<Desc/Clms Page number 1>
La présente invention a trait à un nouvel antibiotique, que la demanderesse a appelé FI 1163, et au prooédé pour sa pro duotion.
Plus particulièrement, elle concerne sa production par la fermentation d'une nouvelle souche de Streptomyoes (Streptomyces lucansis), son obtention des bouillons de fermentation, et sa purification ultérieure.
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La présente invention a pour objet l'antibiotique et ses sels, aussi bien à l'état solide qu'en solution.
L'antibiotique obtenu selon la présente invention exerce une action spécifique sur les champignons et sur les levures pathogènes pour l'homme, les animaux et les plantes. On connaît déjà différentes autres substances ayant une action antifongique, obtenues soit par synthèse, soit par fermentation de microorganismes. Cependant, on sait bien que ces substances présentent généralement une toxi- cité élevée pour les organismes supérieurs, ce qui en limite fortement l'emploi pratique. Parmi celles-ci on peut citer, par exemple, la candidine, l'ascosine, les actino- mycines, la steptotricine, la géomycine, etc..., qui sont des produits du métabolisme d'autres streptomycètes.
,
Comme on l'a dit, l'antibiotique FI 1163 est produit par fermentation d'un nouvel organisme appartenant au genre Streptomyces; il a été isolé d'un échantillon de terrain prélevé dans le territoire de Lucques (Toscane), moyennant suspension-terre en plaque sur terrain glycérine-glycocolle et incubation dans un thermostat à 37 C pendant 5 jours.
Au microscope optique, la souche présente des hyphes rami- fiées avec des ramifications à forme de spirale, fréquemment crochues à leurs extrémités.
Agar pomme de terre : développement excellent, mycélium végétatif jaune citron pâle, mycélium aérien gris chamois ou brun-clair, poudreux, avec des mèches ou zones répandues, plus claires. Pigment soluble gris-cendre après trois jours, gris-brun par la suite.
Agar Czapek : développement assez considérable, mycélium végétatif incolore coaleur miel, mycélium aérien blanc à blanc opaque, poudreux. Il ne produit pas de pigment
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soluble ; revers incolore à jaune-citron très pâle.
Agar carotte : développement bon, mycélium végétatif inco- lore, mycélium aérien gris chamois, poudreux; pas de produc- tion de pigment soluble; revers incolore à ocre.
Agar amidon: développement excellent; mycélium végétatif incolore à couleur miel; mycélium aérien gris chamois couleur chamois à brun-clair, poudreux, parfois avec de petites mèches blanches; il prend parfois aussi une tonalité mauve ; absence de pigment soluble et revers incolore à jaune très pâle. Il hydrolyse assez bien l'amidon.
Agar levure: développement bon; mycélium végétatif brun, mycélium aérien peu développe, gris-brun, pousse en petites colonies relevées; pigment soluble brun.
Agar glycérine-glycocolle: développement excellent, mycélium végétatif jaune-citron, revers jaunâtre, mycélium aériejn gris-brun poudreux ; ilproduit un pigment soluble.
Gélatine : développement abondant; mycélium végétatif brun; mycélium aérien blanc d'abord, gris-brun par la suite. Tort brunissement du substratum déjà après trois jours. Aucune fluidification, même après 25 jours.
Bouillon de viande : après 20 jours, développement très léger en flocons, ou alors flottant en surface, fort bru- nissement du bouillon.
La couche présente une activité très faible sur les germes gram-positifs, pas d'activité sur les germes gram- -négatifs et sur myco-bactéries, une bonne activité, par contre, sur les levures, une activité excellente sur les champignons, soit pathogènes végétaux ou animaux, soit saprophytes en général.
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Sur la base des caractéristiques citées, la souche de Streptomyces isolée par la demanderesse et appelée Streptomyces lucensis ne correspond à aucune autre espèce trouvée par la demanderesse dans la bibliographie (1) et en particulier dans le "Manual of General Microbiology" de Bergey.
La souche se conserve bien sur un terrain solide contenant des hydrates de carbone (tels que l'amidon, le glucose, etc...), des substances azotées telles que les amino-acides et des substances plus complexes, ainsi que ' des sels. La sporification, de cette façon, est toujours très abondante. La période d'incubation est de 10 jours environ à des températures comprises entre 26 et 37 C la meilleure à 28 C.
Sur un terrain solide, la souche se conserve par conséquent jusqu'à 3 mois à une température d'environ 0 C
Elle se conserve d'autre part tout aussi bien dans la terre stérile lyophilisée.
La production de l'antibiotique est effectuée selon un procédé général consistant à cultiver le streptomycète caractérisé ci-dessus, en contact avec un liquide stérile contenant une ou plusieurs sources de carbone et d'azote assimilable, ainsi que des sels. Comme source de carbone assimilable, on peut employer la dextrose, la saccharose, des dextrines ou un autre polysaccharide assimilable.
Comme source d'azote assimilable, on peut employer des subs- tances protéiques comme la caséine, la peptone ou des subs- tances azotées plus simples,' comme les amino-acides, ou alors des extraits végétaux, des extraits de viande et d'autres produits tels que le oorn-steep ou des produits d'hydrolyse des protéines.
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La fermentation peut s'effectuer dans un Erlenmeyer de 100-500 cm3 dans des conditions de bonne aération et à une température optimum de 25-35 C. L'.activité se manifeste déjà après environ 30 heures, et elle se maintient haute et constante jusqu'à 70 heures environ.
La culture de l'organisme producteur peut aussi être conduite en effectuant une fermentation submergée dans les conditions d'agitation, d'aération et de température les plus convenables, selon le mode opératoire et avec les appareillages bien connus par les experts en matière de ces :procédés.
L'activeité antibiotique de ces cultures est essayée sur un organisme test qui, dans le présent cas, est le Debaremyces marylandii op 52 L.C.I. Une suspension appro- priée de cet organisme est ajoutée à un agar Saboaraud (refroidi à 50 C), les plaques sont soumises à une incuba- tion pendant environ 48 heures à 25-29 C, après quoi on lit les halos formés.
La présente invention concerne aussi l'extraction et la purification du nouvel antibiotique des cultures du Streptomyoes lucentsis d'où il est produit. L'obtention de préparations actives et suffisamment purifiées de l'antibio- tiqua, selon la présente invention, a lieu d'après une méthode générale consistant en l'extraction des filtrats des cultures et 'du mycélium séparément, ou du bouillon total non filtré, à l'aide de différents solvants, tels que le chloroforme ou des alcools non miscibles ou par- tiellement miscibles à l'eau; pari;,1 ceux-ci on a préféré l'alcool butylique normal, et on a effectué l'extraction avec ce solvant du filtrat de culture et du mycélium, séparément.
L'extraction séparée du mycélium peut être effectuée avec ces solvants, ou bien avec d'autres, dans lesquels
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l'antibiotique présente une solubilité suffisante (par exemple des alcools inférieurs, anhydres ou aqueux, acétone aqueuse). Le pH des cultures, avant la filtration et l'ex- traction, est réglé à environ 7.
Les extraits obtenus sont concentrés ensuite dans le vide et le produit actif est précipité à l'aide d'un solvant dans lequel il est insoluble, comme l'éther de pétrole.
Ce précipité, séché et pulvérisé, se présente sous forme d'une poudre d'une couleur jaune clair, jaune crème ou légèrement brune.
Le produit brut peut être purifié en utilisant les propriétés de l'antibiotique d'être soluble dans l'eau (sous forme de sel sodique dans une solution de tampon phosphate pH 7 ou de bicarbonate de sodium), d'une part, et d'être peu soluble dans l'eau ayant un pH compris entre 4 et 5, d'autre part. On a préféré un procédé fondé sur cette propriété, de sorte que le produit brut est extrait aveo une solution de tampon phosphate pH 7 ou de bicarbonate de' sodium, la suspension obtenue est soumise à un essorage pour séparer une matière résiduaire inactive, les solutions claires sont portées au pH 4,5 avec un aoide minéral. Le précipité obtenu est essoré et séché. Les opérations sont effectuées, autant que possible, dans un milieu d'azote, à l'abri de la lumière'et à basse température.
Une purification ultérieure du produit peut être obtenue par des procédés bien connus d'extraction et de lavage avec des solvants dans lesquels le FI 1163 soit respectivement soluble ou insoluble,
En tout oas, aussi bien le produit obtenu de la façon susmentionnée que celui ultérieurement purifié montrent constamment les caractéristiques biologiques que la deman-
<Desc/Clms Page number 7>
deresse a indiquées, qui en justifient l'emploi pratique.
Le nouvel antibiotique est une substance azotée de- caractère acide, peu soluble dans l'eau, mais soluble dans l'eau sous forme de sel sodique; elle ne contient pas de soufre, Elle est, en outre, très soluble dans le chloroforme et l'éthylcellosolve, soluble dans le méthanol, l'éthanol, le butanol normal, la pyridine, la diméthylformanmide; peu soluble dans l'acétone et dans l'acétate d'éthyle; inso- luble dans l'éther, l'essence et l'éther de pétrole. Avec l'acide sulfurique concentré, elle donne une coloration rouge-brun. Les solutions dans l'alcool méthylique de l'Fi 1163 présentent dans l'ultraviolet trois maxima d'ab- sorption correspondant aux longueurs d'ondes suivantes : 290, 304 et 318 millimicrons.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge en KBr est représenté sur le dessin annexé, dont les ordonnées indiquent la transmission en % et les abscisses les longueurs d'onde en microns.
Afin de réaliser une caractérisation plus complète du nouveau produit, on donnera ci-après les Rf obtenus dans des essais de ohromatographie sur papier Whatman n 1 avec le développement ascendant et la révélation à l'aide d'une bioautographie sur plaques ensemencées avec de la "Candida albicans" :
EMI7.1
<tb> Système <SEP> solvant <SEP> Rf
<tb>
<tb> 1) <SEP> Butanol-aeide <SEP> acétique-eau <SEP> 2:1:1 <SEP> 0,75
<tb>
<tb> 2) <SEP> Benzène-acide <SEP> acétique-eau <SEP> 2 <SEP> :1:1 <SEP> 0,21
<tb>
<tb> 3) <SEP> Butanol-pyridine-eau <SEP> 1:0,6:
1 <SEP> 0,60
<tb>
<tb> 4) <SEP> Butanol <SEP> saturé <SEP> d'eau <SEP> + <SEP> 2 <SEP> % <SEP> d'hydrate
<tb>
<tb> d'ammonium <SEP> 0,06
<tb>
L'FI 1163 à l'état solide est -très stable, surtout s'il
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est conservé à l'abri de la lumière et de l'air.
Ses solutions aqueuses neutres, conservées à + 5 , gardant luur activité inaltérée pendant plusieurs jours; au contraire, l'activité diminue rapidement si les munies solutions sont conservées à température ambiants.
EMI8.1
Comme il ressort des caractéristiques sus-m. ntionnées, la substance obtenue par la demanderesse appartient au
EMI8.2
groupe des antibiotiques poliéniques avec un chrornophore tétraénique. De ce groupe, les deux premiers représentants ont été décrits en 1951, la nistatine (2) et la rimocydine (3), produites respectivement par le Streptomyces noursei et par le S. rimosus, (souche qui produit de la Terramyoine).
EMI8.3
On a décrit par la suite l'antimycéine (4), substance très semblable à la nistatine et produite par le Strepto-
EMI8.4
myces aureus, et la chrorrine, obtenue par la culture d'une souche semblable au S. antibioticus (5).
Un chromophore tétraénique se trouve enfin dans l'amphotéricine A, obtenue récemment par le Streptomyoes M-4575 (6).
Le Streptomyces lucensis représente, avec ses carac- téristiques morphologiques et de culture, une espèce nette- ment différenciable de celles produisant d'autres antibio-
EMI8.5
tiques antifonsiques, et en particulier du noursei, rimosus, aureus, antibioticus, M-4575
EMI8.6
La substance produiue par l'FI 1163 présente dans propriétés chimiques et physico-chimiques .qui en permettent la différenciation sûre des substances sus-#antionnées.
L'activité antifongique de 1'FI 1163 est confirmée
EMI8.7
par les propriétés bioloi-cilies suivantes de la. substance : Les données conce:rn<::l1t l'activité antibiotique "in vitro" de 1T1'I 1163 sont consi nées dans 1 taaleau I.
Les essais sur 1-,s blastomycètes et les schizoinycètos
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ont été effectués dans un bouillon de viande additionné de glucose; ceux pour les hyphomycètes proprement dits, dans un terrain Sabouraud liquide.
Les lectures ont été effectuées après 8 jours à 30 C
Tableau 1
EMI9.1
Dose inhibitrice minima en mioro5rammes/ml
EMI9.2
<tb> 1 <SEP> Actinomyces <SEP> bostrëmi <SEP> A <SEP> > <SEP> 100 <SEP>
<tb>
EMI9.3
2 TSocardia asteroides > 100
EMI9.4
<tb> 3 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 0,8
<tb>
<tb> 4 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> val <SEP> . <SEP> 0,7
<tb>
<tb> 5 <SEP> Debaryomyces <SEP> hudeloi <SEP> 0,7
<tb>
EMI9.5
6 'r neoormans 0,6 7 " tyrocola 8 8 " marylandii 2 9 " guillermondii 3
EMI9.6
<tb> 10 <SEP> " <SEP> oannensis <SEP> 0,5
<tb>
EMI9.7
11 Torulopsis noofonnanx 0,3
EMI9.8
<tb> 12 <SEP> Saccharomyoes <SEP> oerevisiae <SEP> 2
<tb>
<tb> 13 <SEP> Eremothecium <SEP> hashbyii <SEP> 25
<tb>
<tb> 14 <SEP> Pénicillium <SEP> sp. <SEP> 20
<tb>
EMI9.9
15 Aspergil1 L1S sp.
(T) ' .{. 10
EMI9.10
<tb> 16 <SEP> " <SEP> niger <SEP> 20
<tb>
<tb> 17 <SEP> Glenospora <SEP> graphii <SEP> 100
<tb>
EMI9.11
18 Glenosporel1a dermatitidis 10 ' 19 Pseudomyooderma rr.atalense 1 20 Trichophyton faviforrne ochracetxm 30
EMI9.12
<tb> 21 <SEP> Trichophyton <SEP> maggini <SEP> 30
<tb>
<tb> 22 <SEP> " <SEP> radians <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb> 23 <SEP> " <SEP> rhodainii <SEP> 30
<tb>
EMI9.13
24 " plicatile <.", 10
<Desc/Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb> 25 <SEP> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 30
<tb>
<tb> 26 <SEP> Epidermophyton <SEP> floccosum <SEP> #10
<tb>
<tb> 27 <SEP> Saboaraadites <SEP> gypesus <SEP> # <SEP> 10
<tb>
<tb> 28 <SEP> Histoplasma <SEP> capsulatum
<tb>
<tb> (phase <SEP> du <SEP> mycélium) <SEP> # <SEP> 10
<tb>
Inoculation : 1000 cellules environ pour les blastomycètes et les schizomycètes.
Fragment de culture jeune pour les hyphomycètes proprement dits.
On a trouvé, en outre, que la présence de 10% de sérum dans le terrain de culture détermine seulement de légères modifications de la valeur de la DIM.
Toxicité - L'aspect toxicolgoique aigu de l'FI 1163 se présente favorable, car les DE .50, déterminées sur la soeris par les différentes voies d'administration, sont Iras loin des doses thérapeutiques.
Les exemples ci-après serviront à mieux illustrer l'invention, mais on spécifie que celle-ci ne se limite pas aux substances ou aux quantités particulières indiquées dans les exemples et dans le résumé qui les suit.
Il est entendu que l'invention comprend toutes les matières, toutes les quantités et toutes les opérations équivalentes .
Exemple 1.
On prépare 40 Erlenmeyers de 300 cm3, contenant cha- cun 60 om3 de terrain de la composition suivante (parties pour mille): sucres (dextrine) 20 ; cornsteep 10; caséine 5; carbonate de calcium 4; sulfate d'ammonium 1 ; phosphate bipotassique 0,1 (pH du terrain 6,7). Ces ballons, stérili- sés à 120 C pendant 20 minutes, sont inoculés avec une suspension de spore obtenue en lavant une culture en tube
<Desc/Clms Page number 11>
à bec de flûte ayant un diamètre de 25 mmm, âgée de 20 jours environ, avec 10 cm3 d'eau distillée stérile, à raison de 0,2 cm3 par ballon.
Les ballons sont maintenus à une température de 20 C et agités selon un mouvement rotatif alternatif d'environ 220 tours par minute, pendant 60 heures. Comme on le voit des données indiquées ci-après, l'activité atteint sa valeur maximum après 40 heures environ :
EMI11.1
<tb> Heures <SEP> de <SEP> pH <SEP> du <SEP> bouillon <SEP> Diamètre <SEP> du <SEP> halo
<tb> fermenta- <SEP> de <SEP> culture <SEP> d'inhibition <SEP> sur <SEP> Debar.
<tb> tion <SEP> mâryl. <SEP> en <SEP> mm <SEP> (méthodes
<tb> des <SEP> plaques <SEP> d'agar)
<tb>
<tb>
<tb> 38 <SEP> 6,4 <SEP> 33
<tb>
<tb> 41 <SEP> 6,6 <SEP> 34,5
<tb>
<tb> 47 <SEP> 7,8 <SEP> 31,5
<tb>
<tb> . <SEP> 54 <SEP> 7,8 <SEP> 30,25
<tb>
<tb> 61 <SEP> 7,0 <SEP> 28
<tb>
Exemple 2.
3000 cm3 d'un terrain ayant la composition suivante :
EMI11.2
<tb> Dextrine <SEP> 20 <SEP> %.
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 3 <SEP> %.
<tb>
EMI11.3
CACO3 4 %Éa
EMI11.4
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> technique <SEP> 1 <SEP> %.
<tb> Caséine <SEP> 5 <SEP> %.
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,1 <SEP> %.
<tb>
Après stérilisation à 120 C pendant 60 minutes (pH après stérilisation 7,10), dans un récipient de fermenta- tion de laboratoire de 5 litres, on effectue l'inoculation avec une suspension de spores obtenue du lavare de demi-col-
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les. Les conditions de la fermentation sont les suivantes : Agitation 400 tours par minute aération lt, l/lt/m température 27 c durée 24 heures.
Pour la phase de production, on emploie des récipients de fermentation de 10 litres avec 6000 cm3 de terrain ayant la composition suivante :
EMI12.1
<tb> Saccharose <SEP> , <SEP> 20 <SEP> %.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 10 <SEP> %
<tb>
<tb> Dextrine <SEP> 10 <SEP> %
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 10 <SEP> %
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 4 <SEP> %
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0,1 <SEP> %
<tb>
EMI12.2
(NH4)2S04 teohnique l %0
EMI12.3
<tb> Silicone <SEP> fluide <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
La stérilisation du terrain est effectuée à 120 C pendant 90 minutes. La saccharose et la dextrose sont sté- rilisées à part à 120 C pendant 20 minutes. Le pH après stérilisation est 7,04.
Le terrain est inoculé avec 2,5 % de mycélium végé- tatif de 24 heures.
Les conditions de fermentation sont les suivantes : Agitation 450 tours par minute Aération lt. 1/lt/m Température 27 C Marche de la fermentation :
EMI12.4
Age pH Titre en mioro;rammes/m1
EMI12.5
<tb> DS <SEP> 7,0
<tb>
<tb> 24 <SEP> 6,6 <SEP> 200
<tb>
<tb>
<tb> 48 <SEP> 7,0 <SEP> 580
<tb>
<tb>
<tb> 55 <SEP> 7,0 <SEP> 1020
<tb>
<Desc/Clms Page number 13>
Exemple 3
On effectue une fermentation comme dans l'exemple précédent, en remplaçant le terrain de la phase de produc- tion par un terrain ayant la même composition que celui de
EMI13.1
la phase végétative. Titre maximum : 280 microgranmes/ml à 48 heure s.
Exemple4.
On effectue une fermentation comme dans les exemples 2 et 3, en remplaçant le terrain de 'la phase de production par un terrain de la composition suivante :
EMI13.2
<tb> Saccharose <SEP> 20 <SEP> %
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP> %
<tb>
<tb> NaCo <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 20 <SEP> %.
<tb>
EMI13.3
(NH4)2S04 tecimique 3 %o
EMI13.4
<tb> CaCo3 <SEP> 10 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Silicone <SEP> fluide <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
EMI13.5
Titre maximum : 230 miorogrammés/ml après 24 heures.
Exemple 5.
On effectue une fermentation comme dans les exemples 2,3 et 4 en employant-, pour la phase de production, un terrain ayant la composition suivante :
EMI13.6
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP> %
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 3 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 20 <SEP> %
<tb>
EMI13.7
. (NNjS04-echnique 3%,
EMI13.8
<tb> CaCO3 <SEP> 10%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Silicone <SEP> fluide <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
Tit re maximum : 170 micregrammes /m1 après 24 heures.
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Exemple 6.
18 litres d'un bouillon de fermentation obtenu comme dans l'exemple 2 sont filtrés à l'aide d'un supercel comme co- adjuvant . Le Mycélium obtenu est extrait par agitation avec trois portions successives d'alcool butylique normal rnesu- rant respectivement 2-1, 5-1,5 litres. Le bouillon filtré (17.100 litres) est extrait avec trois portions de butanol (total = 6,600 litres). Tous les extraits réunis et lavés à l'eau (2 litres) sont évaporés sous vide à une température inférieure à 40 C Du liquide concentré obtenu, on préci- pite l'antibiotique par addition d'éther de pétrole.
Rendement : 16,6 g.
Exemple 7*
128 g d'antibiotique brut, obtenus selon un procédé analogue à celui de l'exemple 6, sont dissous dans 1250 cm3 d'une solution saturée de bicarbonate de .sodium.
Cette opération est effectuée en faisant passer un courant d'azote dans le liquide ..
Après dilution avec un volume égal d'eau, la suspens sion est essorée et la solution brune obtenue est portée à pH 4,5 avec HCl 6 N (270 cm3).
L'antibiotique précipite sous forme d'acide libre, est séparé par essorage et séché. Rendement : 95 Bibliographie.
1) S.A. Waksman et H.A. Lechevalier, "Actionomyces and their antibiotics" - 1953.
2) E.L. Hazen et R. Brown, proc.Soc.Exptil Biol.lied. 76
93 (1951).
3) J.w. Davisson et al. : Antibiotics of Chemotherapy 1,
289 (1951).
4) F.Raubitschek et al. Ibid. 2, 179 (1952).
<Desc/Clms Page number 15>
5) S.Wakaki et al. J.Antibiotios (Japon) 5 677 (1952).
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to a novel antibiotic, which the Applicant has called FI 1163, and to the process for its production.
More particularly, it concerns its production by the fermentation of a new strain of Streptomyoes (Streptomyces lucansis), its obtaining fermentation broths, and its subsequent purification.
<Desc / Clms Page number 2>
The present invention relates to the antibiotic and its salts, both in the solid state and in solution.
The antibiotic obtained according to the present invention exerts a specific action on fungi and on pathogenic yeasts for humans, animals and plants. Various other substances are already known which have an antifungal action, obtained either by synthesis or by fermentation of microorganisms. However, it is well known that these substances generally exhibit high toxicity to higher organisms, which severely limits their practical use. Among these, there may be mentioned, for example, candidin, ascosin, actinomycins, steptotricin, geomycin, etc., which are products of the metabolism of other streptomycetes.
,
As has been said, the antibiotic FI 1163 is produced by fermentation of a new organism belonging to the genus Streptomyces; it was isolated from a field sample taken in the territory of Lucca (Tuscany), by means of suspension-soil in a plate on glycerin-glycocoll ground and incubation in a thermostat at 37 C for 5 days.
Under an optical microscope, the strain shows branched hyphae with spiral-shaped branches, frequently hooked at their ends.
Potato agar: excellent development, pale lemon-yellow vegetative mycelium, buff-gray or light-brown aerial mycelium, powdery, with streaks or areas widespread, paler. Soluble pigment ash gray after three days, gray-brown thereafter.
Czapek Agar: fairly considerable development, colorless vegetative mycelium coaling honey, white to opaque white aerial mycelium, powdery. It does not produce pigment
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soluble; colorless to very pale lemon yellow reverse.
Carrot agar: good development, colorless vegetative mycelium, buff-gray aerial mycelium, powdery; no production of soluble pigment; reverse colorless to ocher.
Starch agar: excellent development; colorless to honey-colored vegetative mycelium; buff-gray to light brown aerial mycelium, powdery, sometimes with small white streaks; it sometimes also takes on a purple hue; absence of soluble pigment and colorless to very pale yellow reverse. It hydrolyzes starch quite well.
Yeast agar: good development; vegetative mycelium brown, sparsely developed aerial mycelium, gray-brown, grows in small, raised colonies; soluble pigment brown.
Glycerin-glycocoll agar: excellent development, lemon-yellow vegetative mycelium, yellowish underside, powdery gray-brown airy mycelium; it produces a soluble pigment.
Gelatin: abundant development; brown vegetative mycelium; aerial mycelium white first, gray-brown later. Tort browning of the substratum already after three days. No thinning, even after 25 days.
Meat broth: after 20 days, very light development in flakes, or else floating on the surface, strong rustling of the broth.
The layer has a very low activity on gram-positive germs, no activity on gram-negative germs and on myco-bacteria, good activity, on the other hand, on yeasts, excellent activity on fungi, i.e. plant or animal pathogens, or saprophytes in general.
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On the basis of the characteristics cited, the strain of Streptomyces isolated by the applicant and called Streptomyces lucensis does not correspond to any other species found by the applicant in the bibliography (1) and in particular in the “Manual of General Microbiology” by Bergey.
The strain keeps well on solid ground containing carbohydrates (such as starch, glucose, etc.), nitrogenous substances such as amino acids and more complex substances, as well as' salts . Sporification, in this way, is always very abundant. The incubation period is approximately 10 days at temperatures between 26 and 37 C the best at 28 C.
On solid ground, the strain can therefore be stored for up to 3 months at a temperature of around 0 C
On the other hand, it keeps just as well in sterile freeze-dried soil.
The production of the antibiotic is carried out according to a general process consisting in cultivating the streptomycete characterized above, in contact with a sterile liquid containing one or more sources of carbon and assimilable nitrogen, as well as salts. As the source of assimilable carbon, dextrose, sucrose, dextrins or another assimilable polysaccharide can be employed.
As the source of assimilable nitrogen, protein substances such as casein, peptone or simpler nitrogen substances, such as amino acids, or alternatively vegetable extracts, extracts of meat and meat can be employed. other products such as oorn-steep or protein hydrolysis products.
<Desc / Clms Page number 5>
Fermentation can be carried out in a 100-500 cm3 Erlenmeyer flask under good aeration conditions and at an optimum temperature of 25-35 C. The activity is already manifested after about 30 hours, and it remains high and constant. up to about 70 hours.
The culture of the producing organism can also be carried out by carrying out a submerged fermentation under the most suitable conditions of agitation, aeration and temperature, according to the procedure and with the apparatus well known by the experts in the field of these. : processes.
The antibiotic activity of these cultures is tested on a test organism which, in the present case, is Debaremyces marylandii op 52 L.C.I. A suitable suspension of this organism is added to Saboaraud agar (cooled to 50 ° C.), the plates are incubated for about 48 hours at 25-29 ° C., after which the formed halos are read.
The present invention also relates to the extraction and purification of the novel antibiotic from the cultures of Streptomyoes lucentsis from which it is produced. The obtaining of active and sufficiently purified preparations of the antibiotic according to the present invention takes place according to a general method consisting of the extraction of the filtrates from the cultures and of the mycelium separately, or from the unfiltered total broth. using various solvents, such as chloroform or alcohols which are immiscible or partially miscible with water; However, normal butyl alcohol was preferred, and extraction of the culture filtrate and mycelium with this solvent was carried out separately.
The separate extraction of the mycelium can be carried out with these solvents, or with others, in which
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the antibiotic has sufficient solubility (eg lower alcohols, anhydrous or aqueous, aqueous acetone). The pH of the cultures, before filtration and extraction, is set to about 7.
The extracts obtained are then concentrated in vacuo and the active product is precipitated using a solvent in which it is insoluble, such as petroleum ether.
This precipitate, dried and pulverized, is in the form of a powder of a light yellow, creamy yellow or slightly brown color.
The crude product can be purified using the properties of the antibiotic to be water soluble (as sodium salt in pH 7 phosphate buffer or sodium bicarbonate solution) on the one hand, and 'be poorly soluble in water having a pH between 4 and 5, on the other hand. A process based on this property has been preferred, such that the crude product is extracted with a solution of pH 7 phosphate buffer or sodium bicarbonate, the suspension obtained is subjected to a suction to separate an inactive waste material, the solutions. clear are brought to pH 4.5 with mineral aid. The precipitate obtained is filtered off and dried. The operations are carried out, as far as possible, in a nitrogen medium, protected from light and at low temperature.
Further purification of the product can be obtained by well known methods of extraction and washing with solvents in which the FI 1163 is respectively soluble or insoluble,
In all cases, both the product obtained in the aforementioned manner and that subsequently purified constantly show the biological characteristics as required.
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deresse has indicated, which justify its practical use.
The new antibiotic is a nitrogenous substance of an acidic character, sparingly soluble in water, but soluble in water in the form of sodium salt; it does not contain sulfur. It is, moreover, very soluble in chloroform and ethylcellosolve, soluble in methanol, ethanol, normal butanol, pyridine, dimethylformanmide; sparingly soluble in acetone and in ethyl acetate; insoluble in ether, gasoline and petroleum ether. With concentrated sulfuric acid, it gives a red-brown color. The methyl alcohol solutions of Fi 1163 exhibit three absorption maxima in the ultraviolet corresponding to the following wavelengths: 290, 304 and 318 millimicrons.
The KBr infrared absorption spectrum is shown in the accompanying drawing, the ordinates of which indicate the transmission in% and the abscissas the wavelengths in microns.
In order to achieve a more complete characterization of the new product, the Rf obtained in ohromatography tests on Whatman No. 1 paper with ascending development and revelation using bioautography on plates seeded with "Candida albicans":
EMI7.1
<tb> System <SEP> solvent <SEP> Rf
<tb>
<tb> 1) <SEP> Butanol-aeide <SEP> acetic-water <SEP> 2: 1: 1 <SEP> 0.75
<tb>
<tb> 2) <SEP> Benzene-acid <SEP> acetic-water <SEP> 2 <SEP>: 1: 1 <SEP> 0.21
<tb>
<tb> 3) <SEP> Butanol-pyridine-water <SEP> 1: 0.6:
1 <SEP> 0.60
<tb>
<tb> 4) <SEP> Butanol <SEP> saturated <SEP> with water <SEP> + <SEP> 2 <SEP>% <SEP> of hydrate
<tb>
<tb> ammonium <SEP> 0.06
<tb>
FI 1163 in the solid state is very stable, especially if it
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is stored away from light and air.
Its neutral aqueous solutions, stored at + 5, keeping the activity unaltered for several days; on the contrary, the activity decreases rapidly if the solutions are stored at room temperature.
EMI8.1
As emerges from the characteristics above-m. mentioned, the substance obtained by the applicant belongs to the
EMI8.2
group of polyene antibiotics with a tetraene chrornophore. Of this group, the first two representatives were described in 1951, nistatin (2) and rimocydine (3), produced respectively by Streptomyces noursei and by S. rimosus (strain which produces Terramyoine).
EMI8.3
Antimycein (4), a substance very similar to nistatin and produced by Strepto-
EMI8.4
myces aureus, and chrorrin, obtained by culturing a strain similar to S. antibioticus (5).
Finally, a tetraenic chromophore is found in amphotericin A, recently obtained by Streptomyoes M-4575 (6).
Streptomyces lucensis represents, with its morphological and cultural charac- teristics, a species clearly differentiable from those producing other antibiotics.
EMI8.5
antifonic ticks, in particular noursei, rimosus, aureus, antibioticus, M-4575
EMI8.6
The substance produced by IFI 1163 has chemical and physicochemical properties which allow safe differentiation from the aforementioned substances.
The antifungal activity of the IF 1163 is confirmed
EMI8.7
by the following bioloi-cilies properties of the. substance: The data relating to: rn <:: l1t the antibiotic activity "in vitro" of T1'I 1163 are given in 1 table I.
Tests on 1-, s blastomycetes and schizoinycetes
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were carried out in meat broth supplemented with glucose; those for the hyphomycetes proper, in a liquid Sabouraud soil.
Readings were taken after 8 days at 30 C
Table 1
EMI9.1
Minimum inhibitory dose in mioro5rams / ml
EMI9.2
<tb> 1 <SEP> Actinomyces <SEP> bostrëmi <SEP> A <SEP>> <SEP> 100 <SEP>
<tb>
EMI9.3
2 TSocardia asteroides> 100
EMI9.4
<tb> 3 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> 0.8
<tb>
<tb> 4 <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> val <SEP>. <SEP> 0.7
<tb>
<tb> 5 <SEP> Debaryomyces <SEP> hudeloi <SEP> 0.7
<tb>
EMI9.5
6 'r neoormans 0.6 7 "tyrocola 8 8" marylandii 2 9 "guillermondii 3
EMI9.6
<tb> 10 <SEP> "<SEP> oannensis <SEP> 0.5
<tb>
EMI9.7
11 Torulopsis noofonnanx 0.3
EMI9.8
<tb> 12 <SEP> Saccharomyoes <SEP> oerevisiae <SEP> 2
<tb>
<tb> 13 <SEP> Eremothecium <SEP> hashbyii <SEP> 25
<tb>
<tb> 14 <SEP> Penicillium <SEP> sp. <SEP> 20
<tb>
EMI9.9
15 Aspergil1 L1S sp.
(T) '. {. 10
EMI9.10
<tb> 16 <SEP> "<SEP> niger <SEP> 20
<tb>
<tb> 17 <SEP> Glenospora <SEP> graphii <SEP> 100
<tb>
EMI9.11
18 Glenosporel1a dermatitidis 10 '19 Pseudomyooderma rr.atalense 1 20 Trichophyton faviforrne ochracetxm 30
EMI9.12
<tb> 21 <SEP> Trichophyton <SEP> maggini <SEP> 30
<tb>
<tb> 22 <SEP> "<SEP> radians <SEP> 30
<tb>
<tb>
<tb> 23 <SEP> "<SEP> rhodainii <SEP> 30
<tb>
EMI9.13
24 "plicatile <.", 10
<Desc / Clms Page number 10>
EMI10.1
<tb> 25 <SEP> Trichophyton <SEP> mentagrophytes <SEP> 30
<tb>
<tb> 26 <SEP> Epidermophyton <SEP> floccosum <SEP> # 10
<tb>
<tb> 27 <SEP> Saboaraadites <SEP> gypesus <SEP> # <SEP> 10
<tb>
<tb> 28 <SEP> Histoplasma <SEP> capsulatum
<tb>
<tb> (<SEP> phase of <SEP> mycelium) <SEP> # <SEP> 10
<tb>
Inoculation: approximately 1000 cells for blastomycetes and schizomycetes.
Fragment of a young culture for the hyphomycetes proper.
It was further found that the presence of 10% serum in the culture soil determines only slight changes in the value of DIM.
Toxicity - The acute toxicological aspect of IF 1163 is favorable, since the ED .50, determined in the body by the various routes of administration, are far from the therapeutic doses.
The following examples will serve to better illustrate the invention, but it is specified that the latter is not limited to the particular substances or amounts indicated in the examples and in the summary which follows them.
It is understood that the invention includes all materials, all amounts and all equivalent operations.
Example 1.
40 300 cm3 Erlenmeyer flasks are prepared, each containing 60 µm3 of soil of the following composition (parts per thousand): sugars (dextrin) 20; cornsteep 10; casein 5; calcium carbonate 4; ammonium sulfate 1; bipotassium phosphate 0.1 (soil pH 6.7). These flasks, sterilized at 120 C for 20 minutes, are inoculated with a spore suspension obtained by washing a tube culture.
<Desc / Clms Page number 11>
recorder having a diameter of 25 mmm, aged about 20 days, with 10 cm3 of sterile distilled water, at a rate of 0.2 cm3 per flask.
The balloons are maintained at a temperature of 20 ° C. and stirred in a reciprocating rotary motion of approximately 220 revolutions per minute, for 60 hours. As can be seen from the data shown below, the activity reaches its maximum value after approximately 40 hours:
EMI11.1
<tb> Hours <SEP> of <SEP> pH <SEP> of <SEP> broth <SEP> Diameter <SEP> of <SEP> halo
<tb> fermenta- <SEP> of <SEP> culture <SEP> of inhibition <SEP> on <SEP> Debar.
<tb> tion <SEP> mâryl. <SEP> in <SEP> mm <SEP> (methods
<tb> of <SEP> agar <SEP> plates)
<tb>
<tb>
<tb> 38 <SEP> 6.4 <SEP> 33
<tb>
<tb> 41 <SEP> 6.6 <SEP> 34.5
<tb>
<tb> 47 <SEP> 7.8 <SEP> 31.5
<tb>
<tb>. <SEP> 54 <SEP> 7.8 <SEP> 30.25
<tb>
<tb> 61 <SEP> 7.0 <SEP> 28
<tb>
Example 2.
3000 cm3 of a ground having the following composition:
EMI11.2
<tb> Dextrin <SEP> 20 <SEP>%.
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 3 <SEP>%.
<tb>
EMI11.3
CACO3 4% EA
EMI11.4
<tb> (NH4) 2SO4 <SEP> technical <SEP> 1 <SEP>%.
<tb> Casein <SEP> 5 <SEP>%.
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0.1 <SEP>%.
<tb>
After sterilization at 120 C for 60 minutes (pH after sterilization 7.10), in a 5-liter laboratory fermentation vessel, the inoculation is carried out with a spore suspension obtained from half-cola lavare.
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the. The fermentation conditions are as follows: Agitation 400 revolutions per minute aeration lt, l / lt / m temperature 27 ° C for 24 hours.
For the production phase, 10 liter fermentation vessels are used with 6000 cm3 of soil having the following composition:
EMI12.1
<tb> Sucrose <SEP>, <SEP> 20 <SEP>%.
<tb>
<tb>
Dextrose <SEP> 10 <SEP>%
<tb>
<tb> Dextrin <SEP> 10 <SEP>%
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 10 <SEP>%
<tb>
<tb> CaCO3 <SEP> 4 <SEP>%
<tb>
<tb> K2HPO4 <SEP> 0.1 <SEP>%
<tb>
EMI12.2
(NH4) 2S04 teohnic l% 0
EMI12.3
<tb> Silicone <SEP> fluid <SEP> 1 <SEP>%
<tb>
The ground is sterilized at 120 ° C. for 90 minutes. Sucrose and dextrose are sterilized separately at 120 ° C. for 20 minutes. The pH after sterilization is 7.04.
The land is inoculated with 2.5% 24-hour vegetative mycelium.
The fermentation conditions are as follows: Agitation 450 revolutions per minute Aeration lt. 1 / lt / m Temperature 27 C Progress of fermentation:
EMI12.4
Age pH Title in mioro; rams / m1
EMI12.5
<tb> DS <SEP> 7.0
<tb>
<tb> 24 <SEP> 6.6 <SEP> 200
<tb>
<tb>
<tb> 48 <SEP> 7.0 <SEP> 580
<tb>
<tb>
<tb> 55 <SEP> 7.0 <SEP> 1020
<tb>
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Example 3
A fermentation is carried out as in the previous example, by replacing the soil of the production phase by a soil having the same composition as that of
EMI13.1
the vegetative phase. Maximum titre: 280 microgranmes / ml at 48 hours s.
Example4.
A fermentation is carried out as in Examples 2 and 3, by replacing the field of 'the production phase by a field of the following composition:
EMI13.2
<tb> Sucrose <SEP> 20 <SEP>%
<tb>
<tb> Dextrose <SEP> 10 <SEP>%
<tb>
<tb> NaCo <SEP> 3 <SEP>%
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 20 <SEP>%.
<tb>
EMI13.3
(NH4) 2S04 technical 3% o
EMI13.4
<tb> CaCo3 <SEP> 10 <SEP>%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Silicone <SEP> fluid <SEP> 1 <SEP>%
<tb>
EMI13.5
Maximum titre: 230 miorogrammed / ml after 24 hours.
Example 5.
A fermentation is carried out as in Examples 2, 3 and 4 by employing, for the production phase, a soil having the following composition:
EMI13.6
<tb> Dextrose <SEP> 20 <SEP>%
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 3 <SEP>%
<tb>
<tb>
<tb> Corn <SEP> steep <SEP> 20 <SEP>%
<tb>
EMI13.7
. (NNjS04-echnique 3%,
EMI13.8
<tb> CaCO3 <SEP> 10%
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Silicone <SEP> fluid <SEP> 1 <SEP>%
<tb>
Maximum titer: 170 micregrams / m1 after 24 hours.
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Example 6.
18 liters of a fermentation broth obtained as in Example 2 are filtered using a supercel as co-adjuvant. The Mycelium obtained is extracted by stirring with three successive portions of normal butyl alcohol, respectively 2-1.5-1.5 liters. The filtered broth (17,100 liters) is extracted with three portions of butanol (total = 6,600 liters). All the extracts combined and washed with water (2 liters) are evaporated under vacuum at a temperature below 40 ° C. From the concentrated liquid obtained, the antibiotic is precipitated by adding petroleum ether.
Yield: 16.6 g.
Example 7 *
128 g of crude antibiotic, obtained according to a process analogous to that of Example 6, are dissolved in 1250 cm3 of a saturated solution of sodium bicarbonate.
This is done by passing a stream of nitrogen through the liquid.
After dilution with an equal volume of water, the suspension is filtered off and the brown solution obtained is brought to pH 4.5 with 6 N HCl (270 cm3).
The antibiotic precipitates in the form of free acid, is filtered off and dried. Yield: 95 Bibliography.
1) S.A. Waksman and H.A. Lechevalier, "Actionomyces and their antibiotics" - 1953.
2) E.L. Hazen and R. Brown, proc.Soc.Exptil Biol.lied. 76
93 (1951).
3) J.w. Davisson et al. : Antibiotics of Chemotherapy 1,
289 (1951).
4) F. Raubitschek et al. Ibid. 2, 179 (1952).
<Desc / Clms Page number 15>
5) S. Wakaki et al. J. Antibiotios (Japan) 5,677 (1952).