: ABBOTT LABORATORIES
La présente invention concerne de nouvelles substances douées de propriétés antibactériennes, à savoir la Fortimicine D et la Fortimicine KE. L'invention concerne également la production de Fortimicine D et/ou de Fortimicine KE par culture d'un micro-organisme appartenant au genre Micromonospora, qui est capable de produire l'une ou les deux substances actives dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle l'activité antibactérienne dans le bouillon de culture et à isoler ensuite au moins une
des substances actives du bouillon de culture.
Les antibiotiques qui présentent une artivité contre un large spectre de bactéries sont toujours recherchés. Dans ce but, on a trouvé que, lorsque l'on cultive certaines souches de Micromonospora dans
un milieu nutritif, plusieurs substances antibiotiques sont produites dans
le bouillon de culture. En particulier, on a isolé les facteurs A, B et C
de la Fortimicine dans le bouillon de culture de Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819) ou FERM-P n[deg.] 1560), ces facteurs répondant aux formules suivantes :
<EMI ID=1.1>
Les propriétés chimiques, physiques et biologiques
de ces antibiotiques et leur procédé de production sont décrits en détail dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3 931 400, 3 976 768 et
4 048 015.
La demanderesse a découvert selon l'invention que, lorsque l'on cultive Micromonospora olivoasterospora MK-70, ce microorganisme libère deux autres substances actives en plus des Fortimicines A, B et C. Une étude des propriétés chimiques physiques et biologiques de ces substances actives indique que ce sont de nouveaux antibiotiques qui ont été dénommés Fortimicine D et F ortimicine KE.
Selon l'invention, on produit les nouveaux antibiotiques,
<EMI ID=2.1>
organisme appartenant au genre Micromonospora qui est capable de produire l'un ou les deux facteurs dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle dans le bouillon de culture une activité antibactérienne notable. Lorsque la culture est terminée, on isole du bouillon de culture les fractions actives contenant la Fortimicine D ou la Fortimicine KE par
des moyens connus tels que le traitement par une résine échangeuse d'ions.
Les Fortimicines D et KE présentent une large activité antibactérienne et sont donc utiles notamment pour nettoyer et stériliser
la verrerie de laboratoire et les instruments chirurgicaux et on peut, également utiliser en combinaison avec des savons des détergents et des solutions de lavage à des fins de désinfection.
L'invention concerne également les sels d'addition d'acides non toxiques de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE acceptables en pharmacologie, comprenant les sels d'addition d'acides inorganiques
telc que chlorhydrates, bromhydrates, iodhydrates, sulfates, sulfamates etphosphates et les sels d'addition d'acides organiques tels que maléates, acétates, citrates,oxalates, succinates, benzoates, tartrates, fumarates, malates, mandélates, ascorbates, etc.
Les propriétés physicochimique de la Fortimicine D base libre selon l'invention sont les suivantes :
1) Poudre blanche basique.
2) Analyse élémentaire, valeurs trouvées :
C 44,15%, H 8,77%, N 15,86%,
<EMI ID=3.1> 4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet :
le spectre d'absorption UV d'une solution aqueuse de la substance ne présente pas de maximum d'absorption caractéristique entre 220 et
360 nm, mais présente seulement une absorption terminale.
<EMI ID=4.1>
6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge :
le spectre d'absorption IR mesuré sur une pastille de KBr est illustré à la figure 1 annexée. La Fortimicine D base libre présente des maximum d'absorptions auxnombres d'ondes suivants : 3400, 2900, 1625, 1570, 1470,
<EMI ID=5.1>
7) Réactions colorées :
Réaction à la ninhydrine : positive
Réaction au permanganate de potassium : positive
Réaction d'Elson-Morgan : négative
Réaction au biur�t : négative
8) Le spectre de RMN de la Fortimicine D,mesuré en solution dans l'eau
<EMI ID=6.1>
par la figure 2 annexée.
9) Le spectre de RMN (carbone) de la substance,mesuré en solution dans l'oxyde
de deutérium (pD = 11,1) en utilisant un spectromètre JEOL PFT-100A,
est illustré à la figure 3 ci-annexée.
10) Le spectre de masse de la substance révèle l'ion moléculaire M + 1 et
les ions fragmentaires suivants. La formule entre parenthèses signifie la formule de composition obtenue par spectrométrie de masse à
haute résolution.
<EMI ID=7.1>
A-partir du résultat de la spectrométrie de masse, on détermine que le poids moléculaire de la substance est de 391 et la formule moléculaire est C16H33N506' Les valeurs de l'analyse élémentaire de la substance
(avec 2,5 mêles d'eau d'hydratation) calculéesd'après la formule molé-
<EMI ID=8.1>
11) D'après les données physicophimiques précédentes, on considère que la
formule développée de la Fortimicine D est la suivante :
<EMI ID=9.1>
12) La Fortimicine D base libre est facilement soluble dans l'eau, soluble
dans le méthanol et légèrement soluble dans l'éthanol et l'acétone, mais insoluble dans les solvants organiques tels que chloroforme, benzène, acétate d'éthyle, acétate de butyle, éther, butanol, éther de pétrole, n-hexane, etc.
Les propriétés physicochimiques de la Fortimicine KE base libre selon l'invention sont les suivantes :
1) Poudre blanche basique.
2) Analyse élémentaire, valeurs trouvées :
C 48,18%, H 9,29%, N 15,847..
3) F. 72,77[deg.]C.
4) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet :
le spectre d'absorption UV d'une solution aqueuse de la substance ne présente pas de maximum d'absorption caractéristique entre 220 et 360 nm mais seulement une absorption terminale.
<EMI ID=10.1>
6) Spectre d'absorption dans l'infrarouge :
le spectre d'absorption IR mesuré sur une pastille de KBr est illustré à la figure 4 ci-annexée. La Fortimicine KE base libre présente des maximums d'absorption aux nombres d'ondes suivants : 3350, 2920, 1580,
<EMI ID=11.1>
7) Réactions colorées :
Réaction à là ninhydrine : positive
Réaction au permanganate de potassium : positive
Réaction d'Alson-Morgan : négative
Réaction au biuret : négative.
8) Le spectre de RMN (H) de la Fortimicine KE mesuré en solution en solution dans l'oxyde de deutérium (pD Il,1) en utilisant un spectromètre JEOL JNM-PS-100 est illustré à la figure 5 ci-annexée.
9) Le spectre de RMN (carbone) de la substance mesuré en solution dans
l'oxyde de deutérium (pD = 11,0) en utilisant un spectromètre JEOL PFT-100A est illustré à la figure 6 ci-annexée.
10) Le spectre de masse de la substance révèle l'ion moléculaire M + 1 et
les ions fragmentaires suivants. Les formules entre parenthèses signifient les formules de composition obtenues par spectrométrie de masse à haute résolution.
<EMI ID=12.1>
129 (C6H12N20)
D'après le résultat de la spectrométrie de masse, on détermine que le poids moléculaire de la substance est de 334 et la formule moléculaire
<EMI ID=13.1>
Les valeurs d'analyse élémentaire de la substance (avec 1 mole d'eau d'hydratation) calculées à partir de la formule moléculaire sont :
C 47,71%; H 9,15% et N 15,89%.
11) D'après les données physicochimiques précédentes, on considère que la
formule développée de la Fortimicine KE est la suivante :
<EMI ID=14.1>
12) La Fortimicine KE base libre est facilement soluble dans l'eau, soluble
dans le méthanol et légèrement soluble dans l'éthanol et l'acétone, mais insoluble dans les solvants organiques, tels que chloroforme, benzène, acétate d'éthyle, acétate de butyle, éther, butanol, éther
de pétrole, n-hexane, etc.
Les valeurs de Rf de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE dans la chromatographie sur papier et la chromatographie sur couche mince utilisant divers révélateurs sont indiquées dans les tableaux 1 à III ci-après. A titre comparatif, on indique également les valeurs de
Rf d'antibiotiques semblées aux Fortimicines D et KE.
Le tableau IV ci-après illustre les spectres antibactériens des Fortimicines D et KE contre divers micro-organismes.
Comme il ressort du tableau IV, la Eortimicine D
a une forte activité antibactérienne contre une large gamme de bactéries gram positives et gram négatives. En particulier, il est caractéristique que l'antibiotique est efficace contre certaines souches d'Escherichia coli qui sont résistantes à la kanamycine, à la gentamicine et à la tobramycine. En outre, on s'attend que-la Fortimicine D est un effet thérapeutique sur diverses infections chez l'homme et chez les animaux induite par des diverses bactéries mentionnées au tableau IV. A ce sujet,
<EMI ID=15.1>
dd pesant 20 + 1 g est de 159 mg/kg. Avec ces propriétés antibactériennes, la Fortimicine D est applicable à des fins médicales. Comme il ressort également de ce qui précède et du tableau IV, la Fortimicine KE présente un large spectre antibactérien.
Une comparaison des facteurs D et KE de la Fortimicine avec des antibiotiques connus illustre encore leur nouveauté. Parmi les antibiotiques basiques solubles dans l'eau produits par des microorganiques du genre Micromonospora et ayant un large spectre antibactérien, on connaît le complexe de gentamicine (M.J. Weinstein et col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, page 1; D.J. Cooper et col. J. Infect. Dis.
119. 342, 1969; et J.A. Waitz et col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy
<EMI ID=16.1>
n[deg.] 46-16153), la sisomicine (M. J. Wesinstein et col. : J. Antibiotica,
23, pages 551, 555, 559, 1970) le XK-62-2 (brevet des Etats-Unis d'Amérique
<EMI ID=17.1>
graphie sur papier, la valeur de Rf de la Fortimicine D est de 0,18 et celle de la Fortimicine KE est de 0,59. La Fortimicine D est donc nettement différente des composants de la gentamicine et la Fortimicine KE est
<EMI ID=18.1>
se distinguer l'une de l'autre par chromatographie sur papier. Cependant, dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice du tableau II utilisant le révélateur II, la Fortimicine D (Rf : 0,37) se distingue nettement de la gentamicine Cla (Rf : 0,16). De manière semblable, dans le
<EMI ID=19.1>
tandis que la Fortimicine KE présente un Rf de 0,58. Si l'on compare
les facteurs D et KE de la Fortimicine avec l'antibiotique n[deg.] 460, la sisomicine, le XK-62-2, la Fortimicine B, la Fortimicine A et la Fortimicine C, comme il ressort du tableau III, l'antibiotique n[deg.] 460, la sisomicine,
le XK-62-2, la Fortimicine B, la Fortimicine A et la Fortimicine C présentent des Rf de 0,01, 0,18, 0,49, 0,65, 0,37 et 0,18, respectivement. Le Rf de
la Fortimicine D est de 0,18 et celui de la Fortimicine KE est de 0,59.
La Fortimicine KE est donc nettement différente. Bien que le Rf de la Fortimicine D soit le même (dans le tableau III) que ceux de la sisomicine et la Fortimicine C, dans la chromatographie sur couche mince de gel de silice du tableau II, en utilisant le révélateur II, la Fortimicine C
(Rf : 0,40) et la sisomicine (Rf : 0,18) se distinguent nettement de la Fortimicine D (Rf : 0,37).
De plus, comme antibiotiques basiques solubles dans l'eau, produits par les actinomycetes autres que ceux du genre Micromonospora, et présentant un large spectre antibactérien, on peut citer la streptomycine A et la streptomycine B, la ribostamycine, les lividomycines A, B et D, la spectinomycine, la kasugamicine, les néomycines A, B et C, les kanamycines A, B et C, les complexes de nébramycine, les facteurs 4 et 5 de nébramycine et la paromomycine. Les facteurs D et KE de la Fortimicine se sont révélés être grandement différents de l'un quelconque de ces antibiotiques, en ce
qui concerne les propriétés physico-chimiques. De plus, d'après le tableau III ci-après, on voit que les facteurs D et KE de la Fortimicine sont tout
à fait différents de ces antibiotiques en ce qui concerne les Rf lors
d'une chromatographie sur papier.
D'après ce qui précède, on voit que les facteurs D et
KE de la Fortimicine sont de nouveaux antibiotiques.
Les facteurs D et KE de la Fortimicine sont produits
par fermentation d'un micro-organisme du genre Micromonospora. Toute souche appartenant au genre Micromonospora et capable de former la Fortimicine D et/ou la Fortimicine KE dans la liqueur de culture peut être utilisée. Des exemples de souches préférées sont les suivants : Micromonospora olivoasterospora MK-70 (FERM-P n[deg.] 1560); (ATCC 21819), Micromonospora olivoasterospora
<EMI ID=20.1>
(FERM-P n[deg.] 2193);(ATCC 31009). Ces souches ont été déposées à la culture "American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, Etats-Unis d'Amérique, et à l'agence "Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology",Tokyo, Japon, et ont reçu les numéros indiqués ci-dessus.
Les propriétés microbiologiques de ces souches sont décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 3.931.400.
Comme cela est le cas avec d'autres souches d'Actinomycetes, les micro-organismes utiles pour mettre en oeuvre l'invention peuvent subir des mutations artificielles par des agents, tels que les ultraviolets, les rayons X, et différents agents chimiques, de manière connue, ces mutations favorisant la production de produits du métabolisme;
un exemple est le Micromonospora olivoasterospora CS-26 (FERM-P 3567, NRLL
8178). Ce dernier mutant a été déposé aux Etats-Unis au Département de l'Agriculture, à Peoria, Illinois, et se trouve à la disposition du public.
De manière générale, les techniques classiques de culture d'Actinomycetes peuvent être utilisées selon l'invention. Ainsi, on peut utiliser pour le milieu de culture diverses sources nutritives. Parmi les sources appropriées de carbone, on citera : glucose, amidon, mannose, fructose, saccharose, mélasses, etc., soit seules, soit en association. On peut également utiliser des hydrocarbures, des alcools, des acides organiques, etc., en fonction des caractéristiques d'assimilation des microorganismes considérés.
Comme sources minérales et organiques d'azote, on citera le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, seules ou en combinaison, ou des sources naturelles d'azote comme les peptones, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la levure séchée, la liqueur de macération du mais, la poudre de soja, les hydrolysats acides de caséine, les protéines végétales solubles, etc. Si cela est nécessaire, on peut ajouter au milieu des sels minéraux comme le chlorure de sodium, chlorure de potassium, carbonate de calcium, des phosphates, etc. De plus, on peut encore ajouter des substances organiques ou minérales favorisant la croissance des souches particulières et
la production des facteurs D-et/ou KE de la Fortimicine.
Une technique de culture liquide, en particulier une technique de culture submergée sous agitation, est préférable. La température de culture est de préférence de 25 à 40[deg.]C, et la culture est effectuée de préférence au voisinage du pH neutre. Habituellement, après 2 à 15 jours
de culture en milieu liquide, la Fortimicine D et la Fortimicine KE son_ formées et se sont accumulées dans la liqueur de culture. Lorsque le rendement en ces antibiotiques dans la liqueur de culture atteint la valeur maximale, on stoppe la culture et on isole et purifie le produit souhaité
à partir de la liqueur de culture, après que les cellules microbiennes ont été éliminées, par exemple par filtration.
La récupération et la purification de la Fortimicine D et de la Fortimicine KE sont effectuées par des techniques connues, utilisées pour isoler et purifier les produits du métabolisme microbien partir d'une liqueur de culture.
Etant donné que les antibiotiques Fortimicine D et Fortimicine KE sont des substances basiques facilement solubles dans l'eau-, mais peu solubles dans les solvants organiques ordinaires, les antibiotiques peuvent être purifiés par les techniques habituellement utilisées pour purifier les antibiotiques basiques solubles dans l'eau. Plus particulièrement, les facteurs D et KE peuvent être purifiés par une association convenable d'étapes d'absorption et de désorption dans des résines échan-geuses de cations, par chromatographie sur colonne de cellulose, par adsorption-désorption sur une colonne de Sephadex LH-20, par chromatographie sur colonne de gel de silice, etc.
Par exemple, une technique convenable de purification de la Fortimicine D à partir de la liqueur de culture, lorsque l'on utilise une souche capable de produire le complexe de Fortimicine, c'est-à-dire un mélange contenant les Fortimicines A, B, C, D et KE, et des sous-produits présentant une activité antibactérienne, est la suivante. Le filtrat de culture ne contenant plus de cellules est réglé à pH 7,5 puis versé sur une résine échangeuse de cations comme la résine Amberlite IRC-50
(forme NH4 ) (Rohm & Haas Co., E.U.A.).Après lavage de la résine par l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,5N. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est ensuite
<EMI ID=21.1>
(The Dow Chemical Co., E.U.A.). Les fractions actives obtenues par l'élution sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. On obtient une poudre brute de complexe de Fortimicine. La poudre brute est dissoute dans de
l'eau et la solution est ensuite réglée à pH 5,0 par de l'acide sulfurique 2N. On fait ensuite passer sur une colonne chargée de charbon actif pour adsorber les principes actifs. La colonne de charbon actif est ensuite
lavée par de l'eau pour éliminer les impuretés. On effectue ensuite l'élution par l'acide sulfurique 0,2N pour éluer les principes actifs. Les fractions actives sont rassemblées et, après neutralisation par une résine échangeuse d'anions comme la résine Dowex 44 (forme OH ) (The Dow Chemical Co., E.U.A.), sont lyophilisées. On obtient ainsi la base libre du complexe de Fortimicine.
La poudre brute du complexe de Fortimicine obtenue ci-dessus est soumise à une chromatographie sur colonne de gel de silice
en utilisant comme solvant d'élution un solvant mixte d'isopropanol, de chloroforme et d'ammoniaque dans le rapport 4:2:1 en volume. La poudre
brute est mise en suspension dans le solvant complexe et est introduite
dans la colonne. On effectue l'élution par le même solvant à raison d'environ 30 ml/h. On élue tout d'abord la Fortimicine B et, après élution de plusieurs traces de divers composants, la Fortimicine A est éluée dans
des fractions actives importantes. On continue ensuite l'élution et, après élution de la Fortimicine C, on élue la Fortimicine D dans les fractions actives importantes suivantes. Les fractions actives contenant la Fortimimicine D sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est lyophilisé et l'on obtient la base libre de Fortimicine D (produit blanc). De cette manière, on peut obtenir un échantillon de Fortimicine D considérablement purifié, par chromatographie sur une colonne de gel de silice. Cependant, quelquefois, quelques impuretés sont présentes dans l'échantillon. Dans ce cas, on soumet encore l'échantillon à une chromatographie sur colonne de cellulose. Comme éluant, on utilise un solvant mixte de n-butanol, pyridine, acide acétique et eau(dans le rapport 6:4:2:4 en volume).
Les fractions actives obtenues par élution sont rassemblées et concentrées sous pression réduite et l'on obtient une préparation purifiée de Fortimicine D. Pour éliminer les impuretés présentant une réaction positive à la ninhydrine, on peut également effectuer une chromatographie sur colonne de carboxyméthylcellulose. Plus particulièrement, dans ce cas, on fait passer une solution de la poudre brute dans une colonne chargée de
<EMI ID=22.1>
sur la carboxyméthylcellulose. On lave ensuite soigneusement la colonne par de l'eau pour éluer la majeure partie des pigments et des sels inorganiques. Ensuite, on effectue l'élution par du bicarbonate d'ammonium 0,2N pour éluer les principes actifs. Les fractions contenant la Fortimicine D sont rassemblées et lyophilisées et l'on obtient la Fortimicine D purifiée.
Durant les techniques de purification précisées cidessus, les fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince de gel de silice. Comme solvant de développement, on utilise un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée dans le rapport 2:1:1 en volume, et le développement est effectué à la température ambiante, durant 2 h. La Fortimicine D présente une valeur Rf d'environ 0,43 sur le chromatogramme sur couche mince de gel de silice.
Dans le cas de la Fortimicine KE, la poudre brute obtenue par lyophilisation est dissoute dans l'eau. On règle le pH à 7,5 par de l'acide sulfurique 2N, on fait passer la solution dans une colonne chargée d'une résine échangeuse de cations, la résine Amberlite CG-50 du
<EMI ID=23.1>
pour adsorber la complexe de Fortimicine. La colonne est ensuite lavée par de l'eau. On effectue ensuite une élution par de l'ammoniaque 0,2N. Après élution de plusieurs traces de divers composants, on élue un mélange de Fortimicine B et de Fortimicine KE dans les fractions actives importantes. Ensuite, après élution de plusieurs traces de divers composants, on élue la Fortimicine D et la Fortimicine A. Les fractions actives contenant la Fortimicine KE et la Fortimicine B sont rassemblées et séchées et l'on obtient une poudre des bases libres de Fortimicine KE et Fortimicine B. Ensuite, cette poudre est soumise à une chromatographie sur colonne de gel
de silice utilisant un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée dans le rapport 4:2:1 en volume, comme éluant. La poudre mentionnée ci-dessus est mise en suspension dans le solvant mixte et on introduit cette suspension sur la colonne de gel de silice. On effectue le développement à l'aide du même solvant à raison d'environ 30 ml/h. La Fortimicine B est
éluée la première dans les fractions actives. On élue ensuite la Fortimicine KE. Les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est dissous dans une petite quantité d'eau et lyophilisé. On obtient ainsi la base libre de la Fortimicine KE. Ainsi, on peut obtenir un échantillon considérablement purifié de Fortimicine KE, par chromatographie sur colonne de gel de silice. Cependant, quelquefois, quelques impuretés sont présentes dans l'échantillon.
Durant les techniques ci-dessus de purification, les fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince de gel de silice. On utilise pour le développement un solvant mixte d'isopropanol, chloroforme et ammoniaque concentrée, dans le rapport 2:1:1 en volume. Le développement est effectué à la température ambiante durant 2 h. La Fortimicine KE présente une valeur Rf d'environ 0,58, sur le chromatogramme.
La Fortimicine KE peut également être obtenue par chauffage de la Fortimicine D dans une solution aqueuse alcaline comme une solution d'hydroxyde de sodium ou de baryum. Plus particulièrement, on chauffe la Fortimicine D dans une solution aqueuse d'hydroxyde de baryum saturée, à 100[deg.]C, durant 3 h. On neutralise ensuite la solution réactionnelle par la carboglace et on filtre le précipité résultant de carbonate de
baryum. Le filtrat est concentré et on le fait passer sur une colonne
chargée de résine Amberlite CG-50 (forme NH4+). Après lavage de la colonne par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. Tout d'abord, on élue une petite quantité des sous-produits de réaction, puis la Fortimicine KE. Les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite. Le concentrat est ensuite lyophilisé
et l'on obtient la base libre de la Fortimicine KE.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
EXEMPLE 1
<EMI ID=24.1>
On utilise comme souche d'ensemencement la souche Micromonospora olivoasterospora CS-26 (NRLL 8178); (FERM-P n[deg.] 3567). La souche d'ensemencement est une souche mutante dérivée de la souche Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC 21819); (FERM-P n[deg.] 1560) par traitement à la nitrosoguanidine, par irradiation UV et par irradiation aux rayons y. On utilise comme premier milieu d'ensemencement un milieu contenant 2 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure et 0,1 g/dl
de carbonate de calcium (pH 7,5 avant stérilisation). Des fractions de 10 ml du premier milieu d'ensemencement, dans des tubes à essai de 50 ml, sont inoculées par des boucles de platine de la souche d'ensemencement, et on effectue la culture à 30[deg.]C, durant 5 jours. Ensuite, 10 ml de la première culture d'ensemencement ainsi préparée sont inoculés dans des fractions de
30 ml d'un second milieu d'ensemencement, dans des Erlenmeyer de 250 ml.
Le second milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La seconde culture est effectuée sous agitation à 30[deg.]C, durant
2 jours, puis on inocule 30 ml de la seconde culture d'ensemencement dans des fractions de 300 ml d'un troisième milieu d'ensemencement, dans des Erlenmeyer de 2 litres,munis de cloisons de séparation. Le troisième milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La troisième culture d'ensemencement est effectuée sous agitation à 30[deg.]C, durant 2 jours. Ensuite, 1,5 litre de la troisième culture d'ensemencement (correspondant
à cinq flacons) est inoculé dans 15 litres d'un quatrième milieu d'ensemencement, dans un fermenteur de 30 litres en acier inoxydable. Le quatrième milieu d'ensemencement présente la même composition que le premier. La quatrième culture d'ensemencement, dans le fermenteur, est effectuée sous aération et agitation (350 tr/mn; aération : 15 1/mn) à 37[deg.]C, durant 2 jours. On inocule ensuite 15 litres de la quatrième culture d'ensemencement dans
150 litres d'un milieu de fermentation, dans un fermenteur de 300 litres.
Le milieu de fermentation présente la composition suivante :
<EMI ID=25.1>
<EMI ID=26.1>
La fermentation est effectuée sous aération et agitation (150 tr/mn; aération : 80 1/mn) à 37[deg.]C, durant 4 jours.
<EMI ID=27.1>
Après achèvement de la fermentation, la liqueur de culture est réglée à pH 2,5 par de l'acide sulfurique concentré et est agitée,durant 30 mn. Ensuite, on ajoute environ 7 kg d'un adjuvant de filtration "Radiolite n[deg.] 600",commercialisé par la Société Showa Kagaku. Kogyo Co., Ltd., à la liqueur de culture, et les cellules microbiennes sont éliminées par filtration. Le filtrat est réglé à pH 7,5 par addition d'hydroxyde de sodium 6N, puis passe sur une colonne chargée par environ
20 litres d'une résine échangeuse de cations, Amberlite IRC-50, sous la
<EMI ID=28.1>
est jeté. Après lavage de la résine par de l'eau, on effectue l'élution
des principes actifs par de l'ammoniaque 0,5N. On détermine l'activité de l'éluat par la technique du disque de papier, en utilisant une plaque de gélose de Bacillus subtilis n[deg.] 10707. Les fractions présentant une activité sont rassemblées et concentrées sous pression réduite jusqu'à environ 1 litre. Le concentrat passe ensuite dans une colonne chargée de 500 ml d'une résine
<EMI ID=29.1>
colonne environ 2 litres d'eau. Ainsi, on élimine les impuretés et les principes actifs sont élués par l'eau. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite, à environ 100 ml. Le concentrat traverse une colonne chargée d'environ 50 ml de poudre de charbon actif, ce qui permet d'adsorber les principes actifs. La colonne est lavée par
de l'eau et l'effluent et les eaux de lavage sont jetés. On effectue l'élution par l'acide sulfurique 0,2N. On détermine l'activité de l'éluat par la technique du disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis
n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et traversent une colonne de résine Dowex 44(sous la forme OR-),et l'élution des principes actifs est effectuée par de l'eau. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées à environ 50 ml. Le concentrat est lyophilisé et l'on obtient une poudre brute de complexe de Fortimicine. Le rendement en la poudre brute est d'environ 35 g et l'activité est de 580 unités/mg (l'activité de 1 mg de la préparation pure correspond à 1.000 unités).
<EMI ID=30.1>
Environ 500 ml de gel de silice sont mis en suspension dans un solvant contenant de l'isopropanol, du chloroforme et de l'ammoniaque concentrée (4:2:1 en volume) et on en charge une colonne de verre sous forme d'une couche serrée et uniforme. Ensuite, on lave soigneusement la colonne
par le même solvant. 10 g de poudre brute obtenue dans l'étape B sont ensuite placés sur le gel de silice, pour former une couche mince uniforme. Ensuite,
on verse progressivement le même solvant dans la colonne, à partir de la tête
de la colonne, et on effectue ensuite l'élution, de manière continue, à
raison d'environ 50 ml/h. L'éluat est fractionné en portions de 20 ml, et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707.
On élue tout d'abord la Fortimicine B puis la Fortimicine A. On poursuit ensuite l'élution et, après élution de la Fortimicine C, on élue la Fortimicine D. Les fractions actives sont soumises à une chromatographie en
couche mince et les fractions contenant la Fortimicine D sont rassemblées
et concentrées sous pression réduite pour éliminer suffisamment le solvant.
Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et la solution est lyophilisée. On obtient environ 1,5 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine D. Le produit présente une activité d'environ 980 unités/mg.
<EMI ID=31.1>
par de l'acide sulfurique concentré et on fait passer la solution sur une colonne chargée par 1 litre de résine échangeuse de cations, Amberlite CG-50 (sous la forme NH, ). L'effluent est jeté. La substance active est adsorbée sur la résine. Après lavage de la résine par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 50 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier et par une chromatographie sur couche mince.
Tout d'abord, on élue plusieurs traces de divers
<EMI ID=32.1>
la Fortimicine B. Les fractions sont rassemblées et concentrées à 20 ml. Le concentrât est lyophilisé et l'on obtient 8 g d'une poudre brute.
Environ 500 ml de gel de silice, en suspension dans
un solvant contenant de l'isopropanol, du chloroforme et de l'ammoniaque concentrée (4:2:1 en volume), sont introduits dans une colonne de verre sous forme d'une couche serrée et uniforme. Ensuite, on lave soigneusement la colonne par le même solvant. La poudre brute obtenue ci-dessus est ensuite chargée sur le gel de silice, en une couche mince uniforme, et on verse progressivement le même solvant dans la colonne à partir de la tête de la colonne. On effectue ensuite une élution continue à raison d'environ
50 ml/h. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 20 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier, en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707. On élue tout d'abord la Fortimicine B puis la Fortimicine KE.
Les fractions actives sont soumises à une chromatographie en couche mince et les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour éliminer le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et la solution est lyophilisée. On obtient environ 2 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE. Le produit présente une activité d'environ 970 unités/mg.
EXEMPLE 2
<EMI ID=33.1>
ci-dessus est utilisée comme souche d'ensemencement et les milieux d'ensemencement (milieux 1 à 4) utilisés dans l'exemple 1 sont encore utilisés dans cet exemple. Le milieu de fermentation utilisé présente la composition suivante :
<EMI ID=34.1>
La fermentation est effectuée comme dans l'étape A
de l'exemple 1 et on isole une poudre brute de complexe de Fortimicine comme décrit dans l'étape B de l'exemple 1. On obtient environ 71 g de poudre brute de complexe de Fortimicine présentant une activité d'environ
670 unités/mg. On soumet ensuite 50 g de la poudre brute à une purification selon l'étape C de l'exemple 1. On obtient environ 15 g de Fortimicine D présentant une activité d'environ 840 unités/mg.
Pour effectuer une purification supplémentaire, la préparation est soumise à une chromatographie sur colonne de cellulose. Environ 500 ml d'une poudre de cellulose (AVICEL,de la Société Funakoshi Seiyaku, K.K.) sont mis en suspension dans un solvant mixte de n-butanol, acide acétique, pyridine et eau (6:2:4:4 en volume) et on charge une colonne de verre pour obtenir une couche uniforme serrée. La colonne est ensuite soigneusement lavée par le même solvant. La préparation est introduite sur la poudre de cellulose en une couche mince uniforme. Ensuite, on verse progressivement le même solvant dans la colonne, en partant de la tête de
la colonne, et on effectue ensuite une élution continue à raison d'environ
1 ml/mn. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 10 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique
au disque de papier en utilisant le Bacillus Subtilis n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite de manière à éliminer suffisamment le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et est lyophilisé. De cette manière, on obtient environ 8 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine D présentant
une activité de 970 unités/mg.
EXEMPLE 3
<EMI ID=35.1>
l'exemple 2, pour obtenir environ 68 g d'une poudre brute de complexe de Fortimicine. On soumet ensuite 40 g de la poudre brute à une purification selon la technique décrite dans l'étape D de l'exemple 1. On obtient alors
<EMI ID=36.1>
Pour effectuer une purification supplémentaire, la préparation est soumise à une chromatographie sur colonne de cellulose. Environ 300 ml d'une poudre de cellulose (AVICEL, de la Société Funakdshi Seiyaku K.K.) sont mis en suspension dans un solvant consistant en n-butanol, acide acétique, pyridine et eau, dans le rapport 6:2:4:4 en volume, et on charge une colonne de verre de ce produit, pour former une couche uniforme et serrée. La colonne est ensuite soigneusement lavée par le même solvant. La préparation est chargée sur la poudre de cellulose pour former une couche mince uniforme. Ensuite, on verse progressivement le même solvant dans la colonne, en partant de la tête de la colonne, et
on effectue ensuire une élution continue à raison d'environ 1 ml/mn. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 7 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier en utilisant le Bacillus subtilis n[deg.] 10707. Les fractions actives sont rassemblées et concentrées sous pression réduite pour éliminer le solvant. Le résidu est dissous dans une petite quantité d'eau et est lyophilisé. On obtint ainsi 5 g d'une préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE présentant une activité de 980 unités/mg.
EXEMPLE 4
Dans cet exemple, on utilise la souche utilisée dans l'exemple 1 comme souche d'ensemencement et les milieux d'ensemencement
(un à quatre) utilisés dans l'exemple 1 sont également utilisés ici. Cependant, on utilise le milieu de fermentation présentant la composition suivante :
<EMI ID=37.1>
La fermentation est effectuée dans les mêmes condition que dans l'étape A de l'exemple 1 et on isole la Fortimicine D, avant de la purifier, comme.décrit dans les étapes B et C de l'exemple 1. On obtient
<EMI ID=38.1>
activité d'environ 975 unités/mg.
EXEMPLE 5
Dans cet exemple, on reprend le mode opératoire de l'exemple 4, sauf en ce que l'on isole et purifie la Fortimicine KE comme décrit dans les étapes B et D de l'exemple 1. On obtient environ 7 g d'une préparation purifiée de Fortimicine KE présentant une activité d'environ
985 unités/mg.
EXEMPLE 6
Dans cet exemple, on utilise comme souches d'ensemencement les souches suivantes Micromonospora olivoasterospora MK-70 (ATCC
21819), Micromonospora olivoasterospora EX-80 (ATCC 31010) et Micromonospora olivoasterospora Mm 774 (ATCC 31009). Les milieux d'ensemencement (un à quatre) et le milieu de fermentation utilisés dans l'exemple 1 sont également utilisés dans cet exemple. La fermentation est effectuée comme dans l'étape A de l'exemple 1 et la Fortimicine D est isolée et purifiée comme dans les étapes B et C de l'exemple 1. De même, la Fortimicine KE est isolée et
<EMI ID=39.1>
activités des préparations purifiées de Fortimicine D et de Fortimicine KE sont rassemblés dans le tableau V ci-après.
EXEMPLE 7
Dans cet exemple, on dissout 10 g de la base libre de
<EMI ID=40.1>
repos jusqu'à son refroidissement à la température ambiante. La solution est neutralisée par la carboglace, ce qui précipite le carbonate de baryum. On filtre le précipité, et on le lave par une petite quantité d'eau. Le filtrat et les eaux de lavage sont rassemblés et concentrés à environ 20 ml. Le concentrat passe sur une colonne chargée de 500 ml d'une résine échan-
<EMI ID=41.1>
résine par de l'eau, on effectue l'élution par de l'ammoniaque 0,2N. L'éluat est récupéré sous forme de fractions de 20 ml et chacune des fractions est soumise à une détermination d'activité par la technique au disque de papier. On élue tout d'abord une petite quantité de sous-produits de réaction. On élue ensuite la Fortimicine KE. Les fractions actives sont soumises à une chromatographie sur couche mince et les fractions contenant la Fortimicine KE sont rassemblées et concentrées sous pression réduite,
à 20 ml. Le concentrât est lyophilisé et l'on obtient 7,8 g de préparation purifiée de la base libre de Fortimicine KE, dont l'activité est d'environ
970 unités.
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
TABLEAU II
<EMI ID=44.1>
Révélateur I : couche supérieure du système chloroforme-méthanol-ammoniaque
aqueuse à 17 % (en poids) 2:1:1 en volume
<EMI ID=45.1>
TABLEAU III
<EMI ID=46.1>
papier avec la couche inférieure du système chloroforme-méthanol-ammoniaque aqueuse à 17 % (en poids) 2:1:1 en volume comme révélateur (à la température
ambiante après 12 h de développement
<EMI ID=47.1>
TABLEAU III (suite)
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
TABLEAU IV
Concentration inhibitrice minimale, y/ml, mesurée par la méthode de dilution
sur gélose à pH 8,0
<EMI ID=50.1>
<EMI ID=51.1>
<EMI ID=52.1>
REVENDICATIONS S
1 - Nouvelle substance douée d'activité antibactérienne, dénommée Fortimicine D, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule suivante :
<EMI ID=53.1>
2 - Nouvelle substance douée d'activité antibactérienne, dénommée Fortimicine KE, caractérisée en ce qu'elle répond à la formule suivante :
<EMI ID=54.1>
<EMI ID=55.1>
la Fortimicine, caractérisé en ce que l'on cultive un organisme appartenant
à l'espèce Micromonospora olivoasterospora capable de produire au moins l'un desdits facteurs dans un milieu nutritif, jusqu'à ce que l'on décèle, dans le bouillon de culture, une activité antibactérienne notable et on isole ensuite dudit bouillon de culture l'une au moins desdites Fortimicines D et KE.