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La présente invention concerne un nouvel antibiotique cristallin qui, dans ce qui va suivre, sera désigné sous le nom de "angolamyoine",, de ses sels de certains de ses dérivés et des préparations pharmaceutiques ren- fermant ces composés L'invention concerne aussi le procédé de préparation de ces substances et de mélanges de ces substances.
L'angolamyoine est une base qui, par cristallisation dans un mé- lange de benzène et d'éther, donne des cristaux incolores fondant à 133-136 .
Dans certains solvants, par exemple dans l'éther di-isopropylique ou le dio- xanne, l'angolamycine cristallise sous une seconde forme cristalline, en ai- guilles d'un point de fusion de 165-168 . Les valeurs fournies par l'analy-
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se élémentaire conduisent à la formule brutFC501H 2018No Calculé par rap- port à cette formule, l'angolamycine renferme trois groupes methoxy, deux groupes N-méthyliques, au moins huit groupes C-méthyliques déterminés sui-
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vant la méthode de Kuhn et Roth, ainai qu.e cinq atomes d'hydrogène actif (Zerewitinoff). L'angolamycine est optiquement active, 121 = 64 dans le chloroforme, et elle présente dans l'ultra-violet une forte bande à 240 mu (log é. = 416, dans l'éthanol).
Dans le spectre infra-rouge, pris dans le nujol, on observe entre'-autres des bandes à 2$93 119 3953 ile s84 ,, 599' E95, 6,81 ,u, '7,06 p., 7,25p, 7,59 il 7,7s87 u, 8,16 lie 8,56 lie 9,16 )1, 9,34 ue 10,02 )1, 10,29 .g 11,00 ., 11,91 p., 12,66 li et 13,20 pu Dissoute dans un mé- lange de méthylcellosolve et d'eau (80:20), l'angolamyoine présente une va- leur de pK de 6,74. Lors, de l'hydrogénation dans l'éthanol avec un cataly- seur à base de palladium et de carbonate de calcium, 1 mol d'hydrogène est absorbée, tandis que dans l'acide acétique glacial avec un catalyseur à l'oxy- de de platine 3 mol d'hydrogène sont consommées.
En ce qui a trait à ses constantes physiques, l'angolamyoine pré-
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sente une certaine analogie avec la carbomyoine et avec 1 étythromycineo On peut facilement la différencier de la oarbomycine a. l'aide des réactions de coloration de Piachbaàh et Levine (Ant.biotic,s and 0hemQtherapy 3. 1158 [1953]). L'angolamycine donne alors au début une coloration jaune sale, puis brune, tandis qu'avec la carbomyoine dans les mêms conditions on obtient une coloration violette à pourpre.
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Elle se différencie de ltérythromyoine par son absorption en ul- tra-violet, ainsi que par son comportement à la chromatographie sur papiero Dans le système solvant méthanol (19-parties en volume) -acétone (6 parties en volume)- eau (75 Parties en volume), on a trouvé les valeurs de Rf sui- vantes: angolamycine 0,78, érythromyoine 0,860 Une autre différence entre l'angolamyoine et l'érythromyoine apparaît lors de l'hydrolyse de ces anti- biotiques avec des acides minéraux dilués, les produits de scission réduc- teurs qui se forment se comportant différemment dans une chromatographie sur papier.
Les sels de l'angolamyoine dérivent des acides inorganiques et organiques connus, par exemple de l'acide chlorhydrique, des acides sulfuri- ques, acétique, propionique, valérique, palmitique ou oléique, succinique, citrique, mandélique, glutamique ou pantothéniqueo Ce sont des sels neutres ou acieesoOn les prépare en faisant agir les acides correspondants sur la base libre,ou par- réaction de double décomposition de ses sels, par exemple
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en faisant réagir du sulfate d"angolazyoine sur du pantothénate de sodiutn.
Ltangolamyoine possède une activité antibiotique élevée vis-à-vis de divers organismes-testso Si l'on utilise comme méthode-test in vitro, pour des bactéries, des séries de dilution (par puissances de la) de la sub- stance, dans du bouillon glucose, pour les amibes, des séries de dilution
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dans un milieu de "Bacto-entamoebali du commerce, incubées à 31 pendant 24 heures, les concentrations suivantes sont encore inhibantes :
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<tb> Organismes-tests <SEP> Concentration <SEP> inhibante
<tb>
<tb>
<tb> ug <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0,1- <SEP> 1
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb>
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Yicroaoacus yogenes var.aureus 10 - 100 " " U " , penioillino-
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<tb> résistant <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 100
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtaeriae <SEP> 100
<tb>
<tb> Entamoeba <SEP> histolytiea <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 100
<tb>
In vitro, l'angolamyoine n'est pas active à une concentration
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de 100 ug/om3 vis-à-vis des mioroorganismes suivants : le Streptocooous mi- tis;
le Streptoooocus faecalis, l'Esoheriohis ooli, le Salmonella typhosa', le Salmonella achottmuelleril le Shigella sonnei, le Pseudomonas aeruginosa, le Klebsiella pneumoniae (type A), le Pasteurella pestis, le Vibrio comma (El Tor), le Myeobacterium tuberculosis (H 37 Rv), le Candida albicans et le Candida tropioalis.
In vivo, l'angolamyoine est également active. Lorsqu'on l'admi- nistre à des souris infectées au 'Streptococcus pyogenes, on a trouvé avec 10 x 50- mg/kg par voie sous cutanée 100% d'animaux survivants le sixième jour et 67 % le dixième jour.
La toxicité de l'angolamyoine est faible : 500 mg/kg injectés en une fois par voie sous-cutanée sont supportés par des souris, sans troubles apparents.
L'antibiotique angolamyoine se forme lors de la culture d'une
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nouvelle souche dqaetynomycètes de la famille des Streptomyces qui n'est identique à aucune des souches indiquées dans l'ouvrage de Urgey intitulé "Manuel of Déterminative Bacterio2ogy" 6ème édition, ou dans l'ouvrage de Waksmann et heahevalier intitulé "Actinomycetes and their Antibiotica" (1953)) cette nouvelle souche d'aatynomycètes sera décrite ci-après sous le nom de "Streptomyces eurythermus." Jusqu'à présent, on l'a isolée trois fois et no- tamment à partir de prises d'essai du sol prelevées à Cuanw,(Angola), à Ki- santu (Congo) et près de Regesberg (Suisse).
Ces trois souches produisent toutes le nouvel antibiotique et à quelques différences minimes près, elles concordent du point de vue morphologique et physiologique. Elles sont conser- vées dans les Laboratoires de la Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, Suisse), Institut de Botanique spéciale, sous la désigna- tion A 6677, A 6905 et A 7489.
Sur presque tous les milieux nutritifs, le Streptomyces euryhér- mus forme un mycélium végétatif en longues hyphes et un pigment diffusant brun foncé. Le mycélium aérien est dense et gris la plupart du temps, avec - quelques chaînes de conidies non réunies *en touffes. Ces chaînes de conidies sont une caractéristique typique de la famille des Streptomyces. Les diverses conidies ont une forme ovoïde à sphérique et elles sont lisses; leur taille
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atteint 0,8 - 3ji x 0,6 - 0#'ja. Leur croissance dépend relativement peu de la température ; ce champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 58 , toute- fois la croissance optimum est entre 25 et 32 .
Pour donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance de Streptomyces eurythermus sur différents milieux nu-
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tritifso Les milieux nutritifs 1 à 8 ainsi que 12 ont été préparés suivant W.Lindenbein, Archo Mikrobiol. 17, 361 (1952).
1.) Gélose synthétique ; Croissance pustuleuse, brun-clair;
Mycélium aérien peu abondant, d'abord gris blanc, puis gris cen- dre pigment brun. La souche A 7489 forme un mycélium aérien plus abondant, velouté, serré, gris-cendre.
2.) Milieu synthétique liquide : Croissance immergée, flocons et sédiment brun-clair; pigment brun.
3.) Bouillon glucose : Croissance peu abondante,sédiment pustuleux, jaune- brunâtre
4.) Gélose glucose ; Croissance en forme de coussin à rugueuse, brun-clair; mycélium aérien velouté, gris-blanc à gris-verdâtre; pigment brun- chataigne.
5.) Gélose glucose à l'asparagine : Croissance grèle et voilée, jaune-blanc; mycélium aérien velouté, gris-blanc à gris-cendre ; pigment brun- châtaigne. Le mycélium aérien de la souche A 7489' est légèrement rose à la surface,,
6. ) Gélose au malte de calcium : Croissance lichéneuse, brun clair ; mycélium aérien poussiéreux, gris-cendre ; pigment brun-foncé. Le mycélium aérien de la souche A 6905 est gris-brunâtreo
7.) Milieu gélosé (gélatine) à 18 : Croissance très peu abondante ; pigment brun-foncé.Pour la souche A 6677 faible liquéfaction au bout de
40 jours, pour la souche A 6905 forte liquéfaction (2,2 cm) au bout de 34 jours, et pour la souche A 7489 forte liquéfaction (2,0 cm) au bout de 31 jours.
8.) Gélose à l'amidon : Croissance pustuleuse, jaune d'or ; mycélium aérien veloutée d'abord blanc de neige,puis gris;pigment brun-clair; hydrolyse de l'amidon 0,5 à 0,8 cm au bout de 4 jours 9.) Gélose nutritive: Croissance pustuleuse jaune-brunâtre ; mycélium aé- rien velouté, gris cendre ; pigment brun rougeâtre. La souche
A ,7489 ne forme pas de mycélium aérien.
10.) Pommé de terre : Croissance lichêneuse, brun clair; mycélium aérien ve- @ louté, blanc laiteux, puis gris cendre ; pigment brunâtre à noir de jais. il.) Carotte : Croissance pustuleuse, jaune brunâtre; mycélium aérien velou- té, blanc comme craie à gris pour la souche A 6677, gris blanc à rose pour les souches A 6905 et A 7489 ; pigment noir de jais.
12.) Lait (Difco N B 107) : Croissance annulaire, brune, plus tard croissan- ce superficielle, mycélium aérien gris-cendre; pigment brun-foncé!, peptisation avec coagulation ; tournesol faiblement rougeâtre
Le Streptomyces eurythermus se différencie comme suit des autres genres thermophiles connus de la famille des Streptomyces :
du Streptomyces thermophilus (Gilbert), Waksman et Henrioi, par un mycélium aérien bien développé, par la forte formation de pigment sur la gélatine et la gélose nutritive, ainsi qu par la couleur du pigment. du Streptomyces thermodiastaticus (Bergey), Waksman et Lechevalier, par la couleur de mycélium aérien et par la formation du pigment, du Streptomyces thermofuscus (Waksmann, Umbreit et Cordon), Waksman et Henrici, par la couleur du mycélium aérien et par la formation de pigment sur la gélatine,
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du Streptomyces casei (Bernstein et Morton), Waksman et Lecheva- lier, par la teinte du mycélium aérien, la formation de pigment et l'hydroly- se de l'amidon.
Parmi les Streptomycètes mésophiles, le Streptomyces eurythermus est celui qui est le plus proche du Streptomyces antibioticus (Waksman et Woodruff), Waksman et Henrici, mais sa croissance sur pommes de terre, carot- te et lait est nettement différente.
Le @Streptomyces eurythermus croît de la façon suivante, d'après la méthode T.Go Pridham et Do Gottlieb, J,Bacteriology 56, 107 (1948), lors- qu'on utilise diverses sources de carbone : L-xylose + inuline - L-arabinose + D-mannite + L-rhamnose (-) D-sorbite D-fructose + dulcite - G-galactose + mésoinosite (-) saccharose + salicine + maltose + acétate de sodium + lactose + citrate de sodium (+) raffinose + succinate de sodium +
Les signes ont la signification suivante : + :bonne croissance, utilisation certaine de la source carbone mentionnée, (+) : croissance faible, utilisation douteuse de la source de carbone mention- née, (-) : croissance très faible, utilisation improbable de la source de carbone mentionnée, - : pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mention- née.
En ce qui a trait à la prépartion de l'angolamyoine,, la présente invention n'est pas limitée à l'utilisation du Streptomyces eurythermus ou d'autres souches correspondant à la descritpion, mais elle concerne également l'utilisation de variétés de ces organisme, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonne- ment ultra-violet ou des rayons X ou sous l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir l'angolamyoine,, on cultive de manière aérobie une souche de Streptomycètes présentant les propriétés du Streptomyces euryther- mus, par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels inor- ganiques, des composés azotés et le cas échéant des hydrates de carbone, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle notable, puis on isole l'angolamycine du filtrat de culture.
La solution nutritive renferme comme sels inorganiques par exem- ple des chlorures,nitrates, carbonates, sulfates de métaux alcalins ou alca- lino-terreux, du magnésium, du fer, du zinc, du manganèse. Comme composés azotés et le cas échéant hydrates de carbone et substances favorisant la croissance qu'on peut ajouter, on citera par exemple;
des acides aninés et leur mélanges, des peptides et des protéines ainsi que leurs hydrolysats, comme le 'peptone et le triptone, des extraits de viande, des fractions solu- bles dans l'eau de graines de céréales comme le mais et le froment,de rési- dus de distillation provenant de la préparation de l'alcool, de levures, de fèves, notammentdeesoja, de graines, par exemple de coton, ainsi que du glu-
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cose, du saccharose, du lactose, de l'amidon, etcooo
La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée, avec secouage -ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène, dans des flacons agi- tés ou dans les fermenteurs connus.
Comme température s'avère appropriée une température comprise entre 20 et 50 . En opérant ainsi, la solution nutri- tive accuse un effet antibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Pour isoler l'antibiotique du filtrat de culture séparé du mycé- lium, on peut opérer par exemple de la façon suivante : on extrait le filtrat de culture, avantageusement à un pH supérieur à 7,0, à l'aide d'un solvant organique non miscible à 1 eau, comme les esters d'a- cides gras inférieurs, par exemple l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'amyle, des hydrocarbures chlorés, par exemple le chlorure d'éthylène, le chlorure de méthylène, ou le chloroforme, des cétones, par exemple la méthylpropyl- cétone, la méthylamylcétone, ou la diisobutyloétone, des alcools comme les alcools butyliques ou les alcools amyliques, des éthers, par exemple l'éther éthylique, l'éther di-isopropylique, les éthers dibutyliques ou les éthers de glycols et analogues, A,
la place de l'extraction du filtrat de culture à l'aide d'un solvant, ou en combinaison avec une telle extraction, comme opération de purification complémentaire, on peut aussi obtenir 1 antibioti- que par adsorption, par exemple à du charbon actif ou à des terres activées, comme la terre à foulon ou la floridine, et par extraction subséquente de l'absorbât, par exemple à l'aide d'une solution aqueuse acide et/ou à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, comme l'isopropanol, le butanol ou la méthyléthylcétone. On peut en outre précipi- ter l'antibiotique par exemple sous la.forme d'un sel d'un acide sulfoni- que organique ou le précipiter directement par l'acide picrique dans le fil- trat de culture.
La répartition entre une solution aqueuse acide et un solvant or- ganique non miscible à l'eau constitue un bon procédé de purification . du nou- vel antibiotiqueo La répartition a lieu avantageusement suivant le procédé à contre-courant, dans des appareils appropriéso La chromatographie est égale- ment très bien appropriée pour la purification. L'obtention de l'antibioti- que pur, sous forme cristalline, a lieu par exemple dans des solvants organi- ques comme 1 éther, le dioxanne, des mélanges d'éther et d'éther de pétrole, de benzène et d'éther ou des mélanges d'acétone et d'éther de pétrole. Pour la recristallisation, on se sert des mêmes solvants ou aussi de solutions organiques aqueuses, par exemple d'alcools dilués, d'acétone diluée, etc.
En dehors des procédés de préparation de l'angolamyoine cristalli- ne, de ses sels neutres et acides avec des acides inorganiques ou organiques, la présente invention concerne également les composés indiqués eux-mêmes, no- tamment les sulfates d'angolamyoine, le chlorhydrate d'angolamycine, l'acéta- te d'angolamycine et le pentothénate d'angolamycine, ainsi que les produits de transformation obtenus par l'hydrogénation ou oxydation, ainsi que les produits de scission de l'angolamyoine tels qu'on les obtient par exemple par hydroly- se
L'angolamycine, ses sels, ses produits de transformation et de scission indiqués ci-dessus, ou des mélanges correspondants peuvent être uti- lisés comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceu- tiques.
Ces dernières renferment les composés indiqués en mélange avec une matière de support pharmaceutique, organique ou inorganique, approprié±pour une application entérale, parentérale ou locale. Pour cette matière de sup- port, on envisage les substances qui ne réagissent pas avec les nouveaux com- posés, par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magné- sium, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommes, des
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polyalcoylène-glycols, la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent par exemple se présenter à l'état de comrpimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de sup- positoires ou s.ous Terme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'é- mulsions* Le cas échéant,, elles sont stérilisées et/ou renferment des substan- ces auxiliaires telles que des agents de conservation, de stabilisation, des agents mouillants et émulsifiants. Elles peuvent aussi renfermer encore d'au- tres substances thérapeutiquement précieuses.
L'invention est décrite plus en détail dans l'exemple suivant qui ne la limite en aucune façon. Dans cet exemple, les températures sont indi- quées en degrés centigradeso
La présente invention concerne également à titre de produits indus- triels nouveaux, les produits conformes à ceux définis ci-dessus.
EXEMPLE
On prépare une solution nutritive de la composition suivante : 3 g d'extrait de viande (produit connu dans le commerce sous la dénomination "Oxo Lab Lemoo"), 5 g de peptone, 10 g de glucose brut, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,5. On transvase cette solution ou un multiple de cette solution dans des fioles coniques de 500 cm3 (renfermant chacune 100 cm3 de solution nutritive) ou dans desfermenteurs de 500 litres (renfermant chacun 300 litres de solution nutritive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression d'une atmosphère effective.
On ensemence alors à 27 avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporulante, de Strepto- myces eurythermas et incube en secouant bien-ou en agitant et, dans les fermenteurs, en faisant passer de l'air (environ 1 volume d'air stérile par minute etpar volume de solution nutritive)o Après une croissance de 48 heures, on filtre les cultures en ajoutant une substance facilitant la filtration, sur un entonnoir à succion ou dans un filtre-presse ou dans un filtre rotatif, suivant le volume à filtrer, et l'on débarrasse ainsi la solution aqueuse, renfermant l'antibiotique, du mycélium et des autres composants solides.
Dans un extracteur approprié, on extrait 170 litres de filtrat de culture, à un pH de 8, avec 70 litres d'acétate d'éthyle. L'activité totale vis-à-vis de germes Gram-positifs passe alors dans l'extrait, tandis que le filtrat de culture présente encore une activité vis-à-vis de champignons, notamment vis-à-vis du Candida tropicalis.. L'extrait à l'acétate d'éthyle est alors extrait à trois reprises avec chaque fois 4 litres d'une solution aqueuse demi-normale d'acide acétique, la totalité de l'activité vis-à-vis de germes Gram-positifs passant dans la phase aqueuse. On rend l'extrait acétique alcalin à l'aide d'une solution concentrée de carbonate de sodium et l'extrait à trois reprises avec chaque fois 2,5 litres d'acétate d'éthy- le.
Ensuite, on extrait à nouveau les bases avec au total 3 litres d'une so- lution aqueuse demi-normale d'acide acétique, les met en liberté à l'aide d'une solution concentrée de carbonate de sodium et les extrait finalement avec au total un litre d'acétate d'éthyle. On lave à l'eau la solution d'acé- tate d'éthyle, la sèche sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide à 40 jusqu'à dessication. Il reste 2,39 g d'un produit amorphe jaunâtre dont l'ac- tion antibaotérielle correspond à peu près à celle de l'angolamyoine cris- talline*. Tout en chauffant légèrement, on dissout dans 50 cm 3 d'éther les 2,39 g de produit brut ainsi obtenus.
On filtre la solution et amorce la cristallisation avec de l'angolamycine. Au cours de quelques heures, 1,80 g de l'antibiotique se sépare en cristaux d'un point de fusion de 131-1340.
Pour purifier davantage, on ajoute à une solution des cristaux dans le moins possible de benzène chaud une quantité décuple d'éthero Les cristaux d'antibiotique pur qui se séparent alors fondent à 133-136 o [#]= -64 (C = 1,30 dans le chloroforme).
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Trouvé : C 60,21% ; H 8,78% ; N 1,40%; CH3O 8,80% ; CH3(N) 3,66% ; CH3(C) 11,55% ; H actif 0,52%.
Par recristallisation dans l'éther di-isopropylique ou dans le dioxanne, on obtient l'angolamycine sous la forme de fines aiguilles fon- dant à 165-168 o Trouvé : C 60,49% ; H 8,93% ; N 1,66%.
Au lieu de purifier la base brute par cristallisation directe, on peut aussi la purifier par chromatographie. A cet effet, on cromatogra- phie 42 mg de base brute sur 2 g d'oxyde d'aluminium (activité III selon Brockmann) suivant la méthode par passage,en éluant avec du benzine, du chloroforme et des mélanges de chloroforme et de méthanolo Avec le benzène et le chloroforme, on ne dissout que des traces d'impuretés, tandis que les fractions obtenues avec un mélange de chloroforme et de méthanol (16:1) ren- ferment 40 mg de l'antibiotique pur. On cristallise ce dernier de la manière décrite ci-dessus.
On peut, en outre, purifier la base brute à l'aide d'une réparti- tion à contre-courant, en employant par exemple les systèmes solvants sui- vants : a) tampon de Mac Ilvaine (pH 3,15) et chloroforme (1:1) b) éther isopropylique (12 parties en volume), acétone (10 parties en volume) et eau (10 parties en volume)o
Lors d'une répartition en 100 stades, on trouve le maximum de substance et d'activité avec le système a) au stade N 72 et avec le système b) au sta- de n 55.
Reineckate : A l'aide de 15 cm3 d'une solution éthérée d'acide de
Reinecke (préparée suivant Karrer et Schmid, Helv. 29, 1853 (1946)),on pré- cipite lentement une solution de 60 mg d'angolamycine dans 1 cm3 de méthanol.
On dissout le précipité dans du méthanol et le précipite par addition d'éther.
Trouvé : Cr 3,96%.
A la place de reineckate, on peut aussi préparer des sels d'au- tres acides, notamment des acides sulfuriques, de l'acide chlorhydrique, de l'acide acétique et de l'acide pantothéniqueo Hydrolyse de l'angolamycine : Dans un tube scellé, on chauffe pen- dant 5 heures, à 100 , 18 mg d'angolamycine dans 2 cm 3 d'acide sulfurique demi-normal. On extrait ensuite le mélange réactionnel à deux reprises avec de l'acétate d'éthyle en amenant la phase aqueuse à un pH de 5 par addition d'une solution d'hydroxyde de baryum. On élimine par centrifugation le sul- fate de baryum formé et évapore à sec, sous vide, la solution limpide qui surnage.
On examine le résidu par chromatographie sur papier, en utilisant un mélange de butanol et d'acide acétique glacial (10:1) saturé d'eau. A l'aide d'une solution ammoniacale de nitrate d'argent, on rend visibles sur les ban- des de papier deux substances réductrices présentant des valeurs de Rf de 0, 28 et de 0,65.
Dans les mêmes conditions, l'érythromycine donne deux substances réductrices présentant des valeurs de Rf de 0,23 et de 0,32, tandis qu'à partir de la pioromycine et à partir de la narbomyoine, on n'obtient qu'un produit de scission réducteur d'une valeur de Rf de 0,23.
Hydrogénation de l'angolamycine : a) En atmosphère d'hydrogène, on secoue pendant deux heures, avec 10 mg d'un catalyseur au palladium, une solution de 20 mg d'angolamyoine dans 5 cm3 d'alcool absoluo On filtre alors la solution et l'évapore sous vide. On obtient la dihydro-angolamycine sous la forme d'une poudre incolore
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qui a une action antibiotique . b) En atmosphère d'hydrogène et avec 10 mg d'un catalyseur au plati- ne, on secoue pendant'une heure une solution de 20 mg d'angolamyoine dans 5cm3 d'acide acétique glacial. On filtre ensuite la solution et l'évapore sous vide. On obtient l'hexahydro-angolamycine sous la forme d'une poudre incolore qui a une action antibiotique.
REVENDICATIONS.
Io- Un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique cristallin, caractérisé par le fait qu'on cultive une souche de streptomyces présentant les propriétés du. streptomyces eurythermus jusqu' à ce que la solution, nutri- tive présente un effet antibactériel notable, puis qu'on isole l'angolamy- cine du filtrat de culture.
Le présent procédé peut encore être caractérisé par les points suivants :
1) On cultive dans des conditions aérobies, de préférence de ma- nière submergée, dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels inor- ganiques, des composés azotés et le cas échéant des hydrates de carbone.
2) La solution nutritive renferme des substances favorisant la croissance.
3) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température comprise entre 20 et 500.
4) L'antibiotique est extrait du filtrat de culture à un pH supé- rieur à 7,0, à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau.
5) L'antibiotique est purifié par adsorption, de préférence à l'ai- de de charbon actif, et par extraction de l'adsorbat avec une solution aqueu- se acide et/ou un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau.
6) L'antibiotique est purifié par répartition entre une solution aqueuse acide et un solvant organique non miscible à l'eau.
7) La répartition a lieu suivant le procédé à contre-courant.
8) L'antibiotique est cristallisé dans un solvant organique.
9) L'antibiotique est préparé sous la forme d'un sel cristallin avec un acide inorganique ou organique , par action de cet acide sur la base libre de l'antibiotique ou par réaction de double décomposition d'un sel de l'antibiotique sur un sel de l'acide correspondant.
II.- A titre de produits industriels nouveaux :
10) Le nouvel antibiotique cristallin, dénommé anolamycineo
11) Les sels cristallins de ce nouvel antibiotique, angolamyoine, avec des acides inorganiques ou organiques.
12) Les sels acides de ce nouvel antibiotique,angolamycine, avec des acides inorganiques ou organiques.
13) Les sulfates d'angolamycine.
14) Le chlorhydrate d'angolamyoine.
15) L'acétate d'angolamycine.
16) Le pantothénate d'angolamycine.
17) Les produits obtenus en réduisant l'angolamyoine.
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The present invention relates to a novel crystalline antibiotic which, in what follows, will be referred to as "angolamyoin", its salts of certain of its derivatives and pharmaceutical preparations containing these compounds. The invention also relates to the process for preparing these substances and mixtures of these substances.
Angolamyoin is a base which, on crystallization from a mixture of benzene and ether, gives colorless crystals melting at 133-136.
In some solvents, for example in diisopropyl ether or dioxan, angolamycin crystallizes in a second crystalline form, in needles with a melting point of 165-168. The values provided by the analy-
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elementary lead to the crude formula FC501H 2018No Calculated with respect to this formula, angolamycin contains three methoxy groups, two N-methyl groups, at least eight C-methyl groups determined following
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Before the method of Kuhn and Roth, so five atoms of active hydrogen (Zerewitinoff). Angolamycin is optically active, 121 = 64 in chloroform, and it shows a strong band in the ultraviolet at 240 mu (lodged = 416, in ethanol).
In the infra-red spectrum, taken in nujol, one observes, among others, bands at 2 $ 93 119 3953 ile s84 ,, 599 'E95, 6.81, u,' 7.06 p., 7.25p, 7.59 il 7.7s87 u, 8.16 bind 8.56 bind 9.16) 1, 9.34 ue 10.02) 1, 10.29 .g 11.00., 11.91 p., 12 , 66 µl and 13.20 pu Dissolved in a mixture of methylcellosolve and water (80:20), the angolamyoin has a pK value of 6.74. In the hydrogenation in ethanol with a palladium-calcium carbonate catalyst, 1 mol of hydrogen is absorbed, while in glacial acetic acid with an oxy-oxy catalyst. of platinum 3 mol of hydrogen are consumed.
With regard to its physical constants, angolamyoin pre-
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feels a certain analogy with carbomyoine and with 1 etthromycino It can easily be distinguished from oarbomycin a. using the Piachbaah and Levine staining reactions (Ant.biotic, s and 0hemQtherapy 3. 1158 [1953]). Angolamycin then initially gives a dirty yellow color, then brown, while with carbomyoine under the same conditions a violet to purple color is obtained.
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It differs from erythromyoine by its absorption in ultraviolet, as well as by its behavior in the chromatography on paper o In the solvent system methanol (19-parts by volume) -acetone (6 parts by volume) - water (75 parts by volume), the following Rf values were found: angolamycin 0.78, erythromyoin 0.860 Another difference between angolamyoin and erythromyoine appears during the hydrolysis of these antibiotics with dilute mineral acids, the reducing cleavage products which form behave differently in paper chromatography.
Angolamyoin salts are derived from known inorganic and organic acids, for example hydrochloric acid, sulfuric, acetic, propionic, valeric, palmitic or oleic, succinic, citric, mandelic, glutamic or pantothenic acids. neutral salts or acieso They are prepared by causing the corresponding acids to act on the free base, or by double decomposition reaction of its salts, for example
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by reacting angolazyoin sulfate with sodium pantothenate.
Ltangolamyoine possesses high antibiotic activity against various test organisms If one uses as an in vitro test method, for bacteria, dilution series (by potencies of) of the substance, in glucose broth, for amoeba, dilution series
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in a commercial "Bacto-entamoebali medium, incubated at 31 for 24 hours, the following concentrations are still inhibiting:
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<tb> Test organisms <SEP> Inhibiting <SEP> concentration
<tb>
<tb>
<tb> ug <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 0.1- <SEP> 1
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<tb>
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 10
<tb>
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Yicroaoacus yogenes var.aureus 10 - 100 "" U ", penioillino-
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<tb> resistant <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 100
<tb>
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtaeriae <SEP> 100
<tb>
<tb> Entamoeba <SEP> histolytiea <SEP> 10 <SEP> - <SEP> 100
<tb>
In vitro, angolamyoin is not active at a concentration
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100 µg / om3 against the following microorganisms: Streptocooous miitis;
Streptoooocus faecalis, Esoheriohis ooli, Salmonella typhosa ', Salmonella achottmuelleril Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae (type A), Pasteurella pestis, Vibrio comma (El Tor), Myeobacterium tuberculosis (Hibacterium tuberculosis 37 Rv), Candida albicans and Candida tropioalis.
In vivo, angolamyoin is also active. When administered to mice infected with Streptococcus pyogenes, 10 x 50 mg / kg were found subcutaneously 100% of animals surviving on the sixth day and 67% on the tenth day.
The toxicity of angolamyoin is low: 500 mg / kg injected once by the subcutaneous route are tolerated by mice, without apparent disturbances.
The antibiotic angolamyoin is formed when growing a
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new strain dqaetynomycetes of the Streptomyces family which is not identical to any of the strains indicated in the work by Urgey entitled "Manual of Determinative Bacterio2ogy" 6th edition, or in the work by Waksmann and Heahevalier entitled "Actinomycetes and their Antibiotica" (1953)) this new strain of aatynomycetes will be described below under the name of "Streptomyces eurythermus." So far, it has been isolated three times and in particular from soil test samples taken at Cuanw, (Angola), Kisantu (Congo) and near Regesberg (Switzerland).
These three strains all produce the new antibiotic and, with a few minor differences, they are morphologically and physiologically consistent. They are kept in the laboratories of the Applicant and at the Federal Polytechnic School (Zurich, Switzerland), Special Botanical Institute, under the designation A 6677, A 6905 and A 7489.
On almost all nutrient media Streptomyces euryhermus forms a vegetative mycelium in long hyphae and a dark brown diffusing pigment. The aerial mycelium is dense and gray most of the time, with - a few chains of conidia not united * in tufts. These chains of conidia are a typical feature of the Streptomyces family. The various conidia are ovoid to spherical in shape and are smooth; their size
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reaches 0.8 - 3ji x 0.6 - 0 # 'ja. Their growth depends relatively little on temperature; this fungus grows as well at 18 as at 58, however the optimum growth is between 25 and 32.
To give other characteristics, we will describe in what follows the growth of Streptomyces eurythermus on different nu-
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tritifso Nutrient media 1 to 8 as well as 12 were prepared according to W. Lindenbein, Archo Mikrobiol. 17, 361 (1952).
1.) Synthetic agar; Growth pustular, light brown;
Scanty aerial mycelium, first white gray, then ash gray with brown pigment. Strain A 7489 forms a more abundant, velvety, tight, ash-gray aerial mycelium.
2.) Liquid synthetic medium: Submerged growth, flakes and light brown sediment; brown pigment.
3.) Glucose broth: Growth sparse, sediment pustular, yellow-brownish
4.) Glucose agar; Growth cushion-shaped to rough, light brown; aerial mycelium velvety, gray-white to greenish-gray; brown-chestnut pigment.
5.) Glucose Asparagine Agar: Growth slender and hazy, yellow-white; aerial mycelium velvety, gray-white to ash-gray; chestnut-brown pigment. The aerial mycelium of strain A 7489 'is slightly pink on the surface,
6.) Calcium Malt Agar: Lichenous growth, light brown; dusty, ash-gray aerial mycelium; dark brown pigment. The aerial mycelium of strain A 6905 is brownish-gray.
7.) Agar medium (gelatin) at 18: Very scanty growth; dark brown pigment For strain A 6677 weak liquefaction after
40 days, for strain A 6905 strong liquefaction (2.2 cm) after 34 days, and for strain A 7489 strong liquefaction (2.0 cm) after 31 days.
8.) Starch agar: Growth pustular, golden yellow; velvety aerial mycelium at first snow-white, then gray; pigment light brown; hydrolysis of starch 0.5-0.8 cm after 4 days 9.) Nutrient agar: Pustular yellow-brownish growth; mycelium aerated velvety, ash gray; reddish-brown pigment. Strain
A, 7489 does not form aerial mycelium.
10.) Potato: lichenous growth, light brown; aerial mycelium veined, milky white, then ash gray; brownish to jet black pigment. 11.) Carrot: Growth pustular, brownish yellow; velvet aerial mycelium, chalk-white to gray for strain A 6677, white-gray to pink for strains A 6905 and A 7489; jet black pigment.
12.) Milk (Difco N B 107): Ring-shaped growth, brown, later superficial growth, aerial mycelium ash-gray; dark brown pigment !, peptization with coagulation; weakly reddish sunflower
Streptomyces eurythermus is differentiated from other known thermophilic genera of the Streptomyces family as follows:
of Streptomyces thermophilus (Gilbert), Waksman and Henrioi, by a well-developed aerial mycelium, by the strong pigment formation on gelatin and nutrient agar, as well as by the color of the pigment. of Streptomyces thermodiastaticus (Bergey), Waksman and Lechevalier, by the color of aerial mycelium and by the formation of the pigment, of Streptomyces thermofuscus (Waksmann, Umbreit and Cordon), Waksman and Henrici, by the color of the aerial mycelium and by the formation of pigment on gelatin,
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of Streptomyces casei (Bernstein and Morton), Waksman and Lechevaler, by the coloring of the aerial mycelium, the formation of pigment and the hydrolysis of starch.
Among the mesophilic Streptomycetes, Streptomyces eurythermus is closest to Streptomyces antibioticus (Waksman and Woodruff), Waksman and Henrici, but its growth on potatoes, carrot and milk is markedly different.
The @Streptomyces eurythermus grows in the following way, according to the method T. Go Pridham and Do Gottlieb, J, Bacteriology 56, 107 (1948), when various carbon sources are used: L-xylose + inulin - L-arabinose + D-mannite + L-rhamnose (-) D-sorbite D-fructose + dulcite - G-galactose + mesoinosite (-) sucrose + salicin + maltose + sodium acetate + lactose + sodium citrate (+) raffinose + sodium succinate +
The signs have the following meaning: +: good growth, certain use of the mentioned carbon source, (+): weak growth, doubtful use of the mentioned carbon source, (-): very weak growth, improbable use of mentioned carbon source, -: no growth, no use of the mentioned carbon source.
As regards the preparation of angolamyoine, the present invention is not limited to the use of Streptomyces eurythermus or other strains corresponding to the description, but it also relates to the use of varieties of these. organism, as obtained, for example, by selection or mutation, in particular under the influence of ultraviolet radiation or X-rays or under the action of nitrogen mustard.
To obtain angolamyoin, a strain of Streptomycetes exhibiting the properties of Streptomyces eurythermus is aerobically cultured, for example in an aqueous nutrient solution containing inorganic salts, nitrogenous compounds and, where appropriate, carbohydrates. , until this solution exhibits a notable antibacterial action, then the angolamycin is isolated from the culture filtrate.
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example chlorides, nitrates, carbonates, sulphates of alkali or alkaline earth metals, magnesium, iron, zinc, manganese. As nitrogen compounds and where appropriate carbohydrates and growth promoting substances which can be added, there may be mentioned for example;
amino acids and mixtures thereof, peptides and proteins and their hydrolysates, such as peptone and triptone, meat extracts, water-soluble fractions of cereal seeds such as corn and wheat, distillation residues from the preparation of alcohol, yeasts, beans, especially soya beans, seeds, for example cotton, as well as glu-
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cose, sucrose, lactose, starch, etcooo
The culture takes place aerobically, that is to say for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner, with shaking - or agitation with air or oxygen, in shake flasks or in known fermenters.
As temperature proves suitable a temperature between 20 and 50. By operating in this way, the nutrient solution exhibits a noticeable antibacterial effect, generally after one and a half to five days.
To isolate the antibiotic from the culture filtrate separated from the mycelium, one can operate for example as follows: the culture filtrate is extracted, advantageously at a pH greater than 7.0, with a solvent organic water-immiscible, such as esters of lower fatty acids, eg ethyl acetate or amyl acetate, chlorinated hydrocarbons, eg ethylene chloride, methylene chloride , or chloroform, ketones, for example methylpropyl ketone, methylamyl ketone, or diisobutyloetone, alcohols such as butyl alcohols or amyl alcohols, ethers, for example ethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ethers or glycol ethers and the like, A,
instead of extracting the culture filtrate with the aid of a solvent, or in combination with such an extraction, as an additional purification operation, one can also obtain 1 antibiotic by adsorption, for example with activated carbon or with activated earths, such as fuller's earth or floridin, and by subsequent extraction of the absorbate, for example using an acidic aqueous solution and / or using at least an organic solvent partially soluble in water, such as isopropanol, butanol or methyl ethyl ketone. In addition, the antibiotic can be precipitated, for example, in the form of a salt of an organic sulfonic acid or precipitated directly with picric acid in the culture filter.
Partitioning between an acidic aqueous solution and a water-immiscible organic solvent is a good purification process. of the new antibiotico The distribution takes place advantageously by the countercurrent process, in suitable apparatus. Chromatography is also very suitable for purification. The production of the pure antibiotic in crystalline form takes place, for example, in organic solvents such as ether, dioxane, mixtures of ether and petroleum ether, benzene and ether. or mixtures of acetone and petroleum ether. For recrystallization, the same solvents are used or also aqueous organic solutions, for example dilute alcohols, dilute acetone, etc.
Apart from the processes for the preparation of crystalline angolamyoin, its neutral and acid salts with inorganic or organic acids, the present invention also relates to the compounds indicated themselves, in particular angolamyoin sulphates, hydrochloride. angolamycin acetate, angolamycin acetate and angolamycin pentothenate, as well as transformation products obtained by hydrogenation or oxidation, as well as angolamycin cleavage products as obtained by example by hydrolysis
Angolamycin, its salts, transformation and cleavage products indicated above, or mixtures thereof can be used as medicaments, for example in the form of pharmaceutical preparations.
The latter contain the indicated compounds in admixture with a pharmaceutical carrier material, organic or inorganic, suitable ± for enteral, parenteral or local application. For this carrier material, substances which do not react with the new compounds, for example gelatin, lactose, starch, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums,
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polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterin or other known excipients.
Pharmaceutical preparations can, for example, be presented in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form in the form of solutions, suspensions or liquid. emulsions * Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances such as preservatives, stabilizers, wetting agents and emulsifiers. They may also still contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in more detail in the following example which does not limit it in any way. In this example, the temperatures are given in degrees centigrade.
The present invention also relates, as new industrial products, to products conforming to those defined above.
EXAMPLE
A nutrient solution of the following composition is prepared: 3 g of meat extract (product known commercially under the name "Oxo Lab Lemoo"), 5 g of peptone, 10 g of raw glucose, 5 g of sodium chloride , 10 g of calcium carbonate and a liter of tap water, then adjust it to a pH of 7.5. This solution or a multiple of this solution is transferred to 500 cm3 conical flasks (each containing 100 cm3 of nutrient solution) or to 500 liter fermenters (each containing 300 liters of nutrient solution), then sterilized for 20 to 30 minutes under a pressure of an effective atmosphere.
27 are then inoculated with up to 10% of a partially sporulating vegetative culture of Streptomyces eurythermas and incubated by shaking well - or by shaking and, in the fermenters, passing air (about 1 volume of sterile air per minute and per volume of nutrient solution) o After 48 hours of growth, the cultures are filtered by adding a substance to facilitate filtration, on a suction funnel or in a filter press or in a rotary filter, according to the volume to be filtered, and the aqueous solution, containing the antibiotic, is thus freed from mycelium and other solid components.
In a suitable extractor, 170 liters of culture filtrate are extracted, at a pH of 8, with 70 liters of ethyl acetate. The total activity vis-à-vis Gram-positive bacteria then passes into the extract, while the culture filtrate still exhibits activity vis-à-vis fungi, in particular vis-à-vis Candida tropicalis. The ethyl acetate extract is then extracted three times with each time 4 liters of a half-normal aqueous solution of acetic acid, all of the activity against Gram-positive organisms. passing into the aqueous phase. The acetic extract is made alkaline with a concentrated sodium carbonate solution and extracted three times with 2.5 liters of ethyl acetate each time.
The bases are then extracted again with a total of 3 liters of a semi-normal aqueous solution of acetic acid, released with a concentrated sodium carbonate solution and finally extracted with in total one liter of ethyl acetate. The ethyl acetate solution was washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo at 40 to dryness. 2.39 g of a yellowish amorphous product remain, the antibaoteric action of which corresponds approximately to that of crystalline angolamyoin *. While heating slightly, the 2.39 g of crude product thus obtained are dissolved in 50 cm 3 of ether.
The solution is filtered and crystallization is initiated with angolamycin. Over a few hours, 1.80 g of the antibiotic separates into crystals with a melting point of 131-1340.
To further purify, a tenfold amount of ethero is added to a solution of the crystals in as little hot benzene as possible.The crystals of pure antibiotic which then separate melt at 133-136 o [#] = -64 (C = 1 , 30 in chloroform).
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Found: C 60.21%; H 8.78%; N 1.40%; CH3O 8.80%; CH3 (N) 3.66%; CH3 (C) 11.55%; H active 0.52%.
On recrystallization from diisopropyl ether or dioxane, angolamycin is obtained in the form of fine needles, melting at 165-168 ° Found: C 60.49%; H 8.93%; N 1.66%.
Instead of purifying the crude base by direct crystallization, it can also be purified by chromatography. For this purpose, 42 mg of crude base are chromotographed on 2 g of aluminum oxide (activity III according to Brockmann) according to the pass-through method, eluting with benzine, chloroform and mixtures of chloroform and methanol. With benzene and chloroform only traces of impurities are dissolved, while the fractions obtained with a mixture of chloroform and methanol (16: 1) contain 40 mg of the pure antibiotic. The latter is crystallized in the manner described above.
In addition, the crude base can be purified by countercurrent distribution, for example using the following solvent systems: a) Mac Ilvaine buffer (pH 3.15) and chloroform (1: 1) b) isopropyl ether (12 parts by volume), acetone (10 parts by volume) and water (10 parts by volume) o
When divided into 100 stages, the maximum substance and activity is found with system a) at stage N 72 and with system b) at stage n 55.
Reineckate: Using 15 cm3 of an ethereal solution of acid
Reinecke (prepared according to Karrer and Schmid, Helv. 29, 1853 (1946)), a solution of 60 mg of angolamycin in 1 cm3 of methanol is slowly precipitated.
The precipitate is dissolved in methanol and precipitated by adding ether.
Found: Cr 3.96%.
Instead of reineckate, it is also possible to prepare salts of other acids, in particular sulfuric acids, hydrochloric acid, acetic acid and pantothenic acid. Hydrolysis of angolamycin: In a tube sealed, heated for 5 hours at 100.18 mg of angolamycin in 2 cm 3 of semi-normal sulfuric acid. The reaction mixture is then extracted twice with ethyl acetate, bringing the aqueous phase to a pH of 5 by addition of a solution of barium hydroxide. The barium sulphate formed is removed by centrifugation and the clear solution which supersedes evaporated to dryness under vacuum.
The residue is examined by chromatography on paper, using a mixture of butanol and glacial acetic acid (10: 1) saturated with water. Using an ammoniacal silver nitrate solution, two reducing substances with Rf values of 0.28 and 0.65 were made visible on the paper strips.
Under the same conditions, erythromycin gives two reducing substances with Rf values of 0.23 and 0.32, while from pioromycin and from narbomyoine only one product is obtained. reducing scission with an Rf value of 0.23.
Hydrogenation of angolamycin: a) In a hydrogen atmosphere, a solution of 20 mg of angolamycin in 5 cm3 of absolute alcohol is shaken for two hours with 10 mg of a palladium catalyst. The solution is then filtered. and evaporated in vacuo. Dihydroangolamycin is obtained in the form of a colorless powder.
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which has antibiotic action. b) In a hydrogen atmosphere and with 10 mg of a platinum catalyst, a solution of 20 mg of angolamyoin in 5 cm3 of glacial acetic acid is shaken for one hour. The solution is then filtered and evaporated in vacuo. Hexahydroangolamycin is obtained in the form of a colorless powder which has an antibiotic action.
CLAIMS.
Io- A process for the preparation of a novel crystalline antibiotic, characterized in that a strain of streptomyces having the properties of. streptomyces eurythermus until the nutrient solution exhibits a notable antibacterial effect, and then angolamycin is isolated from the culture filtrate.
The present process can be further characterized by the following points:
1) Cultivation is carried out under aerobic conditions, preferably in a submerged manner, in an aqueous nutrient solution containing inorganic salts, nitrogen compounds and optionally carbohydrates.
2) The nutrient solution contains growth promoting substances.
3) Cultivation takes place for 36 to 120 hours, at a temperature between 20 and 500.
4) The antibiotic is extracted from the culture filtrate at a pH above 7.0, using an organic solvent immiscible with water.
5) The antibiotic is purified by adsorption, preferably with activated charcoal, and by extracting the adsorbate with an acidic aqueous solution and / or an organic solvent at least partially soluble in water. .
6) The antibiotic is purified by partitioning between an acidic aqueous solution and an organic solvent immiscible with water.
7) The distribution takes place according to the counter-current process.
8) The antibiotic is crystallized from an organic solvent.
9) The antibiotic is prepared in the form of a crystalline salt with an inorganic or organic acid, by the action of this acid on the free base of the antibiotic or by the double decomposition reaction of a salt of the antibiotic on a salt of the corresponding acid.
II.- As new industrial products:
10) The new crystalline antibiotic, called anolamycino
11) The crystalline salts of this new antibiotic, angolamyoin, with inorganic or organic acids.
12) The acidic salts of this new antibiotic, angolamycin, with inorganic or organic acids.
13) Angolamycin sulfates.
14) Angolamyoine hydrochloride.
15) Angolamycin acetate.
16) Angolamycin pantothenate.
17) Products obtained by reducing angolamyoine.
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