à 1 mgm/ml, de 12,9 mm à l'état non dilué, et de 10,0 mm, dilué trois fois.
On concentre onze litres du concentré de butanol par distillation dans le vide jusqu'à un volume de 1350 ml, qu'on ajoute à quatre volumes de Skellysolve B pour précipiter l'antibiotique C-159 solide, ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 1999 mm à l'état non dilué et de 17,2 mm, dilué trois fois, et pesant 26 g après séchage.
On augmente la puissance de ces produits solides en formant un brouet dans le méthanol (2 ml/g), puis on sépare les solides non dissous par filtration et on ajoute quatre volumes d'éther diéthylique pour préci- piter l'antibiotique. La liqueur-mère méthanol-éther ne contient que des impuretés inaotiveso
EXEMPLE VIII.-
On prépare un échantillon pur d'antibiotique C=159 par réparti- tion à contre-courant dans six tubes en utilisant comme phase supérieure un mélange saturé d'eau d'une partie de n-butanol et 1,5 partie de méthyl- isobutylcétone, et comme phase inférieure, de l'eau tamponnée par une so- lution 0,02 molaire de phosphate au pH 6,0 et saturée à la fois de butanol et méthylisobutylcétoneo On avait déterminé d'avance que cette paire de systèmes de solvants, donne un rapport de répartition de 1.
On dissout un gramme d'antibiotique C=159 solide dans 100 ml de la phase aqueuse, et on l'introduit dans un tube séparateur contenant 100 ml de la phase supérieu- re de solvant. Après mélange et séparation, on transfère la phase inférieu- re dans un second tube, et on la mélange à de la phase supérieure fraîche.
On ajoute de la phase aqueuse fraîche à la phase supérieure de solvant res- tant dans le tube de départ. On poursuit cet écoulement à contre-courant de la manière usuelle jusqu'à ce que cinq transferts aient encore été ef- fectuéso
On combine les phases aqueuses provenant des tubes 2, 3 et 4, et on les extrait par du butanol. On ajoute ce butanol aux phases de sol- vants combinées provenant des mêmes tubes, on sèche le mélange par azéotro- pie et on le lyophilise pour obtenir 140 mgm d'antibiotique C-159 solide purifié, ayant une puissance, à 1 mgm/ml, de 23,0 mm à l'état non dilué, de 20,0 mm dilué trois fois, et de 17,5 mm dilué neuf fois.
L'antibiotique C=159 accuse dans l'eau, un maximum d'absorption ultraviolette à 345 microns (Et% =71) et un palier à 260 - 280 microns.
1cm Granulé dans du bromure de potassium, 1 antibiotique C-159 accuse des ban- des d'absorption caractéristiques dans la région infrarouge du spectre aux longueurs d'ondes suivantes, exprimées en microns g 2,90, 3,38, 5,85 (palier), 6,05 (palier marqué), 6,10, 6,55, 7,23, 7,50, 8,00 (bande large) et 9,40 (bande large)o
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L'antibiotique C-159 titre à l'analyse environ 58,7% de carbone, 7,4% d'hydrogène, 9,9% d'azote et, par différence, 2490% d'oxygène.
Par chromatographie sur papier suivant deux directions, après hydrolyse, par chauffage à 150 C en tube scellé en présence d'hydroxyde de baryum 0,38 N pendant 1,5 heure ou d'acide chlorhydrique à 20% pendant 5 heures, on trou- ve que l'antibiotique renferme les quatre acides aminés glycine, ce-alanine, thréonine, et acide aspartique, et aucun autre. L'amphomycine contient de l'histidine, de l'acide aspartique,de la glycine, de l'acide glutamique, de la proline, de la valine et un autre acide aminé, et ne contient ni Ó- alanine, ni thréonine.
L'antibiotique C-159 est insoluble dans l'acétone, l'éther et l'acétate de butyle; il est soluble dans le méthanol et est précipité de sa solution dans le méthanol par addition d'acétone ou d'éther.
L'antibiotique C-159 est très soluble dans une solution aqueuse légèrement alcaline, mais est considérablement moins soluble en solution aqueuse à réaction acide. C'est ainsi qu'en acidifiant graduellement une, solution de 1 g dans 20 ml d'eau ayant un pH initial de 8,8, quand on at- teint le pH 4,4, il se forme un précipité lourd et l'activité de la solu- tion est réduite à environ la moitié de sa valeur d'origine. Quand on at- teint le pH 3,7, l'activité de la solution n'est plus que d'environ un dixiè- me de l'activité initiale.
L'antibiotique C=159 est un acide, et se transforme en sel d'am- monium, d'ammonium substitué et en sels métalliques, tels que ceux de so- dium, potassium, calcium, magnésium, aluminium, etc... , par addition de la base appropriée, par exemple, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de so- dium, à une solution aqueuse de l'antibiotique. Si on le désire, on peut séparer les sels métalliques solides, par exemple par lyophilisation, REVENDICATIONS.
1.- Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, le C-159, caractérisé en ce que l'on cultive une souche de Streptomyces canus produc- trice de C-159, dont les propriétés sont décrites dans la description, dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif convenable jusqu'à ce qu'une activité antibiotique notable soit impartie au milieu, et on sépare l'antibiotique du bouillon de fermentation.
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The invention relates to a novel antibiotic, more particularly to methods of preparing, separating, and purifying the antibiotic or its salts.
In the present specification, the new antibiotic is referred to as C-159, no general name having yet been adopted, but C-159 is clearly identified in the detailed description given below.
Antibiotic C-159 and its salts are characterized in that they inhibit the growth of Gram-positive microorganisms, containing the amino acids glycine, alanine, threonine and aspartic acid, and none else; they are highly soluble in alkaline water, and highly insoluble in aqueous solutions with a pH below 4; they are soluble in methanol and insoluble in acetone, diethyl ether and butyl acetate; in the pure state, they contain substantially 58.7% carbon, 7.4% hydrogen, 9.9% nitrogen and 24.0% oxygen (determined by difference); dissolved in water, they show a maximum absorption in ultraviolet light at 345 millimicrons (E1% = 71) and a plateau between 260
1cm and 280;
granulated in potassium bromide, they exhibit characteristic absorption bands in the infrared region of the spectrum at the following wavelengths, expressed in microns g 2.90, 3.38, 5.85 (step) ,.
6.05 (marked plateau), 6.10, 6.55, 7.23, 79509 8.00 (broadband) and 9.40 (broadband); as well as metallic salts
The process for the preparation of the antibiotic C-f59 comprises culturing a strain of Streptomyces canus producing C-159 in an aqueous carbohydrate solution containing a nitrogenous nutrient, under aerobic submerged conditions, to submerged aerobic conditions. that a significant anti-bacterial activity is imparted to the solution; desired, then the antibiotic thus produced is separated from the fermentation broth.
For fermentation, the carbohydrate solution contains a carbon source such as a commercial sugar, certain other carbohydrates or glyceride oil, and also a nitrogen source such as an inorganic salt, for example, ammonium sulfate or sodium nitrate, or an organic substance, frequently in its raw state, such as maize maceration liquor, soluble distillery products, yeast, soy flour. The fermentation medium can also contain mineral salts, buffering agents such as calcium carbonate; these media are well known in the art of the preparation of antibiotics.
The organism producing the antibiotic of the present invention has been isolated from soil samples, and constitutes a new strain of Streptomyces canus.
Streptomyces canus samples (culture C-159) grow well at 28 = 30 ° C on asparagine-dextrose, Bennett's agars and oat-tomato flour. The vegetative mycelium, which grows on agar substrates, is colorless to Flax (linen color) o A gray aerial mycelium develops on the second or third day, and gives rise, in certain environments, to numerous coiled sporophores loosely. In some environments, pigments are formed with shades varying from yellow to yellowish green.
The carbohydrates mentioned below are easily assimilated when they are included in synthetic agar from Pridham and Gottlieb containing no other carbon source dextrin, starch, glycerin, arabinose, rhamnose, xylose, glucose, levulose, maltose, lactose, cellobio-
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se, galactose, mannitol, inositol, sorbitol, sodium acetate, sodium citrate, sodium succinate and calcium malate Sucrose, raffinose, inulin, dulcitol, sodium oxalate, sodium salicylate and sodium tartrate do not help growth.
A more detailed description of the growth of Streptomyces canus (culture C-159) in a number of media commonly used to study elements of the genus Streptomyces is given in Table I.
It indicates the type of growth, pigment production and other characteristics. The media were streaked and all cultures were incubated at 28 = 30 ° C for a period of 21 days. The names of colors which are written with a capital initial in this memo correspond to those described in the work by Maerz and Paul, A Dictionary of Color, 2nd edition, MacGraw-Hill, New York, 1950.
Streptomyces canus (culture C-159) gives an alkaline reaction to sunflower milk, without producing coagulation o Peptonization occurs slowly o Gelatin liquefies slowly, but no soluble pigment occurs. Blood agar is not hemolysis. Peptoneo iron agar blackening does not occur TABLE I.
Culture characteristics of Streptomyces canus (culture C-159)
EMI2.1
<tb> Believe = <SEP> Color <SEP> Pig-
<tb>
<tb> Milieux <SEP> Believe = <SEP> session <SEP> of the <SEP> myc- <SEP> ment <SEP> Remarks
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<tb>. <SEP> w.J. <SEP> J. <SEP> them <SEP> session <SEP> vegeta- <SEP> lium <SEP> air <SEP> soluble
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<tb> tative <SEP> and <SEP> of <SEP> soluble <SEP> spores
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<tb> Agar-dextrose <SEP> frank <SEP> colorless <SEP> white <SEP> none <SEP> Back <SEP> Flax
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<tb> asparagine <SEP> gray <SEP> (lin)
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<tb>
<tb> Agar <SEP> from <SEP> Bennett <SEP> good <SEP> Flax <SEP> (lin)
<SEP> gray <SEP> none <SEP> Back <SEP> yellow
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<tb> nâtre
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<tb> Agar <SEP> nutritive <SEP> frank <SEP> colorless <SEP> slightly <SEP> none <SEP> Back <SEP> inco-
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<tb> white <SEP> lore
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<tb> Agar <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> frank <SEP> Flax <SEP> (linen) <SEP> gray <SEP> frank <SEP> none <SEP> Back <SEP> gray
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<tb> thin
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<tb> Agar <SEP> of <SEP> malate <SEP> frank <SEP> Amber <SEP> Whi- = <SEP> white <SEP> to <SEP> light- <SEP> good <SEP> clear
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<tb> of <SEP> calcium <SEP> te <SEP> (white <SEP> gray <SEP> ment <SEP> yellow <SEP> of <SEP> agar
<tb>
<tb> amber) <SEP> natural
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<tb> Agar <SEP> of <SEP> flour <SEP> good <SEP> Flax <SEP> (linen) <SEP> gray <SEP> green <SEP> yellow- <SEP> Back <SEP> Bron-
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<tb> oats- = tomato <SEP> nâtre <SEP> ze-sheen <SEP> (é-
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<tb> shine <SEP> tanned)
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<tb> Buffer <SEP> of <SEP> pom = <SEP> good <SEP> Cream <SEP> Woodash <SEP> Mauve =
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<tb> me <SEP> from <SEP> earth <SEP> (cream) <SEP> (ash <SEP> taupe
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<tb> from <SEP> wood)
<tb>
<tb> to <SEP> gray
<tb>
The in vitro antibacterial spectrum of the C-159 antibiotic was measured by the tube dilution technique9 to determine the minimum concentrations of the antibiotic producing complete inhibition of bacterial growth for 24 hours. Heart infusion broth was used as a medium for all organisms tested, unless otherwise noted.
The results obtained are as follows g
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EMI3.1
<tb> Organism <SEP> Inhibitory <SEP> concentration
<tb>
<tb> minimum
<tb>
<tb>
<tb> mcg / ml
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> 125
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<tb>
<tb>
<tb> Microcossus <SEP> pyogenes <SEP> varo <SEP> aureus <SEP> 52 <SEP> = <SEP> 79 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb> (resistant <SEP> to <SEP> penicillin <SEP>)
<tb>
<tb>
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<tb> Gaffkya <SEP> tetragena <SEP> 125
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<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C203M <SEP> 500
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> 8
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<tb>
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<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> 12,
5
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<tb>
<tb>
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<tb> Lactobacillus <SEP> acidophilus <SEP> 250
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<tb>
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<tb> Aotobacillus <SEP> casei <SEP> @ <SEP> 500
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<tb> Bacillus <SEP> anthracis <SEP> 31
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<tb>
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> varo <SEP> mycoides <SEP> 250
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 3,
1
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<tb>
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> xerosis <SEP> 4
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 100
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Neisseria <SEP> spo <SEP> 500
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 500
<tb>
Heart infusion + 10% serum @ Tomato juice broth
C-159 is not lethal to a mouse injected intravenously at a rate of 750 mg / kg dissolved in water at a concentration of 2%;
a dose of 1000 mg / kg is lethal
C = 159 dissolved in an 8% ethanol solution successfully protects mice infected by intraperitoneal inoculation of a lethal dose of Diplococcus pneumoniae9 at a rate of 1.75 mg / Kg when treated intraperitoneally, and at a rate of 1395 mg / kg when they are treated intramuscularly at the time of infection. Treatment by oral route at a rate of 500 mg / kg does not act effectively on the experimental infection.
Of course, for the production of the antibiotic, the invention is not limited to this particular microorganism, but particularly includes the use of microorganisms consisting of isolated natural cultures variants or mutants produced by treating the organism described with mutating agents such as x-rays, ultraviolet radiation and nitrogen mustard gases.
The following examples illustrate the preparation of fermentation broths containing the antibiotic.
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EXAMPLE I.-
EMI4.1
Streptomyces canus (culture C509) is subjected to aerobic fermentation for 72 hours at 27 ° C., on a rotary shaker. 100 ml of medium are sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask for 30 minutes at
EMI4.2
1905 atm., Then inoculated with a vegetative growth of 42 hours at a rate of 2%. The aqueous medium contains 3% polysaccharide (Argo; dex-
EMI4.3
trine resynthesized), 1% corn maceration liquor, 0.5% K2HP04y 0.5% NaCl, 0.5% Nana3 and 1% soy flour The final potency of the antibiotic broth, measured by the biological test described above, is 20.2 mm, undiluted, and 18.5 mm, diluted three times.
EXAMPLE II.-
EMI4.4
A C509 culture of Stre tom these cannons was fermented in a 1000 gallon (3785 liter) fermentation apparatus, using the medium of Example I inoculated with 72 hour vegetative seed.
After 60 hours, the strength of the broth is 25 mm in the undiluted state, and 22 mm, diluted three times.
EXAMPLE III.-
EMI4.5
Streptomyoes oanus (culture C159) is subjected to fermentation without stirring and with aeration at a rate of 74 cubic feet (2095 liters)
EMI4.6
per minute at 2995 C for 120 hours, in 600 gallons (2270 liters) of medium containing 190, cerelose, 10% soy flour, 0.5% sodium chloride, 0.1% carbonate calcium and 0.05% of a Curbay filler
EMI4.7
BoGo of soluble distillery products The pH is 7.4 at the start of fermentation; it goes down to 6.0 then goes up to 8.4 to finish at 8.00 The final potency of the antibiotic broth is 14.7 mm, in the undiluted state, and 12.5 mm diluted three times.
EXAMPLE IV.-
Streptomyces canus (culture C 159) is fermented without agitation.
EMI4.8
tion and aeration of 74 cubic feet (2095 liters) per minute at 2ge5OC for 100 hours in 610 gallons (2309 liters) of medium containing 1.0% cerelose, 190, soybean meal, 0.5% chloride. sodium, 0.1% calcium carbonate and 0.05% of a Curbay BG feedstock of soluble distillery products. The pH is 7.1 at the start of fermentation, and gradually rises to around 799. The potency of the antibiotic broth after 70 hours, according to the bioassay described above, is 14.9 mm undiluted, and 12 mm, diluted three times.
EXAMPLE V.-
EMI4.9
Streptomyces canus (culture C 159) is fermented in an aerobic medium for 72 hours at 27 ° C. in a rotary shaker. 100 ml of medium are sterilized in a 500 ml Erlenmeyer flask for 30 minutes at 1.05 atmo and then inoculated with a vegetative growth of 32 hours.
EMI4.10
to 1a The aqueous medium contains 1.0% cerelose, 0.05% Curbay filler of soluble distillery products, 0.5% sodium chloride, 0.1% calcium carbonate and 1.0% flour soy. The final potency of the antibiotic broth is 17.4 mm in the undiluted state, and 14.0, diluted three times. The pH at the time of harvest is 8.0.
Antibiotic C 159 is separated from fermentation broths by
EMI4.11
filtration to separate the mycelium, adjustment of the pH of the filtered broth to about 8.5, and adsorption on chroma- graphically grade magnesium silicate (eg 2.27 kg of Magnesol per 453 liters of filtered broth). After separation of the solids by filtration, the antibiotic is eluted from the cake, for example, by a tenth volume of a mixture.
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1: 1 of methanol and water. The solid antibiotic is then separated from the elute, for example, by concentration by vacuum distillation, followed by lyophilization or spray-drying the aqueous concentrate. The pH is maintained in the range of 6.5-7.5 during this concentration.
Alternatively, the elution is carried out by means of a mixture of 3 parts of n-butanol and one part of water, using one tenth of the volume of the filtered broth. After repeating the operation, the eluates are concentrated. combined and dried thoroughly by vacuum distillation, maintaining the pH in the range of 7 to 8, to a tenth or twentieth of their original volume. After filtration, the antibiotic is precipitated from its concentrated, anhydrous, clear solution in butanol, for example, by addition of mixtures of lower alkanes such as four or five volumes of Skellysolve Bo
The solvent extraction can also be applied. For example, the antibiotic is extracted from the broth filtered at pH 2.5, 6.0 or 9,
0 with n-butanol but not with chloroform or methyl isobutyloetoone The preferred pH range for the extraction is about 8.2-8.5 and the antibiotic is separated from the extract. butanol by concentration until it crystallizes or by azeotropic drying followed by lyophilization, or precipitation by addition of Skellysolve B.
Antibiotic C 159 can also be separated by adsorption onto activated charcoal (eg Darco KB) from filtered broth, followed by elution with a mixture of equal parts of n-butanol and water. acidified to pH 390 with hydrochloric acid. The solids are then separated from the eluate as above.
The examples below illustrate the invention without limiting it, and describe the separation of the antibiotic from a fermentation broth in its two forms, crude and purified.
EXAMPLE VI.-
570 gallons (2147 liters) of fermentation broth obtained according to Example III are filtered by mixing 2.4% of an auxiliary filtering agent therein. The pH of the filtrate was adjusted to 8.5 by the addition of 50% sodium hydroxide, then stirred for 30 minutes with 5 pounds (2.26 kg) of Magnesol per 100 gallons (379 liters) of filtrate. The Magnesol cake is collected and eluted with a solution of equal parts of methanol and water, the volume of which is equal to one tenth of that of the filtered broth. The eluate is then concentrated by vacuum distillation to obtain 32 L of an aqueous solution of the antibiotic having a strength of 19.7 mm in the undiluted state, and 17.1 mm, diluted three times.
A 1300 ml portion of the aqueous concentrate was lyophilized to give 26 g of C 159 antibiotic having a potency, at 1 mg m / ml, of 12.9 undiluted and 10.0 three times diluted.
Another 200 ml portion of the aqueous concentrate at pH 8.0 was extracted four times with a quarter volume of n-butanol. The butanol extracts are combined and concentrated to a volume of 40 ml by distillation in the video Twenty milliliters of the dry concentrate in butanol, to 80 ml of Skellysolve B, are added to precipitate 170 mgm of antibiotic C- 159 solid, having a potency at 1 mgm / ml of 1892 in 1 undiluted state and 1799 mm, diluted three times. The remaining 20 ml of butanol concentrate was vacuum-distilled with the addition of water to give 15 ml of aqueous concentrate which was then lyophilized to obtain 329 mg of solid antibiotic having potency, at 1 mgm / ml of 170 mm in 1 undiluted state and of 1590 mm, diluted three times.
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EXAMPLE VII.-
460 gallons (1741 liters) of fermentation broth obtained according to Example IV at a harvest pH of about 7.1 are filtered, mixing 2.4% filter aid therein. The pH of the filtrate is adjusted to 8.5 by the addition of 50% sodium hydroxide. The filtrate is then stirred for about 30 minutes with Magnesol at the rate of 2.26 kg per 100 gallons (379 liters) of filtrate. The Magnesol cake was collected, and eluted by stirring it twice with about 40 gallons (151 liters) of a mixture of three parts n-butanol with one part water. The combined eluates are concentrated by vacuum distillation to a volume of about 16 liters, having a potency of 1790 mm, diluted tenfold.
It also precipitates 185 g of solid, wet antibiotic having a potency at 1 mgm / ml, 12.9 mm undiluted, and 10.0 mm, diluted three times.
Eleven liters of the butanol concentrate are concentrated by vacuum distillation to a volume of 1350 ml, which is added to four volumes of Skellysolve B to precipitate the solid C-159 antibiotic, having a potency, at 1 mg / m. ml, 1999 mm undiluted and 17.2 mm, diluted three times, and weighing 26 g after drying.
The potency of these solid products is increased by forming a broth in methanol (2 ml / g), then the undissolved solids are filtered off and four volumes of diethyl ether are added to precipitate the antibiotic. The methanol-ether mother liquor contains only inaotiveso impurities
EXAMPLE VIII.-
A pure sample of antibiotic C = 159 is prepared by countercurrent distribution in six tubes using as the upper phase a water-saturated mixture of one part n-butanol and 1.5 parts methyl isobutyl ketone. , and as the lower phase, water buffered with a 0.02 molar solution of phosphate at pH 6.0 and saturated with both butanol and methyl isobutyl ketone. It was previously determined that this pair of solvent systems, gives a distribution ratio of 1.
One gram of solid C = 159 antibiotic is dissolved in 100 ml of the aqueous phase, and placed in a separator tube containing 100 ml of the upper solvent phase. After mixing and separation, the lower phase is transferred to a second tube, and mixed with fresh upper phase.
Fresh aqueous phase is added to the upper solvent phase remaining in the starting tube. This flow is continued against the current in the usual manner until five more transfers have been made.
The aqueous phases from tubes 2, 3 and 4 are combined and extracted with butanol. This butanol was added to the combined solvent phases from the same tubes, the mixture was azeotropically dried and lyophilized to obtain 140 mgm of purified solid C-159 antibiotic, having potency, at 1 mgm / ml. , 23.0 mm undiluted, 20.0 mm diluted three times, and 17.5 mm diluted nine times.
The antibiotic C = 159 shows in water, a maximum of ultraviolet absorption at 345 microns (Et% = 71) and a plateau at 260 - 280 microns.
1cm Granulated in potassium bromide, 1 antibiotic C-159 shows characteristic absorption bands in the infrared region of the spectrum at the following wavelengths, expressed in microns g 2.90, 3.38, 5.85 (step), 6.05 (marked step), 6.10, 6.55, 7.23, 7.50, 8.00 (wideband) and 9.40 (wideband) o
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Antibiotic C-159 assays approximately 58.7% carbon, 7.4% hydrogen, 9.9% nitrogen and, by difference, 2490% oxygen.
By chromatography on paper in two directions, after hydrolysis, by heating at 150 ° C. in a sealed tube in the presence of 0.38 N barium hydroxide for 1.5 hours or 20% hydrochloric acid for 5 hours, it is found. Ve that the antibiotic contains the four amino acids glycine, ce-alanine, threonine, and aspartic acid, and none other. Amphomycin contains histidine, aspartic acid, glycine, glutamic acid, proline, valine and another amino acid, and does not contain Ó-alanine or threonine.
Antibiotic C-159 is insoluble in acetone, ether and butyl acetate; it is soluble in methanol and is precipitated from its solution in methanol by adding acetone or ether.
Antibiotic C-159 is very soluble in a slightly alkaline aqueous solution, but is considerably less soluble in an aqueous solution with an acid reaction. Thus, by gradually acidifying a solution of 1 g in 20 ml of water having an initial pH of 8.8, when pH 4.4 is reached, a heavy precipitate is formed and activity of the solution is reduced to about half of its original value. When pH 3.7 is reached, the activity of the solution is only about one tenth of the initial activity.
Antibiotic C = 159 is an acid, and turns into ammonium salt, substituted ammonium salt and metal salts, such as sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum, etc. , by adding the appropriate base, for example, calcium hydroxide, sodium hydroxide, to an aqueous solution of the antibiotic. If desired, the solid metal salts can be separated, for example by lyophilization.
1.- Process for the preparation of a novel antibiotic, C-159, characterized in that a strain of Streptomyces canus producing C-159, the properties of which are described in the description, is cultivated under conditions aerobic in a suitable nutrient medium until significant antibiotic activity is imparted to the medium, and the antibiotic is separated from the fermentation broth.