: ABBOTT LABORATORIES
La présente invention concerne de nouvelles substances douées de propriétés antibactériennes, à savoir la Fortimicine D et la Fortimicine KE. L'invention concerne également la production de Fortimicine D et/ou de Fortimicine KE par culture d'un micro-organisme appartenant au genre Micromonospora, qui est capable de produire l'une ou les deux substances actives dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle l'activité antibactérienne dans le bouillon de culture et à isoler ensuite au moins une
des substances actives du bouillon de culture.
Les antibiotiques qui présentent une artivité contre un large spectre de bactéries sont toujours recherchés. Dans ce but, on a trouvé que, lorsque l'on cultive certaines souches de Micromonospora dans
un milieu nutritif, plusieurs substances antibiotiques sont produites dans
le bouillon de culture. En particulier, on a isolé les facteurs A, B et C
de la Fortimicine dans le bouillon de culture de Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819) ou FERM-P n[deg.] 1560), ces facteurs répondant aux formules suivantes :
<EMI ID=1.1>
Les propriétés chimiques, physiques et biologiques
de ces antibiotiques et leur procédé de production sont décrits en détail dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3 931 400, 3 976 768 et
4 048 015.
La demanderesse a découvert selon l'invention que, lorsque l'on cultive Micromonospora olivoasterospora MK-70, ce microorganisme libère deux autres substances actives en plus des Fortimicines A, B et C. Une étude des propriétés chimiques physiques et biologiques de ces substances actives indique que ce sont de nouveaux antibiotiques qui ont été dénommés Fortimicine D et F ortimicine KE.
Selon l'invention, on produit les nouveaux antibiotiques,
<EMI ID=2.1>
organisme appartenant au genre Micromonospora qui est capable de produire l'un ou les deux facteurs dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle dans le bouillon de culture une activité antibactérienne notable. Lorsque la culture est terminée, on isole du bouillon de culture les fractions actives contenant la Fortimicine D ou la Fortimicine KE par
des moyens connus tels que le traitement par une résine échangeuse d'ions.
Les Fortimicines D et KE présentent une large activité antibactérienne et sont donc utiles notamment pour nettoyer et stériliser
la verrerie de laboratoire et les instruments chirurgicaux et on peut, également utiliser en combinaison avec des savons des détergents et des solutions de lavage à des fins de désinfection.
L'invention concerne également les sels d'addition d'acides non toxiques de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE acceptables en pharmacologie, comprenant les sels d'addition d'acides inorganiques
telc que chlorhydrates, bromhydrates, iodhydrates, sulfates, sulfamates etphosphates et les sels d'addition d'acides organiques tels que maléates, acétates, citrates,oxalates, succinates, benzoates, tartrates, fumarates, malates, mandélates, ascorbates, etc.
Les propriétés physicochimique de la Fortimicine D base libre selon l'invention sont les suivantes :
1) Poudre blanche basique.
2) Analyse élémentaire, valeurs trouvées :
C 44,15%, H 8,77%, N 15,86%,
<EMI ID=3.1> 4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet :
le spectre d'absorption UV d'une solution aqueuse de la substance ne présente pas de maximum d'absorption caractéristique entre 220 et
360 nm, mais présente seulement une absorption terminale.
<EMI ID=4.1>
6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge :
le spectre d'absorption IR mesuré sur une pastille de KBr est illustré à la figure 1 annexée. La Fortimicine D base libre présente des maximum d'absorptions auxnombres d'ondes suivants : 3400, 2900, 1625, 1570, 1470,
<EMI ID=5.1>
7) Réactions colorées :
Réaction à la ninhydrine : positive
Réaction au permanganate de potassium : positive
Réaction d'Elson-Morgan : négative
Réaction au biur�t : négative
8) Le spectre de RMN de la Fortimicine D,mesuré en solution dans l'eau
<EMI ID=6.1>
par la figure 2 annexée.
9) Le spectre de RMN (carbone) de la substance,mesuré en solution dans l'oxyde
de deutérium (pD = 11,1) en utilisant un spectromètre JEOL PFT-100A,
est illustré à la figure 3 ci-annexée.
10) Le spectre de masse de la substance révèle l'ion moléculaire M + 1 et
les ions fragmentaires suivants. La formule entre parenthèses signifie la formule de composition obtenue par spectrométrie de masse à
haute résolution.
<EMI ID=7.1>
A-partir du résultat de la spectrométrie de masse, on détermine que le poids moléculaire de la substance est de 391 et la formule moléculaire est C16H33N506' Les valeurs de l'analyse élémentaire de la substance
(avec 2,5 mêles d'eau d'hydratation) calculéesd'après la formule molé-
<EMI ID=8.1>
11) D'après les données physicophimiques précédentes, on considère que la
formule développée de la Fortimicine D est la suivante :
<EMI ID=9.1>
12) La Fortimicine D base libre est facilement soluble dans l'eau, soluble
dans le méthanol et légèrement soluble dans l'éthanol et l'acétone, mais insoluble dans les solvants organiques tels que chloroforme, benzène, acétate d'éthyle, acétate de butyle, éther, butanol, éther de pétrole, n-hexane, etc.
Les propriétés physicochimiques de la Fortimicine KE base libre selon l'invention sont les suivantes :
1) Poudre blanche basique.
2) Analyse élémentaire, valeurs trouvées :
C 48,18%, H 9,29%, N 15,847..
3) F. 72,77[deg.]C.
4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet :
le spectre d'absorption UV d'une solution aqueuse de la substance ne présente pas de maximum d'absorption caractéristique entre 220 et 360 nm mais seulement une absorption terminale.
<EMI ID=10.1>
6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge :
le spectre d'absorption IR mesuré sur une pastille de KBr est illustré à la figure 4 ci-annexée. La Fortimicine KE base libre présente des maximums d'absorption aux nombres d'ondes suivants : 3350, 2920, 1580,
<EMI ID=11.1>
7) Réactions colorées :
Réaction à là ninhydrine : positive
Réaction au permanganate de potassium : positive
Réaction d'Alson-Morgan : négative
Réaction au biuret : négative.
8) Le spectre de RMN (H) de la Fortimicine KE mesuré en solution en solution dans l'oxyde de deutérium (pD Il,1) en utilisant un spectromètre JEOL JNM-PS-100 est illustré à la figure 5 ci-annexée.
9) Le spectre de RMN (carbone) de la substance mesuré en solution dans
l'oxyde de deutérium (pD = 11,0) en utilisant un spectromètre JEOL PFT-100A est illustré à la figure 6 ci-annexée.
10) Le spectre de masse de la substance révèle l'ion moléculaire M + 1 et
les ions fragmentaires suivants. Les formules entre parenthèses signifient les formules de composition obtenues par spectrométrie de masse à haute résolution.
<EMI ID=12.1>
129 (C6H12N20)
D'après le résultat de la spectrométrie de masse, on détermine que le poids moléculaire de la substance est de 334 et la formule moléculaire
<EMI ID=13.1>
Les valeurs d'analyse élémentaire de la substance (avec 1 mole d'eau d'hydratation) calculées à partir de la formule moléculaire sont :
C 47,71%; H 9,15% et N 15,89%.
11) D'après les données physicochimiques précédentes, on considère que la
formule développée de la Fortimicine KE est la suivante :
<EMI ID=14.1>
12) La Fortimicine KE base libre est facilement soluble dans l'eau, soluble
dans le méthanol et légèrement soluble dans l'éthanol et l'acétone, mais insoluble dans les solvants organiques, tels que chloroforme, benzène, acétate d'éthyle, acétate de butyle, éther, butanol, éther
de pétrole, n-hexane, etc.
Les valeurs de Rf de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE dans la chromatographie sur papier et la chromatographie sur couche mince utilisant divers révélateurs sont indiquées dans les tableaux 1 à III ci-après. A titre comparatif, on indique également les valeurs de
Rf d'antibiotiques semblées aux Fortimicines D et KE.
Le tableau IV ci-après illustre les spectres antibactériens des Fortimicines D et KE contre divers micro-organismes.
Comme il ressort du tableau IV, la Eortimicine D
a une forte activité antibactérienne contre une large gamme de bactéries gram positives et gram négatives. En particulier, il est caractéristique que l'antibiotique est efficace contre certaines souches d'Escherichia coli qui sont résistantes à la kanamycine, à la gentamicine et à la tobramycine. En outre, on s'attend que-la Fortimicine D est un effet thérapeutique sur diverses infections chez l'homme et chez les animaux induite par des diverses bactéries mentionnées au tableau IV. A ce sujet,
<EMI ID=15.1>
dd pesant 20 + 1 g est de 159 mg/kg. Avec ces propriétés antibactériennes, la Fortimicine D est applicable à des fins médicales. Comme il ressort également de ce qui précède et du tableau IV, la Fortimicine KE présente un large spectre antibactérien.
Une comparaison des facteurs D et KE de la Fortimicine avec des antibiotiques connus illustre encore leur nouveauté. Parmi les antibiotiques basiques solubles dans l'eau produits par des microorganiques du genre Micromonospora et ayant un large spectre antibactérien, on connaît le complexe de gentamicine (M.J. Weinstein et col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, page 1; D.J. Cooper et col. J. Infect. Dis.
119. 342, 1969; et J.A. Waitz et col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy
<EMI ID=16.1>
n[deg.] 46-16153), la sisomicine (M. J. Wesinstein et col. : J. Antibiotica,
23, pages 551, 555, 559, 1970) le XK-62-2 (brevet des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=17.1>
graphie sur papier, la valeur de Rf de la Fortimicine D est de 0,18 et celle de la Fortimicine KE est de 0,59. La Fortimicine D est donc nettement différente des composants de la gentamicine et la Fortimicine KE est
<EMI ID=18.1>
se distinguer l'une de l'autre par chromatographie sur papier. Cependant, dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice du tableau II utilisant le révélateur II, la Fortimicine D (Rf : 0,37) se distingue nettement de la gentamicine Cla (Rf : 0,16). De manière semblable, dans le
<EMI ID=19.1>
tandis que la Fortimicine KE présente un Rf de 0,58. Si l'on compare
les facteurs D et KE de la Fortimicine avec l'antibiotique n[deg.] 460, la sisomicine, le XK-62-2, la Fortimicine B, la Fortimicine A et la Fortimicine C, comme il ressort du tableau III, l'antibiotique n[deg.] 460, la sisomicine,
le XK-62-2, la Fortimicine B, la Fortimicine A et la Fortimicine C présentent des Rf de 0,01, 0,18, 0,49, 0,65, 0,37 et 0,18, respectivement. Le Rf de
la Fortimicine D est de 0,18 et celui de la Fortimicine KE est de 0,59.
La Fortimicine KE est donc nettement différente. Bien que le Rf de la Fortimicine D soit le même (dans le tableau III) que ceux de la sisomicine et la Fortimicine C, dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice du tableau II, en utilisant le révélateur II, la Fortimicine C
(Rf : 0,40) et la sisomicine (Rf : 0,18) se distinguent nettement de la Fortimicine D (Rf : 0,37).
De plus, comme antibiotiques basiques solubles dans l'eau, produits par les actinomycetes autres que ceux du genre Micromonospora, et présentant un large spectre antibactérien, on peut citer la streptomycine A et la streptomycine B, la ribostamycine, les lividomycines A, B et D, la spectinomycine, la kasugamicine, les néomycines A, B et C, les kanamycines A, B et C, les complexes de nébramycine, les facteurs 4 et 5 de nébramycine et la paromomycine. Les facteurs D et KE de la Fortimicine se sont révélés être grandement différents de l'un quelconque de ces antibiotiques, en ce
qui concerne les propriétés physico-chimiques. De plus, d'après le tableau III ci-après, on voit que les facteurs D et KE de la Fortimicine sont tout
à fait différents de ces antibiotiques en ce qui concerne les Rf lors
d'une chromatographie sur papier.
D'après ce qui précède, on voit que les facteurs D et
KE de la Fortimicine sont de nouveaux antibiotiques.
Les facteurs D et KE de la Fortimicine sont produits
par fermentation d'un micro-organisme du genre Micromonospora. Toute souche appartenant au genre Micromonospora et capable de former la Fortimicine D et/ou la Fortimicine KE dans la liqueur de culture peut être utilisée. Des exemples de souches préférées sont les suivants : Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P n[deg.] 1560); (ATCC 21819), Micromonospora olivoasterospora
<EMI ID=20.1>
(FERM-P n[deg.] 2193);(ATCC 31009). Ces souches ont été déposées à la culture "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, et à l'agence "Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology",Tokyo, Japon, et ont reçu les numéros indiqués ci-dessus.
Les propriétés microbiologiques de ces souches sont décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.931.400.
Comme cela est le cas avec d'autres souches d'Actinomycetes, les micro-organismes utiles pour mettre en oeuvre l'invention peuvent subir des mutations artificielles par des agents, tels que les ultraviolets, les rayons X, et différents agents chimiques, de manière connue, ces mutations favorisant la production de produits du métabolisme;
un exemple est le Micromonospora olivoasterospora CS-26 (FERM-P 3567, NRLL
8178). Ce dernier mutant a été déposé aux Etats-Unis au Département de l'Agriculture, à Peoria, Illinois, et se trouve à la disposition du public.
De manière générale, les techniques classiques de culture d'Actinomycetes peuvent être utilisées selon l'invention. Ainsi, on peut utiliser pour le milieu de culture diverses sources nutritives. Parmi les sources appropriées de carbone, on citera : glucose, amidon, mannose, fructose, saccharose, mélasses, etc., soit seules, soit en association. On peut également utiliser des hydrocarbures, des alcools, des acides organiques, etc., en fonction des caractéristiques d'assimilation des microorganismes considérés.
Comme sources minérales et organiques d'azote, on citera le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, seules ou en combinaison, ou des sources naturelles d'azote comme les peptones, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure séchée, la liqueur de macération du mais, la poudre de soja, les hydrolysats acides de caséine, les protéines végétales solubles, etc. Si cela est nécessaire, on peut ajouter au milieu des sels minéraux comme le chlorure de sodium, chlorure de potassium, carbonate de calcium, des phosphates, etc. De plus, on peut encore ajouter des substances organiques ou minérales favorisant la croissance des souches particulières et
la production des facteurs D-et/ou KE de la Fortimicine.
Une technique de culture liquide, en particulier une technique de culture submergée sous agitation, est préférable. La température de culture est de préférence de 25 à 40[deg.]C, et la culture est effectuée de préférence au voisinage du pH neutre. Habituellement, après 2 à 15 jours
de culture en milieu liquide, la Fortimicine D et la Fortimicine KE son_ formées et se sont accumulées dans la liqueur de culture. Lorsque le rendement en ces antibiotiques dans la liqueur de culture atteint la valeur maximale, on stoppe la culture et on isole et purifie le produit souhaité
à partir de la liqueur de culture, après que les cellules microbiennes ont été éliminées, par exemple par filtration.
La récupération et la purification de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE sont effectuées par des techniques connues, utilisées pour isoler et purifier les produits du métabolisme microbien partir d'une liqueur de culture.
Etant donné que les antibiotiques Fortimicine D et Fortimicine KE sont des substances basiques facilement solubles dans l'eau-, mais peu solubles dans les solvants organiques ordinaires, les antibiotiques peuvent être purifiés par les techniques habituellement utilisées pour purifier les antibiotiques basiques solubles dans l'eau. Plus particulièrement, les facteurs D et KE peuvent être purifiés par une association convenable d'étapes d'absorption et de désorption dans des résines échan-geuses de cations, par chromatographie sur colonne de cellulose, par adsorption-désorption sur une colonne de Sephadex LH-20, par chromatographie sur colonne de gel de silice, etc.
Par exemple, une technique convenable de purification de la Fortimicine D à partir de la liqueur de culture, lorsque l'on utilise une souche capable de produire le complexe de Fortimicine, c'est-à-dire un mélange contenant les Fortimicines A, B, C, D et KE, et des sous-produits présentant une activité antibactérienne, est la suivante. Le filtrat de culture ne contenant plus de cellules est réglé à pH 7,5 puis versé sur une résine échangeuse de cations comme la résine Amberlite IRC-50
(forme NH4 ) (Rohm & Haas Co., E.U.A.).Après lavage de la résine par l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,5N. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est ensuite
<EMI ID=21.1>
(The Dow Chemical Co., E.U.A.). Les fractions actives obtenues par l'élution sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. On obtient une poudre brute de complexe de Fortimicine. La poudre brute est dissoute dans de
l'eau et la solution est ensuite réglée à pH 5,0 par de l'acide sulfurique 2N. On fait ensuite passer sur une colonne chargée de charbon actif pour adsorber les principes actifs. La colonne de charbon actif est ensuite
lavée par de l'eau pour éliminer les impuretés. On effectue ensuite l'élution par l'acide sulfurique 0,2N pour éluer les principes actifs. Les fractions actives sont rassemblées et, après neutralisation par une résine échangeuse d'anions comme la résine Dowex 44 (forme OH ) (The Dow Chemical Co., E.U.A.), sont lyophilisées. On obtient ainsi la base libre du complexe de Fortimicine.
La poudre brute du complexe de Fortimicine obtenue ci-dessus est soumise à une chromatographie sur colonne de gel de silice
en utilisant comme solvant d'élution un solvant mixte d'isopropanol, de chloroforme et d'ammoniaque dans le rapport 4:2:1 en volume. La poudre
brute est mise en suspension dans le solvant complexe et est introduite
dans la colonne. On effectue l'élution par le même solvant à raison d'environ 30 ml/h. On élue tout d'abord la Fortimicine B et, après élution de plusieurs traces de divers composants, la Fortimicine A est éluée dans
des fractions actives importantes. On continue ensuite l'élution et, après élution de la Fortimicine C, on élue la Fortimicine D dans les fractions actives importantes suivantes. Les fractions actives contenant la Fortimimicine D sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est lyophilisé et l'on obtient la base libre de Fortimicine D (produit blanc). De cette manière, on peut obtenir un échantillon de Fortimicine D considérablement purifié, par chromatographie sur une colonne de gel de silice. Cependant, quelquefois, quelques impuretés sont présentes dans l'échantillon. Dans ce cas, on soumet encore l'échantillon à une chromatographie sur colonne de cellulose. Comme éluant, on utilise un solvant mixte de n-butanol, pyridine, acide acétique et eau(dans le rapport 6:4:2:4 en volume).
Les fractions actives obtenues par élution sont rassemblées et concentrées sous pression réduite et l'on obtient une préparation purifiée de Fortimicine D. Pour éliminer les impuretés présentant une réaction positive à la ninhydrine, on peut également effectuer une chromatographie sur colonne de carboxyméthylcellulose. Plus particulièrement, dans ce cas, on fait passer une solution de la poudre brute dans une colonne chargée de
<EMI ID=22.1>
sur la carboxyméthylcellulose. On lave ensuite soigneusement la colonne par de l'eau pour éluer la majeure partie des pigments et des sels inorganiques. Ensuite, on effectue l'élution par du bicarbonate d'ammonium 0,2N pour éluer les principes actifs. Les fractions contenant la Fortimicine D sont rassemblées et lyophilisées et l'on obtient la Fortimicine D purifiée.
Durant les techniques de purification précisées cidessus, les fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince de gel de silice. Comme solvant de développement, on utilise un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée dans le rapport 2:1:1 en volume, et le développement est effectué à la température ambiante, durant 2 h. La Fortimicine D présente une valeur Rf d'environ 0,43 sur le chromatogramme sur couche mince de gel de silice.
Dans le cas de la Fortimicine KE, la poudre brute obtenue par lyophilisation est dissoute dans l'eau. On règle le pH à 7,5 par de l'acide sulfurique 2N, on fait passer la solution dans une colonne chargée d'une résine échangeuse de cations, la résine Amberlite CG-50 du
<EMI ID=23.1>
pour adsorber la complexe de Fortimicine. La colonne est ensuite lavée par de l'eau. On effectue ensuite une élution par de l'ammoniaque 0,2N. Après élution de plusieurs traces de divers composants, on élue un mélange de Fortimicine B et de Fortimicine KE dans les fractions actives importantes. Ensuite, après élution de plusieurs traces de divers composants, on élue la Fortimicine D et la Fortimicine A. Les fractions actives contenant la Fortimicine KE et la Fortimicine B sont rassemblées et séchées et l'on obtient une poudre des bases libres de Fortimicine KE et Fortimicine B. Ensuite, cette poudre est soumise à une chromatographie sur colonne de gel
de silice utilisant un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée dans le rapport 4:2:1 en volume, comme éluant. La poudre mentionnée ci-dessus est mise en suspension dans le solvant mixte et on introduit cette suspension sur la colonne de gel de silice. On effectue le développement à l'aide du même solvant à raison d'environ 30 ml/h. La Fortimicine B est
éluée la première dans les fractions actives. On élue ensuite la Fortimicine KE. Les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est dissous dans une petite quantité d'eau et lyophilisé. On obtient ainsi la base libre de la Fortimicine KE. Ainsi, on peut obtenir un échantillon considérablement purifié de Fortimicine KE, par chromatographie sur colonne de gel de silice. Cependant, quelquefois, quelques impuretés sont présentes dans l'échantillon.
Durant les techniques ci-dessus de purification, les fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince de gel de silice. On utilise pour le développement un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée, dans le rapport 2:1:1 en volume. Le développement est effectué à la température ambiante durant 2 h. La Fortimicine KE présente une valeur Rf d'environ 0,58, sur le chromatogramme.
La Fortimicine KE peut également être obtenue par chauffage de la Fortimicine D dans une solution aqueuse alcaline comme une solution d'hydroxyde de sodium ou de baryum. Plus particulièrement, on chauffe la Fortimicine D dans une solution aqueuse d'hydroxyde de baryum saturée, à 100[deg.]C, durant 3 h. On neutralise ensuite la solution réactionnelle par la carboglace et on filtre le précipité résultant de carbonate de
baryum. Le filtrat est concentré et on le fait passer sur une colonne
chargée de résine Amberlite CG-50 (forme NH4+). Après lavage de la colonne par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. Tout d'abord, on élue une petite quantité des sous-produits de réaction, puis la Fortimicine KE. Les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est ensuite lyophilisé
et l'on obtient la base libre de la Fortimicine KE.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
<EMI ID=24.1>
On utilise comme souche d'ensemencement la souche Micromonospora olivoasterospora CS-26 (NRLL 8178); (FERM-P n[deg.] 3567). La souche d'ensemencement est une souche mutante dérivée de la souche Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819); (FERM-P n[deg.] 1560) par traitement à la nitrosoguanidine, par irradiation UV et par irradiation aux rayons y. On utilise comme premier milieu d'ensemencement un milieu contenant 2 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure et 0,1 g/dl
de carbonate de calcium (pH 7,5 avant stérilisation). Des fractions de 10 ml du premier milieu d'ensemencement, dans des tubes à essai de 50 ml, sont inoculées par des boucles de platine de la souche d'ensemencement, et on effectue la culture à 30[deg.]C, durant 5 jours. Ensuite, 10 ml de la première culture d'ensemencement ainsi préparée sont inoculés dans des fractions de
30 ml d'un second milieu d'ensemencement, dans des Erlenmeyer de 250 ml.
Le second milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La seconde culture est effectuée sous agitation à 30[deg.]C, durant
2 jours, puis on inocule 30 ml de la seconde culture d'ensemencement dans des fractions de 300 ml d'un troisième milieu d'ensemencement, dans des Erlenmeyer de 2 litres,munis de cloisons de séparation. Le troisième milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La troisième culture d'ensemencement est effectuée sous agitation à 30[deg.]C, durant 2 jours. Ensuite, 1,5 litre de la troisième culture d'ensemencement (correspondant
à cinq flacons) est inoculé dans 15 litres d'un quatrième milieu d'ensemencement, dans un fermenteur de 30 litres en acier inoxydable. Le quatrième milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La quatrième culture d'ensemencement, dans le fermenteur, est effectuée sous aération et agitation (350 tr/mn; aération : 15 1/mn) à 37[deg.]C, durant 2 jours. On inocule ensuite 15 litres de la quatrième culture d'ensemencement dans
150 litres d'un milieu de fermentation, dans un fermenteur de 300 litres.
Le milieu de fermentation présente la composition suivante :
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
La fermentation est effectuée sous aération et agitation (150 tr/mn; aération : 80 1/mn) à 37[deg.]C, durant 4 jours.
<EMI ID=27.1>
Après achèvement de la fermentation, la liqueur de culture est réglée à pH 2,5 par de l'acide sulfurique concentré et est agitée,durant 30 mn. Ensuite, on ajoute environ 7 kg d'un adjuvant de filtration "Radiolite n[deg.] 600",commercialisé par la Société Showa Kagaku. Kogyo Co., Ltd., à la liqueur de culture, et les cellules microbiennes sont éliminées par filtration. Le filtrat est réglé à pH 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium 6N, puis passe sur une colonne chargée par environ
20 litres d'une résine échangeuse de cations, Amberlite IRC-50, sous la
<EMI ID=28.1>
est jeté. Après lavage de la résine par de l'eau, on effectue l'élution
des principes actifs par de l'ammoniaque 0,5N. On détermine l'activité de l'éluat par la technique du disque de papier, en utilisant une plaque de gélose de Bacillus subtilis n[deg.] 10707. Les fractions présentant une activité sont rassemblées et concentrées sous pression réduite jusqu'à environ 1 litre. Le concentrat passe ensuite dans une colonne chargée de 500 ml d'une résine
<EMI ID=29.1>
colonne environ 2 litres d'eau. Ainsi, on élimine les impuretés et les principes actifs sont élués par l'eau. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite, à environ 100 ml. Le concentrat traverse une colonne chargée d'environ 50 ml de poudre de charbon actif, ce qui permet d'adsorber les principes actifs. La colonne est lavée par
de l'eau et l'effluent et les eaux de lavage sont jetés. On effectue l'élution par l'acide sulfurique 0,2N. On détermine l'activité de l'éluat par la technique du disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis
n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et traversent une colonne de résine Dowex 44(sous la forme OR-),et l'élution des principes actifs est effectuée par de l'eau. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées à environ 50 ml. Le concentrat est lyophilisé et l'on obtient une poudre brute de complexe de Fortimicine. Le rendement en la poudre brute est d'environ 35 g et l'activité est de 580 unités/mg (l'activité de 1 mg de la préparation pure correspond à 1.000 unités).
<EMI ID=30.1>
Environ 500 ml de gel de silice sont mis en suspension dans un solvant contenant de l'isopropanol, du chloroforme et de l'ammoniaque concentrée (4:2:1 en volume) et on en charge une colonne de verre sous forme d'une couche serrée et uniforme. Ensuite, on lave soigneusement la colonne
par le même solvant. 10 g de poudre brute obtenue dans l'étape B sont ensuite placés sur le gel de silice, pour former une couche mince uniforme. Ensuite,
on verse progressivement le même solvant dans la colonne, à partir de la tête
de la colonne, et on effectue ensuite l'élution, de manière continue, à
raison d'environ 50 ml/h. L'éluat est fractionné en portions de 20 ml, et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707.
On élue tout d'abord la Fortimicine B puis la Fortimicine A. On poursuit ensuite l'élution et, après élution de la Fortimicine C, on élue la Fortimicine D. Les fractions actives sont soumises à une chromatographie en
couche mince et les fractions contenant la Fortimicine D sont rassemblées
et concentrées sous pression réduite pour éliminer suffisamment le solvant.
Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et la solution est lyophilisée. On obtient environ 1,5 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine D. Le produit présente une activité d'environ 980 unités/mg.
<EMI ID=31.1>
par de l'acide sulfurique concentré et on fait passer la solution sur une colonne chargée par 1 litre de résine échangeuse de cations, Amberlite CG-50 (sous la forme NH, ). L'effluent est jeté. La substance active est adsorbée sur la résine. Après lavage de la résine par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 50 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier et par une chromatographie sur couche mince.
Tout d'abord, on élue plusieurs traces de divers
<EMI ID=32.1>
la Fortimicine B. Les fractions sont rassemblées et concentrées à 20 ml. Le concentrât est lyophilisé et l'on obtient 8 g d'une poudre brute.
Environ 500 ml de gel de silice, en suspension dans
un solvant contenant de l'isopropanol, du chloroforme et de l'ammoniaque concentrée (4:2:1 en volume), sont introduits dans une colonne de verre sous forme d'une couche serrée et uniforme. Ensuite, on lave soigneusement la colonne par le même solvant. La poudre brute obtenue ci-dessus est ensuite chargée sur le gel de silice, en une couche mince uniforme, et on verse progressivement le même solvant dans la colonne à partir de la tête de la colonne. On effectue ensuite une élution continue à raison d'environ
50 ml/h. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 20 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier, en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707. On élue tout d'abord la Fortimicine B puis la Fortimicine KE.
Les fractions actives sont soumises à une chromatographie en couche mince et les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour éliminer le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et la solution est lyophilisée. On obtient environ 2 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE. Le produit présente une activité d'environ 970 unités/mg.
EXEMPLE 2
<EMI ID=33.1>
ci-dessus est utilisée comme souche d'ensemencement et les milieux d'ensemencement (milieux 1 à 4) utilisés dans l'exemple 1 sont encore utilisés dans cet exemple. Le milieu de fermentation utilisé présente la composition suivante :
<EMI ID=34.1>
La fermentation est effectuée comme dans l'étape A
de l'exemple 1 et on isole une poudre brute de complexe de Fortimicine comme décrit dans l'étape B de l'exemple 1. On obtient environ 71 g de poudre brute de complexe de Fortimicine présentant une activité d'environ
670 unités/mg. On soumet ensuite 50 g de la poudre brute à une purification selon l'étape C de l'exemple 1. On obtient environ 15 g de Fortimicine D présentant une activité d'environ 840 unités/mg.
Pour effectuer une purification supplémentaire, la préparation est soumise à une chromatographie sur colonne de cellulose. Environ 500 ml d'une poudre de cellulose (AVICEL,de la Société Funakoshi Seiyaku, K.K.) sont mis en suspension dans un solvant mixte de n-butanol, acide acétique, pyridine et eau (6:2:4:4 en volume) et on charge une colonne de verre pour obtenir une couche uniforme serrée. La colonne est ensuite soigneusement lavée par le même solvant. La préparation est introduite sur la poudre de cellulose en une couche mince uniforme. Ensuite, on verse progressivement le même solvant dans la colonne, en partant de la tête de
la colonne, et on effectue ensuite une élution continue à raison d'environ
1 ml/mn. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 10 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique
au disque de papier en utilisant le Bacillus Subtilis n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite de manière à éliminer suffisamment le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et est lyophilisé. De cette manière, on obtient environ 8 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine D présentant
une activité de 970 unités/mg.
EXEMPLE 3
<EMI ID=35.1>
l'exemple 2, pour obtenir environ 68 g d'une poudre brute de complexe de Fortimicine. On soumet ensuite 40 g de la poudre brute à une purification selon la technique décrite dans l'étape D de l'exemple 1. On obtient alors
<EMI ID=36.1>
Pour effectuer une purification supplémentaire, la préparation est soumise à une chromatographie sur colonne de cellulose. Environ 300 ml d'une poudre de cellulose (AVICEL, de la Société Funakdshi Seiyaku K.K.) sont mis en suspension dans un solvant consistant en n-butanol, acide acétique, pyridine et eau, dans le rapport 6:2:4:4 en volume, et on charge une colonne de verre de ce produit, pour former une couche uniforme et serrée. La colonne est ensuite soigneusement lavée par le même solvant. La préparation est chargée sur la poudre de cellulose pour former une couche mince uniforme. Ensuite, on verse progressivement le même solvant dans la colonne, en partant de la tête de la colonne, et
on effectue ensuire une élution continue à raison d'environ 1 ml/mn. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 7 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour éliminer le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et est lyophilisé. On obtint ainsi 5 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE présentant une activité de 980 unités/mg.
EXEMPLE 4
Dans cet exemple, on utilise la souche utilisée dans l'exemple 1 comme souche d'ensemencement et les milieux d'ensemencement
(un à quatre) utilisés dans l'exemple 1 sont également utilisés ici. Cependant, on utilise le milieu de fermentation présentant la composition suivante :
<EMI ID=37.1>
La fermentation est effectuée dans les mêmes condition que dans l'étape A de l'exemple 1 et on isole la Fortimicine D, avant de la purifier, comme.décrit dans les étapes B et C de l'exemple 1. On obtient
<EMI ID=38.1>
activité d'environ 975 unités/mg.
EXEMPLE 5
Dans cet exemple, on reprend le mode opératoire de l'exemple 4, sauf en ce que l'on isole et purifie la Fortimicine KE comme décrit dans les étapes B et D de l'exemple 1. On obtient environ 7 g d'une préparation purifiée de Fortimicine KE présentant une activité d'environ
985 unités/mg.
EXEMPLE 6
Dans cet exemple, on utilise comme souches d'ensemencement les souches suivantes Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC
21819), Micromonospora olivoasterospora EX-80 (ATCC 31010) et Micromonospora olivoasterospora Mm 774 (ATCC 31009). Les milieux d'ensemencement (un à quatre) et le milieu de fermentation utilisés dans l'exemple 1 sont également utilisés dans cet exemple. La fermentation est effectuée comme dans l'étape A de l'exemple 1 et la Fortimicine D est isolée et purifiée comme dans les étapes B et C de l'exemple 1. De même, la Fortimicine KE est isolée et
<EMI ID=39.1>
activités des préparations purifiées de Fortimicine D et de Fortimicine KE sont rassemblés dans le tableau V ci-après.
EXEMPLE 7
Dans cet exemple, on dissout 10 g de la base libre de
<EMI ID=40.1>
repos jusqu'à son refroidissement à la température ambiante. La solution est neutralisée par la carboglace, ce qui précipite le carbonate de baryum. On filtre le précipité, et on le lave par une petite quantité d'eau. Le filtrat et les eaux de lavage sont rassemblés et concentrés à environ 20 ml. Le concentrat passe sur une colonne chargée de 500 ml d'une résine échan-
<EMI ID=41.1>
résine par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 20 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier. On élue tout d'abord une petite quantité de sous-produits de réaction. On élue ensuite la Fortimicine KE. Les fractions actives sont soumises à une chromatographie sur couche mince et les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite,
à 20 ml. Le concentrât est lyophilisé et l'on obtient 7,8 g de préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE, dont l'activité est d'environ
970 unités.
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
TABLEAU II
<EMI ID=44.1>
Révélateur I : couche supérieure du système chloroforme-méthanol-ammoniaque
aqueuse à 17 % (en poids) 2:1:1 en volume
<EMI ID=45.1>
TABLEAU III
<EMI ID=46.1>
papier avec la couche inférieure du système chloroforme-méthanol-ammoniaque aqueuse à 17 % (en poids) 2:1:1 en volume comme révélateur (à la température
ambiante après 12 h de développement
<EMI ID=47.1>
TABLEAU III (suite)
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
TABLEAU IV
Concentration inhibitrice minimale, y/ml, mesurée par la méthode de dilution
sur gélose à pH 8,0
<EMI ID=50.1>
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
REVENDICATIONS S
1 - Nouvelle substance douée d'activité antibactérienne, dénommée Fortimicine D, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule suivante :
<EMI ID=53.1>
2 - Nouvelle substance douée d'activité antibactérienne, dénommée Fortimicine KE, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule suivante :
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
la Fortimicine, caractérisé en ce que l'on cultive un organisme appartenant
à l'espèce Micromonospora olivoasterospora capable de produire au moins l'un desdits facteurs dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle, dans le bouillon de culture, une activité antibactérienne notable et on isole ensuite dudit bouillon de culture l'une au moins desdites Fortimicines D et KE.
: ABBOTT LABORATORIES
The present invention relates to novel substances endowed with antibacterial properties, namely Fortimicin D and Fortimicin KE. The invention also relates to the production of Fortimicin D and / or Fortimicin KE by culturing a microorganism belonging to the genus Micromonospora, which is capable of producing one or both active substances in a nutrient medium, up to what is detected antibacterial activity in the culture broth and then isolate at least one
active substances in the culture broth.
Antibiotics that exhibit art against a broad spectrum of bacteria are still in demand. For this purpose, it has been found that when certain strains of Micromonospora are cultivated in
nutrient medium, several antibiotic substances are produced in
culture broth. In particular, we isolated the factors A, B and C
Fortimicin in the culture broth of Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819) or FERM-P n [deg.] 1560), these factors corresponding to the following formulas:
<EMI ID = 1.1>
Chemical, physical and biological properties
of these antibiotics and their production process are described in detail in United States Patents Nos. 3,931,400, 3,976,768 and
4,048,015.
The Applicant has discovered according to the invention that, when Micromonospora olivoasterospora MK-70 is cultivated, this microorganism releases two other active substances in addition to Fortimicins A, B and C. A study of the physical and biological chemical properties of these active substances indicates that these are new antibiotics which have been named Fortimicin D and F ortimicin KE.
According to the invention, the new antibiotics are produced,
<EMI ID = 2.1>
organism belonging to the genus Micromonospora which is capable of producing one or both factors in a nutrient medium, until significant antibacterial activity is detected in the culture broth. When the culture is complete, the active fractions containing Fortimicin D or Fortimicin KE are isolated from the culture broth by
known means such as treatment with an ion exchange resin.
Fortimicins D and KE exhibit broad antibacterial activity and are therefore particularly useful for cleaning and sterilizing
laboratory glassware and surgical instruments and can also be used in combination with soaps detergents and washing solutions for disinfection purposes.
The invention also relates to pharmacologically acceptable non-toxic acid addition salts of Fortimicin D and Fortimicin KE, including inorganic acid addition salts.
such as hydrochlorides, hydrobromides, iodides, sulfates, sulfamates and phosphates and addition salts of organic acids such as maleates, acetates, citrates, oxalates, succinates, benzoates, tartrates, fumarates, malates, mandelates, ascorbates, etc.
The physicochemical properties of Fortimicin D free base according to the invention are as follows:
1) Basic white powder.
2) Elementary analysis, values found:
C 44.15%, H 8.77%, N 15.86%,
<EMI ID = 3.1> 4) Ultraviolet absorption spectrum:
the UV absorption spectrum of an aqueous solution of the substance does not exhibit a characteristic absorption maximum between 220 and
360 nm, but shows only terminal absorption.
<EMI ID = 4.1>
6) Infrared absorption spectrum:
the IR absorption spectrum measured on a KBr pellet is illustrated in FIG. 1 attached. Fortimicin D free base exhibits maximum absorption at the following wave numbers: 3400, 2900, 1625, 1570, 1470,
<EMI ID = 5.1>
7) Color reactions:
Ninhydrin reaction: positive
Reaction to potassium permanganate: positive
Elson-Morgan reaction: negative
Reaction to biur � t: negative
8) The NMR spectrum of Fortimicin D, measured in solution in water
<EMI ID = 6.1>
by Figure 2 attached.
9) The NMR spectrum (carbon) of the substance, measured in solution in the oxide
deuterium (pD = 11.1) using a JEOL PFT-100A spectrometer,
is illustrated in Figure 3 attached.
10) The mass spectrum of the substance reveals the molecular ion M + 1 and
the following fragment ions. The formula in parentheses means the compositional formula obtained by mass spectrometry at
high resolution.
<EMI ID = 7.1>
From the result of mass spectrometry, it is determined that the molecular weight of the substance is 391 and the molecular formula is C16H33N506 'The values of the elemental analysis of the substance
(with 2.5 mixes of water of hydration) calculated according to the molecular formula
<EMI ID = 8.1>
11) From the previous physicophemical data, it is considered that the
Structural formula of Fortimicin D is as follows:
<EMI ID = 9.1>
12) Fortimicin D free base is easily soluble in water, soluble
in methanol and slightly soluble in ethanol and acetone, but insoluble in organic solvents such as chloroform, benzene, ethyl acetate, butyl acetate, ether, butanol, petroleum ether, n-hexane, etc.
The physicochemical properties of Fortimicin KE free base according to the invention are as follows:
1) Basic white powder.
2) Elementary analysis, values found:
C 48.18%, H 9.29%, N 15.847.
3) F. 72.77 [deg.] C.
4) Ultraviolet absorption spectrum:
the UV absorption spectrum of an aqueous solution of the substance does not show a characteristic absorption maximum between 220 and 360 nm but only a terminal absorption.
<EMI ID = 10.1>
6) Infrared absorption spectrum:
the IR absorption spectrum measured on a KBr pellet is illustrated in Figure 4 attached. Fortimicin KE free base exhibits absorption maximums at the following wave numbers: 3350, 2920, 1580,
<EMI ID = 11.1>
7) Color reactions:
Reaction to ninhydrin: positive
Reaction to potassium permanganate: positive
Alson-Morgan reaction: negative
Reaction to biuret: negative.
8) The NMR spectrum (H) of Fortimicin KE measured in solution in solution in deuterium oxide (pD II, 1) using a JEOL JNM-PS-100 spectrometer is illustrated in FIG. 5 attached.
9) The NMR spectrum (carbon) of the substance measured in solution in
deuterium oxide (pD = 11.0) using a JEOL PFT-100A spectrometer is illustrated in Figure 6 attached.
10) The mass spectrum of the substance reveals the molecular ion M + 1 and
the following fragment ions. The formulas in parentheses mean the compositional formulas obtained by high resolution mass spectrometry.
<EMI ID = 12.1>
129 (C6H12N20)
From the result of mass spectrometry, the molecular weight of the substance is determined to be 334 and the molecular formula
<EMI ID = 13.1>
The elemental analysis values of the substance (with 1 mole of water of hydration) calculated from the molecular formula are:
C 47.71%; H 9.15% and N 15.89%.
11) From the previous physicochemical data, it is considered that the
Structural formula of Fortimicin KE is as follows:
<EMI ID = 14.1>
12) Fortimicin KE free base is easily soluble in water, soluble
in methanol and slightly soluble in ethanol and acetone, but insoluble in organic solvents, such as chloroform, benzene, ethyl acetate, butyl acetate, ether, butanol, ether
petroleum, n-hexane, etc.
The Rf values of Fortimicin D and Fortimicin KE in paper chromatography and thin layer chromatography using various developers are shown in Tables 1 to III below. For comparison, the values of
Rf of antibiotics similar to Fortimicins D and KE.
Table IV below illustrates the antibacterial spectra of Fortimicins D and KE against various microorganisms.
As can be seen from Table IV, Eortimicin D
has strong antibacterial activity against a wide range of gram positive and gram negative bacteria. In particular, it is characteristic that the antibiotic is effective against certain strains of Escherichia coli which are resistant to kanamycin, gentamicin and tobramycin. In addition, Fortimicin D is expected to have a therapeutic effect on various infections in humans and animals induced by various bacteria mentioned in Table IV. On this subject,
<EMI ID = 15.1>
dd weighing 20 + 1 g is 159 mg / kg. With these antibacterial properties, Fortimicin D is applicable for medical purposes. As also emerges from the above and from Table IV, Fortimicin KE exhibits a broad antibacterial spectrum.
A comparison of the D and KE factors of Fortimicin with known antibiotics further illustrates their novelty. Among the basic water-soluble antibiotics produced by microorganics of the genus Micromonospora and having a broad antibacterial spectrum, the gentamicin complex is known (MJ Weinstein et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, page 1; DJ Cooper et al. J. Infect Dis.
119. 342, 1969; and J.A. Waitz et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy
<EMI ID = 16.1>
n [deg.] 46-16153), sisomicin (M. J. Wesinstein et al.: J. Antibiotica,
23, pages 551, 555, 559, 1970), XK-62-2 (U.S. patent
<EMI ID = 17.1>
Written on paper, the Rf value of Fortimicin D is 0.18 and that of Fortimicin KE is 0.59. Fortimicin D is therefore clearly different from the components of gentamicin and Fortimicin KE is
<EMI ID = 18.1>
be distinguished from each other by chromatography on paper. However, in the silica gel thin layer chromatography of Table II using Developer II, Fortimicin D (Rf: 0.37) was clearly distinguished from gentamicin Cla (Rf: 0.16). Similarly, in the
<EMI ID = 19.1>
while Fortimicin KE has an Rf of 0.58. If we compare
the D and KE factors of Fortimicin with the antibiotic n [deg.] 460, sisomicin, XK-62-2, Fortimicin B, Fortimicin A and Fortimicin C, as shown in Table III, the antibiotic n [deg.] 460, sisomicin,
XK-62-2, Fortimicin B, Fortimicin A and Fortimicin C show Rf values of 0.01, 0.18, 0.49, 0.65, 0.37 and 0.18, respectively. The Rf of
Fortimicin D is 0.18 and that of Fortimicin KE is 0.59.
Fortimicin KE is therefore distinctly different. Although the Rf of Fortimicin D is the same (in Table III) as those of sisomicin and Fortimicin C, in the silica gel thin layer chromatography of Table II, using Developer II, Fortimicin C
(Rf: 0.40) and sisomicin (Rf: 0.18) are clearly distinguished from Fortimicin D (Rf: 0.37).
In addition, as basic water-soluble antibiotics produced by actinomycetes other than those of the genus Micromonospora, and exhibiting a broad antibacterial spectrum, there may be mentioned streptomycin A and streptomycin B, ribostamycin, lividomycins A, B and D, spectinomycin, kasugamicin, neomycins A, B and C, kanamycins A, B and C, nebramycin complexes, nebramycin factors 4 and 5 and paromomycin. Fortimicin's D and KE factors have been shown to be significantly different from any of these antibiotics, in that
which concerns the physico-chemical properties. In addition, from Table III below, it can be seen that the D and KE factors of Fortimicin are all
quite different from these antibiotics in terms of Rf during
chromatography on paper.
From the above, it can be seen that the factors D and
KE Fortimicin are new antibiotics.
Fortimicin's D and KE factors are produced
by fermentation of a microorganism of the genus Micromonospora. Any strain belonging to the genus Micromonospora and capable of forming Fortimicin D and / or Fortimicin KE in the culture liquor can be used. Examples of preferred strains are as follows: Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P n [deg.] 1560); (ATCC 21819), Micromonospora olivoasterospora
<EMI ID = 20.1>
(FERM-P n [deg.] 2193); (ATCC 31009). These strains were deposited with the "American Type Culture Collection" culture, Rockville, Maryland, United States of America, and at the "Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology", Tokyo, Japan, and received the numbers listed above.
The microbiological properties of these strains are described in US Patent No. [deg.] 3,931,400.
As is the case with other strains of Actinomycetes, the microorganisms useful for carrying out the invention can undergo artificial mutations by agents, such as ultraviolet rays, X-rays, and various chemical agents, of known manner, these mutations promoting the production of metabolic products;
an example is Micromonospora olivoasterospora CS-26 (FERM-P 3567, NRLL
8178). The latter mutant has been deposited in the United States of America at the Department of Agriculture, in Peoria, Illinois, and is available to the public.
In general, conventional techniques for culturing Actinomycetes can be used according to the invention. Thus, various nutrient sources can be used for the culture medium. Among the appropriate sources of carbon, mention will be made of: glucose, starch, mannose, fructose, sucrose, molasses, etc., either alone or in combination. It is also possible to use hydrocarbons, alcohols, organic acids, etc., depending on the assimilation characteristics of the microorganisms considered.
As mineral and organic sources of nitrogen, mention may be made of ammonium chloride, ammonium sulfate, urea, ammonium nitrate, sodium nitrate, alone or in combination, or natural sources of nitrogen. such as peptones, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn maceration liquor, soybean powder, acid hydrolysates of casein, soluble vegetable proteins, etc. If necessary, mineral salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium carbonate, phosphates, etc. can be added to the medium. In addition, organic or mineral substances can also be added to promote the growth of particular strains and
the production of the D-and / or KE factors of Fortimicin.
A liquid culture technique, particularly a submerged culture technique with shaking, is preferable. The culture temperature is preferably 25 to 40 [deg.] C, and the culture is preferably carried out near neutral pH. Usually after 2 to 15 days
culture in liquid medium, Fortimicin D and Fortimicin KE were formed and accumulated in the culture liquor. When the yield of these antibiotics in the culture liquor reaches the maximum value, the culture is stopped and the desired product is isolated and purified.
from the culture liquor, after the microbial cells have been removed, for example by filtration.
The recovery and purification of Fortimicin D and Fortimicin KE are carried out by known techniques, used to isolate and purify the products of microbial metabolism from a culture liquor.
Since the antibiotics Fortimicin D and Fortimicin KE are basic substances easily soluble in water, but poorly soluble in ordinary organic solvents, antibiotics can be purified by the techniques usually used to purify basic antibiotics soluble in water. water. More particularly, factors D and KE can be purified by a suitable combination of absorption and desorption steps in cation exchange resins, by chromatography on a cellulose column, by adsorption-desorption on a column of Sephadex LH -20, by column chromatography on silica gel, etc.
For example, a suitable technique of purification of Fortimicin D from culture liquor, when using a strain capable of producing the Fortimicin complex, i.e. a mixture containing Fortimicins A, B , C, D and KE, and by-products exhibiting antibacterial activity, is as follows. The culture filtrate containing no more cells is adjusted to pH 7.5 and then poured onto a cation exchange resin such as Amberlite IRC-50 resin.
(NH4 form) (Rohm & Haas Co., E.U.A.) After washing the resin with water, the elution is carried out with 0.5N ammonia. The active fractions are combined and concentrated under reduced pressure. The concentrate is then
<EMI ID = 21.1>
(The Dow Chemical Co., E.U.A.). The active fractions obtained by the elution are combined and concentrated under reduced pressure. A raw Fortimicin complex powder is obtained. The raw powder is dissolved in
water and the solution is then adjusted to pH 5.0 with 2N sulfuric acid. It is then passed through a column loaded with activated carbon in order to adsorb the active principles. The activated carbon column is then
washed with water to remove impurities. Elution is then carried out with 0.2N sulfuric acid in order to elute the active ingredients. The active fractions are combined and, after neutralization with an anion exchange resin such as Dowex 44 resin (OH form) (The Dow Chemical Co., E.U.A.), are lyophilized. The free base of the Fortimicin complex is thus obtained.
The crude powder of the Fortimicin complex obtained above is subjected to chromatography on a silica gel column.
using as elution solvent a mixed solvent of isopropanol, chloroform and ammonia in the ratio 4: 2: 1 by volume. The powder
crude is suspended in the complex solvent and is introduced
in the column. Elution is carried out with the same solvent at a rate of approximately 30 ml / h. Fortimicin B is first eluted and, after elution of several traces of various components, Fortimicin A is eluted in
large active fractions. Elution is then continued and, after elution of Fortimicin C, Fortimicin D is eluted in the following important active fractions. The active fractions containing Fortimimicin D are combined and concentrated under reduced pressure. The concentrate is lyophilized and the free base of Fortimicin D (white product) is obtained. In this way, a considerably purified sample of Fortimicin D can be obtained by chromatography on a column of silica gel. However, sometimes some impurities are present in the sample. In this case, the sample is again subjected to chromatography on a cellulose column. As the eluent, a mixed solvent of n-butanol, pyridine, acetic acid and water (in the ratio 6: 4: 2: 4 by volume) is used.
The active fractions obtained by elution are combined and concentrated under reduced pressure and a purified preparation of Fortimicin D is obtained. To remove the impurities exhibiting a positive reaction with ninhydrin, it is also possible to carry out chromatography on a carboxymethylcellulose column. More particularly, in this case, a solution of the crude powder is passed through a column loaded with
<EMI ID = 22.1>
on carboxymethylcellulose. The column is then washed thoroughly with water in order to elute the major part of the pigments and of the inorganic salts. Then, the elution is carried out with 0.2N ammonium bicarbonate to elute the active ingredients. The fractions containing Fortimicin D are combined and lyophilized and the purified Fortimicin D is obtained.
During the purification techniques specified above, the fractions are analyzed by thin layer chromatography on silica gel. As the developing solvent, a mixed solvent of isopropanol, chloroform and concentrated ammonia in the ratio 2: 1: 1 by volume is used, and the development is carried out at room temperature for 2 hours. Fortimicin D shows an Rf value of about 0.43 on the silica gel thin layer chromatogram.
In the case of Fortimicin KE, the crude powder obtained by lyophilization is dissolved in water. The pH is adjusted to 7.5 with 2N sulfuric acid, the solution is passed through a column loaded with a cation exchange resin, Amberlite CG-50 resin from
<EMI ID = 23.1>
to adsorb Fortimicin complex. The column is then washed with water. Elution is then carried out with 0.2N ammonia. After elution of several traces of various components, a mixture of Fortimicin B and Fortimicin KE is eluted in the important active fractions. Then, after elution of several traces of various components, Fortimicin D and Fortimicin A are eluted. The active fractions containing Fortimicin KE and Fortimicin B are combined and dried and a powder of the free bases of Fortimicin KE is obtained and Fortimicin B. Then, this powder is subjected to gel column chromatography
of silica using a mixed solvent of isopropanol, chloroform and concentrated ammonia in the ratio 4: 2: 1 by volume, as eluent. The powder mentioned above is suspended in the mixed solvent and this suspension is introduced onto the column of silica gel. Development is carried out using the same solvent at a rate of about 30 ml / h. Fortimicin B is
eluted first in the active fractions. Fortimicin KE is then eluted. The fractions containing Fortimicin KE are combined and concentrated under reduced pressure. The concentrate is dissolved in a small amount of water and lyophilized. The free base of Fortimicin KE is thus obtained. Thus, a considerably purified sample of Fortimicin KE can be obtained by chromatography on a silica gel column. However, sometimes some impurities are present in the sample.
During the above purification techniques, the fractions are analyzed by thin layer chromatography on silica gel. A mixed solvent of isopropanol, chloroform and concentrated ammonia, in the ratio 2: 1: 1 by volume, is used for the development. Development is carried out at room temperature for 2 h. Fortimicin KE shows an Rf value of approximately 0.58 on the chromatogram.
Fortimicin KE can also be obtained by heating Fortimicin D in an aqueous alkaline solution such as sodium or barium hydroxide solution. More particularly, Fortimicin D is heated in a saturated aqueous solution of barium hydroxide, at 100 [deg.] C, for 3 h. The reaction solution is then neutralized with dry ice and the resulting precipitate of carbonate is filtered.
barium. The filtrate is concentrated and passed through a column
filled with Amberlite CG-50 resin (NH4 + form). After washing the column with water, the elution is carried out with 0.2N ammonia. First, a small amount of the reaction by-products is eluted, followed by Fortimicin KE. The fractions containing Fortimicin KE are combined and concentrated under reduced pressure. The concentrate is then lyophilized
and the free base of Fortimicin KE is obtained.
The following examples illustrate the invention without, however, limiting its scope.
EXAMPLE 1
<EMI ID = 24.1>
The strain Micromonospora olivoasterospora CS-26 (NRLL 8178) is used as the seed strain; (FERM-P n [deg.] 3567). The seed strain is a mutant strain derived from the strain Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819); (FERM-P n [deg.] 1560) by treatment with nitrosoguanidine, by UV irradiation and by irradiation with γ rays. A medium containing 2 g / dl of glucose, 0.5 g / dl of peptone, 0.5 g / dl of yeast extract and 0.1 g / dl is used as the first inoculating medium.
of calcium carbonate (pH 7.5 before sterilization). 10 ml fractions of the first seed medium, in 50 ml test tubes, are inoculated with platinum loops of the seed strain, and cultivation is carried out at 30 [deg.] C, for 5 years. days. Then, 10 ml of the first seed culture thus prepared are inoculated into fractions of
30 ml of a second seeding medium, in 250 ml Erlenmeyer flasks.
The second seeding medium has the same composition as the first. The second culture is carried out with stirring at 30 [deg.] C, for
2 days, then 30 ml of the second seed culture are inoculated into 300 ml fractions of a third seed medium, in 2 liter Erlenmeyer flasks, fitted with partition walls. The third inoculation medium has the same composition as the first. The third inoculation culture is carried out with stirring at 30 [deg.] C for 2 days. Then 1.5 liters of the third seed culture (corresponding
to five vials) is inoculated into 15 liters of a fourth seed medium, in a 30-liter stainless steel fermenter. The fourth seeding medium has the same composition as the first. The fourth seed culture, in the fermenter, is carried out with aeration and stirring (350 rev / min; aeration: 15 1 / min) at 37 [deg.] C, for 2 days. 15 liters of the fourth seed culture are then inoculated into
150 liters of fermentation medium, in a 300-liter fermenter.
The fermentation medium has the following composition:
<EMI ID = 25.1>
<EMI ID = 26.1>
The fermentation is carried out under aeration and stirring (150 rpm; aeration: 80 l / min) at 37 [deg.] C, for 4 days.
<EMI ID = 27.1>
After completion of the fermentation, the culture liquor is adjusted to pH 2.5 with concentrated sulfuric acid and is stirred for 30 min. Then, about 7 kg of a filter aid "Radiolite n [deg.] 600", sold by the company Showa Kagaku, is added. Kogyo Co., Ltd., to the culture liquor, and the microbial cells are removed by filtration. The filtrate is adjusted to pH 7.5 by adding 6N sodium hydroxide, then passes through a column loaded with approximately
20 liters of a cation exchange resin, Amberlite IRC-50, under the
<EMI ID = 28.1>
is thrown. After washing the resin with water, the elution is carried out
of the active ingredients with 0.5N ammonia. The activity of the eluate is determined by the paper disc technique, using a Bacillus subtilis n [deg.] 10707 agar plate. Fractions showing activity are pooled and concentrated under reduced pressure to about 1. liter. The concentrate then passes through a column loaded with 500 ml of a resin
<EMI ID = 29.1>
column about 2 liters of water. Thus, the impurities are eliminated and the active ingredients are eluted by the water. The active fractions are combined and concentrated under reduced pressure to approximately 100 ml. The concentrate passes through a column loaded with approximately 50 ml of activated carbon powder, which allows the active principles to be adsorbed. The column is washed by
water and effluent and wash water are discarded. Elution is carried out with 0.2N sulfuric acid. The activity of the eluate is determined by the paper disc technique using Bacillus subtilis
n [deg.] 10707. The active fractions are combined and pass through a column of Dowex 44 resin (in the OR - form), and the elution of the active principles is carried out with water. The active fractions are combined and concentrated to about 50 ml. The concentrate is lyophilized and a crude powder of Fortimicin complex is obtained. The yield of the crude powder is about 35 g and the activity is 580 units / mg (the activity of 1 mg of the pure preparation corresponds to 1,000 units).
<EMI ID = 30.1>
About 500 ml of silica gel are suspended in a solvent containing isopropanol, chloroform and concentrated ammonia (4: 2: 1 by volume) and loaded into a glass column in the form of a tight and even coat. Then the column is washed thoroughly
by the same solvent. 10 g of crude powder obtained in step B are then placed on the silica gel, to form a uniform thin layer. Then,
the same solvent is gradually poured into the column, starting from the head
column, and the elution is then carried out continuously at
rate of approximately 50 ml / h. The eluate is fractionated into 20 ml portions, and each of the fractions is subjected to activity determination by the paper disc technique using Bacillus subtilis n [deg.] 10707.
Fortimicin B is first eluted then Fortimicin A. Elution is then continued and, after elution of Fortimicin C, Fortimicin D is eluted. The active fractions are subjected to chromatography in
thin layer and the fractions containing Fortimicin D are pooled
and concentrated under reduced pressure to sufficiently remove the solvent.
The residue is dissolved in a small amount of water and the solution is lyophilized. About 1.5 g of a purified preparation of the free base of Fortimicin D is obtained. The product has an activity of about 980 units / mg.
<EMI ID = 31.1>
with concentrated sulfuric acid and the solution is passed through a column loaded with 1 liter of cation exchange resin, Amberlite CG-50 (in the NH form). The effluent is discarded. The active substance is adsorbed on the resin. After washing the resin with water, the elution is carried out with 0.2N ammonia. The eluate is collected in the form of 50 ml fractions and each of the fractions is subjected to an activity determination by the paper disc technique and by thin layer chromatography.
First of all, we elect several traces of various
<EMI ID = 32.1>
Fortimicin B. The fractions are combined and concentrated to 20 ml. The concentrate is lyophilized and 8 g of a crude powder are obtained.
About 500 ml of silica gel, suspended in
a solvent containing isopropanol, chloroform and concentrated ammonia (4: 2: 1 by volume), are introduced into a glass column in the form of a tight and uniform layer. Then the column is washed thoroughly with the same solvent. The raw powder obtained above is then loaded onto the silica gel, in a uniform thin layer, and the same solvent is gradually poured into the column from the top of the column. A continuous elution is then carried out at a rate of approximately
50 ml / h. The eluate is collected in the form of 20 ml fractions and each of the fractions is subjected to an activity determination by the paper disc technique, using Bacillus subtilis n [deg.] 10707. It is first eluted. Fortimicin B then Fortimicin KE.
The active fractions are subjected to thin layer chromatography and the fractions containing Fortimicin KE are combined and concentrated under reduced pressure to remove the solvent. The residue is dissolved in a small amount of water and the solution is lyophilized. About 2 g of a purified preparation of the free base of Fortimicin KE are obtained. The product has an activity of approximately 970 units / mg.
EXAMPLE 2
<EMI ID = 33.1>
above is used as the seed strain and the seed media (media 1 to 4) used in Example 1 are still used in this example. The fermentation medium used has the following composition:
<EMI ID = 34.1>
Fermentation is carried out as in step A
of Example 1 and a crude powder of Fortimicin complex is isolated as described in step B of Example 1. Approximately 71 g of crude powder of Fortimicin complex is obtained having an activity of approximately
670 units / mg. 50 g of the crude powder are then subjected to purification according to step C of Example 1. Approximately 15 g of Fortimicin D are obtained, exhibiting an activity of approximately 840 units / mg.
To carry out further purification, the preparation is subjected to chromatography on a cellulose column. About 500 ml of a cellulose powder (AVICEL, from the Company Funakoshi Seiyaku, KK) are suspended in a mixed solvent of n-butanol, acetic acid, pyridine and water (6: 2: 4: 4 by volume) and loading a glass column to obtain a tight uniform layer. The column is then carefully washed with the same solvent. The preparation is introduced onto the cellulose powder in a uniform thin layer. Then, the same solvent is gradually poured into the column, starting from the head of
column, and then continuous elution is carried out at a rate of approximately
1 ml / min. The eluate is collected in the form of 10 ml fractions and each of the fractions is subjected to an activity determination by the technique.
on a paper disc using Bacillus Subtilis n [deg.] 10707. The active fractions are combined and concentrated under reduced pressure so as to sufficiently remove the solvent. The residue is dissolved in a small amount of water and is lyophilized. In this way, about 8 g of a purified preparation of the free base of Fortimicin D having
an activity of 970 units / mg.
EXAMPLE 3
<EMI ID = 35.1>
Example 2, to obtain approximately 68 g of a crude Fortimicin complex powder. 40 g of the crude powder are then subjected to purification according to the technique described in step D of Example 1. One then obtains
<EMI ID = 36.1>
To carry out further purification, the preparation is subjected to chromatography on a cellulose column. About 300 ml of a cellulose powder (AVICEL, from the company Funakdshi Seiyaku KK) are suspended in a solvent consisting of n-butanol, acetic acid, pyridine and water, in the ratio 6: 2: 4: 4 in volume, and a glass column is loaded with this product, to form a uniform and tight layer. The column is then carefully washed with the same solvent. The preparation is loaded onto the cellulose powder to form a uniform thin layer. Then, the same solvent is gradually poured into the column, starting from the head of the column, and
continuous elution is then carried out at a rate of approximately 1 ml / min. The eluate is collected in the form of 7 ml fractions and each of the fractions is subjected to an activity determination by the paper disc technique using Bacillus subtilis n [deg.] 10707. The active fractions are combined and concentrated. under reduced pressure to remove the solvent. The residue is dissolved in a small amount of water and is lyophilized. In this way 5 g of a purified preparation of the free base of Fortimicin KE was obtained, exhibiting an activity of 980 units / mg.
EXAMPLE 4
In this example, the strain used in Example 1 is used as the seeding strain and the seeding media
(one to four) used in Example 1 are also used here. However, the fermentation medium having the following composition is used:
<EMI ID = 37.1>
The fermentation is carried out under the same conditions as in step A of example 1 and Fortimicin D is isolated, before purifying it, as described in steps B and C of example 1. One obtains
<EMI ID = 38.1>
activity of about 975 units / mg.
EXAMPLE 5
In this example, the procedure of Example 4 is repeated, except in that Fortimicin KE is isolated and purified as described in steps B and D of Example 1. Approximately 7 g of a purified preparation of Fortimicin KE exhibiting an activity of approximately
985 units / mg.
EXAMPLE 6
In this example, the following strains Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC
21819), Micromonospora olivoasterospora EX-80 (ATCC 31010) and Micromonospora olivoasterospora Mm 774 (ATCC 31009). The seed media (one to four) and the fermentation medium used in Example 1 are also used in this example. The fermentation is carried out as in step A of example 1 and Fortimicin D is isolated and purified as in steps B and C of example 1. Likewise, Fortimicin KE is isolated and
<EMI ID = 39.1>
The activities of the purified preparations of Fortimicin D and Fortimicin KE are collated in Table V below.
EXAMPLE 7
In this example, 10 g of the free base of
<EMI ID = 40.1>
stand until cooled to room temperature. The solution is neutralized by dry ice, which precipitates the barium carbonate. The precipitate is filtered off, and washed with a small amount of water. The filtrate and the washings are combined and concentrated to about 20 ml. The concentrate passes through a column loaded with 500 ml of an exchangeable resin.
<EMI ID = 41.1>
resin with water, elution is carried out with 0.2N ammonia. The eluate is collected as 20 ml fractions and each of the fractions is subjected to activity determination by the paper disc technique. A small amount of reaction by-products is first eluted. Fortimicin KE is then eluted. The active fractions are subjected to thin layer chromatography and the fractions containing Fortimicin KE are combined and concentrated under reduced pressure,
to 20 ml. The concentrate is lyophilized and 7.8 g of purified preparation of the free base of Fortimicin KE is obtained, the activity of which is approximately
970 units.
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
TABLE II
<EMI ID = 44.1>
Developer I: upper layer of the chloroform-methanol-ammonia system
17% aqueous (by weight) 2: 1: 1 by volume
<EMI ID = 45.1>
TABLE III
<EMI ID = 46.1>
paper with the lower layer of the chloroform-methanol-17% aqueous ammonia system (by weight) 2: 1: 1 by volume as developer (at temperature
ambient after 12 h of development
<EMI ID = 47.1>
TABLE III (continued)
<EMI ID = 48.1>
<EMI ID = 49.1>
TABLE IV
Minimum inhibitory concentration, y / ml, measured by the dilution method
on agar at pH 8.0
<EMI ID = 50.1>
<EMI ID = 51.1>
<EMI ID = 52.1>
CLAIMS S
1 - New substance endowed with antibacterial activity, called Fortimicin D, characterized in that it meets the following formula:
<EMI ID = 53.1>
2 - New substance endowed with antibacterial activity, called Fortimicin KE, characterized in that it corresponds to the following formula:
<EMI ID = 54.1>
<EMI ID = 55.1>
Fortimicin, characterized in that an organism belonging to
to the species Micromonospora olivoasterospora capable of producing at least one of said factors in a nutrient medium, until a significant antibacterial activity is detected in the culture broth and then said culture broth is isolated. at least one of said Fortimicins D and KE.