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La présente invention concerna., notamment, deux nouveaux antibiotiques qui, dans ce qui va suivre, seront désignés parles dénominations "cinérubine A" et "cinérubine B", leurs dérivés et leurs sels et les mélangea de ces composés, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composes. L'invention concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et mélanges de substances.
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Ces cinérubines se forment lors de la culture d'une nouvelle souche d'actionmycètes de la famille des streptomyces, qui n'est identique à aucune des souches indiquées dans l'ouvrage de Bergey intitulé "Manual of Determinative Bacteriology", 6e édition, ou dans l'ouvrage de Waksmann et Lechevaller intitulé "Actinomycetes and their Antibiotics" (1953) ; cette nouvelle souche d'actinomycètes sera décrite ci-après sous le nom de "Streptomyces cinereoruber Corbaz et al. var. fructofermentans". Elle a été isolée à partir de prises d'essais faites dans le sol du Zoo de Zurich et a été conservée dans les Laboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, Suisse), Institut de botanique spéciale, sous la désignation A 6143.
Le Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans forme un mycélium aérien peu abondant qui, au début, est blanc puis gris-blanc, et finalement gris-cendre. Il possède des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typique de la famille des streptomyces. Les spores sont lisses. Le mycélium végétatif est rouge et constitue un pigment soluble.
La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 toutefois, la croissance optimum se situe entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance du Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans sur différents milieux
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nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 7 ainsi que 11 ont été préparés suivant W. Lindenbein, "Arch. Mikrobiol." 17, 361 (1952).
Gélose synthétique :Croissance grêle, voilée, incolore au bout de trois jours, plus tard rose; mycélium àérien poussiéreux, blanc laiteux ou carmin pâle au bout de huit
Jours, gris-cendre au bout de quatorze jours;un pigment soluble rouge rosâtre se forme au bout de quatre jours.
Milieu synthétique liquide : Flocons gris-blanc à rose; pellicule avec mycélium aérien gris-blanc peu abondant; pigment carmin pâle.
Gélose-glucose Croissance punctiforme, incolore ou rouge-corail par endroits au bout de trois jours, rouge chair au bout de huit jours; mycélium aérien peu abondante gris-blanc au bout de huit jours, gris- cendre au bout de quatorze jours, substratum rouge chair au bout de huit jours.
Gélose-glucose à l'asparagine : Croissance comme sur le gélose-glucose; mycélium aérien pous- siéreux, blanc crayeux au bout de quatre
Jours, plus tard gris-blanc,pigment soluble rouge carmin pâle.
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Gélose au malate de calcium : Comme pour le gélose-glucose à l'asparagine.
Milieu gélosé (gélatine) à 18 C : Croissance superficielle jaune blanc à rouge jaune clair, mycélium aérien peu abondant gris blancs pigment soluble brun châtaigne intense à brun rougeâtre;,liquéfaction très lente, commençant au bout,de 34 jours,
0,4 cm au bout de 42 jours.
Gélose à l'amidon Croissance punctiforme Incolore; mycélium aérien poussiéreux gris-blanc; hydrolyse de l'amidon traces au bout de 4 jours.
Gélose nutritive : Croissance peu abondante, jaune clair; pas de mycélium aérien ? pigment faible, brun rougeâtre. omme de terre : Croissance lichéneuse, rouge cuivreux au bout de quatre jours, brunâtre à noir de brai au bout de huit jours, pas de mycélium aérien; substratum coloré en noir bleuâtre.
Carottes : Croissance lichéneuse, gris-blanc et car- min pâle; mycélium aérien velouté au bout de huit jours, gris-blanc à gris-cendre pigment noir bleuâtre.
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Lait de tournesol : Croissance annulaire, pellicule brun clair; mycélium aérien peu abondant d'un gris blanc, peptonisation au bout de sept jours;pas de coagulation.
Le Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans croît de la façon suivante, d'après la méthode de T.G.Pridham et D.Gottlleb, "J.Bacteriology" 56, 107 (1948), lorsqu'on utilise diverses sources de carbone :
L-xylose . inuline (-) L-arabinose ¯ D-mannite L-rhamnose (+) D-sorbite + D-fructose + dulcite (-) D-galactose mésoinosite saccharose (+) salle ine maltose + acétate de sodium (-) lactose citrate de sodium (-) raffinose - succinete de sodium (-)
Les signes ont la signification suivante : + : bonne croissance. utilisation certaine'de la source de carbone mentionnée (+): croissance faible, utilisation douteuse de la source de carbone mentionnée (-) croissance très faible, utilisation improbable de la source de carbone mentionnée - : pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée.
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Le Streptomices cinereoruber var.fructofermentans correspond bien, du point de vue morphologique, au Streptomyces cinereoruber (R. Corbaz, L.Ettlinger, W.Keller-Schierlein et H. Zähner, "Arch.Mikrob.", en impression), mais se différencie toutefois du point de vue biologique de cette espèce par la faculté qu'il a d'exploiter des sources de carbone différentes.
Le Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans montre en outre certaines analogies avec le S. purpurascens
Lindenbein, qui forme toutefois des spores épineuses et montre un spectre absolument différent pour les sources de carbone. Cette dernière constatation est également valable pour le S. Bobiliae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
En ce qui a trait à la préparation des antibiotiques cinérubine A et cinérubine B ou de leurs mélanges, la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation du Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans ou d'autres souches corres- pondant à la description, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir ces cinérubines, on cultive de manière aérobie une souche de streptomycètes présentant les propriétés du Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans, par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels
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inorganiques, des composés azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle notable, puis on isole du filtrat de culture la cinérubine A et/ou la cinérubine B ou des mélanges de ces composés.
La solution nutritive renferme comme sels inorgani- ques par exemple des chlorures, nitrates, carbonates, sulfates de métaux alcalins ou alcalino-terreux, de magnésium, de fer, de zinc, de manganèse. Comme composés azotés, hydrates de carbone et substances favorisant la croissance le cas échéant à ajouter, on citera par exemple -.
des acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines ainsi que leurs hydroly.- sats, comme les peptones et tryptones, des extraits de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, des résidus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, des levures, des fèves, notamment de soja, des graines, par exemple de coton, ainsi que du glucose, du saccharose, du lactose, de 1''amidon etc.
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de 1 air ou de l'oxygène dans des flaeons agités ou dans les fermenteurs connus, de préférence à un pH de 6-8. Comme température, s'avère appropriée une température comprise entre 20 et 40 .
En opérant ainsi, la solution nutritive accuse un effet
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antibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Suivant la composition de la solution nutritive utilisée, on produit soit un mélange des cinérubines A et B, soit surtout de la cinérubine A ou surtout de la cinérubine E On peut, par exemple, cultiver le Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans sur des solutions nutritives +enfermant, pour un litre d'eau, les substances suivantes : Solution nutritive No. 12/41 : glycérine 20 g, farine de soja
10 g, chlorure de sodium 5 g, carbonate de calcium 10 g et nitrate de sodium 1 g.
Solution nutritive No. 22 1 mannite 20 g, produit connu dans le commerce sous le nom de "Distillers solubles"20 g, chlorure de sodium
3 g et nitrate de sodium 1 g.
Solution nutritive No 19 : mannita 20 g et farine de soja 20 g,
Lorsqu'on utilise la solution nutritive No. 19, il se forme surtout de la cinérubine A, et avec la solution nutritive No. 12/41 essentiellement de la cinérubine B. Avec la solution nutritive No. 22, on produit un mélange des cinérubines A et B.
Pour isoler les cinéfrubines, on peut, par eremple, se servir des procédés suivants -. On sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve dans ledit filtrat
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la majeure partie des antibiotiques. Il reste toutefois des quantités notables d'antibiotiques qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. A cet effet, sont appropriés notamment les solvants organiques au moins partiellement miscibles à l'eau, tels que des alcools, comme par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones comme par exemple l'acétone et la méthyléthylcétone, ou alors des acides organi- ques ou inorganiques comme les acides acétique , chlorhydri- que ou sulfurique.
Ces extraits de mycélium sont ajoutés au filtrat de culture soit directement, soit après une concentra- tion préalable sous vide. On extrait avantageusement le mélange à un pH supérieur à 7, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, par exemple avec des esters d'acides gras inférieurs, par exemple avec de l'acétate d'éthyle ou de l'acétate d'amyle, avec des hydrocarbures, par exemple avec du benzène, avec des hydrocarbures chlorés, par exemple avec du chlorure d'éthylène, du chlorure de méthylène ou du chloro- forme, avec des cétones, par exemple.avec la méthylpropyl- cétone, la méthylamylcétone ou la diisobutylcétone, avec des alcools, comme des alcools butyliques ou des alcools amyliques, avec des éthers, par exemple avec l'éther éthylique, l'éther diisopropylique,
avec des éthers dibutyliques ou des éthers du glycol, et analogues. A la place de l'extraction des cultures a l'aide d'un solvant, ou en combinaison avec une
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telle extraction servant d'opération de purification complé- mentaire, on peut aussi obtenir les antibiotiques par adsorp- tion, par exemple à du charbon actif ou à des terres activées comme la terre à foulon, et par extraction rubséquente de l'adaorbat, par exemple à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, comme l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone.
On peut aussi extraire les cultures directement de la manière indiquée, sans séparation préalable du mycélium.
On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques, renfermant les antibiotiques, avec une solution acide aqueuse d'un pH inférieur à 5, la majeure partie de l'activité antibiotique passant dans la phase aqueuse. Une quantité moindre d'activité reste dans la phase organique. Après avoir été réunies, les solutions aqueuses acides sont ensuite de la manière décrite extraites à nouveau à un pH supérieur à 7, avec un solvant organique non miscible à l'eau. On peut répéter cette opération plusieurs fois. Comme solutions aqueuses acides sont appropriés des acides dilués comme les acides acétique, chlorhydrique ou sulfurique, ou des solutions tampons comme les tampons à base de citrate ou de phosphate.
La répartition entre une solution acide ou une solution aqueuse alcoolique et un solvant non miscible à l'eau constitue un bon procédé de purification et, le cas échéant,
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de séparation des nouveaux antibiotiques. La répartition a lieu avantageeusement suivant le procédé à contre-courant dans des appareils appropriés. La chromatographie est également appropriée pour la purification et le cas échéant pour la séparation. L'obtention des antibiotiques purs sous forme cristalline a lieu par exemple deas des solvants organiques comme l'acétone, le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, des mélanges d'acétone et de méthanol, des mélanges d'acétone et d'éther, des mélanges d'acétone ot d'éther de pétrole ou dans des mélanges de benzène et de méthanol.
Pour la recristal- lisation, on se sert des marnes solvants ou aussi de solutions organiques aqueuses, par exemple d'alcools dilué;, d'acétone diluée, etc.
L'antibiotique que constitue la cinérubine A cristal- lise en paillettes renfermant beaucoup de soldant, qui par séchage à l'air ou sous vide se décomposent en une poudre rouge foncé, d'un point de fusion de 155-157 . L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes: C = 61,12%, H = 7,03%, N = 1,91%, OCH3 = 4,08%. Le spectre d'absorption ultra-violet présente des bandes aux longueurs d'ondes suivantes : 234 mu ( log E = 2,28), 258 mu (log E = 2,36), 292 mu (log E = 1,92), 475 m (log E = 2,05), 495 m (log E = 2,11) et 530 m (log E = 1,94).
Dans le spectre infra-rouge, on peut voir des bandes, entre autres aux longueurs d'ondes suivantes :2,9 3,4 , 3,5 5,77 , 6,06 , 6,21 ,
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6,81 7,02 7,06 7,21 , 7,55 , 7,68 , 7,88 , 8,14 8,56 , 8,88 , 9,05 , 9,56 9,84 10,37 , , 10,78 , 11,19 , 11,31 , 11,79 , 12,32 , 12,71 (bande avec pointe triple), 1µ,la , 13,49 . 13,75 et 14,21 cinérubinone.
Lors de l'hydrolyse avec des acides minéraux dilués, l'antibiotique que constitue la oinérubine A se décompose en deux composants glucidiques réducteurs et en une aglycone neutre ayant un effet antibiotique, la à Cette dernière forme des cristaux rouge-brillant fondant 220 . 217 - C - L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes 63,70%. (C)CH3 = H = 5,38%, 3,42%, OCH3 spectre = 7,27% et hydrogène actif = 1,26%. Dans le : ultra-violet, on peut voir des bandes aux longueurs d'ondes suivantes 234 m E = (log 3,01), m 258 E = (log m 2,68), 294 E = (log 2,25), 470 m 495 m (log E - 2p30), E = (log 2,34), m 515 m (log E - 2,28) et 530 = (log E cinérubine 2,20).
La 181 . B forme des cristaux orange-brillant qui fondent à 180 - élémentaire L'analyse :C fournit les valeurs suivantes = = 59,76%, H 6,50%, 30,44%, 0 = N - = 6,38%. 1,78%, OCH, = 4,54%, C-CH- 235 m Le spectre ultra- violet présente des bandes aux longueurs d'ondes suivantes
1% E (log 1 cm = 2,77), 258 m (log E = 2,46), 291 m (log E - 2,03), 297 m (inflexion), 394 m (inflexion), 415 m (inflexion), 471 m (inflexion), 488 m (log E - 2,24), ' 497 (log E . 2,27), 519 m (log E . 2,16) et 533 m
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(log E = 2,la).
Dans le spectre infra-rouge, on peut voir des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes :
EMI13.1
S,83 Me 3,38 Me 3,58 e, 5,71 ee 6,16 me 6,78 7,02 Me 7â47 Me 7,60 Me 8,06 9, 8,48 g, 8,75 go 9s1 9,72 Me 9,90, 10,18 me 10,62 11,62 , 12,15 12,43 et 12,85 ,
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Lorsqu'on hydrolyse de la elnérublne B avec des acides minéraux dilues, il se forme la même aglycone, à savoir la cinérubinone, que lorsqu'on hydrolyse de la cinérubine A.
Les cinérubines présentent une certaine analogie
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avec les rhodomycines A et B (H. Boaicmann et collabos,tus, "Chem. Berichte" 88, 1792 [19551 et communications antérieures qui y sont citées), mais se comportent toutefois de façon différente lors d'une chromatographie sur papier. En outre, l'aglycone obtenue à partir des cinérubines A et B, à savoir
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la oinérubinone, se différencie de 1,Srhodomycinone par son point de fusion, sa composition analytique et surtout par son spectre d'absorption infra-rouge.
EMI13.5
Les sels de la cinérubine A t de la c1nérub1ne B dérivent des acides inorganiques et organiques connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuriques, des acides acétique, propionique, valérianique, palmitique ou oléique, des acides succinique, citrique, mandélique, glutami- que ou pantothénique. Ils constituent des sels neutres ou acides. On les prépare en faisant agir les acides correspondants sur la base libre ou par double décomposition de leurs sels, par exemple du sulfate de cinérubine et du pantothénate de calcium.
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Les antibiotiques que constituent les cinérubines A et B possèdent une efficacité antibiotique vis-à-vis de divers organismes-tests. Si l'on utilise comme méthode-test in vitro des séries de dilution (par puissances de 10) dans du bouillon glucose. incubées à 37 pendant 24 heures, on a alors les concentrations suivantes qui sont encore inhibantes :
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<tb> Organismes-testa <SEP> Concentration <SEP> inhibane
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> . <SEP> àn <SEP> g/cm3
<tb>
<tb>
<tb> Cinérubine <SEP> A <SEP> Cinérubine <SEP> B
<tb>
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Miorococcus pyogenes, var 0, . 10 M1crococcus pogxes,var.guru pénicillino-résistant 1 10
EMI14.3
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,01 <SEP> 0,01
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0,001 <SEP> 0,1
<tb>
<tb> Baclllus <SEP> megatherlum <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb>
<tb> Candida <SEP> vuklgais <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> aibicans <SEP> 0,01 <SEP> 1
<tb>
EMI14.4
Mycobacterium tuberculosis zij 1 10 Entamoeba histolyt1ca.
++) 33 100 +) Cultivé dans le milieu synthétique de kirchner avec de l'albumine bovine à 5 100; ; examen de la croissance au bout de 2 semaines.
EMI14.5
++) Cultivé dans un milieu de acc-namobs9 examen de l'effet aminbicide au bout de 24 heures.
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Le développement du virus de l'influenza sur des membranes isolées de chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours d'incubation est encore inhibé par les cinérubines A et B à une concentration inférieure à 1 g/cm3, tandis que le tissu de chorioallantois lui-même n'est pas toxiquement endommagé par 100 g/cm3.
De plus, les cinérubines exercent une forte ac- tion d'inhibition sur la croissance des tumeurs; c'est ainsi que la croissance d'une tumeur de souris, l'adénocarcinome EO 771, est fortement inhibée.
En dehors du procédé de préparation des antibio- tiques cristallins dénommés cinérubine A et cinérubine B et de leurs sels neutres et acides, la présente invention concerne également, à titre de produits industriels nouveaux, les com- posés indiqués proprement dits, notamment les sulfates, chlor- hydrates, acétates et pantothénatea de ces cinérubines, ainsi que les produits de leurs transformations obtenus par hydro- génation ou oxydation, ainsi que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse des cinérubines A et B.
Les antibiotiques dénommés cinérubine A et ciné- rubine B, leurs sels et dérivés, les produits de transformation et de scission indiqués ci-dessus, ou des mélangea correspon- dants peuvent être utilisés comme médicaments.
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Par exemple sous la forme de préparations phar- maceutiques renfermant les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale.
Comme matières de support, entrent en ligne de compte les substances ne réagissant pas sur les nouveaux composés, comme par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyl- tques, des gommes, des polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus. Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemple, sous la forme de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions. Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances au- xiliaires, telles que des agents de conservation, de stabili- sation, des agents mouillants ou émulsifiants.
Elles peuvent encore renfermer aussi d'autres substances thérapeutiquement précieuses.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés centigrades.
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Exemple 1
On prépare une solution nutritive de la composition suivante: 20 g de farine de soja, 20 g de mannite et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,8. On transvase cette solution ou un multiple de cette dernière dans des fioles coniques d'un volume global de 500 cm3 (remplies chacune avec 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fermenteurs de 500 litres (remplis chacun de 300 litres de solution nutri- tive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression de 1 atmosphère. On ensemence ensuite avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporulante, de Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans et incube, tout en secouant bien ou en agitant, dans les fermenteurs, à 27 , en faisant passer de l'air (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute).
Après 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures, en ajoutant un adjuvant de filtration, suivant le volume soit à travers un entonnoir filtrant, soit à travers un filtre-presse ou un filtre rotatif, et débarrasse ainsi du mycélium et d'autres composants solides la solution aqueuse antibiotiquement active qui renferme es- sentiellement de la cinérubine A.
Exemple 2 -----------
Si l'on utilise à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c, d, ou e décrites ci-après, on obtient après avoir, d'une manière analogue,
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stérilisé ensemencé avec du Streptomyces cinereoruber var. fructo èrmentans, incubé ' à 27 et filtré, des solutions aqueuses anti- biotiquement actives, les solutions nutritives a, b, c, et e permettant d'obtenir un mélange de cinérubine A et de cinérubine B, et la solution nutritive d permettant d'obtenir essentiel- lement de la cinérubine B. a) 10 g de glucose brut, 5 g'de peptone, 3 g d'ex- trait de viande (Oxo Lab Lemco), 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisation:
7,5. b) 10 g de glucose brut, 10 g de "Distillers solubles", 1 g de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet, pH avant stérilisation : 7,5. c) 10 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du mats (corn steep liquor), 2 g d'hydrophosphatu secondaire de potassium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisa- tion : 7,5. d) 20 g de glycérine, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium, 1 g de nitrate de sodium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant sté- rilisation : 7,5. e) 20 g de mannite, 20 g de "Distillera solubles", 3 g de chlorure de sodium, 1 g de nitrate de sodium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisation : 7,8.
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Exemple 3 -----------
Avec 25 litres d'acétone, on agite le résidu de filtration d'une charge de 50 litres obtenue suivant l'exemple 1 ou 2, puis filtre à nouveau. On répète cette opéra: tion deux fois, après quoi on réunit les solutions acétoniques renfermant l'antibiotique, les concentre sous vide à 5 litres et les réunit au filtrat de culture-. On extrait alors cette solution à un pH de 8,5 avec 70 litres d'acétate d'éthyle dans un extracteur "Westfalia", la totalité de l'activité anti- bactérielle passant dans la phase organique. On lave ensuite l'extrait à l'eau, concentre sous vide à 5 litres et extrait ensuite à plusieurs reprises avec de l'acide acétique demi- normal.
La solution d'acétate d'éthyle montre maintenant une activité antibactérielle minime, tandis que la majeure partie de l'activité est trouvée dans les solutions acétiques. Ces solutions teintées en rouge-orange sont réuniesamenées à un pH de 8,5 à l'aide d'une solution binormale de carbonate de sodium, ce qui fait que la teinte vire au violet, puis elles sont extraites à nouveau à l'acétate d'éthyle. On extrait à nouveau l'extrait obtenu à l'acétate d'éthyle avec de l'acide acétique demi-normal, après quoi celui-ci est, comme décrit, alcalinisé et extrait. Finalement, on sèche la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide.
On obtient ainsi les bases brutes, colorées en rouge foncé, qui ont une forte activité antibactérielle.
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L'extrait d'acétate d'éthyle qui, après le traite- ment décrit à l'acide acétique dilué, présente encore une activité natibactérielle relativement minime est lavé à l'eau, séché sur du sulfate de sodium et évapore sous vide. On obtient une huile rouge, fluide. On traite cette dernière avec de l'éther de pétrole, ce qui fait qu'on obtient une poudre rouge qui, suivant la solution nutritive utilisée, est constituée par de la oinérubine A, par de la cinérubine B ou par des mélanges de celles-ci.
Exemple 4
On soumet 2,95 g des bases brutes obtenues suivante les exemples 1 et 3 à une répartition à contre-courant com- portant 120 stades, en utilisant le mélange de solvants sui- vant : 5 parties en volume de tétrachlorure de carbone, 4,5 parties en volume de méthanol et 0,7 partie en volume d'eau.
Après évaporation sous vide, à 30 , du contenu des divers réci- pients de répartition, on trouve dans les stades 7,51, 63, 88 et 115 de petits maxima de substance et d'activité, tandis que,la quantité principale de la substance et de l'activité est enrichie au stade 22. On réunit les fractions 14 à 35 et obtient 1,61 g de cinérubine A qui, par chromatographie sur papier, s'avère unitaire. On la recristallise dans un mélange d'acétone et de méthanol, et elle forme des paillettes renfer- mant beaucoup de solvant qui, par séchage, se décomposent pour
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donner une poudre rouge foncé, d'un point de fusion de 155-157 .
Analyse : C 61,12%, H 7,03%, N 1,91%, OCH3 4,08%. Spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu: on observe des bandes à 234 mu (log E = 2,28), 258 m (log E . 2,36), 292 m (log E = 1,92), 475 mu (log E = 2,05), 495 m (log E= 2,11) et 530 m (log E = 1,94).
Spectre d'absorption Infra- rouge dans le nujol : on observe des bandes,entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes : 1 2,9 , 3,4 , 3,5 , 5,77 , 6,06 , 6,21 , 6,81 , 7,02 , 7,06 , 7,21 , 7,55 , 7,68 , 7,88 , 8,14 , 8,56 , 8,88 , 9,05 , 9,56 , 9,84 , 10,37 , 10,78 , 11,19 , 11,31 , 11,79 , 12,32 , 12,71 , (bande avec pointe triple), 13,10 , 13,49 ,13,75 et 14,21 .
Dans un chromatogramme sur papier avec filtre rond et le système de solvants benzène-forma ml de, la cinérubine A montre une valeur de RF de 0,55. Dans les marnes conditions, la rhodomycine A et la rhodomycine B restent au point d'impact des gouttes.
Exemple 5
On chauffe pendant 20 minutes à 100 une solution de 50 mg de cinérubine A dans 10 cm3 d'acide sulfurique normal.
Il se sépare alors des flocons rouges..Après refroidissement, on extrait la solution rouge à l'acétate d'éthyle, ce qui fait que la teinte passe dans 'la phase organique.
On neutralise la phase aqueuse avec une solution binormale d'hydroxyde de baryum; filtre et évapore sous vide.
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Le résidu renferme au moins deux glucides réducteurs qui, dans un chromatogramme sur papier, avec un Mélange de butanol et d'acide acétique glacial (9:1) saturé d'eau, présentent respectivement des valeurs de RF de 0,13 et de 0,38.
Les extraits d'acétate d'éthyle colorés en rouge sont lavés à l'eau, séchés sur du sulfate de sodium et évaporés sous vide. Dans un mélange de benzène et de méthanol, on ob- tient la cinérubinone en cristaux rouges brillantspoint de fusion = 217-220 .Analyse : C 63,70%, H 5,38% (C)CH3 3,42%., OCH3 7,27%, H act. 1,26%. Spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu: on observe des bandes à 234 m (log E = 3,01), 258 m (log E = 2,68), 2,94 m (log E = 2,25), 470 m (log E = 2,30), 495 m (log E = 2,34)515 m (log E = 2,28) et 530 m (log E = 2,20).
Spectre d'absorption infra-rouge dans le bromure de potassium: on observe des bandes, entre autres, à 2,87 , 3,00 , 3,25 , 3,43 , 3,52 . 5,78 , 6,06 , 6,24 , 6,88 , 7,07 , 7,55 , 7,69 8,30 8,13 , , : 8,54 , 8,84 9,34 9,06 , , 9,56 , 9,75 , 9,98 , 10,07 10,28 , 10,47 , 11,01 , Il..59 , 11,87 , 12,02 , 12,72 , 13,31 , 13,88 14,10 . et 14,49 :
Dans un chromatogramme sur papieravec le système de solvants benzène-formamide, la cinérubinone pr sente une valeur de Rp de 0,8.
Avec 3.'acide sulfurique concentré, elle donne une teinte d'un bleu pur.
La cinérubinone exerce un effet antibiotique vis- à-vis de certains organismes-tests.
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Exemple 6 -----------
On soumet 16 g des bases brutes obtenues suivant les exemples 2 (solution nutritive d) et 3, à une répartition à contre-courant en.300 stades, en utilisant le mélange de solvants suivant; 7,5 parties en volume de tétrachlorure de carbone, 6,375 parties en volume de méthanol et 1,125 partie en volume d'eau. Le contenu des divers récipients de réparti- tion est évaporé sous vide à 30 .A coté d'assez petits maxima d'activité et de substance, par exemple aux stades 260 à 295, la cinérubine A se trouve dans les stades 54 à 70 et la ciné- rubine B dans les récipients 17 à 37. On réunit les solutions de ces récipients et y ajoute 500 cm3 d'eau. On sépare ensuite la phase Inférieure et extrait encore la phase supérieure à deux reprises avec chaque fois 200 cm3 de tétrachlorure de carbone.
On réunit les extraits, les lave avec un peu d'eau, les sèche sur du sulfate de sodium et les évapore sous vide.
On dissout le résidu dans 50 cm3 de benzène et ajoute à chaud un peut de méthanol. En laissant reposer, la cinérubine B se ..sépare sous la forme de cristaux de couleur orange. On les recristallise dans le même mélange de solvants et ils fondent à 180-181 . Analyse : C 59,76%, H 6,50%, 0 30,44%, N 1,78%, OCH3 4,54%, C-CH3 6,38%.
Le spectre d'absorption ultra-violet dans l'alcool absolu présente les bandes suivantes : # max (m 235 258 291 297 394 415 Log E 1% 1cm 2,77 2,46 2,03 2,025 1,56 1,67
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# max (m ) 471 488 497 519 533 log E 1% 2,17 2,24 2,27 2,16 2,10
1 cm Spectre infra-rouge (dans le bromure de potassium): on observe des bandes, entre autres, à : 2,83 , 3,38 , 3,58 , 5,71 ,
EMI24.1
6,16 go 6,78 go 7sO2 go 7e47 go 7,60 go 8,06 go 8,48 go 8,75 9, 9,41 go 9,72 /1, 9,90 go 10,18 /1, 10,62 go 11,62 go 12,15 go 12,43 et 12,85 .
Exemple 7
On chauffe pendant 20 minutes à 1000 une solution de 50 mg de cinérubine B dans 10 cm3 d'acide sulfurique nor- mal, puis traite comme décrit dans l'exemple 5. La substance obtenue à partir des extraits d'acétate d'éthyle est identique à la cinérubinone décrite dans l'exemple 5.
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The present invention relates, in particular, to two new antibiotics which, in what follows, will be designated by the names "cinerubin A" and "cinerubin B", their derivatives and their salts and mixtures of these compounds, as well as the pharmaceutical preparations. containing these compounds. The invention also relates to a process for the preparation of these substances and mixtures of substances.
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These cinerubins are formed during the cultivation of a new strain of action mycetes of the streptomyces family, which is not identical to any of the strains indicated in Bergey's work entitled "Manual of Determinative Bacteriology", 6th edition, or in the work by Waksmann and Lechevaller entitled "Actinomycetes and their Antibiotics" (1953); this new strain of actinomycetes will be described below under the name “Streptomyces cinereoruber Corbaz et al. var. fructofermentans”. It was isolated from samples taken in the soil of Zurich Zoo and was kept in the Applicant's laboratories and at the Federal Institute of Technology (Zurich, Switzerland), Institute of Special Botany, under the designation A 6143.
Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans forms a sparse aerial mycelium which initially is white, then gray-white, and finally gray-ash. It has chains of conidia which are a typical feature of the streptomyces family. The spores are smooth. The vegetative mycelium is red and constitutes a soluble pigment.
Growth is relatively little temperature dependent and the fungus thrives at both 18 and 40 however optimum growth is between 25 and 32.
To give other characteristics, we will describe in what follows the growth of Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans on different media
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nutritious. Nutrient media 1 to 7 as well as 11 were prepared according to W. Lindenbein, "Arch. Mikrobiol." 17, 361 (1952).
Synthetic agar: Growth slender, hazy, colorless after three days, later pink; dusty air mycelium, milky white or pale carmine after eight
Days, ash-gray after fourteen days; a pinkish-red soluble pigment forms after four days.
Liquid synthetic medium: Gray-white to pink flakes; skin with scanty gray-white aerial mycelium; pale carmine pigment.
Glucose agar Growth punctiform, colorless or coral red in places after three days, flesh red after eight days; aerial mycelium scanty gray-white after eight days, gray-ash after fourteen days, flesh-red substratum after eight days.
Asparagine Glucose Agar: Growth as on Glucose Agar; aerial mycelium dusty, chalky white after four
Days, later gray-white, soluble pigment pale carmine red.
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Calcium Malate Agar: As with Asparagine Glucose Agar.
Agar medium (gelatin) at 18 C: Superficial growth yellow white to light yellow red, sparse aerial mycelium gray white soluble pigment intense chestnut brown to reddish brown;, very slow liquefaction, starting after 34 days,
0.4 cm after 42 days.
Starch Agar Punctiform Growth Colorless; gray-white dusty aerial mycelium; hydrolysis of trace starch after 4 days.
Nutrient Agar: Growth sparse, light yellow; no aerial mycelium? weak pigment, reddish brown. potato: Growth lichenous, coppery red after four days, brownish to pitch black after eight days, no aerial mycelium; substratum colored in bluish black.
Carrots: Lichenous growth, gray-white and pale crimson; aerial mycelium velvety after eight days, gray-white to ash-gray with bluish-black pigment.
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Sunflower milk: Ring-shaped growth, light brown skin; sparse aerial mycelium gray-white, peptonization after 7 days; no coagulation.
Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans grows as follows, according to the method of T.G. Pridham and D. Gottlleb, "J. Bacteriology" 56, 107 (1948), when various carbon sources are used:
L-xylose. inulin (-) L-arabinose ¯ D-mannite L-rhamnose (+) D-sorbite + D-fructose + dulcite (-) D-galactose mesoinosite sucrose (+) room ine maltose + sodium acetate (-) lactose citrate sodium (-) raffinose - sodium succinete (-)
The signs have the following meaning: +: good growth. certain use of the mentioned carbon source (+): weak growth, doubtful use of the mentioned carbon source (-) very low growth, unlikely use of the mentioned carbon source -: no growth, no use of the carbon source mentioned.
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Streptomices cinereoruber var.fructofermentans corresponds morphologically to Streptomyces cinereoruber (R. Corbaz, L. Ettlinger, W. Keller-Schierlein and H. Zähner, "Arch.Mikrob.", In print), but is However, biologically differentiates this species by the ability it has to exploit different carbon sources.
Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans also shows certain analogies with S. purpurascens
Lindenbein, which, however, forms thorny spores and shows an absolutely different spectrum for carbon sources. This last observation is also valid for S. Bobiliae (Waksman and Curtis) Waksman and Henrici.
As regards the preparation of the antibiotics cinerubin A and cinerubin B or their mixtures, the present invention is not limited to the use of Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans or other strains corresponding to the description, but it also relates to the use of varieties of these organisms, as obtained, for example, by selection or mutation, in particular under the influence of ultraviolet radiation or X-rays, or under the action of mustard. nitrogen.
To obtain these cinerubins, a streptomycetes strain exhibiting the properties of Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans is aerobically cultivated, for example in an aqueous nutrient solution containing salts.
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inorganic compounds, nitrogenous compounds and, where appropriate, carbohydrates, until this solution exhibits notable antibacterial action, then cinerubin A and / or cinerubin B or mixtures of these are isolated from the culture filtrate. compounds.
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example chlorides, nitrates, carbonates, sulphates of alkali or alkaline earth metals, of magnesium, of iron, of zinc and of manganese. As nitrogen compounds, carbohydrates and growth promoting substances, if necessary, to be added, there may be mentioned for example -.
amino acids and mixtures thereof, peptides and proteins as well as their hydrolyzates, such as peptones and tryptones, meat extracts, water-soluble fractions of grains of cereals such as corn and wheat, distillation residues from the preparation of alcohol, yeasts, beans, especially soybeans, seeds, for example cotton, as well as glucose, sucrose, lactose, starch etc.
The cultivation takes place aerobically, that is to say, for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner with shaking or agitation with air or oxygen in shaking flasks or in known fermenters, preferably at a pH of 6-8. As temperature, a temperature between 20 and 40 is suitable.
By operating in this way, the nutrient solution has an effect
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Noticeable antibacterial usually after one and a half to five days.
Depending on the composition of the nutrient solution used, either a mixture of cinerubins A and B, or especially cinerubin A or especially cinerubin E, is produced.For example, Streptomyces cinereoruber var.fructofermentans can be grown on nutrient solutions + containing, for one liter of water, the following substances: Nutrient solution No. 12/41: glycerin 20 g, soy flour
10 g, sodium chloride 5 g, calcium carbonate 10 g and sodium nitrate 1 g.
Nutrient solution No. 22 1 mannite 20 g, product known commercially as "Soluble distillers" 20 g, sodium chloride
3 g and sodium nitrate 1 g.
Nutrient solution No 19: mannita 20 g and soy flour 20 g,
When nutrient solution No. 19 is used, mostly cinerubin A is formed, and with nutrient solution No. 12/41 mainly cinerubin B. With nutrient solution No. 22, a mixture of cinerubins is produced. A and B.
To isolate cinefrubins, one can, for example, use the following methods -. The mycelium is separated from the culture filtrate, after which it is found in said filtrate
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most of the antibiotics. However, significant amounts of antibiotics remain which are adsorbed to the mycelium. It is therefore advantageous to properly extract the latter by washing. Suitable for this purpose are in particular organic solvents which are at least partially miscible with water, such as alcohols, such as for example methanol, ethanol and butanols, or ketones such as for example acetone and methyl ethyl ketone, or else organic or inorganic acids such as acetic, hydrochloric or sulfuric acids.
These mycelium extracts are added to the culture filtrate either directly or after prior concentration in vacuo. The mixture is advantageously extracted at a pH greater than 7, using an organic solvent immiscible with water, for example with esters of lower fatty acids, for example with ethyl acetate or amyl acetate, with hydrocarbons, for example with benzene, with chlorinated hydrocarbons, for example with ethylene chloride, methylene chloride or chloroform, with ketones, for example with methyl propyl ketone, methyl amyl ketone or diisobutyl ketone, with alcohols, such as butyl alcohols or amyl alcohols, with ethers, for example with ethyl ether, diisopropyl ether,
with dibutyl ethers or glycol ethers, and the like. Instead of extracting cultures using a solvent, or in combination with a
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as such extraction serves as a further purification operation, antibiotics can also be obtained by adsorption, for example with activated carbon or activated earths such as fuller's earth, and by subsequent extraction of the adaorbate, by example using an organic solvent at least partially soluble in water, such as acetone, butanol or methyl ethyl ketone.
The cultures can also be extracted directly as indicated, without prior separation of the mycelium.
Further enrichment can also be obtained by re-extracting the organic extracts, containing the antibiotics, with an aqueous acidic solution with a pH of less than 5, most of the antibiotic activity passing into the aqueous phase. Less activity remains in the organic phase. After having been combined, the acidic aqueous solutions are then, as described, extracted again at a pH greater than 7, with an organic solvent immiscible with water. You can repeat this operation several times. Suitable aqueous acidic solutions are dilute acids such as acetic, hydrochloric or sulfuric acids, or buffer solutions such as citrate or phosphate buffers.
Partitioning between an acidic solution or an aqueous alcoholic solution and a water-immiscible solvent is a good method of purification and, if necessary,
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separation of new antibiotics. The distribution takes place advantageously by the counter-current process in suitable devices. Chromatography is also suitable for purification and optionally for separation. Obtaining pure antibiotics in crystalline form takes place, for example, in organic solvents such as acetone, methanol, ethanol, chloroform, mixtures of acetone and methanol, mixtures of acetone and ether. , mixtures of acetone and petroleum ether or in mixtures of benzene and methanol.
For the recrystallization, solvent marls or also aqueous organic solutions, for example dilute alcohols, dilute acetone, etc. are used.
The antibiotic of cinerubin A crystallizes into flakes containing a lot of solid which, on drying in air or in a vacuum, decompose into a dark red powder with a melting point of 155-157. Elemental analysis provides the following values: C = 61.12%, H = 7.03%, N = 1.91%, OCH3 = 4.08%. The ultraviolet absorption spectrum shows bands at the following wavelengths: 234 mu (log E = 2.28), 258 mu (log E = 2.36), 292 mu (log E = 1.92) , 475 m (log E = 2.05), 495 m (log E = 2.11) and 530 m (log E = 1.94).
In the infra-red spectrum, we can see bands, among others at the following wavelengths: 2.9 3.4, 3.5 5.77, 6.06, 6.21,
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6.81 7.02 7.06 7.21, 7.55, 7.68, 7.88, 8.14 8.56, 8.88, 9.05, 9.56 9.84 10.37, , 10.78, 11.19, 11.31, 11.79, 12.32, 12.71 (tape with triple tip), 1µ, la, 13.49. 13.75 and 14.21 cinerubinone.
Upon hydrolysis with dilute mineral acids, the antibiotic oinerubin A breaks down into two reducing carbohydrate components and a neutral aglycone with an antibiotic effect, the latter forming bright red crystals melting 220. 217 - C - Elemental analysis provides the following values 63.70%. (C) CH3 = H = 5.38%, 3.42%, OCH3 spectrum = 7.27% and active hydrogen = 1.26%. In the: ultra-violet, we can see bands at the following wavelengths 234 m E = (log 3.01), m 258 E = (log m 2.68), 294 E = (log 2.25) , 470 m 495 m (log E - 2p30), E = (log 2.34), m 515 m (log E - 2.28) and 530 = (log E cinerubin 2.20).
The 181. B forms bright orange crystals which melt at 180 - elemental Analysis: C gives the following values = = 59.76%, H 6.50%, 30.44%, 0 = N - = 6.38%. 1.78%, OCH, = 4.54%, C-CH- 235 m The ultraviolet spectrum shows bands at the following wavelengths
1% E (log 1 cm = 2.77), 258 m (log E = 2.46), 291 m (log E - 2.03), 297 m (inflection), 394 m (inflection), 415 m ( inflection), 471 m (inflection), 488 m (log E - 2.24), '497 (log E. 2.27), 519 m (log E. 2.16) and 533 m
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(log E = 2, la).
In the infra-red spectrum, we can see bands, among others, at the following wavelengths:
EMI13.1
S, 83 Me 3.38 Me 3.58 e, 5.71 ee 6.16 me 6.78 7.02 Me 7â47 Me 7.60 Me 8.06 9, 8.48 g, 8.75 gb 9s1 9 , 72 Me 9.90, 10.18 me 10.62 11.62, 12.15 12.43 and 12.85,
EMI13.2
When hydrolysis of elnerubin B with dilute mineral acids, the same aglycone, cinerubinone, is formed as when hydrolysing cinerubin A.
Cinerubins have a certain analogy
EMI13.3
with rhodomycins A and B (H. Boaicmann et al., tus, "Chem. Berichte" 88, 1792 [19551 and previous communications cited therein), but however behave in a different manner during chromatography on paper. In addition, the aglycon obtained from cinerubins A and B, namely
EMI13.4
oinerubinone differs from 1, Srhodomycinone by its melting point, its analytical composition and above all by its infrared absorption spectrum.
EMI13.5
The salts of cinerubin A and c1nerubin B are derived from known inorganic and organic acids, for example hydrochloric acid, sulfuric acids, acetic, propionic, valerian, palmitic or oleic acids, succinic, citric, mandelic acids. , glutamic or pantothenic. They are neutral or acidic salts. They are prepared by causing the corresponding acids to act on the free base or by double decomposition of their salts, for example cinerubin sulfate and calcium pantothenate.
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The antibiotics constituted by cinerubins A and B have antibiotic efficacy against various test organisms. If a dilution series (in powers of 10) in glucose broth is used as an in vitro test method. incubated at 37 for 24 hours, we then have the following concentrations which are still inhibiting:
EMI14.1
<tb> Testa-organisms <SEP> Concentration <SEP> inhibane
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>. <SEP> àn <SEP> g / cm3
<tb>
<tb>
<tb> Cinerubin <SEP> A <SEP> Cinerubin <SEP> B
<tb>
EMI14.2
Miorococcus pyogenes, var 0,. 10 M1crococcus pogxes, penicillin-resistant guru var 1 10
EMI14.3
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0.01 <SEP> 1
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0.01 <SEP> 0.01
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 1 <SEP> 10
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphteriae <SEP> 0.001 <SEP> 0.1
<tb>
<tb> Baclllus <SEP> megatherlum <SEP> 0.01 <SEP> 1
<tb>
<tb> Candida <SEP> vuklgais <SEP> 0.1 <SEP> 1
<tb>
<tb> Endomyces <SEP> aibicans <SEP> 0.01 <SEP> 1
<tb>
EMI14.4
Mycobacterium tuberculosis zij 1 10 Entamoeba histolyt1ca.
++) 33,100 +) Grown in synthetic kirchner medium with 5,100 bovine albumin; ; examination of growth after 2 weeks.
EMI14.5
++) Grown in acc-namobs9 medium examining the aminbicidal effect after 24 hours.
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The development of influenza virus on isolated membranes of chorioallantois from chickens from eggs having 14 days of incubation is further inhibited by cinerubins A and B at a concentration of less than 1 g / cm3, while the tissue of chorioallantois itself is not toxic damaged by 100 g / cm3.
In addition, cinerubins exert a strong inhibitory action on the growth of tumors; thus, the growth of a mouse tumor, the EO 771 adenocarcinoma, is strongly inhibited.
Apart from the process for the preparation of crystalline antibiotics called cinerubin A and cinerubin B and their neutral and acid salts, the present invention also relates, as new industrial products, to the compounds indicated proper, in particular the sulphates, hydrochlorides, acetates and pantothenates of these cinerubins, as well as the products of their transformations obtained by hydrogenation or oxidation, as well as the products of cleavage such as are obtained for example by hydrolysis of cinerubins A and B.
The antibiotics referred to as cinerubin A and cine rubin B, their salts and derivatives, the transformation and cleavage products indicated above, or mixtures thereof can be used as medicaments.
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For example in the form of pharmaceutical preparations containing the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or local application.
Substances which do not react with the new compounds, such as gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, are taken into account as carrier materials. , gums, polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterin or other known excipients. The pharmaceutical preparations can be presented, for example, in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form in the form of solutions, suspensions or emulsions. Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers.
They may still also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow. In these examples, temperatures are shown in degrees centigrade.
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Example 1
A nutrient solution of the following composition is prepared: 20 g of soy flour, 20 g of mannite and one liter of tap water, and then adjusted to a pH of 7.8. This solution or a multiple thereof is transferred into conical flasks with an overall volume of 500 cm3 (each filled with 100 cm3 of nutrient solution) or into 500-liter fermenters (each filled with 300 liters of nutrient solution. ), then sterilize for 20 to 30 minutes under a pressure of 1 atmosphere. Up to 10% of a partially sporulating vegetative culture of Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans and incubate, while shaking well or stirring, in the fermenters, at 27, passing air (about one volume of sterile air per volume of nutrient solution per minute).
After 70 to 120 hours of growth, the cultures are filtered, adding a filter aid, depending on the volume either through a filter funnel or through a filter press or a rotary filter, and thus frees mycelium and other solid components the antibiotically active aqueous solution which contains essentially cinerubin A.
Example 2 -----------
If the nutrient solutions a, b, c, d, or e described below are used instead of the medium indicated in Example 1, after having, in a similar manner,
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sterilized inoculated with Streptomyces cinereoruber var. fructo èrmentans, incubated at 27 and filtered, anti-biotically active aqueous solutions, nutrient solutions a, b, c, and e making it possible to obtain a mixture of cinerubin A and cinerubin B, and nutrient solution d allowing d 'obtain essentially cinerubin B. a) 10 g of raw glucose, 5 g of peptone, 3 g of meat extract (Oxo Lab Lemco), 5 g of sodium chloride, 10 g of carbonate calcium and 1 liter of tap water; pH before sterilization:
7.5. b) 10 g of raw glucose, 10 g of "Soluble distillers", 1 g of sodium nitrate, 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water, pH before sterilization: 7 , 5. c) 10 g of raw glucose, 20 cm3 of corn steep liquor, 2 g of secondary potassium hydrophosphatu and 1 liter of tap water; pH before sterilization: 7.5. d) 20 g of glycerin, 10 g of soy flour, 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate, 1 g of sodium nitrate and 1 liter of tap water; pH before sterilization: 7.5. e) 20 g of mannite, 20 g of "Soluble Distillera", 3 g of sodium chloride, 1 g of sodium nitrate and 1 liter of tap water; pH before sterilization: 7.8.
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Example 3 -----------
With 25 liters of acetone, the filter residue from a 50 liter charge obtained according to Example 1 or 2 is stirred, then filtered again. This operation is repeated twice, after which the acetone solutions containing the antibiotic are combined, concentrated in vacuo to 5 liters and combined with the culture filtrate. This solution is then extracted at a pH of 8.5 with 70 liters of ethyl acetate in a "Westfalia" extractor, all of the anti-bacterial activity passing into the organic phase. The extract is then washed with water, concentrated in vacuo to 5 liters and then extracted several times with semi-normal acetic acid.
Ethyl acetate solution now shows minimal antibacterial activity, while most of the activity is found in acetic solutions. These solutions tinted in red-orange are combined brought to a pH of 8.5 using a binormal solution of sodium carbonate, which causes the hue to turn purple, then they are extracted again with acetate. ethyl. The ethyl acetate extract obtained is extracted again with semi-normal acetic acid, after which the latter is, as described, basified and extracted. Finally, the ethyl acetate solution is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo.
This gives the raw bases, colored dark red, which have a strong antibacterial activity.
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The ethyl acetate extract which, after the described treatment with dilute acetic acid, still exhibits relatively minimal bacterial activity is washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. A red, fluid oil is obtained. The latter is treated with petroleum ether, which gives a red powder which, depending on the nutrient solution used, consists of oinerubin A, of cinerubin B or of mixtures of these. this.
Example 4
2.95 g of the crude bases obtained according to Examples 1 and 3 are subjected to countercurrent distribution comprising 120 stages, using the following mixture of solvents: 5 parts by volume of carbon tetrachloride, 4, 5 parts by volume of methanol and 0.7 part by volume of water.
After evaporation in vacuo, at 30, of the contents of the various distribution containers, in stages 7.51, 63, 88 and 115, small maxima of substance and activity are found, while, the main quantity of the substance and activity is enriched in Stage 22. Fractions 14 to 35 are combined to obtain 1.61 g of cinerubin A which, by chromatography on paper, turns out to be unitary. It is recrystallized from a mixture of acetone and methanol, and it forms flakes containing a lot of solvent which, on drying, decompose to form flakes.
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give a dark red powder, melting point 155-157.
Analysis: C 61.12%, H 7.03%, N 1.91%, OCH3 4.08%. Ultraviolet absorption spectrum in absolute alcohol: bands are observed at 234 mu (log E = 2.28), 258 m (log E. 2.36), 292 m (log E = 1.92) , 475 mu (log E = 2.05), 495 m (log E = 2.11) and 530 m (log E = 1.94).
Infrared absorption spectrum in nujol: bands are observed, among others, at the following wavelengths: 1 2.9, 3.4, 3.5, 5.77, 6.06, 6.21 , 6.81, 7.02, 7.06, 7.21, 7.55, 7.68, 7.88, 8.14, 8.56, 8.88, 9.05, 9.56, 9 , 84, 10.37, 10.78, 11.19, 11.31, 11.79, 12.32, 12.71, (tape with triple tip), 13.10, 13.49, 13.75 and 14.21.
In a chromatogram on paper with a round filter and the benzene-forma ml solvent system, cinerubin A shows an RF value of 0.55. Under marl conditions, rhodomycin A and rhodomycin B remain at the point of impact of the drops.
Example 5
A solution of 50 mg of cinerubin A in 10 cm3 of normal sulfuric acid is heated for 20 minutes at 100.
The red flakes then separated. After cooling, the red solution was extracted with ethyl acetate, whereby the color passed into the organic phase.
The aqueous phase is neutralized with a binormal solution of barium hydroxide; filter and evaporate in vacuo.
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The residue contains at least two reducing carbohydrates which, in a chromatogram on paper, with a mixture of butanol and glacial acetic acid (9: 1) saturated with water, show RF values of 0.13 and 0, respectively. , 38.
The red colored ethyl acetate extracts are washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. In a mixture of benzene and methanol, cinerubinone is obtained in bright red crystals, melting point = 217-220. Analysis: C 63.70%, H 5.38% (C) CH3 3.42%., OCH3 7.27%, H act. 1.26%. Ultraviolet absorption spectrum in absolute alcohol: bands are observed at 234 m (log E = 3.01), 258 m (log E = 2.68), 2.94 m (log E = 2, 25), 470 m (log E = 2.30), 495 m (log E = 2.34) 515 m (log E = 2.28) and 530 m (log E = 2.20).
Infrared absorption spectrum in potassium bromide: bands are observed, among others, at 2.87, 3.00, 3.25, 3.43, 3.52. 5.78, 6.06, 6.24, 6.88, 7.07, 7.55, 7.69 8.30 8.13,,: 8.54, 8.84 9.34 9.06, , 9.56, 9.75, 9.98, 10.07 10.28, 10.47, 11.01, Il..59, 11.87, 12.02, 12.72, 13.31, 13 , 88 14.10. and 14.49:
In a paper chromatogram with the benzene-formamide solvent system, cinerubinone shows an Rp value of 0.8.
With 3. concentrated sulfuric acid it gives a pure blue tint.
Cinerubinone exerts an antibiotic effect against certain test organisms.
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Example 6 -----------
16 g of the crude bases obtained according to Examples 2 (nutrient solution d) and 3 are subjected to a countercurrent distribution in 300 stages, using the following mixture of solvents; 7.5 parts by volume of carbon tetrachloride, 6.375 parts by volume of methanol and 1.125 parts by volume of water. The contents of the various distribution vessels are evaporated under vacuum at 30. Along with relatively small maxima of activity and substance, for example in stages 260 to 295, cinerubin A is found in stages 54 to 70 and cine-rubin B in vessels 17 to 37. The solutions of these vessels are combined and 500 cm3 of water are added thereto. The lower phase is then separated and the upper phase is further extracted twice with 200 cm3 of carbon tetrachloride each time.
The extracts are combined, washed with a little water, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo.
The residue is dissolved in 50 cm3 of benzene and a can of methanol is added hot. On leaving to stand, the cinerubin B separates in the form of orange crystals. They are recrystallized from the same mixture of solvents and they melt at 180-181. Analysis: C 59.76%, H 6.50%, 0 30.44%, N 1.78%, OCH3 4.54%, C-CH3 6.38%.
The ultraviolet absorption spectrum in absolute alcohol has the following bands: # max (m 235 258 291 297 394 415 Log E 1% 1cm 2.77 2.46 2.03 2.025 1.56 1.67
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# max (m) 471 488 497 519 533 log E 1% 2.17 2.24 2.27 2.16 2.10
1 cm Infra-red spectrum (in potassium bromide): bands are observed, among others, at: 2.83, 3.38, 3.58, 5.71,
EMI24.1
6.16gb 6.78gb 7sO2gb 7e47gb 7.60gb 8.06gb 8.48gb 8.75 9, 9.41gb 9.72 / 1, 9.90gb 10.18 / 1, 10 , 62 go 11.62 go 12.15 go 12.43 and 12.85.
Example 7
A solution of 50 mg of cinerubin B in 10 cm3 of normal sulfuric acid is heated for 20 minutes at 1000, then treated as described in Example 5. The substance obtained from the extracts of ethyl acetate is identical to the cinerubinone described in Example 5.