**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour la production microbiologique d'un 12-dihydrostéroïde, caractérisé en ce qu'on soumet un 12-hydroxystéroïde à l'action d'un micro-organisme producteur de 12déhydroxylase dans un milieu de culture et on recueille le 12-di hydrostéroide résultant.
2. Procédé selon la revendication 1, pour préparer un composé de formule générale:
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dans laquelle chaque reste X est un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste oxo et R est un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste de taurine ou de glycine, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule générale:
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dans laquelle X et R sont tels que définis ci-dessus à l'action d'un micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase dans un milieu de culture et on recueille ledit produit final.
3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ledit micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase est choisi parmi les genres Clostridium et Bifidobacterium.
4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme appartient au genre Clostridium.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le micro-organisme est Clostridium perfringens.
6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que chaque reste X est un groupe a-hydroxy.
7. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le composé II est l'acide 3a,7a, 12a-trihydroxy- 5,B-cholanique.
8. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le produit final est l'acide 3a,7a:-dihydroxy-5ss-cholanique.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit 12-dihydrostérolde est l'acide 3a,7a-dihydroxy-Sfl- cholanique.
10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme producteur de déhydroxylase appartient au genre Clostridium.
La présente invention concerne un procédé microbiologique pour la production d'un 12-dihydrostéroïde tel que l'acide 3a,7a-dihydroxy- SB-cholanique, qui est généralement extrait de la bile de poules ou d'oies.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet un 12-hydroxystéroïde à l'action d'un micro-organisme producteur de 12-déydroxylase.
Plus particulièrement, l'invention concerne un procédé pour la préparation de composés de formule:
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dans laquelle chaque reste X est un atome d'hydrogène ou un groupe hydroxy, acyloxy, alcoxy ou un reste oxo (O=) et R est un groupe hydroxy, acyloxy ou alcoxy ou un reste de taurine ou de glycine; ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on soumet un composé de formule:
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dans laquelle X et R sont tels que définis ci-dessus à l'action d'un micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase choisi dans les genres Clostridium et Bifidobacterium.
On préfère selon l'invention les composés dans lesquels chaque reste X est un groupe hydroxy et R peut être un groupe hydroxy ou un reste de taurine ou de glycine.
Dans la présente description, une ligne ondulée (t) est utilisée dans les formules de structure pour indiquer que le substituant concerné peut être dans la configuration a ours, selon les cas.
Dans la mise en oeuvre préférée de l'invention, les produits obtenus sont les stéroïdes 3,7-disubstitués et peuvent comprendre des composés tels que l'acide 3a,7a-Sss-cholanique et ses dérivés de taurine et de glycine, l'acide 3a,7B-dihydroxy-5B- cholanique et ses dérivés de taurine et de glycine, les acides 3a,7 a-diacyloxy-Sfi-cholaniques, l'acide 3,7-dioxo-5B-cholani- que et les acides 3a,7a-dialcoxy-5ss-cholaniques et leurs dérivés, qui sont tous des composés connus et dont certains possèdent des propriétés pharmacologiques souhaitables, par exemple une activité hypolipémiante.
Parmi les dérivés 12-hydroxy de départ préféré que l'on peut utiliser de manière satisfaisante dans la pratique de l'invention, on peut citer les composés tels que l'acide 3,7,12-trihydr oxy-5ss-cholanique et ses dérivés alcoxy et acyloxy et ses dérivés de taurine et de glycine; par exemple l'acide 3a,7a,12a-trihydr- oxy-5ss-cholanique, l'acide 3(r,7B, 12ar-trihydroxy-5B-cholani- que et d'autres de ces composés 12-hydroxy de départ.
Les radicaux acyloxy préféré selon l'invention sont ceux dérivés d'acides hydrocarburecarboxyliques jusqu'en C11, tels que les acides alcanoïques, alcénolques, arylcarboxyliques, cycloalcanoïques et cycloalcénoïques.
Les radicaux alcoxy préférés selon l'invention sont ceux
correspondant aux groupes alkyle inférieurs jusqu'en C6 et comprennent des groupes alcoxy tels que méthoxy, éthoxy, butoxy, etc.
Afin de produire les composés préparés selon l'invention, on soumet le composé 12-hydroxy de départ à l'action d'un microorganisme producteur de 12-déhydroxylase dans les genres
Clostridium et Bifidobacterium. Plus particulièrement, on peut soumettre les composés 12-hydroxy de départ soit à l'action de la déhydroxylase du micro-organisme désiré, soit directement à l'action du micro-organisme lui-même dans les conditions appropriées et dans le milieu nécessaire où le micro-organisme peut pousser. Selon la nature du micro-organisme producteur de 12-déhydroxylase lui-même, on peut faire varier le microorganisme et le milieu dans lequel il peut pousser pour adapter le micro-organisme particulier concerné et on peut les modifier selon les résultats désirés ou le micro-organisme utilisé.
Parmi les micro-organismes que l'on peut utiliser dans la pratique de l'invention, on peut citer d'une manière générale les micro-organismes producteurs de 1 2-déhydroxylase et plus particulièrement ceux des genes Clostrium et Bifidobacterium.
Plus particulièrement, les micro-organismes producteurs de 12déhydroxylase comprennent des micro-organismes tels que
Clostridium perfringens, par exemple Clostridium perfringens (ATCC-19574) et Clostridium welchii. En outre, on peut également utiliser les micro-organismes producteurs de 12déhydroxylase appartenant au genre Bifidobacterium.
En général, les conditions de culture du micro-organisme désiré pour les buts de l'invention sont, sauf pour l'introduction du produit 12-hydroxylé de départ, les mêmes que dans la culture des organismes analogues à cet effet, c'est-à-dire que l'on fait pousser le micro-organisme soit en milieu aérobie, soit en milieu anaérobie (selon le micro-organisme choisi, par exemple on cultive en général les Clostridia en conditions anaérobies) en contact avec (dans ou sur) un milieu de fermentation convenable. Un milieu approprié comprend essentiellement une source de carbone et d'énergie. Cette dernière peut être un hydrate de carbone, un acide gras, une graisse et/ou le 12-hydroxystéroïde de départ lui-même. Parmi les graisses utilisables, on peut citer le saindoux, l'huile de soja, l'huile de graine de lin, etc.
Parmi les acides gras, on citera l'acide stéarique, l'acide palmitique, etc. La source de facteurs azotés peut être organique (par exemple farine de soja, liqueur de trempage de maïs et/ou matières solubles de distilleries) ou synthétique, composée de produits organiques ou inorganiques de synthèse tels que sels d'ammonium, hydrates alcalins, aminoacides, urée, etc.).
Pour la fermentation aérobie, on doit maintenir une alimentation appropriée en air stérile. Pour la fermentation anaérobie, les cuves de fermentation doivent être maintenues à l'abri de sources extérieures d'oxygène. On peut ajouter le composé 12hydroxylé de départ à la culture pendant la période d'incubation, ou bien elle peut être contenue dans le milieu avant la stérilisation ou l'inoculation. Une gamme de concentrations satisfaisante mais non limitative du 12-hydroxystéroide de départ, par exemple l'acide 3a,7a,12a-trihydroxy-5ss-cholani- que, dans la culture peut être d'environ 0,01 à 0,5%; cependant, on peut augmenter cette concentration selon l'aptitude du micro-organisme à pousser convenablement dans les milieux résultants.
La durée de culture, ou plutôt la durée pendant laquelle on soument le 12-hydroxystéroide de départ à l'action de la 12-déhydroxylase, peut varier considérablement; un intervalle de 2 à 96 h est approprié, mais non limitatif. En outre, on peut faire varier le pH du milieu de culture entre environ 5,0 et 7,0 sans modifier le résultat final obtenu.
L'exemple suivant illustre l'invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple
On inocule 50 ml d'un milieu comprenant un bouillon de thioglycolate modifié selon Brewer (vendu par la Société
Baltimore Biological Laboratories), en conditions anaérobies avec une culture de réserve de Clostridium perfringens ATCC 19574. On fait incuber le milieu en conditions anaérobies à 37 C pendant 96 h et on utiliser la culture résultante pour inoculer un litre du même milieu. Au moment de l'inoculation, on ajoute 2 g d'acide 3a,7a,12a,-trihydroxy-5ss-cholanique dissous dans 15 ml d'éthanol et stérilisé à travers un tampom de
Seitz.
On incube le flacon en conditions anaérobies pendant 72 h et on filtre ensuite le bouillon sur un Büchner à l'aide d'un adjuvant de filtration et on acidifie ensuite le filtrat à pH 1-2 par HCI, on extrait trois fois par l'éther et on lave à l'eau les extraits éthérés combinés, on sèche sur sulfate de sodium et on évapore à siccité sous vide. On recristallise ensuite le résidu dans un mélange acétate d'éthyle-heptane pour obtenir l'acide 3a,7a-dihydroxy-5ss-cholanique brut. Si une purification supplémentaire est nécessaire, on peut traiter encore le produit résultant selon les modes opératoires indiqués dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique Serial n" 417 170 déposée le 19 novembre 1973 au nom de la demanderesse.
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CLAIMS
1. Process for the microbiological production of a 12-dihydrosteroid, characterized in that a 12-hydroxysteroid is subjected to the action of a 12-dehydroxylase-producing microorganism in a culture medium and the 12-di is collected. resulting hydrosteroid.
2. Process according to claim 1, for preparing a compound of general formula:
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wherein each X residue is a hydrogen atom, a hydroxy, acyloxy or alkoxy group or an oxo residue and R is a hydroxy, acyloxy or alkoxy group or a taurine or glycine residue, said process being characterized in that 'a compound of general formula is subjected:
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wherein X and R are as defined above on the action of a 12-dehydroxylase-producing microorganism in a culture medium and said final product is collected.
3. Method according to claims 1 and 2, characterized in that said 12-dehydroxylase-producing microorganism is chosen from the genera Clostridium and Bifidobacterium.
4. Method according to claim 2, characterized in that the microorganism belongs to the genus Clostridium.
5. Method according to claim 2, characterized in that the microorganism is Clostridium perfringens.
6. Method according to claim 2, characterized in that each X residue is an α-hydroxy group.
7. The method of claim 2, characterized in that compound II is 3a, 7a, 12a-trihydroxy- 5, B-cholanic acid.
8. Method according to claim 2, characterized in that the final product is 3a, 7a: -dihydroxy-5ss-cholanic acid.
9. The method of claim 1, characterized in that said 12-dihydrosteroid is 3a, 7a-dihydroxy-Sfl-cholanic acid.
10. The method of claim 1, characterized in that the microorganism producing dehydroxylase belongs to the genus Clostridium.
The present invention relates to a microbiological process for the production of a 12-dihydrosteroid such as 3a, 7a-dihydroxy-SB-cholanic acid, which is generally extracted from the bile of chickens or geese.
The process according to the invention is characterized in that a 12-hydroxysteroid is subjected to the action of a 12-deydroxylase-producing microorganism.
More particularly, the invention relates to a process for the preparation of compounds of formula:
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wherein each X residue is a hydrogen atom or a hydroxy, acyloxy, alkoxy or an oxo (O =) residue and R is a hydroxy, acyloxy or alkoxy group or a taurine or glycine residue; said process being characterized in that a compound of formula is subjected:
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in which X and R are as defined above on the action of a 12-dehydroxylase-producing microorganism chosen from the genera Clostridium and Bifidobacterium.
Preferred according to the invention are compounds in which each residue X is a hydroxy group and R may be a hydroxy group or a residue of taurine or glycine.
In the present description, a wavy line (t) is used in the structural formulas to indicate that the relevant substituent may be in the bear configuration, as appropriate.
In the preferred embodiment of the invention, the products obtained are the 3,7-disubstituted steroids and may comprise compounds such as 3a, 7a-Sss-cholanic acid and its derivatives of taurine and glycine, 3a, 7B-dihydroxy-5B-cholanic acid and its derivatives of taurine and glycine, 3a, 7a-diacyloxy-Sfi-cholanic acids, 3,7-dioxo-5B-cholanic acid and 3a acids , 7α-dialkoxy-5ss-cholanics and their derivatives, all of which are known compounds and some of which have desirable pharmacological properties, for example lipid-lowering activity.
Among the preferred starting 12-hydroxy derivatives which can be used satisfactorily in the practice of the invention, mention may be made of compounds such as 3,7,12-trihydr oxy-5ss-cholanic acid and its alkoxy and acyloxy derivatives and its taurine and glycine derivatives; for example 3a, 7a, 12a-trihydr-oxy-5ss-cholanic acid, 3 (r, 7B, 12ar-trihydroxy-5B-cholanic acid and others of these starting 12-hydroxy compounds.
The preferred acyloxy radicals according to the invention are those derived from hydrocarbon-carboxylic acids up to C11, such as alkanoic, alkenol, arylcarboxylic, cycloalkanoic and cycloalkenoic acids.
The preferred alkoxy radicals according to the invention are those
corresponding to lower alkyl groups up to C6 and include alkoxy groups such as methoxy, ethoxy, butoxy, etc.
In order to produce the compounds prepared according to the invention, the starting 12-hydroxy compound is subjected to the action of a microorganism producing 12-dehydroxylase in the genera
Clostridium and Bifidobacterium. More particularly, the starting 12-hydroxy compounds can be subjected either to the action of the dehydroxylase of the desired microorganism, or directly to the action of the microorganism itself under the appropriate conditions and in the necessary medium where the microorganism can grow. Depending on the nature of the 12-dehydroxylase producing microorganism itself, the microorganism and the medium in which it can grow can be varied to suit the particular microorganism concerned and can be modified according to the desired results or microorganism. -organism used.
Among the microorganisms which can be used in the practice of the invention, mention may in general be made of microorganisms which produce 1 2-dehydroxylase and more particularly those of the Clostrium and Bifidobacterium genes.
More particularly, the 12-dehydroxylase-producing microorganisms include microorganisms such as
Clostridium perfringens, for example Clostridium perfringens (ATCC-19574) and Clostridium welchii. In addition, 12-dehydroxylase-producing microorganisms belonging to the genus Bifidobacterium can also be used.
In general, the conditions for culturing the microorganism desired for the purposes of the invention are, except for the introduction of the starting 12-hydroxylated product, the same as in the cultivation of similar organisms for this purpose, that is i.e. the microorganism is grown either in an aerobic or anaerobic medium (depending on the microorganism chosen, for example Clostridia is generally cultivated under anaerobic conditions) in contact with (in or on ) a suitable fermentation medium. A suitable medium essentially comprises a source of carbon and energy. The latter can be a carbohydrate, a fatty acid, a fat and / or the starting 12-hydroxysteroid itself. Among the fats that can be used, mention may be made of lard, soybean oil, flaxseed oil, etc.
Among the fatty acids, mention will be made of stearic acid, palmitic acid, etc. The source of nitrogenous factors can be organic (e.g. soybean meal, corn steep liquor and / or distilleries soluble matter) or synthetic, composed of synthetic organic or inorganic products such as ammonium salts, alkali hydrates, amino acids , urea, etc.).
For aerobic fermentation, an adequate supply of sterile air must be maintained. For anaerobic fermentation, fermentation tanks should be kept away from external sources of oxygen. The starting 12 hydroxy compound can be added to the culture during the incubation period, or it can be contained in the medium prior to sterilization or inoculation. A satisfactory but non-limiting range of concentrations of the starting 12-hydroxysteroid, for example 3a, 7a, 12a-trihydroxy-5ss-cholanic acid, in culture can be about 0.01 to 0.5%. ; however, this concentration may be increased depending on the ability of the microorganism to grow well in the resulting media.
The culture time, or rather the time during which the starting 12-hydroxysteroide is subjected to the action of 12-dehydroxylase, can vary considerably; an interval of 2 to 96 hours is suitable, but not limiting. In addition, the pH of the culture medium can be varied between about 5.0 and 7.0 without changing the final result obtained.
The following example illustrates the invention without however limiting its scope.
Example
50 ml of a medium comprising a thioglycolate broth modified according to Brewer (sold by the Company) are inoculated.
Baltimore Biological Laboratories), under anaerobic conditions with a stock culture of Clostridium perfringens ATCC 19574. The medium is incubated under anaerobic conditions at 37 ° C for 96 h and the resulting culture is used to inoculate one liter of the same medium. At the time of inoculation, 2 g of 3a, 7a, 12a, -trihydroxy-5ss-cholanic acid dissolved in 15 ml of ethanol and sterilized through a tampon of
Seitz.
The flask is incubated under anaerobic conditions for 72 h and the broth is then filtered on a Büchner using a filter aid and the filtrate is then acidified to pH 1-2 with HCl, extracted three times with ether and the combined ethereal extracts are washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is then recrystallized from an ethyl acetate-heptane mixture to obtain crude 3a, 7a-dihydroxy-5ss-cholanic acid. If further purification is required, the resulting product can be further processed according to the procedures set forth in U.S. Patent Application Serial No. 417,170 filed November 19, 1973 on behalf of the Applicant.