Procédé de préparation d'une nouvelle substance antibiotique. La présente invention est; relative à. un liroiédé de préparation d'une nouvelle subs- tiinee antibiotique, pour laquelle la titulaire propose la désignation Viomyein , qui a été enregistrée comme marque.
('e procédé est, caraetérisé en ce que le iiiiero-organisine Streptomyces puniceus est enltivé dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions d'aérobie et en profondeur.
Le micro-organisme Streptomyces puniceus n' < i pas encore été décrit jusqu'ici. Il a été isolé à partir d'un échantillon d'une terre qui se trouve près de Cienfuegos à Cuba.. La des cription d'une de ses souches, portant les nu- niéros 1q1-1-5, selon la méthode indiquée clans le Manuel de bactériologie détermina tive de Bergey, 6e édition, pages 929 à 933, est donnée dans le tableau ci-après.
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à l'emploi de cette souche particulière; elle englobe notam ment aussi l'utilisation d'organismes modifiés obtenus par des moyens de mutation tels que ces rayons X, des rayons ultraviolets, le chlorhydrate de 2,2'-diehloro-N-méthyl-di- éthylamine, ete.
Les caractéristiques du tableau ci-après sont. basées sur dix éprouvettes, à l'exception de celles utilisant des sucres (deux éprou vettes). Les couleurs à côté desquelles se trouve la lettre R sont désignées d'après Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
EMI0002.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> blycélium <SEP> aérien <SEP> et; <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> @'1LIC(lS(', <SEP> modérée <SEP> la <SEP> eouleui' <SEP> (le <SEP> la <SEP> partie <SEP> Spo- <SEP> alreuli <SEP> voloilie <SEP> (1ressée; <SEP> bord <SEP> lisse;
<tb> asparagine, <SEP> ridée <SEP> varie <SEP> depuis <SEP> le <SEP> gris <SEP> surface <SEP> rugueuse; <SEP> sporula agar <SEP> perle <SEP> et <SEP> le <SEP> brun <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> tion <SEP> bonne; <SEP> bouts <SEP> des <SEP> hyphes
<tb> ,itisqti'au <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (cil <SEP> et <SEP> ries <SEP> eollidiophores <SEP> rouges
<tb> ,-général) <SEP> et <SEP> au <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> ou <SEP> roses: <SEP> conidies <SEP> de <SEP> dimen @(R);
<SEP> celle <SEP> de <SEP> la <SEP> partie <SEP> ci- <SEP> lion <SEP> 0,65 <SEP> X <SEP> 1,30 <SEP> < c <SEP> oblongues
<tb> reuse <SEP> varie <SEP> etrire <SEP> le <SEP> rouge <SEP> et <SEP> Pu <SEP> chaînes; <SEP> pariai <SEP> environ
<tb> neutre <SEP> et. <SEP> le <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Co- <SEP> 1.10 <SEP> colonie:
<tb> rinthe <SEP> (R) <SEP> 1 <SEP> 2:5 <SEP> colonies <SEP> complètement
<tb> sporulées, <SEP> presque <SEP> gris <SEP> olive
<tb> pâle <SEP> (R.);
<tb> '_' <SEP> environ <SEP> 80 <SEP> colonies <SEP> avec
<tb> peu <SEP> de <SEP> sporulations, <SEP> blanc <SEP> à
<tb> brun <SEP> pâle <SEP> (R):
<SEP> niycéliuin
<tb> aérien <SEP> eouvert <SEP> de <SEP> gouttelet tes <SEP> incolores;
<tb> 3 <SEP> environ <SEP> 5 <SEP> colonies <SEP> ayant
<tb> une <SEP> surfaee <SEP> cireuse, <SEP> aucun
<tb> mycélium <SEP> aérien, <SEP> mais <SEP> des
<tb> structures <SEP> analogues <SEP> à <SEP> des
<tb> eorémies <SEP> et <SEP> dont <SEP> le <SEP> bout
<tb> porte <SEP> souvent <SEP> des <SEP> hyphes
<tb> sporulés.
<tb> Toutes <SEP> les <SEP> colonies <SEP> compor tent <SEP> des <SEP> inycélia <SEP> végétatifs
<tb> très <SEP> semblables <SEP> au <SEP> pourpre
<tb> de <SEP> Corinthe <SEP> (R).
<tb> gélatine <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> à.
<SEP> chamois <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> aucun <SEP> forte <SEP> liquéfaction
<tb> (R.)
<tb> lait <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> anneau <SEP> brun <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> aucune <SEP> liplrolvse <SEP> ou <SEP> pepto tournesol <SEP> nisation: <SEP> le <SEP> pH <SEP> passe <SEP> de <SEP> 6,2 <SEP> à
<tb> 6,3 <SEP> à <SEP> 6,7
<tb> nialate <SEP> de <SEP> bonne <SEP> à <SEP> blanc <SEP> pour <SEP> quatre <SEP> éprouvet- <SEP> aucun <SEP> l'envers <SEP> est <SEP> blanc <SEP> dans <SEP> six
<tb> chaux <SEP> modérée <SEP> tes; <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> éprouvettes <SEP> et <SEP> jaunâtre <SEP> dans
<tb> pour <SEP> deux <SEP> éprouvettes;
<SEP> pour <SEP> les <SEP> quatre <SEP> autres <SEP> tubes
<tb> les <SEP> quatre <SEP> autres <SEP> épr <SEP> ouvet tes, <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> au <SEP> cen tre <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie <SEP> et <SEP> presque
<tb> jaune <SEP> de <SEP> Chalcédoine <SEP> pâle
<tb> (R) <SEP> aux <SEP> bords
<tb> cellulose <SEP> très <SEP> faible
<tb> ou, <SEP> nulle
EMI0003.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> ATycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> -hu#ose, <SEP> bonne <SEP> blanc <SEP> à <SEP> iris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> brun <SEP> surface <SEP> plissée <SEP> et <SEP> craquelée;
<SEP> q
<tb> arar <SEP> envers <SEP> brun
<tb> l@ounnes <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> ou <SEP> taché <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> colonies <SEP> plissées
<tb> (le <SEP> terre <SEP> de <SEP> gris <SEP> pâle <SEP> (R <SEP> j <SEP> ; <SEP> surfaces <SEP> ci reuses <SEP> d'un <SEP> pourpre <SEP> livide
<tb> (R)
<tb> plaques <SEP> pauvre <SEP> de <SEP> lilas <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> à <SEP> gris <SEP> aucun <SEP> faiblement <SEP> hydrolysé;
<SEP> envers
<tb> d'amidon <SEP> de <SEP> fumée <SEP> pâle <SEP> et <SEP> gris <SEP> bru- <SEP> rouge <SEP> neutre <SEP> à <SEP> pourpre <SEP> de
<tb> nitre <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> Corinthe <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> agar <SEP> syti- <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> à <SEP> (gris <SEP> souris <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> livide <SEP> (R)
<tb> thétique <SEP> pâle <SEP> (R)
<tb> agas <SEP> modérée <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> laitritif
<tb> milieu <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R);
<SEP> parties <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> pourpre <SEP> vi d'Emerson <SEP> cireuses <SEP> presque <SEP> ;ris <SEP> vineux <SEP> neux <SEP> foncé <SEP> (R)
<tb> clair <SEP> (R)
<tb> (1-xylose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Corinthe
<tb> (R)
<tb> 1-arabinose <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> bris <SEP> cannelle <SEP> clair <SEP> ou
<tb> gris <SEP> vineux <SEP> (R)
<tb> l-rhamnose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> lévulose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> vineux <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> de <SEP> Corinthe
<tb> (R)
<tb> ralaetose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R,)
<SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> vineux <SEP> foncé
<tb> (R)
<tb> sucrose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> maltose <SEP> modérée <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> pourpre <SEP> vineux <SEP> foncé
<tb> (R)
<tb> laetose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> raffinose <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> iiiuliiie <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> (1-niannite <SEP> bonne <SEP> gris <SEP> olive <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> pourpre <SEP> vi nelix <SEP> foncé <SEP> (R)
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Croissance <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarques
<tb> ,
l-5orbite <SEP> pauvre <SEP> blaltc <SEP> < lllctltl <SEP> ctt@eï@ <SEP> blaw#
<tb> r1u1cite <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc
<tb> itlosite <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> aneth <SEP> @ncet@@ <SEP> blanc
<tb> salicine <SEP> pauvre <SEP> < Fris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aneltll <SEP> etlcer-# <SEP> @;
rïs <SEP> (le <SEP> cannelle <SEP> clair
<tb> lu <SEP> i
<tb> citrate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R.) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> brun. <SEP> très <SEP> clair
<tb> sodium
<tb> succinate <SEP> pauvre <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> etlcers <SEP> plaine
<tb> de <SEP> sodium
<tb> fer <SEP> de <SEP> bonne <SEP> milieu <SEP> lnellall-'e
<tb> hligler
<tb> tyroslnate, <SEP> llall@'l.'e <SEP> presque <SEP> -ris <SEP> brun <SEP> <B>(R.)</B> <SEP> aucun <SEP> eolotlte <SEP> tlltlwe, <SEP> elrellse, <SEP> plaie,
<tb> agas <SEP> translucide;
<SEP> envers, <SEP> brun <SEP> clan'
<tb> bouillon <SEP> de <SEP> modérée <SEP> nitrates <SEP> réflltits
<tb> nitrate
<tb> a@-ar <SEP> nutri- <SEP> altcune <SEP> en
<tb> tif, <SEP> éprou- <SEP> profondeur
<tb> tettes <SEP> se couées Le nouvel antibiotique appartient au groupe des antibiotiques basiques qui ne peu vent pas être extraits par des solvants orga niques.
Le nouvel antibiotique partage égale ment avec ce groupe la propriété de pouvoir être précipité par certains colorants acides, tels que le violet au chrome Erio, l'orange fixe Pontamine, le rouge d'aliaa.rine S, le bleu de sy nthracène, le bleu acier Pontamine, le vert Pontalnine et d'autres colorants sulfo- niques similaires. Ce groupe basique, auquel appartient le nouvel antibiotique,
est caracté risé par lin champ d'activité antibiotique étendu, plus particulièrement parmi les bac- téries -rani-négatices. Le tableau ci-après montre les champs d'activité comparés de la ehlorotétr acycline, de formule
EMI0004.0024
(lu chlora.mphénicol, de la streptottlyeitle, de la strept.othricine et du nouvel antibiotique.
EMI0005.0001
<I>Tableau <SEP> I:
</I>
<tb> lüc <SEP> rogrammes <SEP> d'antibiotique <SEP> par <SEP> cul, <SEP> nécessaires <SEP> pour <SEP> inhiber <SEP> la <SEP> croissance <SEP> des <SEP> organismes
<tb> suivants <SEP> sur <SEP> des <SEP> plaques <SEP> d'agar <SEP> nutritif.
<tb> Chlorotétra- <SEP> Chloram- <SEP> Strepto- <SEP> Strepto- <SEP> Nouvel
<tb> (Organisme <SEP> cycline <SEP> phénicol <SEP> mycine <SEP> thricine <SEP> antibiotique
<tb> (1<U>)</U> <SEP> (2) <SEP> <U>(3) <SEP> (4</U>) <SEP> (5)
<tb> ;
. <SEP> anren. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> Ô <SEP> 50
<tb> ,. <SEP> alblls <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> <B>100</B>
<tb> R. <SEP> subtilis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7. <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 100
<tb> 13. <SEP> invedides <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,9 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb> 1 <SEP> li'@''aillsnle <SEP> (le <SEP> B0denllelnler <SEP> 1 <SEP> <B>500</B> <SEP> > <SEP> 1000 <SEP> 10 <SEP> 500
<tb> S. <SEP> tYpho.5a <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> -1 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> pu] <SEP> lorttm <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> <B><U>'-#</U></B>. <SEP> paratvphi <SEP> .1. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> E <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> < i <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Ii. <SEP> pneumoniae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 7 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> Sl(. <SEP> paradvsenteriae <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> soli <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> .1. <SEP> lterogelles <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,9 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> f's. <SEP> aeruginosa <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 3000
<tb> Protetls <SEP> sp. <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 500
<tb> 11. <SEP> albieans <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 2000 <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> > <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 3000
<tb> (1) <SEP> Chlorhydrate <SEP> cristallisé
<tb> Cristallisé
<tb> (3) <SEP> Sulfate <SEP> à <SEP> 750 <SEP> unités/mg
<tb> (4) <SEP> Sulfate <SEP> à <SEP> 300 <SEP> unités/mg <SEP> (ex <SEP> hélianthate <SEP> cristallisé)
<tb> (5) <SEP> Sulfate <SEP> amorphe <SEP> brut, <SEP> préparé <SEP> selon <SEP> l'exemple <SEP> III <SEP> ci-après Le nouvel antibiotique diffère en outre des antibiotiques connus et obtenus à partir d'au tres espèces de Streptomi-ces,
en ce qui con cerne l'activité des antibiotiques envers des eultnres de bactéries rendues résistantes à l'antibiotique par transfert successif dans des bouillons contenant des quantités progressi vement croissantes d'antibiotique, par rap port à la culture initiale, sensible à tous les antibiotiques. Le tableau ci-après, dans lequel. le dosage a été réduit à des unités de dilution E. soli par millilitre, montre Bette particu]a- i-il (-. L'efficacité de chaque antibiotique était.
d'abord établie en déterminant le vol-Lune to tal en millilitres d'un bouillon nutritif conte nant une culture de E. coli standardisée qui pouvait être gardé libre de croissance à l'aide d'un milligramme d'antibiotique pendant lune incubation de 18 heures à 37 C. Ce nombre de millilitres est. appelé la valeur UDC de cet, antibiotique.
Pour comparer ces antibioti ques au niveau de la même activité biologique, on a choisi pour tous des valeurs uniformes de 50 et 100 UDC/ml et on a. pris la quantité nécessaire de chaque antibiotique pour obtenir lesdites valeurs.
EMI0006.0001
<I>Tableau <SEP> II:</I>
<tb> Comparaison <SEP> de <SEP> l'activité <SEP> de <SEP> divers <SEP> antibiotiques <SEP> envers <SEP> différentes <SEP> souches <SEP> de <SEP> 1. <SEP> aero@;
enes.
<tb> Streptomycine <SEP> Streptothricine <SEP> Chloramphénieol <SEP> Nouvel
<tb> Souche <SEP> (LDC/ml) <SEP> (LDCJml) <SEP> (LDC,%ml) <SEP> antibiotique
<tb> (UDC'@m1)
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> <B>d,</B> <SEP> .- <SEP> ,-- <SEP> + <SEP> -_
<tb> _L <SEP> _ - <SEP> = <SEP> croissance <SEP> - <SEP> = <SEP> aucune <SEP> croi,sance
<tb> La <SEP> souche <SEP> A <SEP> est.
<SEP> sensible <SEP> à <SEP> <B>25</B> <SEP> UDC/ml <SEP> de <SEP> tons <SEP> les <SEP> antibiotiqne5 <SEP> @i-de"n,.
<tb> l'a <SEP> souche <SEP> D <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> ?00 <SEP> L'I)C/nll <SEP> de <SEP> ehloramphénicol.
<tb> La <SEP> souche <SEP> C" <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> -1400 <SEP> FDC/ml <SEP> de <SEP> streptomycine
<tb> et <SEP> à <SEP> environ <SEP> _5 <SEP> I?DC/lnl <SEP> de <SEP> streptotlir-icine.
<tb> La <SEP> souche <SEP> D <SEP> est <SEP> sensible <SEP> à <SEP> 7500 <SEP> L\DC/nil <SEP> de <SEP> streptothricine
<tb> et <SEP> à <SEP> environ <SEP> ?00 <SEP> b'DC/ml <SEP> de <SEP> streptomycine.
Le tableau II montre que le nouvel anti biotique est capable d'inhiber la croissance des souches de A. aerogenes rendues résistan tes à la streptomycine et au chloramphénicol, mais non celle des souches rendues résistantes à. la streptothricine. Ceci montre que le nou vel. antibiotique se distingue nettement de la streptomycine et du ehloramphénicol.
Le nouvel antibiotique se distingue de la. streptothricine et de la streptomycine par son comportement sur un papier chromat.ographi- que dans de l'eau saturée avec du n-butanol et contenant 9-11/ode pipéridine et ? /o d'acide p-toluène sulfonique. Les résultats ci-après se rapportent à un traitement de 96 heures à ?5 , en se servant du E.
subtili, comme orga nisme d'essai.
EMI0006.0024
Antibiotique <SEP> Rf.
<tb> streptonlveille <SEP> A <SEP> 0,3@
<tb> treptothricine <SEP> 0,0-1
<tb> -Nouvel <SEP> antibiotique <SEP> 0,06 Le nouvel antibiotique est stable quand on le fait bouillir pendant 15 minutes à une concentration de 500 m-7/rnl dans de l'eau ayant des pH de ?,0, 6,5 et 9,0.
La, toxicité du nouvel. antibiotique, com parée à celle de quelques autres antibiotiques, ressort du tableau III ci-après:
EMI0006.0029
<I>Tableau <SEP> III:</I>
<tb> <I>Toxicité <SEP> de <SEP> dirers <SEP> aritibiotiqrtes</I>
<tb> (mg <SEP> pour <SEP> ?0 <SEP> g <SEP> de <SEP> souris)
<tb> Antibiotique <SEP> Intraveineux <SEP> Sous-cutané <SEP> Par <SEP> la <SEP> bouche
<tb> LD, <SEP> LD,o <SEP> LD, <SEP> LD@" <SEP> LD" <SEP> LDSa
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> streptoniveine <SEP> '.#
<tb> sulfate <SEP> de <SEP> streptothrieine <SEP> 4.0
<tb> C <SEP> hlora <SEP> mphénicol <SEP> <B>0,6</B>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> chlorotétraey <SEP> eline <SEP> 1,5
<tb> qulfate <SEP> du <SEP> nouvel <SEP> antibiotique <SEP> (brut)
<SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 3.5 <SEP> >'?00 <SEP> indéter miné <B>La</B> culture du Streptoniy ces puniceus est effectuée clé préférence entre 24 et. 30 pen- < lant une période allant de ? jours à 1 se- niaine et avec agitation.
Le milieu nutritif eofient (le préférence: une source d'hydrates (le earbolie, telle que des sucres, de l'amidon, de la ,glycérine; une source .d'azote organique, telle que de la farine de soja ou du gluten de lité : une source de substances favorisant la i111 < ssance du micro-organisme, telle que la partie hydrosoluble du résidu de distillation (le l'alcool d'un mélange de fermentation, et cil outre du sel ordinaire et du carbonate de valcilini, utilisé comme agent tampon.
Quand lui croissance est. terminée, le mycélium est sé- li;iré et l'antibiotique peut être précipité hors (lu bouillon, par exemple par addition de co lorants sulfoniques, tels que le violet au elironie Trio, l'oran\re fixe Pontainine, etc. Le sel du colorant est ensuite décomposé pour ré- générer l'antibiotique.
On peut. en particulier exécuter le pro cédé comme suit Pour la culture initiale (inoculum) du micro-organisme, on emploie un milieu solide préparé selon la formule:
EMI0007.0034
Dextrose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> clé <SEP> viande <SEP> de <SEP> baeuf <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>2,5-</B>
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1 <SEP> litre
<tb> On <SEP> règle <SEP> le <SEP> pH <SEP> à <SEP> 7,0 <SEP> et
<tb> on <SEP> ajoute <SEP> agar <SEP> 30 <SEP> 0.
Cette culture initiale est utilisée pour ino- etiler des flacons secoués ou des cuves d'ino- euluin submergé. Dans un flacon secoué, la croissance atteint généralement son niaxiniuin ait bout. de 4 jours, alors que dans les euv es d.'inoculum submergé, la croissance la plus fa- %'o gable est atteinte en.
? jours. Depuis la, cuve cl'inoeuliim, le milieu de culture et le micro- oi-,,anisnie sont transférés dans l'appareil de fermentation, dans des conditions absolument stériles, et, la culture continue pendant une nouvelle période de 2 jours. A tout moment, on assure l'aération de la cuve de fermenta tion, en y introduisant de l'air stérile par un distributeur avec un débit de 0,5 à 2 volumes d'air par volume de bouillon et par minute, tout en maintenant l'agitation. Une stérilité complète doit être assurée et la température du bouillon est généralement maintenue entre ?4. et. 30 .
Le nouvel antibiotique peut être récupéré hors du bouillon de fermentation, dans lequel il est produit, par plusieurs méthodes diffé rentes. La précipitation au moyen de colo rants acides et la décomposition des sels de colorants ainsi formés a déjà été mentionnée. Parmi ces colorants, on préfère le violet au chrome Brio. Les sels de colorants précipités peuvent être convertis en d'autres sels de l'antibiotique, en traitant une suspension d'un sel de colorant, dans un solvant tel que le mé thanol ou un mélange de méthanol et d'acé tone, par exemple avec du sulfate de triéthyl- a.mine, ce qui fait précipiter le sulfate de l'antibiotique.
Suivant une variante, on peut traiter un sel de colorant. par un sel inorgani que tel que le chlorure de baryiun ou de cal cium, et séparer le sel métallique du colorant, ainsi précipité, d'avec la solution du sel anti biotique.
Une autre méthode générale pour récu pérer l'antibiotique consiste à utiliser des échangeurs de cations, de préférence des ré sines carboxylées, et notamment le produit marque Amberlite IRC 50 (Rohm R Haas Co.). Après que l'antibiotique a été adsorbé par la résine, il peut être élué au moyen d'un acide dilué et l'antibiotique solide peut être isolé de la solution aqueuse de -diverses ma nières.
Après réglage du pH à environ 6, la solution peut être séchée par congélation ou elle peut être concentrée et. traitée par un solvant, tel que le méthanol, ou par un mé lange de solvants, tels que le méthanol et le butanol, pour préparer un sel insoluble de l'antibiotique.
Si l'on se sert d'acide chlor- liy drique dilué pour éluer l'échangeur de ca tions, on peut ainsi préparer et isoler le chlorhydrate de l'antibiotique, lequel peut à son tour être converti en sulfate qui est pré cipité par du méthanol aqueux, par exemple par du méthanol contenant 20% d'eau.
Divers sels cristallisés de l'antibiotique peuvent être préparés, notamment le reine ekate, le pierate, le fl-naplrtalène-sulfonate, le sulfate et le chlorhydrate.
L'antibiotique et. les sels qu'on peut en préparer peuvent se présenter sous forme (le ïeurs solutions diluées, de concentrés bruits ou de cristaux purs.
Le nouvel antibiotique, tel qu'il est obtenu à partir des bouillons de fermentation, semble renfermer cieux constituants actifs, qui se distinguent par leur comportement sur du papier chroinatographique, en présence d'un système solvant formé de pipéridine. de bu- tanal et d'acide p-toluène sulfonique, comme décrit par Winsten, -Am. 8oe. 70, 3333 (1948).
Le nouvel antibiotique est une base orga nique forte constituée par les éléments car bone, hydrogène, azote et oxygène. Comme déjà dit, il forme des sels avec de nombreux acides organiques et. inorganiques. Le pouvoir rotatoire de son sulfate cristallisé,
EMI0008.0028
cor- respond à -31 3 (H.0, 1%).
Le spectre d'absorption ultraviolet de son sulfate cristallisé, en solution aqueuse, pré sente un maximum distinct et. unique
EMI0008.0035
@. 267,5 mlr, = 285. Le spectre infrarouge de son sulfate cristallisé, dans de l'huile miné rale, montre clés bandes d'absorption nettes et caractéristiques, à des fréquences de 3210, 1677 et 1228 cm-1, et une bande très large dont le maximum est, à environ 1081 em--1. Le chlorhydrate cristallisé fond en se décom posant à 265-266 C.
Le sulfate cristallisé n'a pas de point de fusion défini, il se décompose graduellement à température élevée.
Un échantillon du sulfate cristallisé, séché à 100 pendant trois heures dans le vide, a donné à l'analyse les résultats suivants: 36,73 /o clé carbone, 7.80% d'hpcll-og,ène. 21,12% d'azote, 17,53% (le l'ion sulfate et 18520,
!0 d'oxygène (par différence. Les sels de l'antibiotique avec clés acides inorganiques, tels que l'acide chlorhydrique ou sulfurique, sont. très solubles dans l'eau, mais seulement légèrement solubles dans des solvants tels que le méthanol, l'acétone et le inonoéther méthy lique de l'étlivlène-#-lycol.
L'activité clé l'antibiotique peut. être dé terminée par la méthode turbidimétrique, en se servant (le l'organisme hlebsiella pneunio- niae (PCI 602) et du milieu d'essai antibioti que du Laboratoire Biologique de Baltimore, préparé selon la formule de la Food and Drug Administration pour les bouillons pour l'ana lyse turbidimétrique de la streptomycine. La méthode d'essai est. celle de 11eMahan, .T. R.
(.T. Biol. Chem. 153, pages 2-19 à 258, avril 1911). Le sulfate cristallisé de l'antibiotique, avant les propriétés indiquées plus haut, est utilisé comme norme pour la comparaison des activités d'autres échantillons de l'antibioti que et. de ses solutions. L'activité attribuée au sulfate est de 765 ce qui donne à la base libre de l'antibiotique une activité écale à 1.000 Les exemples suivants illustrent l'inven tion.
On a utilisé pour tous ces exemples la rouelle de Streptoinvces puniceus portant les numéros 1311-5, telle qu'elle est décrite au début du présent. exposé.
EMI0008.0086
<I>L'xemy'ple <SEP> I:</I>
<tb> On. <SEP> prépare <SEP> un <SEP> milieu <SEP> (le <SEP> culture <SEP> ayant <SEP> la
<tb> composition <SEP> suivante:
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soja <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP> g;
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Partie <SEP> hydrosoluble <SEP> du <SEP> résidu <SEP> de <SEP> dis tillation <SEP> de <SEP> l'alcool <SEP> (1'111l <SEP> ulélarlloe
<tb> de <SEP> fermentation <SEP> O,:ï <SEP> g
<tb> l:
<SEP> au <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 1 <SEP> litre
<tb> On <SEP> règle <SEP> le <SEP> vii <SEP> ;i <SEP> <B>7,0</B> <SEP> ave(# <SEP> -ho <SEP> >Il <SEP> et
<tb> on <SEP> ajoute
<tb> Carbonate <SEP> clé <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> @Y On introduit 500 71i1 (le ce milieu dans un flacon de Fernbaeli de '',@ 1 et oil stérilise pendant 30 min. à 121 .
Après refroidisse- ment, on inocule le milieu avec un inoculum (le S. puniceus, préparé comme indiqué plus haut. On secoue le flacon sur un appareil tournant ayant. un déplacement d'environ 62,5 nim et tournant à 200 t/min. pendant -1 jours et à 27 . On constate alors que le bouillon a une activité de 320 UDC par ml, avec 1111 pH égal à 7,3.
La solution de l'antibiotique ainsi obtenue peut. être utilisée comme suit, pour préparer, sons forme solide, le sulfate de l'antibiotique: Le hH est réglé à 2,0 avec H.SO.t, on ajoute une quantité réduite de produit marque Sul)ei@-eel et on filtre le mélange.
Le pH du mélange clarifié est réglé à 5,5 et on ajoute du violet au chrome Erio à raison de 2 g par litre, en a-itant. On continue l'agitation pen < lant une heure à la température ambiante et on ajoute assez de produit marque Super- ce] pour permettre la filtration.
Le gâteau est. séparé par filtration et est lavé avec une quantité d'eau correspondant à 201/o du vo lume initial. Quand. il est. sec, le gâteau est mis en suspension dans 1/i2 du volume origi- nal de méthanol à 80% et est décomposé à l'aide de 0,5 g de BaCL . 2H20 pour chaque gramme de colorant. en agitant pendant. 2 heures à la température ambiante.
Après fil tration, le filtrat méthanolique est décoloré à l'aide d'une petite quantité de charbon et est. filtré à nouveau. Au filtrat limpide comme de l'eau, on ajoute 2 volumes de méthanol absolu et 2 ml d'une solution à 50% de sulfate de triéthylamine dans du méthanol, pour chaque gramme de BaC12 . 2H20.
On sépare par fil tration un précipité de sulfate de baryum et de sulfate de l'antibiotique à l'aide de pro duit marque Super-eel . Le gâteau est lavé au méthanol absolu et secoué avec de l'eau pour dissoudre le sulfate de l'antibiotique, le sulfate de baryum et le produit marque .'#uper-eel étant. éliminés par filtration.
La solution aqueuse, limpide comme de l'eau, du sulfate de l'antibiotique ainsi obtenue est sé- ehée. La poudre blanche et amorphe, que l'on obtient, a une .activité de 40 UDC/mg. <I>Exemple II:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante: Gluten de blé 10 g Glycérine 10 g Caséine 5 g Mélasse de betteraves 2 g Liqueur de macération du maïs 2 g Partie hydrosoluble du résidu de dis tillation de l'alcool d'un mélange de fermentation 2 g On règle le PH à 7,0 avec KOH et on ajoute Carbonate de calcium 5 g <B>El</B> au pour faire 1 litre Huile de soja 1 ml On stérilise pendant 45 minutes à 121 .
On inocule environ 75 1 de ce milieu dans une cuve de 180 1 munie d'agitateur, avec 2 1 d'un inoculum préparé comme décrit. plus haut, par culture en profondeur du S. puni- cens. On maintient la température à 27 pen dant 24 heures avec agitation constante et in sufflation d'air stérile à raison de 1,0 à 1,5 volume < l'air par volume de bouillon et par minute. Au bout de 24 heures, la culture intermédiaire ainsi préparée est introduite, dans des conditions absolument stériles, dans 560 1 du même milieu de culture, contenu dans une cuve de fermentation de 9501.
L'agi tation et l'aération restent les mêmes et, au bout de 48 h. à 27 , le bouillon obtenu a une activité finale de 100 UDC/ml. <I>Exemple III:</I> On prépare un milieu de culture ayant la composition suivante: Gluten de blé 10 g Glycérine 100, Caséine hydrolysée 5 g Mélasse de betteraves 2 g Liqueur de macération du maïs 2 g Partie hydrosoluble du résidu d e dis tillation de l'alcool d'un mélange de fermentation 2 g Eau pour faire 1 litre On règle le pH à 7,0 avec KOH et on ajoute Carbonate de calcium 5 g On stérilise quatre flacons de Fernbach de 2,8 1, contenant chacun 1 1 de ce milieu,
pendant 20 minutes à 1\31 . Après refroidis sement, ils sont inoculés avec une suspension de S. puniceus et. ils sont secoués dans un appareil tournant pendant. 4-8 heures à 28 . L'inoculum ainsi préparé est. utilisé pour ino- euler une cuve de fermentation de 180<B>1</B> con tenant 75 1 du milieu susdit, stérilisé pendant 20 minutes à 121 .
On remue avec un agita teur à hélice pendant que l'on maintient la cuve sous pression -et que l'on y introduit de l'air stérile à l'aide d'lin distributeur. Après 78 heures, le bouillon a une activité de 100 t DC/ml.
La solution de l'antibiotique ainsi obtenue peut. être utilisée comme suit. pour préparer, sous forme solide, le sulfate de l'antibiotique: Le bouillon, dont. la quantité correspond à 75 1, est séparé du my célium par filtration, son pH est réglé à 6,5 avec H.SO,l et on ,y- ajoute \?10 g d'oxalate d'ammonium pour pré cipiter le calcium à l'état d'oxalate, qui est éliminé par filtration.
Le pH du bouillon cla rifié est alors réglé à 5,5 avec I-I.SO.l et on ajoute 160 -- de violet. a.11 chrome Erio, après quoi le bouillon est agité pendant une heure et demie. Le sel du colorant est séparé par filtration à l'aide de produit marque Super eel .
Le gâteau de filtration est lavé avec 15 1 d'eau et séché par insufflation d'air dans le filtre-presse. Le produit sec est mis en sus- pension dans 3 1 d\un mélange de 80% de méthanol et de 20% d'acétone (en volumes)
et on ajoute<B>250</B> n11 d'une solution méthanolique à 50% de sulfate de triéthylamine, l'ensem- ble étant agité pendant une heure et demie. Le précipité comprenant le sulfate de l'anti biotique et le produit marque Super-cel est séparé par filtration et est lavé avec de l'acé tone et ensuite avec du méthanol.
Le gâteau séché est alors agité pendant une demi-heure clans deux litres d'eau distillée et le produit marque Super-eel est séparé de la solution de sulfate de l'antibiotique par filtration. La solution, limpide comme de l'eau, est séchée et en obtient une substance solide blanche et amorphe avec une activité de 370 I\DC/mg.
Process for the preparation of a new antibiotic substance. The present invention is; relative to. a process for the preparation of a new antibiotic substance, for which the proprietor proposes the designation Viomyein, which has been registered as a trademark.
(The process is characterized in that the iiiieroorganin Streptomyces puniceus is activated in an aqueous nutrient medium, under aerobic conditions and at depth.
The microorganism Streptomyces puniceus has not yet been described. It was isolated from a sample of a land near Cienfuegos in Cuba. The description of one of its strains, bearing the numbers 1q1-1-5, according to the method indicated in clans Bergey's Manual of determinative bacteriology, 6th edition, pages 929 to 933, is given in the table below.
However, the invention is not limited to the use of this particular strain; it also includes in particular the use of modified organisms obtained by means of mutation such as these X-rays, ultraviolet rays, 2,2'-diehloro-N-methyl-di-ethylamine hydrochloride, ete.
The characteristics of the table below are. based on ten test tubes, with the exception of those using sugars (two tests). The colors with the letter R next to it are designated according to Ridgway, Color Standards and Nomenclature.
EMI0002.0001
Medium <SEP> Growth <SEP> blycelium <SEP> aerial <SEP> and; <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarks
<tb> @ '1LIC (lS (', <SEP> moderate <SEP> the <SEP> eouleui '<SEP> (the <SEP> the <SEP> part <SEP> Spo- <SEP> alreuli <SEP> voloilie <SEP> (1stressed; <SEP> edge <SEP> smooth;
<tb> asparagine, <SEP> wrinkled <SEP> varies <SEP> from <SEP> the <SEP> gray <SEP> rough <SEP> surface; <SEP> sporula agar <SEP> pearl <SEP> and <SEP> the <SEP> brown <SEP> vinous <SEP> pale <SEP> tion <SEP> good; <SEP> <SEP> ends of <SEP> hyphae
<tb>, itisqti'au <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (cil <SEP> and <SEP> ries <SEP> eollidiophores <SEP> red
<tb>, -general) <SEP> and <SEP> to <SEP> chamois <SEP> olive <SEP> or <SEP> roses: <SEP> conidia <SEP> of <SEP> dimen @ (R);
<SEP> that <SEP> of <SEP> the <SEP> part <SEP> ci- <SEP> lion <SEP> 0.65 <SEP> X <SEP> 1.30 <SEP> <c <SEP> oblong
<tb> reuse <SEP> varies <SEP> and write <SEP> the red <SEP> <SEP> and <SEP> Pu <SEP> strings; <SEP> pariai <SEP> approximately
<tb> neutral <SEP> and. <SEP> the <SEP> purple <SEP> of <SEP> Co- <SEP> 1.10 <SEP> colony:
<tb> rinthe <SEP> (R) <SEP> 1 <SEP> 2: 5 <SEP> colonies <SEP> completely
<tb> spore-forming, <SEP> almost <SEP> gray <SEP> olive
<tb> pale <SEP> (R.);
<tb> '_' <SEP> approximately <SEP> 80 <SEP> colonies <SEP> with
<tb> little <SEP> of <SEP> sporulations, <SEP> blank <SEP> to
<tb> light brown <SEP> <SEP> (R):
<SEP> niycéliuin
<tb> aerial <SEP> open <SEP> of <SEP> droplets of colorless <SEP>;
<tb> 3 <SEP> approximately <SEP> 5 <SEP> colonies <SEP> having
<tb> a waxy <SEP> surfaee <SEP>, <SEP> none
<tb> mycelium <SEP> aerial, <SEP> but <SEP> of
<tb> <SEP> structures similar to <SEP> to <SEP> of
<tb> Eoremias <SEP> and <SEP> including <SEP> the <SEP> end
<tb> carries <SEP> often <SEP> of <SEP> hyphae
<tb> sporulated.
<tb> All <SEP> <SEP> colonies <SEP> contain <SEP> vegetative <SEP> inycelia <SEP>
<tb> very <SEP> similar <SEP> to purple <SEP>
<tb> of <SEP> Corinth <SEP> (R).
<tb> gelatin <SEP> moderate <SEP> white <SEP> to.
<SEP> buff <SEP> olive <SEP> pale <SEP> none <SEP> strong <SEP> liquefaction
<tb> (R.)
<tb> milk <SEP> from <SEP> poor <SEP> ring <SEP> brown <SEP> brown <SEP> dark <SEP> none <SEP> liplrolvse <SEP> or <SEP> pepto sunflower <SEP> nization: <SEP> the <SEP> pH <SEP> changes <SEP> from <SEP> 6,2 <SEP> to
<tb> 6.3 <SEP> to <SEP> 6.7
<tb> nialate <SEP> from <SEP> good <SEP> to <SEP> blank <SEP> for <SEP> four <SEP> test- <SEP> none <SEP> the reverse <SEP> is <SEP> blank <SEP> in <SEP> six
<tb> lime <SEP> moderate <SEP> tes; <SEP> buff <SEP> pale <SEP> olive <SEP> (R) <SEP> test tubes <SEP> and <SEP> yellowish <SEP> in
<tb> for <SEP> two <SEP> test pieces;
<SEP> for <SEP> the <SEP> four <SEP> other <SEP> tubes
<tb> the <SEP> four <SEP> other <SEP> test <SEP> open, <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> at the <SEP> center <SEP> of <SEP> the <SEP> colony <SEP> and <SEP> almost
<tb> yellow <SEP> of <SEP> Chalcedon <SEP> pale
<tb> (R) <SEP> at <SEP> edges
<tb> cellulose <SEP> very <SEP> weak
<tb> or, <SEP> null
EMI0003.0001
Medium <SEP> Growth <SEP> ATycelium <SEP> aerial <SEP> and <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarks
<tb> -hu # ose, <SEP> good <SEP> white <SEP> to <SEP> iris <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> brown <SEP> pleated <SEP> surface <SEP> and <SEP> cracked;
<SEP> q
<tb> arar <SEP> reverse <SEP> brown
<tb> l @ ounnes <SEP> good <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> or <SEP> stained <SEP> brown <SEP> dark <SEP> colonies <SEP > pleated
<tb> (the <SEP> earth <SEP> of <SEP> light gray <SEP> <SEP> (R <SEP> j <SEP>; <SEP> surfaces <SEP> ci reuse <SEP> of a < SEP> purple <SEP> livid
<tb> (R)
<tb> plates <SEP> poor <SEP> of <SEP> lilac <SEP> vinous <SEP> pale <SEP> to <SEP> gray <SEP> none <SEP> weakly <SEP> hydrolyzed;
<SEP> backwards
<tb> starch <SEP> from <SEP> smoke <SEP> pale <SEP> and <SEP> gray <SEP> bru- <SEP> red <SEP> neutral <SEP> to <SEP> purple <SEP> of
<tb> nitre <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> Corinth <SEP> dark <SEP> (R)
<tb> agar <SEP> syti- <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> to <SEP> (gray <SEP> mouse <SEP> none <SEP> towards <SEP> purple <SEP> livid <SEP> (R)
<tb> thetic <SEP> pale <SEP> (R)
<tb> agas <SEP> moderate <SEP> white <SEP> none <SEP> towards <SEP> white
<tb> dairy milk
<tb> middle <SEP> good <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (R);
<SEP> parts <SEP> none <SEP> upside <SEP> almost <SEP> purple <SEP> Emerson vi <SEP> waxers <SEP> almost <SEP>; reef <SEP> vinous <SEP> neux <SEP > dark <SEP> (R)
<tb> clear <SEP> (R)
<tb> (1-xylose <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> vinous <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> purple <SEP> of <SEP> Corinth
<tb> (R)
<tb> 1-arabinose <SEP> poor <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> breakage <SEP> cinnamon <SEP> clear <SEP > or
<tb> gray <SEP> vinous <SEP> (R)
<tb> l-rhamnose <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> backwards <SEP> white
<tb> levulose <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> vinous <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> towards <SEP> purple <SEP> of <SEP> Corinth
<tb> (R)
<tb> ralaetosis <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (R,)
<SEP> none <SEP> reverse <SEP> purple <SEP> vinous <SEP> dark
<tb> (R)
<tb> sucrose <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> backwards <SEP> white
<tb> maltose <SEP> moderate <SEP> gray <SEP> light olive <SEP> <SEP> (R) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> purple <SEP> vinous <SEP> dark
<tb> (R)
<tb> laetose <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> backwards <SEP> white
<tb> raffinose <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> backwards <SEP> white
<tb> iiiuliiie <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> towards <SEP> white
<tb> (1-niannite <SEP> good <SEP> gray <SEP> olive <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> upside <SEP> almost <SEP> purple <SEP> vi nelix <SEP> dark <SEP> (R)
EMI0004.0001
Medium <SEP> Growth <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> and <SEP> spores <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> Remarks
<tb>,
l-5orbit <SEP> poor <SEP> blaltc <SEP> <lllctltl <SEP> ctt @ eï @ <SEP> blaw #
<tb> r1u1cite <SEP> poor <SEP> white <SEP> none <SEP> towards <SEP> white
<tb> itlosite <SEP> poor <SEP> white <SEP> dill <SEP> @ ncet @@ <SEP> white
<tb> salicin <SEP> poor <SEP> <Fris <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> aneltll <SEP> etlcer- # <SEP> @;
rïs <SEP> (the <SEP> cinnamon <SEP> clear
<tb> lu <SEP> i
<tb> citrate <SEP> from <SEP> poor <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R.) <SEP> none <SEP> backwards <SEP> brown. <SEP> very <SEP> clear
<tb> sodium
<tb> succinate <SEP> poor <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> none <SEP> etlcers <SEP> plain
<tb> of <SEP> sodium
<tb> iron <SEP> of <SEP> good <SEP> middle <SEP> lnellall-'e
<tb> hligler
<tb> tyroslnate, <SEP> llall@'l.'e <SEP> almost <SEP> -ris <SEP> brown <SEP> <B> (R.) </B> <SEP> none <SEP> eolotlte <SEP> tlltlwe, <SEP> elrellse, <SEP> wound,
<tb> agas <SEP> translucent;
<SEP> backwards, <SEP> brown <SEP> clan '
<tb> broth <SEP> of <SEP> moderate <SEP> nitrates <SEP> reflltits
<tb> nitrate
<tb> a @ -ar <SEP> nutri- <SEP> altcune <SEP> en
<tb> tif, <SEP> test- <SEP> depth
The new antibiotic belongs to the group of basic antibiotics which cannot be extracted by organic solvents.
The new antibiotic also shares with this group the property of being able to be precipitated by certain acid dyes, such as Erio chromium violet, Pontamine fixed orange, aliaa.rine red S, sy nthracene blue, Pontamine steel blue, Pontalnine green and other similar sulphonic dyes. This basic group, to which the new antibiotic belongs,
is characterized by its wide field of antibiotic activity, more particularly among the -rani-negative bacteria. The table below shows the compared fields of activity of ehlorotetr acycline, of formula
EMI0004.0024
(lu chlora.mphenicol, streptottlyeitle, strept.othricin and the new antibiotic.
EMI0005.0001
<I> Table <SEP> I:
</I>
<tb> lüc <SEP> antibiotic <SEP> rograms <SEP> by <SEP> ass, <SEP> necessary <SEP> to <SEP> inhibit <SEP> the <SEP> growth <SEP> of the <SEP> organizations
<tb> following <SEP> on <SEP> of <SEP> plates <SEP> of nutrient <SEP> agar <SEP>.
<tb> Chlorotetra- <SEP> Chloram- <SEP> Strepto- <SEP> Strepto- <SEP> New
<tb> (Organism <SEP> cyclin <SEP> phenicol <SEP> mycin <SEP> thricine <SEP> antibiotic
<tb> (1 <U>) </U> <SEP> (2) <SEP> <U> (3) <SEP> (4 </U>) <SEP> (5)
<tb>;
. <SEP> anren. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.9 <SEP> 7 <SEP> 4 <SEP> Ô <SEP> 50
<tb>,. <SEP> alblls <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.9 <SEP> 7 <SEP> 6 <SEP> 5 <SEP> <B> 100 </B>
<tb> R. <SEP> subtilis <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7. <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 100
<tb> 13. <SEP> invedides <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.9 <SEP> 4 <SEP> 7 <SEP> 70 <SEP> 80
<tb> 1 <SEP> li '@' 'aillsnle <SEP> (the <SEP> B0denllelnler <SEP> 1 <SEP> <B> 500 </B> <SEP>> <SEP> 1000 <SEP> 10 < SEP> 500
<tb> S. <SEP> tYpho.5a <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> -1 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> pu] <SEP> lorttm <SEP>.
<SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> <B><U>'-#</U> </B>. <SEP> paratvphi <SEP> .1. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 20 <SEP> 5 <SEP> 100
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> E <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <i <SEP> 5 <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Ii. <SEP> pneumoniae <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 7 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> Sl (. <SEP> paradvsenteriae <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> E. <SEP> soli <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 7 <SEP> 100
<tb>. 1. <SEP> lterogelles <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.9 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 5 <SEP> 30
<tb> f's. <SEP> aeruginosa <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 3000
<tb> Protetls <SEP> sp. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 50 <SEP> 80 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 500
<tb> 11. <SEP> albieans <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 2000 <SEP>> <SEP> 2000 <SEP>> <SEP> 2000 <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 3000
<tb> (1) <SEP> Hydrochloride <SEP> crystallized
<tb> Crystallized
<tb> (3) <SEP> Sulfate <SEP> to <SEP> 750 <SEP> units / mg
<tb> (4) <SEP> Sulfate <SEP> to <SEP> 300 <SEP> units / mg <SEP> (eg <SEP> helianthate <SEP> crystallized)
<tb> (5) <SEP> Sulfate <SEP> amorphous <SEP> crude, <SEP> prepared <SEP> according to <SEP> example <SEP> III <SEP> below The new antibiotic also differs from known antibiotics obtained from other species of Streptomi-ces,
with regard to the activity of antibiotics against bacteria made resistant to the antibiotic by successive transfer into broths containing progressively increasing amounts of antibiotic, compared to the initial culture, sensitive to all antibiotics . The table below, in which. the dosage was reduced to E. soli dilution units per milliliter, shows Bette particu] a- i-il (-. The effectiveness of each antibiotic was.
first established by determining the total volume in milliliters of a nutrient broth containing a standardized E. coli culture that could be kept free from growth using one milligram of antibiotic during incubation of 18 hours at 37 C. This number of milliliters is. called the UDC value of this, antibiotic.
In order to compare these antibiotics at the level of the same biological activity, uniform values of 50 and 100 UDC / ml were chosen for all and one has. took the necessary amount of each antibiotic to obtain said values.
EMI0006.0001
<I> Table <SEP> II: </I>
<tb> Comparison <SEP> of <SEP> the <SEP> activity of <SEP> various <SEP> antibiotics <SEP> towards <SEP> different <SEP> strains <SEP> of <SEP> 1. <SEP> aero @;
enes.
<tb> Streptomycin <SEP> Streptothricin <SEP> Chloramphenol <SEP> New
<tb> Strain <SEP> (LDC / ml) <SEP> (LDCJml) <SEP> (LDC,% ml) <SEP> antibiotic
<tb> (UDC '@ m1)
<tb> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 100
<tb> <B> d, </B> <SEP> .- <SEP>, - <SEP> + <SEP> -_
<tb> _L <SEP> _ - <SEP> = <SEP> growth <SEP> - <SEP> = <SEP> none <SEP> growth
<tb> The <SEP> strain <SEP> A <SEP> is.
<SEP> sensitive <SEP> to <SEP> <B> 25 </B> <SEP> UDC / ml <SEP> of <SEP> tones <SEP> the <SEP> antibiotiqne5 <SEP> @ i-de "n ,.
<tb> the <SEP> strain <SEP> D <SEP> is <SEP> sensitive <SEP> to <SEP>? 00 <SEP> The I) C / nll <SEP> of <SEP> ehloramphenicol.
<tb> The <SEP> strain <SEP> C "<SEP> is <SEP> sensitive <SEP> to <SEP> -1400 <SEP> FDC / ml <SEP> of <SEP> streptomycin
<tb> and <SEP> to <SEP> approximately <SEP> _5 <SEP> I? DC / lnl <SEP> of <SEP> streptotlir-icine.
<tb> The <SEP> strain <SEP> D <SEP> is <SEP> susceptible <SEP> to <SEP> 7500 <SEP> L \ DC / nil <SEP> of <SEP> streptothricin
<tb> and <SEP> to <SEP> approximately <SEP>? 00 <SEP> b'DC / ml <SEP> of <SEP> streptomycin.
Table II shows that the new antibiotic is capable of inhibiting the growth of the strains of A. aerogenes made resistant to streptomycin and to chloramphenicol, but not that of the strains made resistant to. streptothricin. This shows that the new vel. antibiotic is clearly distinguished from streptomycin and ehloramphenicol.
The new antibiotic differs from the. streptothricin and streptomycin by its behavior on a chromat.ographic paper in water saturated with n-butanol and containing 9-11 / ode piperidine and? / o p-toluene sulfonic acid. The following results relate to a 96 hour treatment at? 5, using E.
subtle, as a test organism.
EMI0006.0024
Antibiotic <SEP> Ref.
<tb> streptonlveille <SEP> A <SEP> 0.3 @
<tb> treptothricin <SEP> 0.0-1
<tb> -New <SEP> antibiotic <SEP> 0.06 The new antibiotic is stable when boiled for 15 minutes at a concentration of 500 m-7 / rnl in water with pH values of?, 0 , 6.5 and 9.0.
The toxicity of the new. antibiotic, compared to that of some other antibiotics, is shown in Table III below:
EMI0006.0029
<I> Table <SEP> III: </I>
<tb> <I> Toxicity <SEP> of <SEP> dirers <SEP> aritibiotiqrtes </I>
<tb> (mg <SEP> for <SEP>? 0 <SEP> g <SEP> of <SEP> mouse)
<tb> Antibiotic <SEP> Intravenous <SEP> Subcutaneous <SEP> By <SEP> the <SEP> mouth
<tb> LD, <SEP> LD, o <SEP> LD, <SEP> LD @ "<SEP> LD" <SEP> LDSa
<tb> <SEP> streptoniveine <SEP> 'sulfate <SEP>. #
<tb> <SEP> streptothriein <SEP> 4.0 sulfate <SEP>
<tb> C <SEP> hlora <SEP> mphenicol <SEP> <B> 0.6 </B>
<tb> <SEP> chlorotetraey <SEP> hydrochloride <SEP> eline <SEP> 1.5
<tb> qulfate <SEP> of the <SEP> new <SEP> antibiotic <SEP> (raw)
<SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 10 <SEP> 3.5 <SEP>> '? 00 <SEP> undeter mined <B> The </B> culture of Streptoniy these puniceus is carried out preferably between 24 and. 30 during a period ranging from? days to 1 week and with agitation.
The nutrient medium is effective (preferably: a source of hydrates (earbolie, such as sugars, starch, glycerin; a source of organic nitrogen, such as soy flour or gluten of ity: a source of substances promoting the growth of the microorganism, such as the water-soluble part of the distillation residue (the alcohol of a fermentation mixture, and besides common salt and valcilini carbonate, used as a buffering agent.
When it is growth. complete, the mycelium is separated and the antibiotic can be precipitated out (the broth, for example by adding sulphonic dyes, such as violet to the ironie Trio, fixed orange Pontainine, etc. The dye salt is then broken down to re-generate the antibiotic.
We can. in particular, carry out the process as follows For the initial culture (inoculum) of the microorganism, a solid medium prepared according to the formula is used:
EMI0007.0034
Dextrose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Extract <SEP> key <SEP> meat <SEP> from <SEP> beef <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Peptone <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Extract <SEP> of <SEP> yeast <SEP> 1 <SEP> g
<tb> <SEP> sodium <SEP> <SEP> <B> 2,5- </B> chloride
<tb> Distilled <SEP> water <SEP> for <SEP> to make <SEP> 1 <SEP> liter
<tb> On <SEP> sets <SEP> the <SEP> pH <SEP> to <SEP> 7.0 <SEP> and
<tb> on <SEP> add <SEP> agar <SEP> 30 <SEP> 0.
This initial culture is used to inoculate shaken flasks or vats of submerged inoluin. In a shaken flask, the growth usually reaches its niaxiniuin end. 4 days, whereas in submerged inoculum, the most reasonable growth is achieved in.
? days. From the cl'inoeuliim tank, the culture medium and the micro-anisnia are transferred to the fermentation apparatus, under absolutely sterile conditions, and the culture continues for a further period of 2 days. At all times, the fermentation tank is ventilated by introducing sterile air through a distributor with a flow rate of 0.5 to 2 volumes of air per volume of broth and per minute, while now the commotion. Complete sterility must be ensured and the temperature of the broth is generally maintained between? 4. and. 30 .
The new antibiotic can be recovered from the fermentation broth, in which it is produced, by several different methods. The precipitation by means of acid dyes and the decomposition of the dye salts thus formed has already been mentioned. Among these dyes, Brio chrome violet is preferred. The precipitated dye salts can be converted to other salts of the antibiotic, by treating a suspension of a dye salt, in a solvent such as methanol or a mixture of methanol and acetone, for example. with triethylamine sulfate, which precipitates the sulfate from the antibiotic.
Alternatively, a dye salt can be treated. with an inorganic salt such as baryiun or calcium chloride, and separate the metal salt of the dye, thus precipitated, from the solution of the anti-biotic salt.
Another general method for recovering the antibiotic consists in using cation exchangers, preferably carboxylated resins, and in particular the product brand Amberlite IRC 50 (Rohm R Haas Co.). After the antibiotic has been adsorbed by the resin, it can be eluted with dilute acid and the solid antibiotic can be isolated from the aqueous solution in various ways.
After adjusting the pH to about 6, the solution can be freeze dried or it can be concentrated and. treated with a solvent, such as methanol, or with a mixture of solvents, such as methanol and butanol, to prepare an insoluble salt of the antibiotic.
If dilute hydrochloric acid is used to elute the cation exchanger, the hydrochloride can be prepared and isolated from the antibiotic, which in turn can be converted to sulfate which is precipitated by aqueous methanol, for example by methanol containing 20% water.
Various crystalline salts of the antibiotic can be prepared, including queen ekate, pierate, fl-naplrtalene sulfonate, sulfate and hydrochloride.
The antibiotic and. the salts which can be prepared therefrom may be in the form of dilute solutions, noisy concentrates or pure crystals.
The new antibiotic, as obtained from fermentation broths, appears to contain active constituents, which are distinguished by their behavior on chroinatographic paper, in the presence of a solvent system formed from piperidine. butanal and p-toluenesulfonic acid, as described by Winsten, -Am. 8oe. 70, 3333 (1948).
The new antibiotic is a strong organic base made up of the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen. As already said, it forms salts with many organic acids and. inorganic. The rotary power of its crystallized sulfate,
EMI0008.0028
corresponds to -31 3 (H. 0, 1%).
The ultraviolet absorption spectrum of its crystallized sulfate, in aqueous solution, shows a distinct maximum and. unique
EMI0008.0035
@. 267.5 mlr, = 285. The infrared spectrum of its sulphate crystallized, in mineral oil, shows key clear and characteristic absorption bands, at frequencies of 3210, 1677 and 1228 cm-1, and a band very wide, the maximum of which is, at about 1081 em - 1. The crystallized hydrochloride melts and decomposes at 265-266 C.
Crystallized sulphate has no defined melting point, it decomposes gradually at elevated temperature.
A sample of the crystallized sulfate, dried at 100 for three hours in vacuum, gave on analysis the following results: 36.73% carbon, 7.80% hpcll-og, ene. 21.12% nitrogen, 17.53% (the sulfate ion and 18520,
! 0 oxygen (by difference. Salts of the antibiotic with key inorganic acids, such as hydrochloric or sulfuric acid, are. Very soluble in water, but only slightly soluble in solvents such as methanol, acetone and ethyl ethyl inonoether - # - lycol.
The key activity of the antibiotic can. be determined by the turbidimetric method, using (the organism hlebsiella pneunioniae (PCI 602) and antibiotic test medium from the Baltimore Biological Laboratory, prepared according to the Food and Drug Administration formula for broths for turbidimetric analysis of streptomycin The test method is that of 11eMahan, .TR
(.T. Biol. Chem. 153, pages 2-19 to 258, April 1911). The crystalline sulfate of the antibiotic, before the properties stated above, is used as a standard for comparing the activities of other samples of the antibiotic and. of its solutions. The activity attributed to the sulfate is 765 which gives the free base of the antibiotic an activity of 1000. The following examples illustrate the invention.
The ringlet of Streptoinvces puniceus bearing the numbers 1311-5, as described at the beginning of the present, was used for all these examples. exposed.
EMI0008.0086
<I> L'xemy'ple <SEP> I: </I>
<tb> On. <SEP> prepares <SEP> a <SEP> medium <SEP> (the <SEP> culture <SEP> having <SEP> the
<tb> following <SEP> composition:
<tb> Soy <SEP> <SEP> flour <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP> g;
<tb> Sodium <SEP> <SEP> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Water-soluble <SEP> part <SEP> of <SEP> residue <SEP> of <SEP> distillation <SEP> of <SEP> alcohol <SEP> (1'111l <SEP> ulélarlloe
<tb> of <SEP> fermentation <SEP> O,: ï <SEP> g
<tb> l:
<SEP> to <SEP> for <SEP> to make <SEP> 1 <SEP> liter
<tb> On <SEP> rule <SEP> the <SEP> vii <SEP>; i <SEP> <B> 7,0 </B> <SEP> ave (# <SEP> -ho <SEP>> It <SEP> and
<tb> on <SEP> add
<tb> Carbonate <SEP> key <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> @Y 500 71i1 (this medium is introduced into a Fernbaeli flask of '', @ 1 and sterilized for 30 min. at 121.
After cooling, the medium is inoculated with an inoculum (S. puniceus, prepared as indicated above. The flask is shaken on a rotating apparatus having a displacement of about 62.5 nm and rotating at 200 rpm. for -1 days and at 27. It is then observed that the broth has an activity of 320 UDC per ml, with 1111 pH equal to 7.3.
The antibiotic solution thus obtained can. be used as follows, to prepare, in solid form, the sulfate of the antibiotic: The hH is adjusted to 2.0 with H.SO.t, a reduced amount of product brand Sul) ei @ -eel is added and filter the mixture.
The pH of the clarified mixture is adjusted to 5.5 and Erio chromium violet is added at the rate of 2 g per liter, with a-itant. Stirring is continued for one hour at room temperature and enough Super-ce brand product is added to allow filtration.
The cake is. separated by filtration and washed with a quantity of water corresponding to 201% of the initial volume. When. he is. dry, the cake is suspended in 1 / i2 of the original volume of 80% methanol and is decomposed with 0.5 g of BaCl. 2H20 for each gram of dye. shaking during. 2 hours at room temperature.
After filtration, the methanolic filtrate is decolorized with a small amount of charcoal and is. filtered again. To the filtrate clear as water, 2 volumes of absolute methanol and 2 ml of a 50% solution of triethylamine sulfate in methanol are added for each gram of BaC12. 2H20.
A precipitate of barium sulphate and sulphate of the antibiotic is separated by filtration using a product brand Super-eel. The cake is washed with absolute methanol and shaken with water to dissolve the antibiotic sulfate, barium sulfate, and the branded product. '# Uper-eel being. removed by filtration.
The aqueous solution, clear as water, of the sulfate of the antibiotic thus obtained is dried. The white, amorphous powder which is obtained has an activity of 40 UDC / mg. <I> Example II: </I> A culture medium is prepared having the following composition: Wheat gluten 10 g Glycerin 10 g Casein 5 g Beet molasses 2 g Corn maceration liquor 2 g Water-soluble part of the residue of dis tation of the alcohol of a fermentation mixture 2 g The pH is adjusted to 7.0 with KOH and calcium carbonate 5 g <B> El </B> is added to make 1 liter Soybean oil 1 ml. sterilizes for 45 minutes at 121.
Approximately 75 L of this medium is inoculated into a 180 L vessel fitted with a stirrer, with 2 L of an inoculum prepared as described. above, by deep cultivation of S. punicens. The temperature was maintained at 27 for 24 hours with constant agitation and the sufflation of sterile air at a rate of 1.0 to 1.5 vol. Of air per volume of broth per minute. After 24 hours, the intermediate culture thus prepared is introduced, under absolutely sterile conditions, into 560 l of the same culture medium, contained in a 9501 fermentation tank.
Agitation and aeration remain the same and after 48 hours. at 27, the broth obtained has a final activity of 100 UDC / ml. <I> Example III: </I> A culture medium is prepared having the following composition: Wheat gluten 10 g Glycerin 100, Hydrolyzed casein 5 g Beet molasses 2 g Corn maceration liquor 2 g Water-soluble part of the residue of distillation of alcohol from a fermentation mixture 2 g Water to make 1 liter The pH is adjusted to 7.0 with KOH and 5 g calcium carbonate is added. Four 2.8 L Fernbach flasks are sterilized, containing each 1 1 of this medium,
for 20 minutes at 1 \ 31. After cooling, they are inoculated with a suspension of S. puniceus et. they are shaken in a rotating device. 4-8 hours at 28. The inoculum thus prepared is. used to inoculate a 180 <B> 1 </B> fermentation tank containing 75 1 of the aforementioned medium, sterilized for 20 minutes at 121.
Stir with a propeller stirrer while maintaining pressure in the vessel and introducing sterile air into it using a dispenser. After 78 hours, the broth has an activity of 100 t DC / ml.
The antibiotic solution thus obtained can. be used as follows. to prepare, in solid form, the sulfate of the antibiotic: Broth, including. the quantity corresponds to 75 l, is separated from the mycelium by filtration, its pH is adjusted to 6.5 with H.SO, 1 and one, to it, is added 10 g of ammonium oxalate to precipitate the calcium in the form of oxalate, which is removed by filtration.
The pH of the clarified broth is then adjusted to 5.5 with I-I.SO.l and 160 - of violet is added. a.11 Erio chromium, after which the broth is stirred for an hour and a half. The salt of the dye is separated by filtration using a product brand Super eel.
The filter cake is washed with 15 L of water and dried by blowing air into the filter press. The dry product is suspended in 3 l of a mixture of 80% methanol and 20% acetone (by volume).
and <B> 250 </B> n11 of a 50% methanolic solution of triethylamine sulfate is added, the whole being stirred for one and a half hours. The precipitate comprising the sulfate of the anti-biotic and the Super-cel brand product is separated by filtration and is washed with acetone and then with methanol.
The dried cake is then stirred for half an hour in two liters of distilled water and the Super-eel brand product is separated from the sulfate solution of the antibiotic by filtration. The solution, clear as water, is dried to obtain a white and amorphous solid with an activity of 370 I \ DC / mg.