Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention est relative à un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique utile, que l'on propose d'appeler anisomycine et qui est vendu sous la marque Flagecidin . L'anti biotique peut se présenter sous la forme d'un produit dilué, d'un concentras brut et à l'état cristallisé pur. Il est particulièrement utile pour combattre des micro-organismes patho gènes, plus spécialement des champignons et des protozoaires.
Le procédé selon l'invention pour la prépa ration de ce nouvel antibiotique ayant un point de fusion de 140 - 1410 C, des maximums d'absorption dans l'ultra-violet à 224, 277 et 283,5 m#t et des pointes caractéristiques dans son spectre infrarouge aux fréquences 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 15<B>1</B>5, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, <B>1178,</B> 1036 et 962 cm-' est caractérisé en ce qu'on cultive une espèce de Streptomyces pro duisant cet antibiotique, dans des conditions d'aérobiose submergée.
Comme micro-organisme du genre Strepto myces produisant ce nouvel antibiotique, on peut utiliser le Streptomyces griseolus ou le Streptomyces roseochromogenus. Deux non- velles souches, particulièrement appropriées, de ces micro-organismes ont été identifiées par culture dans des milieux types utilisés normale ment pour une telle identification et leurs ca ractéristiques ont été comparées à celles dé crites dans le traité de Bergey Manual of Déterminative Bacteriology , 6e édition (1948).
La nouvelle souche de S. griseolus est désignée par le No- 14576-4 dans la collection des cul tures de Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y. Une culture de cette souche fut déposée à l' American Type Culture Collection Washington, D.C. et ajoutée sous le No ATCC <I>11796</I> à sa collection permanente de micro organismes.
La nouvelle souche de S. roseo- chromogenus est désignée par le No 15855-4, dans la collection des cultures de Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y.
Les caractéristiques de la nouvelle souche de S. griseolus sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. A moins qu'on ne le spécifie au trement, les résultats sont basés sur six essais de culture identiques inoculés pendant deux semaines.
Les couleurs accompagnées de la lettre R sont celles indiquées dans le traité de Ridgway Color Standards and Nomencla ture .
EMI0002.0001
<U>Tableau <SEP> I</U>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> griseolus, <SEP> ATCC <SEP> 11796</I>
<tb> Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> croissance <SEP> soluble
<tb> glucose <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> modérée <SEP> : <SEP> presque <SEP> aucun <SEP> environ <SEP> brun <SEP> crémeux <SEP> ;
<SEP> spores
<tb> asparagine <SEP> brun <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> gram-positifs, <SEP> mesurant
<tb> agar <SEP> 1-1,3 <SEP> (1,3) <SEP> X <SEP> <B>0,65 <SEP> (1,0)</B> <SEP> X <SEP> 1,3 <SEP> @,
<tb> en <SEP> spirales
<tb> gélatine <SEP> modéré <SEP> colonies <SEP> d'un <SEP> blanc <SEP> cireux <SEP> aucun <SEP> liquéfaction <SEP> modérée
<tb> crème <SEP> ; <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> ;
<tb> aucun <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> lait <SEP> écrémé <SEP> modéré <SEP> anneau <SEP> blanc <SEP> crémeux <SEP> rose <SEP> aucune <SEP> coagulation; <SEP> hydrolyse;
<tb> (280) <SEP> corail <SEP> le <SEP> <I>pH</I> <SEP> change <SEP> de <SEP> 6,4 <SEP> à <SEP> 6,9
<tb> (R)
<tb> glucose <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> ;
<SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> moyen
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> rosâtre
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> mince <SEP> et <SEP> brun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> nutritif <SEP> plat <SEP> ; <SEP> sporulation <SEP> très
<tb> ï <SEP> clair
<tb> maléate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc;
<SEP> aucun <SEP> maléate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> digéré;
<tb> calcium <SEP> à <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> modéré
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> pauvre, <SEP> presque <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux <SEP> à <SEP> gris
<tb> synthétique <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> clair
<tb> agar <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> modérée <SEP> presque <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> d'Emerson <SEP> gris <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> clair
<tb> cellulose <SEP> aucun
<tb> bouillon <SEP> modéré <SEP> aucune <SEP> réduction <SEP> des <SEP> nitrates
<tb> nitrate
<tb> dextrose
<tb> rondelles <SEP> bon <SEP> sporulation <SEP> plus <SEP> foncée <SEP> que <SEP> brun
<tb> de <SEP> pommes <SEP> gris <SEP> souris <SEP> (R)
<SEP> moyen
<tb> de <SEP> terre <SEP> à <SEP> foncé
<tb> amidon <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> brun <SEP> aucun <SEP> croissance <SEP> superficielle <SEP> jaune <SEP> ;
<tb> agar <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair <SEP> ; <SEP> zone <SEP> étroite
<tb> d'hydrolyse La nouvelle souche de S. griseolus diffère des souches déjà décrites du même micro-organisme de différentes manières qui sont indiquées dans le tableau suivant.
EMI0003.0001
<U>Tableau <SEP> II</U>
<tb> Milieu <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> ATCC <SEP> 11796 <SEP> Description <SEP> de <SEP> Bergey
<tb> gélatine <SEP> colonies <SEP> d'un <SEP> blanc <SEP> cireux <SEP> crème <SEP> (dans <SEP> pellicules <SEP> jaunâtres <SEP> et <SEP> floconneuses <SEP> avec
<tb> des <SEP> cuvettes <SEP> de <SEP> Pétri) <SEP> sédiment <SEP> (dans <SEP> des <SEP> bâtonnets <SEP> de
<tb> gélatine)
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> pauvre <SEP> presque <SEP> gris <SEP> souris <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> d'abord <SEP> gris <SEP> et
<tb> synthétique <SEP> (R) <SEP> ; <SEP> croissance <SEP> pauvre <SEP> devenant <SEP> ensuite <SEP> d'un <SEP> gris <SEP> neutre <SEP> et
<tb> pâle <SEP> ;
<SEP> croissance <SEP> superficielle <SEP> limitée
<tb> presque <SEP> entièrement <SEP> à <SEP> du <SEP> mycélium
<tb> aérien
<tb> glucose <SEP> croissance <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> croissance <SEP> étalée <SEP> ; <SEP> partie <SEP> centrale <SEP> de
<tb> agar <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> couleur <SEP> crème <SEP> prononcée <SEP> et <SEP> devenant
<tb> foncée
<tb> lait <SEP> de <SEP> (sur <SEP> du <SEP> lait <SEP> écrémé <SEP> à <SEP> 280) <SEP> croissance <SEP> croissance <SEP> abondante <SEP> ; <SEP> pellicules <SEP> roses <SEP> ;
<tb> tournesol <SEP> modérée; <SEP> anneau <SEP> blanc <SEP> crémeux; <SEP> peptonisé <SEP> ; <SEP> devient <SEP> alcalin, <SEP> coagulé
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> d'un <SEP> rose <SEP> corail <SEP> (R) <SEP> ;
<tb> aucune <SEP> coagulation <SEP> ;
<SEP> hydrolyse <SEP> ; <SEP> le <SEP> <I>pH</I>
<tb> devient <SEP> alcalin
<tb> bouillon <SEP> aucune <SEP> réduction <SEP> en <SEP> nitrites <SEP> nitrites <SEP> obtenus
<tb> dextrose
<tb> nitrate
EMI0003.0002
<U>Tableau <SEP> III</U>
<tb> <I>Caractéristiques <SEP> de <SEP> la <SEP> nouvelle <SEP> souche <SEP> de <SEP> Streptomyces <SEP> roseochromogenus <SEP> (No <SEP> 15855 <SEP> - <SEP> 4)</I>
<tb> Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> <B><U>#</U></B> <SEP> croissance <SEP> soluble
<tb> Plaques <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> jaune <SEP> aucun <SEP> colonie <SEP> légèrement <SEP> élevée <SEP> ;
<tb> glucose <SEP> cireux <SEP> le <SEP> long <SEP> du <SEP> bord <SEP> d'une <SEP> surface <SEP> plissée <SEP> ;
<SEP> envers <SEP> entre
<tb> asparagine <SEP> colonie <SEP> ; <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> jaune <SEP> abricot <SEP> (R) <SEP> et <SEP> jaune <SEP> de
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> cadmium <SEP> (R) <SEP> ; <SEP> spirales
<tb> présentes <SEP> ; <SEP> spores <SEP> ellipsoïdales,
<tb> gram-positives, <SEP> <B>0,66-0,95(0,95)</B>
<tb> X <SEP> 0,95-1,3 <SEP> (1,3) <SEP> #t; <SEP> sporulation
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> à <SEP> roux
<tb> vinacé <SEP> (R), <SEP> où <SEP> cette <SEP> sporulation
<tb> forme <SEP> des <SEP> amas;
<SEP> colonies <SEP> d'une
<tb> couleur <SEP> brun <SEP> clair <SEP> sans <SEP> spores
<tb> plaques <SEP> de <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> bonne <SEP> liquéfaction
<tb> gélatine <SEP> foncé
<tb> lait <SEP> écrémé <SEP> I <SEP> pauvre <SEP> anneau <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> plus <SEP> aucune <SEP> coagulation <SEP> ; <SEP> aucune
<tb> (28 ) <SEP> à <SEP> moyen <SEP> clair <SEP> hydrolyse <SEP> ; <SEP> le <SEP> <I>pH</I> <SEP> change <SEP> de
<tb> modéré <SEP> qu'avel- <SEP> 6,5 <SEP> à <SEP> 6,9
<tb> lave <SEP> (R)
<tb> I <SEP> I
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> pigment <SEP> Remarques
<tb> croissance <SEP> soluble
<tb> glucose <SEP> modéré <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux <SEP> ;
<SEP> mycélium <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> agar <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> la <SEP> partie <SEP> moyen
<tb> supérieure <SEP> de <SEP> la <SEP> souche <SEP> ;
<tb> aucune <SEP> sporulation
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> nutritif <SEP> à <SEP> clair <SEP> à
<tb> modéré <SEP> moyen
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> roux <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> incolore
<tb> synthétique <SEP> vinacé <SEP> (R)
<tb> maléate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> fauve <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> incolore
<tb> calcium
<tb> rondelles <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> brun
<tb> de <SEP> pommes <SEP> clair;
<SEP> sporulation <SEP> depuis <SEP> fauve <SEP> clair
<tb> de <SEP> terre <SEP> clair <SEP> vinacé <SEP> (R) <SEP> à <SEP> roux
<tb> vinacé <SEP> (R)
<tb> plaques <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> crémeux, <SEP> cireux <SEP> ; <SEP> pas <SEP> aucun <SEP> hydrolyse <SEP> pauvre <SEP> à <SEP> modérée
<tb> d'amidon <SEP> de <SEP> sporulation
<tb> bouillon <SEP> modéré <SEP> pas <SEP> de <SEP> réduction <SEP> en <SEP> nitrites
<tb> dextrose <SEP> i
<tb> nitrate
<tb> agar <SEP> modéré <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux;
<SEP> sporulation <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> (R) <SEP> à <SEP> fauve
<tb> vinacé <SEP> clair <SEP> (R)
<tb> I Les caractéristiques susdites correspondent presque entièrement à la description du Strep tomyces roseochromogenus dans le traité de Bergey.
Bien qu'on sache qu'une autre souche de S. roseochromogenus forme l'antibiotique ro- séomycine , il a été clairement établi que l'anisomycine est différente de la roséomycine, comme il résulte des particularités indiquées ci-après.
Il est évident que l'invention n'est pas li mitée à des organismes qui répondent complè tement à la description faite ci-dessus, celle-ci n'ayant été donnée qu'à titre illustratif. Elle englobe notamment l'usage des espèces mu tantes obtenues à partir des organismes décrits en ayant recours à divers moyens, par exemple une exposition aux rayons X ou aux rayons ultraviolets, l'utilisation de gaz de moutarde et analogues.
L'antibiotique anisomycine est particulière ment actif contre les protozoaires et champi gnons pathogènes. Le tableau ci-dessous montre l'activité antibiotique de l'anisomycine déter minée par des essais effectués avec divers fongi. Ces essais ont lieu en ensemençant du bouillon nutritif, contenant des concentrations différentes de l'antibiotique pur avec l'orga nisme particulier spécifié et en observant les concentrations pour lesquelles aucune crois sance ou une croissance effective a lieu.
L'anti biotique est utilisé avec des concentrations de 1, 10, 50, 100, 500 et 1000 microgrammes/mil- lilitre (mcg/ml). Chaque essai a lieu dans des conditions normalisées.
EMI0005.0001
<U>Tableau <SEP> IV</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus</I>
<tb> <I>envers <SEP> des <SEP> champignons <SEP> pathogènes</I>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> en <SEP> mcg/ml
<tb> Organisme <SEP> croissance <SEP> aucune <SEP> croissance
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B>......</B> <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> . <SEP> .
<SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans. <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> .......... <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> dermatiditis. <SEP> . <SEP> 500
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 500
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> . <SEP> . <SEP> 500
<tb> Hormodendron <SEP> compactum <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP> . <SEP> . <SEP> 500
EMI0005.0002
<I>b) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> roseochromogenus</I>
<tb> <I>envers <SEP> des <SEP> champignons <SEP> pathogènes</I>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> en <SEP> mcg/ml
<tb> Organisme <SEP> croissance <SEP> aucune <SEP> croissance
<tb> M. <SEP> canis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> M. <SEP> audouini <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> H. <SEP> capsulatum <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> Crypt. <SEP> neoformans <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> T. <SEP> sulfureum <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>------ <SEP> 10 <SEP> <I>50</I></B>
<tb> Ph. <SEP> verrucosa <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> B. <SEP> dermatiditis <SEP> <B>--------</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> Sp. <SEP> schenkii <SEP> <B>---- <SEP> -----</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> T. <SEP> violaceum <SEP> <B>--- <SEP> ------</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> H. <SEP> compactum <SEP> <B>---</B> <SEP> .
<SEP> <B>----</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> B. <SEP> brasiliensis <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> IP <SEP> indique <SEP> une <SEP> inhibition <SEP> partielle. L'activité anti-fongi de l'antibiotique ani- somycine est illustrée, en outre, par le tableau V, celui-ci montrant la concentration minimum de l'antibiotique à laquelle la croissance de souches différentes de Candida Albicans ne se produit pas. Cette concentration, exprimée en mcg/ml, est appelée concentration inhibi- toire minimum .
Une méthode normalisée est utilisée, analogue à celle décrite ci-dessus à propos du tableau<I>IV.</I> L'activité anti-fongi de l'anisomycine chez les humains n'a pas encore été démontrée.
EMI0006.0001
<U>Tableau <SEP> V</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> b) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine</I>
<tb> <I>obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> roseochromogenus</I>
<tb> <I>contre <SEP> le <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> contre <SEP> le <SEP> Candida <SEP> Albicans</I>
<tb> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitoire <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitoire
<tb> souche <SEP> No <SEP> minimum <SEP> souche <SEP> No <SEP> minimum
<tb> 8 <SEP> 3,12 <SEP> IP <SEP> 8 <SEP> 3,12
<tb> 9 <SEP> 6,25 <SEP> IP <SEP> 9 <SEP> 6,25
<tb> 11 <SEP> 3,12 <SEP> 11 <SEP> 3,12
<tb> 13 <SEP> 12,5 <SEP> 13 <SEP> 6,25
<tb> IP <SEP> indique <SEP> une <SEP> inhibition <SEP> partielle.
L'activité antiprotozoaire de l'antibiotique anisomycine est déterminée en inoculant des tubes contenant des concentrations différentes de l'antibiotique avec des protozoaires patho gènes typiques, Trichomonas vaginalis et En- damoeba histolytica et en observant le degré de mobilité et/ou de croissance des micro organismes après une incubation pendant 48 heures.
A titre comparatif, les mêmes essais ont été faits avec l'antibiotique dénommé fumagil- line, qui est connu pour son activité antipro- tozoaire. Les résultats de ces essais sont indi qués dans le tableau<I>VI</I> qui montre les degrés d'activité contre les Trichomonas en se basant sur la mobilité et la croissance observées avec des lamelles préparées à partir de tubes incubés avec les concentrations spécifiées.
EMI0006.0012
<U>Tableau <SEP> VI</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> antiprotozoaire <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus</I>
<tb> Activité <SEP> à <SEP> des <SEP> concentrations <SEP> de
<tb> Antibiotique <SEP> Protozoaire <SEP> 7,8 <SEP> mcg/ml <SEP> 3,9 <SEP> mcg/ml <SEP> 1,9 <SEP> mcg/ml
<tb> Anisomycine <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> 2+
<tb> Anisomycine <SEP> Endamoeba <SEP> -f Fumagilline <SEP> Trichomonas <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> - <SEP> Fumagilline <SEP> '\ <SEP> Endamoeba <SEP> - <SEP> - <SEP> <B>*</B> <SEP> Aucune <SEP> activité <SEP> n'est <SEP> observée <SEP> en <SEP> dessous <SEP> de <SEP> 15,6 <SEP> mcg/ml.
<tb> <I>b) <SEP> Activité <SEP> antiprotozoaire <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S.
<SEP> roseochromogenus</I>
<tb> Activité <SEP> à <SEP> des <SEP> concentrations <SEP> de
<tb> Antibiotique <SEP> Protozoaire <SEP> 7,8 <SEP> mcg/ml <SEP> 3,9 <SEP> mcglml <SEP> 1,9 <SEP> mcg/ml
<tb> Anisomycine <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -f- <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 4
<tb> 4 <SEP> -t- <SEP> 3 <SEP> -F- <SEP> 2+
<tb> Anisomycine <SEP> Endamoeba <SEP> -I- <SEP> -f- <SEP> -h Pour déterminer l'activité contre le Trichomo nas, le chiffre 4 -I- indique une activité inhi- bitoire complète des antibiotiques essayés, c'est-à-dire une mobilité et une croissance nulles du micro-organisme ; le chiffre 3 -f- indique une activité marquée de l'antibiotique ou une mobilité et/ou une croissance réduite ;
le chiffre 2 -I- indique une activité modérée ; -I- indique une activité légère et (-) indique une activité nulle. L'activité contre l'Endamoeba est déter minée en comparant le nombre de cellules dans des tubes de repère au nombre de cellules dans des tubes contenant les antibiotiques avec les concentrations indiquées, les tubes marqués par le signe (-I-) ayant une activité inhibitoire complète et ceux marqués par le signe (-) n'ayant aucune activité.
ll résulte du tableau ci-dessus que l'antibio tique anisomycine est fortement actif contre le Trichomonas et l'Endamoeba. Par ailleurs, les résultats montrent que l'antibiotique est beaucoup plus actif contre ces organismes que la fumagilline.
On n'a observé aucune activité de l'antibio tique anisomycine contre les mycobactéries saprophytiques quand des concentrations de l'antibiotique allant jusqu'à 100 mcg/ml sont essayées contre les espèces M. ranae, phlei, smegmatis, No 607, berolinense et butyricum. Une légère activité seulement est observée contre divers micro-organismes gram-positifs et gram-négatifs.
On a constaté que l'antibiotique anisomy- cine ne possède qu'un degré de toxicité relati vement bas quand il est utilisé pour des essais avec des animaux. Par exemple l'indice LDo, quand l'antibiotique est administré, par voie intraveineuse, à des souris, en solution aqueuse, est d'environ 2 mg/20 g de souris.
Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, l'antibiotique anisomycine est pro duit pendant la culture du micro-organisme S. griseolus <I>ATCC-11796</I> ou du micro-orga nisme S. roseochromogenus N 15855-4 dans un milieu nutritif aqueux à une température d'environ 24-300, dans des conditions d'aéro biose submergée et sous agitation.
Des milieux nutritifs qui sont utiles pour ces méthodes contiennent un hydrate de carbone, tel que du sucre, de l'amidon, de la farine de blé, ou de la glycérine, une source d'azote organique, telle que la caséine, la farine de soja, la farine d'arachides, le gluten de blé, la farine de graines de coton, la lactalbumine, un produit de digestion enzymatique de la caséine, du tryptone. Une source d'activateurs de la culture, telle que des résidus de la distillation, d'hydrates de carbone fermentés, de l'extrait de levure, des résidus de la fermentation de mélasses ainsi que des sels minéraux, tels que du chlorure de sodium, du sulfate de ma gnésium et des oligo-éléments, tels que le cuivre, le zinc et le fer, peuvent également être utilisés avec des résultats favorables.
S'il se produit une formation excessive de mousses au cours de la fermentation, des agents anti- mousse, tels que des huiles végétales, peuvent être ajoutés au milieu de fermentation. Le<I>pH</I> de la fermentation tend à rester constant mais si des variations se produisent, on peut également ajouter au milieu un agent tampon, tel que le carbonate de calcium.
Un inoculum pour la préparation de l'anti biotique anisomycine par la culture du S. gri- seolus ou S. roseochromogenus peut être obtenu en utilisant des cultures de souches sur des mi lieux tels que l'agar d'Emerson ou du bouillon de viande avec de la lactose. La culture peut être utilisée pour inoculer des flacons secoués ou des cuves à inoculum pour la culture sub mergée. Suivant une variante, les cuves à ino- culum peuvent être ensemencées à l'aide de cultures obtenues dans des flacons secoués.
La culture du micro-organisme atteint générale ment son maximum après environ deux ou trois jours. Toutefois, en faisant varier les appareils utilisés, le degré d'aération, le degré d'agita tion, etc., on peut agir sur la vitesse à laquelle l'activité maximum est atteinte. En général, on continue la fermentation jusqu'à ce que le mi lieu présente une activité antimicrobienne substantielle, une période comprise entre 24 heures et 4 jours étant suffisante dans la plupart des cas. L'aération du milieu dans les cuves pour une culture submergée se fait avec un débit d'environ un demi à deux volumes d'air libre par volume de bouillon et par minute.
L'agitation peut se faire à l'aide d'agitateurs de genres appropriés qui sont bien connus de ceux qui s'occupent des industries de fermentation. Des conditions aseptiques doivent, bien en tendu, être maintenues pendant le transfert de l'inoculum et pendant la croissance du micro organisme.
Après la croissance du micro-organisme, le mycélium, qui est généralement très abon dant et fin, peut être séparé du bouillon de fermentation à l'aide de divers appareils tels que des filtres-presses, centrifuges, etc. Ensuite, l'antibiotique peut être séparé du bouillon -de fermentation par plusieurs méthodes diffé rentes. Suivant une variante, tout le bouillon peut être utilisé tel quel ou il peut être séché. L'antibiotique peut être purifié davantage de différentes manières.
Il peut être extrait, par exemple, d'une solution aqueuse à un<I>pH</I> neutre ou légèrement alcalin, compris de pré férence entre environ 6 et environ 10, en se servant de divers solvants organiques non mis cibles à l'eau, comprenant des éthers, des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs, des hydrocar bures halogénés et des mélanges de ceux-ci. A titre d'exemple on cite l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthyl-isobutyl-cétone, le butanol et le chlo roforme. L'antibiotique peut être extrait de la plupart des solutions dans un solvant par de l'eau acidifiée ayant, de préférence, un<I>pH</I> in férieur à environ- 2;5.
Si on le désire, l'extrait dans le solvant peut être concentré avant d'être extrait à nouveau par l'eau acidifiée. En réglant le<I>pH</I> à la neutralité ou l'alcalinité, l'antibio tique peut être extrait à nouveau dans un des solvants indiqués plus haut. Après séchage du solvant et concentration de la solution, l'anti biotique cristallise sous la forme de longues aiguilles blanches. Le produit peut être recris- tallisé en refroidissant une solution de ce pro duit dans un butanol chaud, de l'acétate d'éthyle, du benzène et du bichlorure d'éthylène.
D'autres méthodes de récupération, qui sont évidentes, comprennent l'absorption sur du charbon de bois avec lavage subséquent, le traitement par des résines échangeuses d'ions et la chromatographie sur des colonnes d'alumine.
L'antibiotique anisomycine est un composé basique et organique blanc qui est soluble dans des acides aqueux dilués tout en étant modéré ment soluble dans l'eau. Il est très soluble dans plusieurs solvants organiques tels que le métha nol, l'éthanol, l'acétone, le dioxane et le chlo roforme. Il est insoluble dans l'hexane, le cyclohexane, le tétrachlorure de carbone et l'éther. Le composé conserve sa stabilité pen dant plusieurs heures à la température ambiante dans une zone étendue de<I>pH.</I> Par contre, il est très instable en étant chauffé dans une solu tion acide.
Il est stable à l'état sec ou en étant dissous dans des solvants, secs. L'antibiotique cristallisé a un point de fusion d'environ 140- 141o. Il présente trois maximums d'absorption dans l'ultraviolet, respectivement à 224, 277 et 283,5 m#x (3,34 mg dans ml de méthanol). Quand il est dissous dans le chloroforme, l'an tibiotique présente plusieurs pointes caracté ristiques dans son spectre infrarouge, les pointes les plus significatives se présentant aux fré quences suivantes (en cm-1) : 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 1515, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, 1178, 1036 et 962.
La fi-. 1 montre le spectre infra rouge du nouvel antibiotique, sous forme de base libre pour les fréquences comprises entre 5000 et<B>1100</B> cm-', les abscisses inférieures correspondant à ces fréquences exprimées en microns et les abscisses supérieures en cm-' (I/cm-1) alors que les ordonnées donnent la transmittance en o/o. La fig. 1 A montre le même spectre mais pour des fréquences com prises entre 1100 et 625 cm-'. La base, dissoute dans du méthanol (0,10/0) après l'établissement de l'équilibre, a un [a]25 = - 30,0 .
Lorsque la base est dissoute dans du chloroforme (0,1 0/0) elle présente un pouvoir rotatoire [a]25 = - 450 3o.
Un échantillon d'anisomycine obtenu à par tir de S. griseolus et cristallisé hors de l'acétate d'éthyle, a été séché pendant trois heures à 56o, sans perte de poids. L'antibiotique est en suite analysé et on constate qu'il comprend les éléments suivants, en o/o en poids : carbone 63,55 ; hydrogène 7,27 ; azote 5,20 et oxy gène (par différence) 23,98.
Le poids moléculaire de l'antibiotique ani- somycine obtenu à partir du S. roseochromo- genus, ce poids ayant été déterminé par la mé thode ébullioscopique, correspond à 276.
Un échantillon de cette anisomycine, qui a été cristallisé hors de l'acétate d'éthyle, est sé ché pendant trois heures à 56 sans perte de poids. L'antibiotique cristallisé et séché est ensuite analysé et on trouve qu'il comprend les éléments suivants, en % en poids : carbone 63,51 ; hydrogène 7,21 ; azote 5.22 et oxygène (par différence) 24,06.
Les analyses ci-dessus correspondent à la formule empirique probable CIAON04 pour l'antibiotique basique. L'antibiotique anisomycine se distingue nettement des autres antibiotiques par ses pro priétés, ce qui est mis en évidence par les pro priétés indiquées ci-dessus et par des mesures faites sur papier chromatographique. Des sels utiles de l'antibiotique peuvent être préparés par des méthodes bien connues des spécialistes, par exemple par traitement de la base avec un acide approprié en solution aqueuse ou dans des conditions anhydres.
Par exemple, le chlor- hydrate peut être préparé en dissolvant la base dans l'acétone et en faisant passer de l'acide chlorhydrique gazeux dans la solution. D'autres acides, tels que l'acide sulfurique ou phosphorique, peuvent être utilisés pour pré parer des sels d'acides de l'antibiotique.
L'invention est illustrée par les exemples suivants <I>Exemple 1</I> On prépare un milieu nutritif avec les ma tières suivantes dans un litre d'eau.
Glucose ( Cérélose )<B>-------</B> .<B>....</B> 10 g Amidon de blé . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Caséine hydrolysée ( N-Z Amine B ) 5 Résidus de fermentation de mélasse produit marque Curbay BG . . 5 Farine de soja<B>............ . -----<I>15</I></B> Chlorure de sodium . . . . . . . . . . . . . . 1 Après avoir réglé le<I>pH</I> du mélange à 7 à l'aide d'hydroxyde de potassium, on ajoute un gramme de carbonate de calcium et on fait passer de la vapeur d'eau dans le mélange pen dant environ 30 à 45 minutes pour stériliser celui-ci.
Une culture de la nouvelle souche de S. griseolus est transférée dans 100 ml du mi lieu susdit dans un flacon d'Erlenmeyer de 300 ml et on secoue le flacon pendant 45 heures jusqu'à ce qu'une bonne croissance soit obtenue. On prépare un inoculum pour la fer mentation d'une quantité plus grande en trans férant le contenu du flacon susdit, dans des conditions aseptiques, dans un litre du même milieu contenu dans un flacon de 3 litres que l'on secoue pendant 48 heures.
On prépare et on stérilise 190 litres du mi lieu nutritif comme indiqué plus haut et ce mi- lieu est inoculé avec l'inoculum ainsi préparé. L'organisme est ensuite cultivé dans des con ditions d'aérobiose submergée et sous agitation, pendant une période de trois jours. Le<I>pH</I> du bouillon de fermentation est réglé à environ 2 avec de l'acide sulfurique concentré, le bouil lon est filtré avec du produit marque Super- cel pour en séparer le mycélium. Ensuite, on règle le<I>pH</I> du filtrat à 9 avec de l'hydroxyde de sodium concentré et on l'extrait deux fois avec 57 litres de chloroforme.
Les extraits de chloroforme combinés sont concentrés et extraits avec de l'eau acidifiée à <I>pH 2</I> avec de l'acide sulfurique. Ensuite, la solution aqueuse acidifiée est concentrée et son <I>pH</I> est réglé à 9 en y ajoutant de l'hydroxyde de sodium: L'antibiotique est extrait à nouveau avec du chloroforme que l'on évapore jusqu'à réduire le volume à 50 m1. Après addition d'un volume égal de cyclohexane et après une nou velle évaporation, on provoque la cristallisa tion de l'antibiotique brut et on le récupère par filtration.
L'antibiotique brut est purifié en le dissolvant dans l'acétate d'éthyle, en traitant la solution obtenue avec du charbon actif et en évaporant l'acétate d'éthyle ce qui donne l'an tibiotique anisomycine sous la forme de longs cristaux blancs.
<I>Exemple 11:</I> Une souche de S. roseochromogenus sur de l'agar d'Emerson est cultivée, dans des condi tions contrôlées, en vue d'obtenir des spores dont on se sert pour inoculer un milieu nutritif ayant la composition suivante Glucose ( Cérélose ) . . . . . . . . . . . . 10 g Farine de soja<B>......</B> .<B>.......</B> .. .. 10 Chlorure de sodium . . . . . . . . . . . . 5 Résidus de fermentation de mélasses produit marque Curbay BG . . 5 Amidon de blé . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Ce mélange de matières nutritives est dilué avec de l'eau jusqu'à avoir un volume d'un litre, on règle le<I>pH à 7</I> avec de l'hydroxyde de po- tassium, on ajoute 0,1 % de carbonate de cal- cium qui agit comme tampon et on soumet l'ensemble à la stérilisation par la chaleur. Le milieu est ensuite refroidi et les spores sont ajoutés dans des conditions aseptiques. La cul ture de l'organisme a lieu dans des flacons secoués à environ 280 pendant une période de deux jours.
Le mélange de bouillon et de mycélium ainsi formé est utilisé pour inoculer 57 litres d'un milieu de fermentation stérile ayant, en substance, la même composition que celui indi qué plus haut. On soumet le mélange à une agitation et à une aération dans des conditions stériles pendant deux jours à environ 28(). En suite en sépare le mycélium à l'aide de produit marque Supercel et on concentre le bouil lon dans le vide jusqu'à ce qu'il ait un volume de 11,5 litres. Ce concentrat est extrait plu sieurs fois avec de l'acétate d'éthyle.
Les phases de solvant mélangées, dont la quantité correspond à environ 57 litres, sont concentrées sous vide jusqu'à avoir un volume de 1,5 litre et le concentrat est secoué 5 fois avec des por tions de 100 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. Le<I>pH</I> de la solution acide, contenant l'antibio tique, est réglé à 9,0 avec de l'hydroxyde de sodium et la solution est ensuite extraite dix fois avec des portions de 250 ml d'éther. L'éther est séparé dans le vide et l'eau restante est enlevée par distillation azéotropique avec du benzène.
Après concentration du distillat et après séparation du benzène, l'antibiotique cris tallise et peut être séparé par filtration. L'anti biotique est cristallisé à nouveau par dissolution dans de l'acétate d'éthyle chaud, par traite ment subséquent avec du charbon actif et par refroidissement de la solution obtenue. Le pro duit, cristallisé sous la forme de longues aiguilles blanches, est filtré, séché et essayé comme in diqué plus haut. Ce produit est très actif contre les protozoaires et champignons pathogènes.
On constate que l'antibiotique ainsi préparé est identique à celui obtenu comme décrit dans l'exemple 1 en se basant sur les spectres d'ab sorption dans l'infrarouge et l'ultraviolet, sur des mesures faites au papier chromatographique et sur le point de fusion mixte des produits mé langés. Ceci a été confirmé par les spectres microbiens et par d'autres caractéristiques phy siques et chimiques obtenues au cours d'essais faits avec des produits dérivés de souches du S. roseochromogenus et du S. griseolus dont question plus haut.
Les légères différences exis tant entre les résultats d'essai indiqués plus haut se trouvent entre les limites d'erreurs expé rimentales et n'affectent aucunement la con clusion de produits identiques.
Process for preparing a novel antibiotic The invention relates to a process for preparing a novel useful antibiotic, which is proposed to be called anisomycin and which is sold under the trademark Flagecidin. The anti-biotic can be in the form of a diluted product, a crude concentrate and in a pure crystalline state. It is particularly useful for combating pathogenic microorganisms, more especially fungi and protozoa.
The process according to the invention for the preparation of this novel antibiotic having a melting point of 140 - 1410 C, absorption maxima in the ultraviolet at 224, 277 and 283.5 m # t and peaks characteristics in its infrared spectrum at frequencies 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 15 <B> 1 </B> 5, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, <B> 1178 , </B> 1036 and 962 cm- 'is characterized in that a species of Streptomyces producing this antibiotic is cultivated under conditions of submerged aerobiosis.
As microorganism of the genus Strepto myces producing this novel antibiotic, it is possible to use Streptomyces griseolus or Streptomyces roseochromogenus. Two new, particularly suitable strains of these microorganisms were identified by culturing in standard media normally used for such identification and their characteristics were compared with those described in the Bergey Manual of Determinative Bacteriology. , 6th edition (1948).
The new strain of S. griseolus is designated as No. 14576-4 in the Chas cultures collection. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y. A culture of this strain was deposited in the American Type Culture Collection Washington, D.C. and added as ATCC No. <I> 11796 </I> to its permanent collection of microorganisms.
The new strain of S. roseochromogenus is designated as No. 15855-4 in the Chas culture collection. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y.
The characteristics of the new strain of S. griseolus are shown in Table 1 below. Unless otherwise specified, results are based on six identical culture trials inoculated for two weeks.
Colors marked with the letter R are those indicated in the Ridgway Color Standards and Nomenclature treatise.
EMI0002.0001
<U> Table <SEP> I </U>
<tb> <I> Streptomyces <SEP> griseolus, <SEP> ATCC <SEP> 11796 </I>
<tb> Medium <SEP> Degree <SEP> of <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> and <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarks
<tb> soluble <SEP> growth
<tb> glucose <SEP> moderate <SEP> sporulation <SEP> moderate <SEP>: <SEP> almost <SEP> none <SEP> approximately <SEP> brown <SEP> creamy <SEP>;
<SEP> spores
<tb> asparagine <SEP> brown <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> gram-positive, <SEP> measuring
<tb> agar <SEP> 1-1.3 <SEP> (1.3) <SEP> X <SEP> <B> 0.65 <SEP> (1.0) </B> <SEP> X < SEP> 1.3 <SEP> @,
<tb> in <SEP> spirals
<tb> gelatin <SEP> moderate <SEP> colonies <SEP> of a white <SEP> <SEP> waxy <SEP> none <SEP> liquefaction <SEP> moderate
<tb> cream <SEP>; <SEP> none <SEP> sporulation <SEP>;
<tb> none <SEP> aerial <SEP> mycelium
<tb> skimmed <SEP> milk <SEP> moderate <SEP> ring <SEP> white <SEP> creamy <SEP> pink <SEP> none <SEP> coagulation; <SEP> hydrolysis;
<tb> (280) <SEP> coral <SEP> the <SEP> <I> pH </I> <SEP> changes <SEP> from <SEP> 6.4 <SEP> to <SEP> 6.9
<tb> (R)
<tb> glucose <SEP> good <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> white <SEP>;
<SEP> brown <SEP> reverse <SEP> medium brown <SEP>
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> pinkish
<tb> agar <SEP> poor <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> thin <SEP> and <SEP> brown <SEP> backing <SEP> white <SEP> creamy
<tb> nutritious <SEP> dish <SEP>; <SEP> sporulation <SEP> very
<tb> ï <SEP> clear
<tb> maleate <SEP> of <SEP> poor <SEP> mycelium <SEP> white <SEP>;
<SEP> none <SEP> maleate <SEP> of <SEP> calcium <SEP> digested;
<tb> calcium <SEP> to <SEP> none <SEP> sporulation <SEP> towards <SEP> white <SEP> creamy
<tb> moderate
<tb> agar <SEP> poor <SEP> sporulation <SEP> poor, <SEP> almost <SEP> none <SEP> towards <SEP> white <SEP> creamy <SEP> to <SEP> gray
<tb> synthetic <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> light
<tb> agar <SEP> moderate <SEP> sporulation <SEP> moderate <SEP> almost <SEP> brown <SEP> backwards <SEP> brown <SEP> light
Emerson <tb> <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> (R) <SEP> light
<tb> cellulose <SEP> none
<tb> broth <SEP> moderate <SEP> no <SEP> reduction <SEP> of <SEP> nitrates
<tb> nitrate
<tb> dextrose
<tb> washers <SEP> good <SEP> sporulation <SEP> more <SEP> dark <SEP> than <SEP> brown
<tb> from <SEP> apples <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> (R)
<SEP> medium
<tb> from <SEP> earth <SEP> to dark <SEP>
<tb> starch <SEP> moderate <SEP> sporulation <SEP> almost <SEP> brown <SEP> none <SEP> growth <SEP> superficial <SEP> yellow <SEP>;
<tb> agar <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> backwards <SEP> brown <SEP> light <SEP>; <SEP> narrow <SEP> zone
<tb> hydrolysis The new strain of S. griseolus differs from the already described strains of the same microorganism in different ways which are indicated in the following table.
EMI0003.0001
<U> Table <SEP> II </U>
<tb> Medium <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> ATCC <SEP> 11796 <SEP> Description <SEP> of <SEP> Bergey
<tb> gelatin <SEP> colonies <SEP> of a <SEP> white <SEP> waxy <SEP> cream <SEP> (in <SEP> films <SEP> yellowish <SEP> and <SEP> flaky <SEP> with
<tb> of the <SEP> cuvettes <SEP> of <SEP> Petri) <SEP> sediment <SEP> (in <SEP> of <SEP> sticks <SEP> of
<tb> gelatin)
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> poor <SEP> almost <SEP> gray <SEP> mouse <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> first <SEP> gray <SEP> and
<tb> synthetic <SEP> (R) <SEP>; <SEP> growth <SEP> poor <SEP> becoming <SEP> then <SEP> of a gray <SEP> <SEP> neutral <SEP> and
<tb> pale <SEP>;
<SEP> growth <SEP> shallow <SEP> limited
<tb> almost <SEP> entirely <SEP> to <SEP> of <SEP> mycelium
aerial <tb>
<tb> glucose <SEP> growth <SEP> good <SEP>; <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> growth <SEP> spread <SEP>; <SEP> central <SEP> part <SEP> of
<tb> agar <SEP> white <SEP>; <SEP> none <SEP> sporulation <SEP> cream color <SEP> <SEP> pronounced <SEP> and <SEP> becoming
dark <tb>
<tb> milk <SEP> from <SEP> (on <SEP> from <SEP> skimmed <SEP> milk <SEP> to <SEP> 280) <SEP> growth <SEP> growth <SEP> abundant <SEP>; <SEP> <SEP> pink dandruff <SEP>;
<tb> sunflower <SEP> moderate; <SEP> creamy white <SEP> ring <SEP>; <SEP> Peptonized <SEP>; <SEP> becomes <SEP> alkaline, <SEP> coagulated
<tb> soluble <SEP> pigment <SEP> of a pink <SEP> <SEP> coral <SEP> (R) <SEP>;
<tb> none <SEP> coagulation <SEP>;
<SEP> hydrolysis <SEP>; <SEP> the <SEP> <I> pH </I>
<tb> becomes alkaline <SEP>
<tb> broth <SEP> no <SEP> reduction <SEP> in <SEP> nitrites <SEP> nitrites <SEP> obtained
<tb> dextrose
<tb> nitrate
EMI0003.0002
<U> Table <SEP> III </U>
<tb> <I> Characteristics <SEP> of <SEP> the <SEP> new <SEP> strain <SEP> of <SEP> Streptomyces <SEP> roseochromogenus <SEP> (No <SEP> 15855 <SEP> - <SEP > 4) </I>
<tb> Medium <SEP> Degree <SEP> of <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> and <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarks
<tb> <B><U>#</U> </B> <SEP> soluble <SEP> growth
<tb> Plates <SEP> moderate <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> white <SEP>; <SEP> yellow <SEP> none <SEP> colony <SEP> slightly <SEP> high <SEP>;
<tb> glucose <SEP> waxy <SEP> the <SEP> long <SEP> of the <SEP> edge <SEP> of a <SEP> surface <SEP> pleated <SEP>;
<SEP> towards <SEP> between
<tb> asparagine <SEP> colony <SEP>; <SEP> sporulation <SEP> almost <SEP> yellow <SEP> apricot <SEP> (R) <SEP> and <SEP> yellow <SEP> of
<tb> fawn <SEP> vinaceous <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> cadmium <SEP> (R) <SEP>; <SEP> spirals
<tb> present <SEP>; <SEP> ellipsoidal <SEP> spores,
<tb> gram-positive, <SEP> <B> 0.66-0.95 (0.95) </B>
<tb> X <SEP> 0.95-1.3 <SEP> (1.3) <SEP> #t; <SEP> sporulation
<tb> fawn <SEP> vinaceous <SEP> pale <SEP> (R) <SEP> to <SEP> red
<tb> vinaceous <SEP> (R), <SEP> where <SEP> this <SEP> sporulation
<tb> <SEP> form of <SEP> clusters;
<SEP> colonies <SEP> of a
<tb> color <SEP> brown <SEP> light <SEP> without <SEP> spores
<tb> plates <SEP> of <SEP> good <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> white <SEP> brown <SEP> good <SEP> liquefaction
<tb> gelatin <SEP> dark
<tb> skimmed <SEP> milk <SEP> I <SEP> poor <SEP> ring <SEP> yellow <SEP> light <SEP> to <SEP> brown <SEP> plus <SEP> none <SEP> coagulation <SEP >; <SEP> none
<tb> (28) <SEP> to <SEP> medium <SEP> clear <SEP> hydrolysis <SEP>; <SEP> the <SEP> <I> pH </I> <SEP> changes <SEP> from
<tb> moderate <SEP> than avel- <SEP> 6.5 <SEP> to <SEP> 6.9
<tb> lava <SEP> (R)
<tb> I <SEP> I
EMI0004.0001
Medium <SEP> Degree <SEP> of <SEP> Mycelium <SEP> aerial <SEP> and <SEP> sporulation <SEP> pigment <SEP> Remarks
<tb> soluble <SEP> growth
<tb> glucose <SEP> moderate <SEP> light brown <SEP>, <SEP> waxy <SEP>;
<SEP> mycelium <SEP> brown <SEP> reverse <SEP> brown <SEP> light
<tb> agar <SEP> aerial <SEP> white <SEP> to <SEP> the <SEP> part <SEP> medium
<tb> superior <SEP> of <SEP> the <SEP> strain <SEP>;
<tb> none <SEP> sporulation
<tb> agar <SEP> poor <SEP> brown <SEP> light, <SEP> waxy <SEP> brown <SEP> reverse <SEP> brown <SEP> light
<tb> nutritious <SEP> to <SEP> clear <SEP> to
<tb> moderate <SEP> medium
<tb> agar <SEP> poor <SEP> sporulation <SEP> almost <SEP> red <SEP> none <SEP> towards <SEP> almost <SEP> colorless
<tb> synthetic <SEP> vinaceous <SEP> (R)
<tb> maleate <SEP> of <SEP> poor <SEP> sporulation <SEP> almost <SEP> fawn <SEP> (R) <SEP> none <SEP> towards <SEP> almost <SEP> colorless
<tb> calcium
<tb> washers <SEP> moderate <SEP> mycelium <SEP> aerial <SEP> white <SEP> to <SEP> gray <SEP> brown
<tb> from <SEP> apples <SEP> clear;
<SEP> sporulation <SEP> from <SEP> fawn <SEP> clear
<tb> from <SEP> earth <SEP> clear <SEP> vinaceous <SEP> (R) <SEP> to <SEP> red
<tb> vinaceous <SEP> (R)
<tb> plates <SEP> poor <SEP> white <SEP> creamy, <SEP> waxy <SEP>; <SEP> not <SEP> none <SEP> hydrolysis <SEP> poor <SEP> to <SEP> moderate
<tb> starch <SEP> from <SEP> sporulation
<tb> broth <SEP> moderate <SEP> no <SEP> of <SEP> reduction <SEP> in <SEP> nitrites
<tb> dextrose <SEP> i
<tb> nitrate
<tb> agar <SEP> moderate <SEP> light brown <SEP>, <SEP> waxy;
<SEP> sporulation <SEP> against <SEP> light brown <SEP>
<tb> fauve <SEP> vinaceous <SEP> (R) <SEP> to <SEP> fauve
<tb> vinaceous <SEP> clear <SEP> (R)
<tb> I The above characteristics correspond almost entirely to the description of Strep tomyces roseochromogenus in Bergey's treatise.
Although another strain of S. roseochromogenus is known to form the antibiotic roseomycin, it has been clearly established that anisomycin is different from roseomycin, as results from the particularities given below.
It is obvious that the invention is not limited to organisms which completely correspond to the description given above, the latter having been given only by way of illustration. It particularly encompasses the use of mutant species obtained from the organisms described by resorting to various means, for example exposure to X-rays or ultraviolet rays, the use of mustard gas and the like.
The antibiotic anisomycin is particularly active against pathogenic protozoa and fungi. The table below shows the antibiotic activity of anisomycin determined by tests carried out with various fungi. These tests are performed by inoculating nutrient broth, containing different concentrations of the pure antibiotic with the particular organism specified, and observing the concentrations at which no growth or effective growth takes place.
The anti-biotic is used in concentrations of 1, 10, 50, 100, 500 and 1000 micrograms / milliliter (mcg / ml). Each test takes place under standardized conditions.
EMI0005.0001
<U> Table <SEP> IV </U>
<tb> <I> a) <SEP> Activity <SEP> of <SEP> anisomycin <SEP> obtained <SEP> at average <SEP> <SEP> of <SEP> S. <SEP> griseolus </ I >
<tb> <I> towards <SEP> of <SEP> fungi <SEP> pathogens </I>
<tb> Concentration <SEP> of <SEP> the antibiotic <SEP> in <SEP> mcg / ml
<tb> Organism <SEP> growth <SEP> no <SEP> growth
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B> ...... </B> <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP>. <SEP>.
<SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans. <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> .......... <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> dermatiditis. <SEP>. <SEP> 500
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 500
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP>. <SEP>. <SEP> 500
<tb> Hormodendron <SEP> compactum <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP>. <SEP>. <SEP> 500
EMI0005.0002
<I> b) <SEP> Activity <SEP> of <SEP> anisomycin <SEP> obtained <SEP> at the average <SEP> <SEP> of <SEP> S. <SEP> roseochromogenus </I>
<tb> <I> towards <SEP> of <SEP> fungi <SEP> pathogens </I>
<tb> Concentration <SEP> of <SEP> the antibiotic <SEP> in <SEP> mcg / ml
<tb> Organism <SEP> growth <SEP> no <SEP> growth
<tb> M. <SEP> canis <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> M. <SEP> audouini <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> H. <SEP> capsulatum <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> Crypt. <SEP> neoformans <SEP> <B> ... </B> <SEP>. <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> T. <SEP> sulfureum <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> ------ <SEP> 10 <SEP> <I>50</I> </B>
<tb> Ph. <SEP> verrucosa <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> B. <SEP> dermatiditis <SEP> <B> -------- </B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> Sp. <SEP> schenkii <SEP> <B> ---- <SEP> ----- </B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> T. <SEP> violaceum <SEP> <B> --- <SEP> ------ </B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> H. <SEP> compactum <SEP> <B> --- </B> <SEP>.
<SEP> <B> ---- </B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> B. <SEP> brasiliensis <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> IP <SEP> indicates <SEP> a partial <SEP> inhibition <SEP>. The anti-fungus activity of the antibiotic ani- somycin is further illustrated by Table V, this showing the minimum concentration of the antibiotic at which growth of different strains of Candida Albicans does not occur. This concentration, expressed in mcg / ml, is called the minimum inhibitory concentration.
A standard method is used, analogous to that described above in connection with Table <I> IV. </I> The anti-fungus activity of anisomycin in humans has not yet been demonstrated.
EMI0006.0001
<U> Table <SEP> V </U>
<tb> <I> a) <SEP> <SEP> activity of <SEP> anisomycin <SEP> b) <SEP> <SEP> activity of <SEP> anisomycin </I>
<tb> <I> obtained <SEP> at average <SEP> <SEP> of <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> obtained <SEP> at average <SEP> <SEP> of <SEP> S. < SEP> roseochromogenus </I>
<tb> <I> against <SEP> the <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> against <SEP> the <SEP> Candida <SEP> Albicans </I>
<tb> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitory <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitory
<tb> strain <SEP> No <SEP> minimum <SEP> strain <SEP> No <SEP> minimum
<tb> 8 <SEP> 3.12 <SEP> IP <SEP> 8 <SEP> 3.12
<tb> 9 <SEP> 6.25 <SEP> IP <SEP> 9 <SEP> 6.25
<tb> 11 <SEP> 3.12 <SEP> 11 <SEP> 3.12
<tb> 13 <SEP> 12.5 <SEP> 13 <SEP> 6.25
<tb> IP <SEP> indicates <SEP> a partial <SEP> inhibition <SEP>.
The antiprotozoal activity of the antibiotic anisomycin is determined by inoculating tubes containing different concentrations of the antibiotic with typical pathogen protozoa, Trichomonas vaginalis and En- damoeba histolytica and observing the degree of mobility and / or growth of the cells. microorganisms after incubation for 48 hours.
For comparison, the same tests were carried out with the antibiotic called fumagillin, which is known for its antiprotozoal activity. The results of these tests are shown in Table <I> VI </I> which shows the levels of activity against Trichomonas based on the mobility and growth observed with coverslips prepared from tubes incubated with the specified concentrations.
EMI0006.0012
<U> Table <SEP> VI </U>
<tb> <I> a) <SEP> Antiprotozoal <SEP> activity <SEP> of <SEP> anisomycin <SEP> obtained <SEP> at the mean <SEP> <SEP> of <SEP> S. <SEP> griseolus </I>
<tb> Activity <SEP> to <SEP> of <SEP> concentrations <SEP> of
<tb> Antibiotic <SEP> Protozoa <SEP> 7,8 <SEP> mcg / ml <SEP> 3.9 <SEP> mcg / ml <SEP> 1.9 <SEP> mcg / ml
<tb> Anisomycin <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> 2+
<tb> Anisomycin <SEP> Endamoeba <SEP> -f Fumagillin <SEP> Trichomonas <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> - <SEP> Fumagillin <SEP> '\ <SEP> Endamoeba <SEP> - < SEP> - <SEP> <B> * </B> <SEP> No <SEP> activity <SEP> is <SEP> observed <SEP> in <SEP> below <SEP> of <SEP> 15.6 <SEP> mcg / ml.
<tb> <I> b) <SEP> Antiprotozoal <SEP> activity <SEP> of <SEP> anisomycin <SEP> obtained <SEP> at the average <SEP> <SEP> of <SEP> S.
<SEP> roseochromogenus </I>
<tb> Activity <SEP> to <SEP> of <SEP> concentrations <SEP> of
<tb> Antibiotic <SEP> Protozoan <SEP> 7.8 <SEP> mcg / ml <SEP> 3.9 <SEP> mcglml <SEP> 1.9 <SEP> mcg / ml
<tb> Anisomycin <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -f- <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 4
<tb> 4 <SEP> -t- <SEP> 3 <SEP> -F- <SEP> 2+
<tb> Anisomycin <SEP> Endamoeba <SEP> -I- <SEP> -f- <SEP> -h To determine activity against Trichomo nas, the number 4 -I- indicates complete inhibitory activity of antibiotics tested, that is, zero mobility and growth of the microorganism; the number 3 -f- indicates marked activity of the antibiotic or reduced mobility and / or growth;
the number 2 -I- indicates moderate activity; -I- indicates light activity and (-) indicates zero activity. Activity against Endamoeba is determined by comparing the number of cells in marker tubes to the number of cells in tubes containing the antibiotics with the concentrations indicated, the tubes marked with the sign (-I-) having activity complete inhibitor and those marked with the sign (-) having no activity.
It follows from the table above that the antibiotic anisomycin is strongly active against Trichomonas and Endamoeba. Furthermore, the results show that the antibiotic is much more active against these organisms than fumagillin.
No activity of the antibiotic anisomycin has been observed against saprophytic mycobacteria when concentrations of the antibiotic up to 100 mcg / ml are tested against the species M. ranae, phlei, smegmatis, No. 607, berolinense and butyricum. Only slight activity is observed against various gram-positive and gram-negative microorganisms.
The antibiotic anisomycin has been found to have only a relatively low degree of toxicity when used in animal tests. For example the LDo index, when the antibiotic is administered intravenously to mice, in aqueous solution, is about 2 mg / 20 g of mouse.
According to a preferred embodiment of the invention, the antibiotic anisomycin is produced during the culture of the microorganism S. griseolus <I> ATCC-11796 </I> or of the microorganism S. roseochromogenus N 15855- 4 in an aqueous nutrient medium at a temperature of about 24-300, under conditions of submerged aero-biose and with stirring.
Nutrient media which are useful for these methods contain a carbohydrate, such as sugar, starch, wheat flour, or glycerin, a source of organic nitrogen, such as casein, flour soybean, peanut flour, wheat gluten, cottonseed flour, lactalbumin, an enzymatic digest of casein, tryptone. A source of culture activators, such as distillation residues, fermented carbohydrates, yeast extract, molasses fermentation residues as well as inorganic salts, such as sodium chloride , magnesium sulfate and trace elements, such as copper, zinc and iron, can also be used with favorable results.
If excessive foaming occurs during fermentation, anti-foam agents, such as vegetable oils, may be added to the fermentation medium. The <I> pH </I> of the fermentation tends to remain constant, but if variations occur, a buffering agent, such as calcium carbonate, can also be added to the medium.
An inoculum for the preparation of the anti-biotic anisomycin by culturing S. griseolus or S. roseochromogenus can be obtained using strain cultures on media such as Emerson's agar or meat broth. with lactose. The culture can be used to inoculate shake flasks or inoculum vessels for submerged culture. Alternatively, the inoculum vats can be inoculated with cultures obtained in shaken flasks.
The culture of the microorganism usually reaches its maximum after about two or three days. However, by varying the apparatus used, the degree of ventilation, the degree of agitation, etc., it is possible to influence the speed at which the maximum activity is reached. In general, fermentation is continued until the medium exhibits substantial antimicrobial activity, a period of between 24 hours and 4 days being sufficient in most cases. Aeration of the medium in the tanks for submerged culture is done with a flow rate of about one-half to two volumes of free air per volume of broth per minute.
Agitation can be accomplished with the aid of suitable types of agitators which are well known to those in the fermentation industries. Aseptic conditions should be maintained during the transfer of the inoculum and during the growth of the microorganism, carefully.
After the growth of the microorganism, the mycelium, which is usually very abundant and fine, can be separated from the fermentation broth using various devices such as filter presses, centrifuges, etc. Thereafter, the antibiotic can be separated from the fermentation broth by several different methods. Alternatively, all of the broth can be used as it is or it can be dried. The antibiotic can be further purified in different ways.
It can be extracted, for example, from an aqueous solution at a neutral or slightly alkaline <I> pH </I>, preferably between about 6 and about 10, using various non-target organic solvents. water, including ethers, aromatic hydrocarbons, esters, ketones, lower alcohols, halogenated hydrocarbons, and mixtures thereof. By way of example, mention may be made of diethyl ether, benzene, ethyl acetate, butyl acetate, methyl-isobutyl-ketone, butanol and chloroform. The antibiotic can be extracted from most solvent solutions with acidified water preferably having a <I> pH </I> less than about -2; 5.
If desired, the solvent extract can be concentrated before being extracted again with acidified water. By adjusting the <I> pH </I> to neutral or alkalinity, the antibiotic can be extracted again into one of the solvents indicated above. After the solvent has dried and the solution concentrated, the anti-biotic crystallizes in the form of long white needles. The product can be recrystallized by cooling a solution of this product in hot butanol, ethyl acetate, benzene and ethylene dichloride.
Other recovery methods, which are obvious, include absorption on charcoal with subsequent washing, treatment with ion exchange resins and chromatography on alumina columns.
The antibiotic anisomycin is a white basic, organic compound which is soluble in dilute aqueous acids while being sparingly soluble in water. It is very soluble in several organic solvents such as methanol, ethanol, acetone, dioxane and chloroform. It is insoluble in hexane, cyclohexane, carbon tetrachloride and ether. The compound retains its stability for several hours at room temperature over a wide range of <I> pH. </I> On the other hand, it is very unstable when heated in an acidic solution.
It is stable in the dry state or when dissolved in solvents, dry. The crystallized antibiotic has a melting point of about 140-141o. It exhibits three absorption maxima in the ultraviolet, respectively at 224, 277 and 283.5 m # x (3.34 mg in ml of methanol). When dissolved in chloroform, the antibiotic exhibits several characteristic peaks in its infrared spectrum, the most significant peaks occurring at the following frequencies (in cm-1): 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 1515, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, 1178, 1036 and 962.
The fi-. 1 shows the infra-red spectrum of the new antibiotic, in the form of a free base for the frequencies between 5000 and <B> 1100 </B> cm- ', the lower abscissas corresponding to these frequencies expressed in microns and the upper abscissas in cm - '(I / cm-1) while the ordinates give the transmittance in o / o. Fig. 1 A shows the same spectrum but for frequencies between 1100 and 625 cm- '. The base, dissolved in methanol (0.10 / 0) after equilibrium has been established, has an [a] 25 = - 30.0.
When the base is dissolved in chloroform (0.1 0/0) it exhibits a rotatory power [a] 25 = - 450 3o.
A sample of anisomycin obtained by shooting S. griseolus and crystallized out of ethyl acetate, was dried for three hours at 56o, without loss of weight. The antibiotic is then analyzed and it is found that it comprises the following elements, in o / o by weight: carbon 63.55; hydrogen 7.27; nitrogen 5.20 and oxygen gene (by difference) 23.98.
The molecular weight of the antibiotic ani- somycin obtained from S. roseochromogenus, this weight having been determined by the ebullioscopic method, corresponds to 276.
A sample of this anisomycin, which has crystallized out of ethyl acetate, is dried for three hours at 56 without weight loss. The crystallized and dried antibiotic is then analyzed and found to comprise the following elements, in% by weight: carbon 63.51; hydrogen 7.21; nitrogen 5.22 and oxygen (by difference) 24.06.
The above analyzes correspond to the probable empirical formula CIAON04 for the basic antibiotic. The antibiotic anisomycin is clearly distinguished from other antibiotics by its properties, which is demonstrated by the properties indicated above and by measurements made on chromatographic paper. Useful salts of the antibiotic can be prepared by methods well known to those skilled in the art, for example by treating the base with an appropriate acid in aqueous solution or under anhydrous conditions.
For example, the hydrochloride can be prepared by dissolving the base in acetone and passing hydrochloric acid gas through the solution. Other acids, such as sulfuric or phosphoric acid, can be used to prepare acid salts of the antibiotic.
The invention is illustrated by the following examples <I> Example 1 </I> A nutrient medium is prepared with the following materials in one liter of water.
Glucose (Cerelose) <B> ------- </B>. <B> .... </B> 10 g Wheat starch. . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Hydrolyzed casein (N-Z Amine B) 5 Molasses fermentation residues produced by Curbay BG. . 5 Soy flour <B> ............. ----- <I> 15 </I> </B> Sodium chloride. . . . . . . . . . . . . . 1 After adjusting the <I> pH </I> of the mixture to 7 using potassium hydroxide, one gram of calcium carbonate is added and water vapor is passed through the mixture during about 30 to 45 minutes to sterilize it.
A culture of the new strain of S. griseolus is transferred to 100 ml of the above-mentioned medium in a 300 ml Erlenmeyer flask and the flask is shaken for 45 hours until good growth is obtained. An inoculum for fermentation of a larger quantity is prepared by transferring the contents of the above-mentioned vial, under aseptic conditions, into one liter of the same medium contained in a 3-liter vial which is shaken for 48 hours.
190 liters of the nutrient medium are prepared and sterilized as indicated above and this medium is inoculated with the inoculum thus prepared. The organism is then cultured in submerged aerobic conditions and with agitation for a period of three days. The <I> pH </I> of the fermentation broth is adjusted to about 2 with concentrated sulfuric acid, the broth is filtered with the product brand Supercell to separate the mycelium. Then, the <I> pH </I> of the filtrate is adjusted to 9 with concentrated sodium hydroxide and extracted twice with 57 liters of chloroform.
The combined chloroform extracts are concentrated and extracted with water acidified to <I> pH 2 </I> with sulfuric acid. Then, the acidified aqueous solution is concentrated and its <I> pH </I> is adjusted to 9 by adding sodium hydroxide: The antibiotic is extracted again with chloroform which is evaporated until reduce the volume to 50m1. After the addition of an equal volume of cyclohexane and after further evaporation, the crude antibiotic is crystallized and recovered by filtration.
The crude antibiotic is purified by dissolving it in ethyl acetate, treating the resulting solution with activated charcoal and evaporating the ethyl acetate to give the antibiotic anisomycin in the form of long white crystals. .
<I> Example 11: </I> A strain of S. roseochromogenus on Emerson's agar is cultivated, under controlled conditions, to obtain spores which are used to inoculate a nutrient medium having the following composition Glucose (Cerelose). . . . . . . . . . . . 10 g Soy flour <B> ...... </B>. <B> ....... </B> .. .. 10 Sodium chloride. . . . . . . . . . . . 5 Molasses fermentation residues produced by Curbay BG. . 5 Wheat starch. . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 This mixture of nutrients is diluted with water to a volume of one liter, the <I> pH is adjusted to 7 </I> with potassium hydroxide, 0 is added. , 1% calcium carbonate which acts as a buffer and the whole is subjected to sterilization by heat. The medium is then cooled and the spores are added under aseptic conditions. Culture of the organism takes place in shaken flasks at about 280 for a period of two days.
The mixture of broth and mycelium thus formed is used to inoculate 57 liters of a sterile fermentation medium having, in substance, the same composition as that indicated above. The mixture is subjected to stirring and aeration under sterile conditions for two days at about 28 (). The mycelium is then separated from it using a product brand Supercel and the boil is concentrated in a vacuum until it has a volume of 11.5 liters. This concentrate is extracted several times with ethyl acetate.
The mixed solvent phases, the amount of which corresponds to approximately 57 liters, are concentrated under vacuum until they have a volume of 1.5 liters and the concentrate is shaken 5 times with portions of 100 ml of hydrochloric acid 0, 1 N. The <I> pH </I> of the acidic solution, containing the antibiotic, is adjusted to 9.0 with sodium hydroxide and the solution is then extracted ten times with portions of 250 ml ether. The ether is removed in vacuo and the remaining water is removed by azeotropic distillation with benzene.
After concentration of the distillate and after separation of the benzene, the antibiotic crystallizes and can be separated by filtration. The anti-biotic is crystallized again by dissolving in hot ethyl acetate, subsequently treating it with activated charcoal and cooling the resulting solution. The product, crystallized in the form of long white needles, is filtered, dried and tested as indicated above. This product is very active against protozoa and pathogenic fungi.
It is observed that the antibiotic thus prepared is identical to that obtained as described in Example 1 based on the absorption spectra in the infrared and the ultraviolet, on measurements made on chromatographic paper and on the point of mixed fusion of mixed products. This was confirmed by the microbial spectra and by other physical and chemical characteristics obtained during tests carried out with products derived from strains of S. roseochromogenus and S. griseolus mentioned above.
The slight differences between the test results given above are within the limits of experimental error and do not affect the conclusion of identical products.