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La présente invention concerne un nouvel antibio- tique qui,. dans ce qui va suivre, sera désigné par la dénomi- nation "échinomycine", ses dérivés et produits de scission, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés. L'invention.concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et.mélanges de substances.
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L'antibiotique dénommé "échinomycine" se forme lors de la culture d'une nouvelle souche d'actionomyctes de la famille des Streptomyces, qui n'est identique à aucune des souches indiquées dans l'ouvrage de Bergey intitulé "Manual of Determinative Bacteriology", 6ème édition, ou dans l'ouvrage de Waksman et Lechevalier intitulé "Actinomycetes and their
Antibiotics" (1953); cette nouvelle souche sera décrite ci- après sous le nom de "Streptomyces echinatus nov.sp." Elle a été isolée à partir d'une prise d'essai faite dans le sol de l'Angola et elle est conservée dans les Laboratoires de la
Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich,
Suisse), Institut de botanique spéciale, sous la désignation
A 8331.
Le Streptomyces echinatus forme un mycélium aérien gris-cendre. Il porte des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typique de la famille des Streptomyces. Les ,pores sont elliptiques à ovales. Leur surface est couverte de longues et minces épines, et leur taille atteint 0,9 x 0,6
0,7 . La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18 qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32
Pour.donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance du Streptomyces echlratus sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 8, ainsi que 12, ont été préparés suivant W. Lindenbein,
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"Arch. Mikrobiol." 17, 361 (1952).
1) Gélose synthétique Croissance grêle, voilée, jaune- verdâtre ou jaune-citron à vert-poireau mycélium aérien velouté, blanc comme neige au bout de 4 jours, jaune-citron au bout de 7 jours, pigment jaune- verdâtre à vert-pré au bout de 14
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' ..'1¯ ¯="1' . jours.
2) Milieu synthétique liquide Croissance peu abondante, léger louche.
3) Bouillon glucosé Croissance flottante, punctiforme, brun-clair, pas de pigment.
4) Gélose-glucose mycélium végétatif rugueux, jaune d'oeuf; mycélium aérien velouté, blanc comme neige au centre, jaune-brunâtre au bord-au bout de 4 jours, laineux blanc-gris à gris-cendre au bout de
7 jours; pigment jaune-foncé à jaune d'or.
5) Gélose-glucose à l'asparagine : mycélium végétatif mince, lisse, jaune.d'or à jaune verdâtre, également gris-verdâtre au bout de
7 jours; mycélium aérien velouté, gris-cendre à violet-rougeâtre en allant du haut vera le baa dans
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l'éprouvette, gris-blanc au bout de
4 jours, gris-cendre au bout de 7 jours sur toute la longueur du gélose; pas de pigment notable.
6) Gélose au malate de calcium :croissance grêle, voilée, jaune-pâle au bout de 4 jours, jaune- verdâtre au bout de 7 jours, mycélium aérien pulvérulent blanc-laiteux à jaune-pâlepas do pigment.
7) Milieu gélosé (gélatine) à 18 C : croissance superficielle, grêle, brun-foncé; mycélium aérien velouté, gris-verdâtre au bout de 14 jours;pigment brun-foncé; pas de liquéfaction au bout de 31 jours.
8) Gélose à l'amidon : croissance pustuleuse, jaune-foncé, mycélium aérien velouté, gris-cendre, pas d'hydrolyse ou tout au plus des traces au bout de 5 jours.
9) Gélose nutritive : croissance punctiforme, jaune-clair, pas de mycélium aérien; pas de pigment.
10) Pomme de terre: . mycélium végétatif lichéneux, noir- verdâtre à noir-corbeau; mycélium aérien peu abondant, pulvérulent gris- blanc au bout de 4 jours, bleu-gris au bout de 7 jours; substratum bunâere
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à noir de brai.
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11) Carotte bzz croissance,gr8le--jaune-clair; mycélium aérien pulvérulente gris-blanc au bout de 4 jours, gris-verdâtre au bout de 7 jours; pas de pigment diffusant.
12) Lait de tournesol : croissance annulaire et tégument; -mycélium aérien pulvérulent, gris- blanc à gris-cendre; coagulation et -peptonisation au bout de*-5, complètes au bout de 12 jours .
Le Streptomyces echinatus croît de la façon suivante, d'après la méthode de T.G.Pridham et D.Gottlieb, "J.Bacteriolo- gy" 56 107 (1948). lorsqu'on utilise diverses sources de carbone :
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<tb> L-xylose <SEP> + <SEP> inuline <SEP> -
<tb>
<tb>
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<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbite
<tb>
<tb>
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<tb> D-fructose <SEP> dulcite
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D-galactose <SEP> + <SEP> mésoinosite
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<tb> saccharose <SEP> - <SEP> - <SEP> salicine <SEP> -
<tb>
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<tb> maltose <SEP> + <SEP> acétate <SEP> de <SEP> sodium
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lactose <SEP> + <SEP> citrate <SEP> de <SEP> sodium
<tb>
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raffinose + succinate de sodium
Les signes ont la signification suivante : + :
bonnes croissance, utilisation certaine de la
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source de carbone mentionnée, (+) : croissance faible, utilisation douteuse de la source de carbone mentionnée, (-) : croissance très faible, utilisation improbable de la source de carbone mentionnée, - : pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée.
Le Streptomyces echinatus présente certaines analogies avec le Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici et avec le Streptomyces flaveolus (Waksman) Waksman et Henrici, qui possèdent tous les deux également un mycélium aérien gris-cendre et des spores avec des appendices. Dans le cas du Streptomyces flaveolus, ces appendices sont constitués toutefois,d'après T.R. Vetnon [Nature 176, 935 (1955)] par des filaments pouvant atteindre jusqu'à 1 de longueur. Par ailleurs, le Streptomyces griseoflavus possède sur les spores des épines d'une longueur maximum de 0,2 , c'est-à-dire notablement plus courtes que dans le cas du Streptomyces echinatus.
En outre, le Streptomyces griseoflavus ne forme pas de pigment jaune et fournit une liquéfaction totale de la gélatine, ainsi qu'une hydrolyse moyenne de l'amidon.
La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la préparation de l'antibiotique dénommé " chinomycine" a l'utilisation du Streptomyces echinatus ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également
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l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote.
Pour obtenir l'antibiotique dénommé "échinomycine" p on cultive de manière aérobie une souche de Streptomycètes présentant les propriétés du Streptomyces echinatus, par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels inorganiques, des composés azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone, jusqu'à ce que cette solution présente une action antibactérielle notable, puis on isole l'antibioti- que dénommé "échinomycine".
La solution nutritive renferme comme sels inorgani- ques par exemple des chlorures, nitrates, carbonates, sulfates de métaux alcalins ou alcalino-terreux, de magnésium, de fer, de zinc,.de manganèse. Comme composés azotés et le cas échéant hydrates de carbone et substances favorisant la croissance qu'on peut ajouter, on citera par exemple -.
des acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines, ainsi que leurs hydrolysats, comme les peptones ou tryptones, des extraite de viande, des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, de résidus de distilla- tion provenant de la préparation de l'alcool, de levures, de fèves, notamment de soja, de graines, par exemple de coton, ainsi que du glucose, du saccharose, du lactose, de l'amiden,etc
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La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus.
Comme température s'avère appropriée une température comprise entre 18 et 40 . En opérant ainsi, la solution nutri- tive accuse un effet antibactériel notable en général au bout d'un jour et demi à cinq jours.
Pour isoler l'antibiotique, on peut par exemple se servir des procédés suivants On sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve dans ledit filtrat la majeure partie de l'antibiotique. Il reste toutefois des quantités notables d'antibiotique qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. A cet effet, sont appropriés notamment des solvants or- ganiques au moins partiellement solubles dans l'eau, tels que des alcools, comme par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones, comme par exemple l'acétone et la méthyléthylcétone. Ces extraits de mycélium sont ajoutés au fil- trat de culture soit directement, soit après une concentration préalable.
On extrait avantageusement le mélange à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, par exemple avec des esters d'acides gras inférieurs, par exemple avec de l'acétate d'éthyle ou de l'acétate d'amyle, avec des hydrocarbures, par exemple avec du benzène, avec des hydrocarbures chlorés, par
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exemple avec du chlorure d'éthylene, du chlorure de méthulène ou du chloroforme, avec des cétones, par exemple avec de la méthylpropylcétone, de la méthylamylcétone ou de la dilsobutyl- cétone, avec des alcools, comme les alcools butyliques ou les alcools amyliques, avec des éthers, par exemple avec l'éther éthylique, l'éther diisopropylique,
avec des éthers dibutyli= ques ou des éther du glycol et analogues. A la place de l'ex- % action des cultures à l'aide d'un solvant,ou en combinaison avec une telles extraction, comme opération de purification complémentaire, on peut aussi obtenir 1 antibiotique par adsorption, par exemple à du charbon actif ou à des terres activées, comme la terre à foulon ou la floridine, et par extraction subséquente de l'adsorbat, par exemple a l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, comme l'acétone, le butanol ou la méthyléthylcétone.
On peut aussi extraire les cultures directement de le manière indiquée, sans séparation préalable du mycélium.
On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques renfermant l'anti- biotique, d'abord avec une solution acide aqueuse d'un pH inférieur à 5, et ensuite en extrayant avec une solution alcaline aqueuse, à un pH supérieur à 8, la majeure partie de l'activité antibiotique restant dans la phase organique, de laquelle l'échinomycine est isolée. Une quantité moindre d'activité se trouve dans les extraits alcalins aqueux à parti?
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desquels on peut obtenir, par extraction avec les solvants organiques indiqués ci-dessus, à un pH inférieur à 5, un acid organique actif comme antibiotique.
Comme solutions aqueuses acides sont appropriés des acides dilues comme les acides acétique, chlorhydrique ou suif unique, ou des solutions- tampons, comme les tampons à base de citrates ou de phosphates, et comme solutions alcalines aqueuses des alcalis dilués comme des solutions d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium, ou des solutions-tampons comme les tampons à base de phosphates et analogues.
La répartition entre une solution alcoolique aqueuse et un solvant non miscible à l'eau constitue un bon procédé de purification pour le nouvel antibiotique. La répartition a lieu de préférence suivant le procédé à contre-courant dans des appareils appropriés. La chromatographie est également très bien appropriée pour la purification. L'obtention de l'antibiotique pur sous forme cristalline a lieu par exemple dans des solvants organiques comme l'acétone, le méthanol, l'éthanol, le chloroforme, des mélanges d'acétone et de méthanol, des mélanges d'acétone et d'éther ou des mélanges d'acétone et d'éther de pétrole. Pour la recristallisation, on se sert des mêmes solvants ou aussi de solutions organiques aqueuses, par exemple d'alcools dilués, d'acétone diluée, etc.
On obtient l'antibiotique sous la forme d'une coudre microcristalline incolore, fondant à 217 - 218 , et
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possédant un pouvoir rotatoire spdcî'flque [Q]D = - µ10 .
L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes g C = 55,79%, H = 5,74%, N = 15,20%, S = 5,24%, (N)CH3 = r,,2n,tc,', (C)CH3 = 2,63%. Ces valeurs conduisent à la formule C29H37O7N7S, d'après laquelle la substance ne renfermerait pas de groupes 0-méthyles, mais deux groupes N-méthyles et deux groupes C-méthyles. Son spectre d'absorption ultra-violet
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montre deux bandes a 242 ma (log E = S.76)eta322 mi 1 cm (log E 1% = 2,02). Dans le spectre infrarouge, on peut
1 cm observer des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes
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suivantes ô ,J1 1 ü 12a8 9' U"8 6,8l '8 Y 9""" IW8 8"' ^ 1> 7 85 - 8.00 (bande très large). 8,75 9, 9,06 , iz,78 y et 13,16 Ma L'echinontyoine ne possède pas de propriétés basiques et pas de groupes hydroxyles facilement acylables.
Lors de'l'hydrolyse acide de l'échinomycine, il se
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forme les acides aminés dénommés D-sérine et L-alan1n9 ainsi que d'autres produits de scission qui fournissent une réaction colorée positive avec la ninhydrine. Par ailleurs, lors du traitement doux de l'échinomyeinee avec un alcali, il se forme
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un produit d'hydrolyse acide, faeide dchinomcique '. Son spectre d'absorption ultra-violet montre deux bandes bzz, 242 m (log Ê.1%'" '' .- 2,83) et 322 Ru Qg a = 2,11). Lors de
1 cm 1 cm l'hydrolyse acide de cet acide, il se forme, entre autres, de l'alanine, mais pas de sérine.
Lorsqu'on la fait bouillir avec une solution concentrée d'hydroxyde de sodium, l'échinomyeine
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fournit environ 1,2 mol d'ammoniac, tandis qu'à partir du mélange de réaction alcalin, on peut, après acidification et extraction à l'acétate d'éthyle, isoler l'acide quinoxaline-
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carboxylique-(2). D'après ces recheroheGj lAéch1no-rnyine est, apparemment un composé de structure dans lequel à cote de la L-alanlne, de la D-sévîne, de l'acide quinosa- line-2-carboxylique et de l'armoniso vr&!cb18bleont lié sous forum amldique, il existe encore un reste trimaient de formule C141 O,N:aS.
L'antiblotigue d6nor:ié éehinonycine possède une très forte activité antibiotiquo vie-a-v1# de .(3ives's organ1ames- testa. 31 l'on utilise comme n-6thoda-tGote in Vitro des séries de dilution (par puissance de 10) dans du bouillon glucose incubées par 37 pondant 24 heures, on a les concentration suivantes qui sont encore inhibantes
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0rganisixes-tests Concentration -.."I inhibant jUg/CRr 'Hicrococcus pyogenes var.aureus 0,1 r1icrococcuB pyogenes, var.8.ureua pénlcllllno-résistant 0,1
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<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,1
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb>
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Corynebacterium dlphtherlae 0,
1
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<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> -10
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb>
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Yecobacterium tuberculoals -!-) 100 Entamoeba hlatolytica ++) 1000
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<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> +++) <SEP> <4
<tb>
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+) cultivé dans le milieu synthétique de Kirchner avec de l'albumine bovine à 5%, examen de la croissance au bout de deux semaines.
++) culture dans unmilieu de Bacto-Entamoebai examen de 18 effet amibicide au bout de 24 heures.
+++) cultivé dans du bouillon à 37 renfermant 10% de sérum,de cheval.- examen au bout de 4 jours.
Le développement du virus de l'Influenzà sur des membranes Isolées du chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours d'incubation est encore inhibé à une concentration inférieure à 1 g/cm3, tanças que le tissu de chorioallantois lui-même n'est pas toxiquement endommagé par 100 g/cm3.
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L'antibiotique dénommé échinomycine est également actif in vivo. Cinq injections sous-cutanées de 5 mg/kg prati- quées sur des souris infectées au Streptococcus permettent de retarder l'exitus de deux jours. Chez les souris, lors des applications sous-cutanées de 1 mg/kg, on obtient un effet supprimant à 100% les infections au Borrelia recurrens.
De plus, des administrations par voie perorale de 5 mg/kg dans le cas de rats infectés avec des amibes ont un effet de 100%.
Le traitement local de hamsters vaginalement in- fectés avec du Trichomonas foetus accuse un bon effet curatif avec une solution d'échinomyoine à 1%.
En dehors du procédé de préparation de l'anti- biotique dénommé échinomycien. la présente invention a également pour objet le composé mentionné lui-même, ainsi que ses produits de transformation obtenus par hydrogénation ou oxydation, de même que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse de l'antibiotique dénommé échinomycine.
L'antibiotique dénommé échinomycine, les produits de transformation et de scission inc ués ci-dessus, ou des mélanges correspondants peuvent être utilisés comme médicaments,
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par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques renfermant les composés indiques en mélange avec un excipient pharmaceutique, organique ou Inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale.
Comme exci- pients entrent en ligne de compte les substances ne réagissait pas sur les nouveaux composés, par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium;, le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommesdes polyalcoylène-glycols,la vaseline, la cholestérine ou d'autres excipients connus,Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemplesous la forme de comprimés, de dragées, de poudres, d'onguents, de crèmes, de suppositoires ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions.
Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances auxiliaires, telles que des agents de conservation, de stabilisation, 'des agents mouillants ou émulsifiants. Elles peuvent encore renfermer d'autres substances thérapeutiquement précieuses.
L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont Indiquées en degrés centigrades.
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Exemple 1 -----------
On prépare une solution nutritive de la compo- sition suivante : 20 g de farine de soja, 20 g de mannite et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de 7,8. On transvase cette solution ou un multiple de cette dernière dans des fioles coniques d'un volume de 500 cm3 (remplies chacune avec 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fer- menteurs de 500 litres (remplis chacun de 300 litres de so- lution nutritive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression de 1 atmosphère.
On ensemence ensuite avec jusqu'à 10% d'une culture végétative, partiellement sporulante, de Streptomyces eahinatus et incube, tout en secouant bien ou en agitant, dans les fermenteurs, à 27 , en faisant passer de l'air (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute). Après 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures, en ajoutant un adjuvant de filtration, suivant le volume soit à travers un entonnoir filtrant, soit à travers un filtre-presse ou un filtre rotatif, et débarrasse ainsi du mycélium et d'autres composants solides la solution aqueuse antibiotiquement active.
Exemple 2
Si lion utilise, à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c ou d décrites ci-après, on obtient après avoir, d'une manière analogue,
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stérilisé, ensemencé avec du Streptomyces echinatus, incubé à 27 , et filtré, des solutions aqueuses actives comme anti- biotiques. a) 10 g de glucose brut, 5 g de peptone, 3 g d'extrait de viande (Oxo Lab Lemco), 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisation : 7,5. b) 10 g de glucose brut, 10 g du produit connu dans le commerce sous le nom de "Distillera solubles", 1 g de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet;
pH avant stérilisations 7,5 c) 10 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du maïs (corn steep liquor), 2 g d'hydrophosphate secondaire de potassium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stérilisations 7,5. d) 20 g de glycérine, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 1 g de nitrate de sodium, 10 g de car- bonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stéri- lisation; 7,5.
Exemple 3 --------------
Avec 25 litres d'acétone, on agite le résidu de filtration'd'une charge de 150 litres obtenu suivant l'exemple ou 2, puis filtre à nouveau. On répète cette opération deux fois, après quoi on réunit les solutions acétomniques renfermant
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l'antibiotique, les concentre sous vide à 5 litres et les réunit avec le filtrat de culture. On extrait alors cette solution avec 70 litres d'acétate d'éthyle dans un extracteur "Westfalia", la totalité de l'activité antibactérielle passant dans la phase organique.
On lave alors l'extrait à l'eau, con- centre sous vide à 5 litres et extrait ensuite à plusieurs reprises avec de l'acide acétique demi-normal, puis avec une solution binormale d'hydroxyde de sodium. Finalement, on sèche la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium et l'évapore sous vide, ce qui fait qu'on obtient un résidu huileux. Par traitement avec de l'éther de pétrole, on obtient l'antibiotique brut dénommé "échinomycine" sous forme de flocons jaunâtres.
Les extraits sus-mentionnés, obtenus avec la so- lution d'hydroxyde de sodium, possèdent une faible activité antibiotique. On les amène à un pH de 3 et les extrait à l'acétate d'éthyle. On lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide. Le résidu jaune amorphe est anti- biotiquement actif.
Exemple 4 -----------
On soumet 5,7 g de l'antibiotique brut dénommé "échinomycine", obtenu suivant l'exemple 3, à une répartition à contre-courant comportant 82 stades, en utilisant le mélange de solvants suivant : 2,63 parties en volume de tétrachlorure
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de carbone, 0,37 partie en volume de chloroforme, 2,4 parties en volume de méthanol et 0,6 partie en volume d'eau. Après avoir évaporé sous vide à 30 le contenu des divers récipients de répartition, on trouve au stade 35 la majeure partie de la substance et de l'activité. On réunit les fractions 30 à 40 et obtient 1,20 g d'échinomycine qui, par chromatographie sur papier, s'avère unitaire.
On la recristallise dans le méthanol et elle forme une poudre microcristalline incolore fondant à 217-218 et présentant un pouvoir rotatoire spéci- tique [a]D= -3100 (dans le chloroforme). Analyse :C 55,79%p H 5,74%, N 15,20%, S 5,24%, (N)CH3 5,20%, (C)CH3 2,63%, H act.
0,68%. Spectre d'absorption ultra-violet,àans l'alcool absolus On observe des bandes à 242 m (log E l cm = 2,76) et à 322 m (log E a1 cm = 2,02); spectre d'absorption infra-rouge dans le nujol; on observe des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes: 5,74 , 6,00 , 6,81 , 7,06 , 7,22 , 7,85 - 8,00 (bande très large) 8,75 , 9,06 , 12,79 et 13,16 .
Exemple 5- On chromatographie 5 g de l'antibiotique brut dénommé "échinomycine" qui est obtenu suivant l'exemple 3, sur une colonne.de 150 g d'oxyde d'aluminium (activité III), en éluant avec du benzène, du chloroforme, des mélanges de chloroforme et de méthanol et avec du méthanol. On évapore
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sous vide les diverses fractions (de 400 cm3 chacune) et les examine quant à leur activité antibiotique. Les fractions benzéniques et chloroformiques renferment seulement des subs- tances accompagnatrices inactives, tandis que les fractions éluées avec des mélanges de chloroforme et de méthanol (99:1) sont hautement actives.
On les réunit et les cristallise dans le méthanol. On obtient 900 mg d' "échinomycine" d'un point de fusion de 217-218 et d'un pouvoir rotatoire spéci- fique [a]D = - 3100 (dans le chloroforme).
L'échinomycine peut, par exemple) être utilisée sous la forme des préparations pharmaceutiques suivantes destinées à une application topique: a) solution à 1%o dans un mélange d'eau et de N-méthylpyrrolidone (80:20 parties en volume) b) solution à 1%o dans l'huile de ricin c) solution à 0,1%o dans l'huile d'arachide.
Exemple 6 ------------
On chauffe pendant 16 heures à 100 ,dans un tube scellé, une solution de 20 mg d'échinomycine dans 5 cm' d'acide chlorhydrique à 20%, puis l'évapore à sec sous vide, à 35 . On examine le résidu par chromatographie sur papier et, à côté d'autres substances positives à la ninhydrine. on peut déceler de la serine et de l'alanine.
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Exemple 7
A une solution de 250 mg d'échinomycine dans 20 cm3 d'éthanol, on ajoute une solution de 1 g d'hydroxyde de potassium dans 30 cm3 d'éthanol et laisse le mélange reposéx pendant 14 heures à 200. On ajoute alors de l'eau et extrait la solution à plusieurs reprises avec de l'acétate d'éthyle.
On lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore, ce qui fait qu'on obtient 3 mg de la matière de départ. On acidi- fie la phase alcaline aqueuse par addition d'acide chlorhydrique dilué et l'extrait à nouveau avec de l'acétate d'éthyle. Après les avoir lavés et les avoir séchés, on évapore les extraits sous vide. On obtient 200 mg d'acide échinomycique incolore.
Spectre d'absorption ultra-violet: on observe des bandes à 242 m (log E 1 cm = 2,83) et à 322 m (log E 1 cm = 2,11),
Comme décrit dans l'exemple 6, on hydrolyse 20 mg d'acide échinomycique avec 5 em3 d'acide chlorhydrique à 20%. pans l'hydrolysat on peut, lors d'un examen chromatographique sur papier, à coté d'autres substances positives à la ninhydrine, déceler de l'alanine.
Exemple 8 -----------
On chauffe pendant 20 heures à 100 , dans un tube scelle, 500 mg d'échinomycine dans un mélange de 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et de 5 cm3 d'eau. On dilue à l'eau la solution réactionnelle colorée en vert-noir et y ajoute un
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peu de charbon actif. Après filtration, on évapore la solution tous vide à 40 , ce qui fait qu'on obtient un résidu brun.
On reprend à nouveau ce dernier dans 15 cm3 d'eau. On ajoute à cette solution d'abord 500 mg de bicarbonate de sodium, et ensuite une solution de 500 mg de 2,4-dinitro-fluorobenzène dans 30 cm3 d'alcool. Après avoir laissé reposer deux heures à la température ambiante, on concentre la solution sous vide au quart de son volume, puis l'extrait à l'éther. On acidifie ensuite la phase aqueuse résultante et l'extrait à nouveau à l'éther. A partir des extraits on obtient, après lavage, séchage et évaporation, une huile visqueuse qui, d'après un examen chromatographique sur papier, renferme les dérivés 2,4-dinitriohényliques de la sérine et de l'alanine. On peut la scinder en ses composants par une chromatographie de répar- tition.
Dans ce but, on prépare une colonne de 40 g d'acide silicique qu'on malaxe avec 16 g d'eau et qu'on met ensuite en suspension avec du chloroforme. On verse ensuite l'huile, en solution dans peu de chloroforme, sur la colonne et élue ensuite d'abord avec un mélange de chloroforme et de butanol (99:1) et ensuite avec un mélange analogue dans le rapport 19:1, ce qui fait que la 2,4-dinitrophényl-alanine et la 2,4-dinitrophényl-sérine sont extraites par dissolution. Cette dernière cristallise, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole, gous la forme d'aiguilles jaunes d'un point de fusion de 175-176,5 et d'un pouvoir rotatoire spécifique [a]D 18 - + 19
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(c = 1,09 dans l'acétone). Il s'agit donc de la 2,4-dinitro- phényl-D-sérine.
La fraction renfermant la 2,4-dinitrophényl- alanine est purifiée à nouveau par une répartition à contre- courant entre de l'éther et un tampon de Mac Ilvaine (pH 4,9).
Tors d'une répartition en 62 stades, le maximum de la substance se trouve au stade 26. On réunit les stades 20 à 32 et les extrait à l'éther. Après lavage, séchage et évapora lion des extraits, on obtient un résidu qui cristallise dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole. Point de fusion 173-176 , [a]D 18 = - 15,5 (c = 1,07 dans l'acétone). Il séagit donc de la 2,4-dinitrophényl-L-alanien.
Exemple 9
Dans un récipient de distillation, on chauffe lentement 2 g d'échinomycin avec une solution de 4 g d'hur de sodium dans 35 cm3 d'eau, puis on chauffe à l'ébullition en ajoutant, lorsque 30 cm3 environ de distillat ont été éliminés par évaporation, à nouveau 30 cm3 d'eau dans le réai- pient et en éliminant à nouveau cette quantité par distillation.
On recueille le distillat dans 50 cm3 d'acide chlorhydrique décinormal.-Les fractions volatiles qui passent renferment 1,2 mol d'ammoniac, ce qu'on peut déterminer en titrant le contenu de l'allonge et en isolant le chlorure d'ammonium.
.-On reprend dans 30 cm3 d'eau le résidu alcalin de distillation, l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique et l'extrait à quatre reprises avec de l'acétate d'éthyle. On lave
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les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide.
Par cristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient, à partir du résidu d'extraction, 410 mg d'acide quinoxaline-/ carboxylique-(2) sous forme cristalline. Pour le purifier davantage, on le sublime sous un vide poussé. Point de fusion 212-2130, équivalent-poids 181, analyse :C 62,07%, H 3,47%, N 16,09%.
L'ester méthylique formé en faisant agir du diazométhane sur l'acide quinoxaline-carboxylique-(2) fond à 110-110,50. Analyse : C 64,15%, H 4,10%, N 14,88%, OCH3 16,76%.
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The present invention relates to a novel antibiotic which ,. in what follows, will be designated by the name "echinomycin", its derivatives and cleavage products, as well as the pharmaceutical preparations containing these compounds. The invention also relates to a process for the preparation of such substances and mixtures of substances.
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The antibiotic called "echinomycin" is formed during the culture of a new strain of actionomyctes of the Streptomyces family, which is not identical to any of the strains indicated in Bergey's work entitled "Manual of Determinative Bacteriology" , 6th edition, or in the work by Waksman and Lechevalier entitled "Actinomycetes and their
Antibiotics "(1953); this new strain will be described below under the name of" Streptomyces echinatus nov.sp. "It was isolated from a test portion made in the soil of Angola and is kept in the Laboratories of
Applicant and to the Swiss Federal Institute of Technology (Zurich,
Switzerland), Institute of Special Botany, under the designation
A 8331.
Streptomyces echinatus forms an ash-gray aerial mycelium. It carries chains of conidia which are a typical feature of the Streptomyces family. The pores are elliptical to oval. Their surface is covered with long, thin thorns, and their size reaches 0.9 x 0.6
0.7. Growth is relatively little temperature dependent, and the fungus thrives at 18 as well as at 40; however the optimum growth is between 25 and 32
To give other characteristics, we will describe in what follows the growth of Streptomyces echlratus on different nutrient media. Nutrient media 1 to 8, as well as 12, were prepared according to W. Lindenbein,
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"Arch. Mikrobiol." 17, 361 (1952).
1) Synthetic Agar Growth slender, hazy, yellow-greenish or lime-yellow to leek-green velvety aerial mycelium, snow-white after 4 days, lemon-yellow after 7 days, yellow-greenish to meadow-green pigment after 14
EMI3.1
'..' 1¯ ¯ = "1 '. Days.
2) Liquid synthetic medium Sparse growth, slightly sleazy.
3) Glucose broth Floating growth, punctiform, light brown, no pigment.
4) Agar-glucose rough vegetative mycelium, egg yolk; aerial mycelium velvety, snow-white in the center, yellow-brownish at the edge - after 4 days, woolly white-gray to ash-gray after
7 days; dark yellow to golden yellow pigment.
5) Asparagine Glucose Agar: thin, smooth vegetative mycelium, golden yellow to greenish yellow, also greenish-gray after
7 days; velvety aerial mycelium, ash-gray to reddish-purple from the top vera the baa in
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the test tube, gray-white at the end of
4 days, ash-gray after 7 days over the entire length of the agar; no noticeable pigment.
6) Calcium malate agar: growth slender, hazy, pale yellow after 4 days, greenish-yellow after 7 days, powdery white-milky to pale yellow aerial mycelium with no pigment.
7) Agar medium (gelatin) at 18 C: superficial growth, slender, dark brown; aerial mycelium velvety, greenish-gray after 14 days; pigment dark brown; no liquefaction after 31 days.
8) Starch agar: pustular growth, dark yellow, velvety aerial mycelium, ash-gray, no hydrolysis or at most traces after 5 days.
9) Nutrient agar: punctiform growth, light yellow, no aerial mycelium; no pigment.
10) Potato:. lichenous vegetative mycelium, greenish-black to raven-black; sparse aerial mycelium, powdery gray-white after 4 days, blue-gray after 7 days; bunâere substratum
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pitch black.
EMI5.1
11) Carrot bzz growth, gr8le - light yellow; aerial mycelium powdery gray-white after 4 days, gray-greenish after 7 days; no diffusing pigment.
12) Sunflower milk: annular growth and seed coat; - powdery aerial mycelium, gray-white to ash-gray; coagulation and -peptonization after * -5, complete after 12 days.
Streptomyces echinatus grows as follows, according to the method of T.G. Pridham and D. Gottlieb, "J. Bacteriology" 56,107 (1948). when using various carbon sources:
EMI5.2
<tb> L-xylose <SEP> + <SEP> inulin <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D-fructose <SEP> dulcite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> D-galactose <SEP> + <SEP> mesoinosite
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> sucrose <SEP> - <SEP> - <SEP> salicin <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> maltose <SEP> + <SEP> sodium <SEP> acetate <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> lactose <SEP> + <SEP> sodium <SEP> citrate <SEP>
<tb>
EMI5.3
raffinose + sodium succinate
The signs have the following meaning: +:
good growth, certain use of
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mentioned carbon source, (+): weak growth, doubtful use of the mentioned carbon source, (-): very weak growth, improbable use of the mentioned carbon source, -: no growth, no use of the carbon source mentioned.
Streptomyces echinatus shows some analogies with Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman and Henrici and with Streptomyces flaveolus (Waksman) Waksman and Henrici, both of which also have ash-gray aerial mycelium and spores with appendages. In the case of Streptomyces flaveolus, however, according to T.R. Vetnon [Nature 176, 935 (1955)] these appendages consist of filaments which can reach up to 1 in length. Furthermore, Streptomyces griseoflavus has spores on the spores of a maximum length of 0.2, that is to say notably shorter than in the case of Streptomyces echinatus.
In addition, Streptomyces griseoflavus does not form a yellow pigment and provides complete gelatin liquefaction, as well as moderate starch hydrolysis.
The present invention is not limited, as regards the preparation of the antibiotic called "chinomycin" to the use of Streptomyces echinatus or other strains corresponding to the description, but it also relates to
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the use of varieties of these organisms, as obtained, for example, by selection or mutation, in particular under the influence of ultraviolet radiation or X-rays, or under the action of nitrogen mustard.
To obtain the antibiotic called "echinomycin" p, a strain of Streptomycetes exhibiting the properties of Streptomyces echinatus is aerobically cultured, for example in an aqueous nutrient solution containing inorganic salts, nitrogenous compounds and, where appropriate, hydrates of carbon, until this solution exhibits a notable antibacterial action, then the antibiotic called “echinomycin” is isolated.
The nutrient solution contains, as inorganic salts, for example chlorides, nitrates, carbonates, sulphates of alkali or alkaline earth metals, of magnesium, of iron, of zinc, of manganese. As nitrogen compounds and where appropriate carbohydrates and growth-promoting substances which can be added, there may be mentioned, for example -.
amino acids and mixtures thereof, peptides and proteins, as well as their hydrolysates, such as peptones or tryptones, meat extracts, water-soluble fractions of cereal seeds such as corn and wheat, residues of distillation from the preparation of alcohol, yeasts, beans, especially soybeans, seeds, for example cotton, as well as glucose, sucrose, lactose, amiden, etc.
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The culture takes place aerobically, that is to say, for example in surface culture at rest or, preferably, in an immersed manner with shaking or agitation with air or oxygen in the shaken flasks or in known fermenters.
As temperature proves suitable a temperature between 18 and 40. By operating in this way, the nutrient solution exhibits a noticeable antibacterial effect, generally after one and a half to five days.
The following methods can be used, for example, to isolate the antibiotic. The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the major part of the antibiotic is found in said filtrate. However, significant amounts of antibiotic remain which are adsorbed to the mycelium. It is therefore advantageous to properly extract the latter by washing. To this end, organic solvents which are at least partially soluble in water, such as alcohols, such as for example methanol, ethanol and butanols, or ketones, such as for example acetone and methyl ethyl ketone. These mycelium extracts are added to the culture filter either directly or after prior concentration.
The mixture is advantageously extracted using an organic solvent immiscible with water, for example with esters of lower fatty acids, for example with ethyl acetate or amyl acetate. , with hydrocarbons, for example with benzene, with chlorinated hydrocarbons, for
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example with ethylene chloride, methulene chloride or chloroform, with ketones, for example with methylpropyl ketone, methyl amyl ketone or dilsobutyl ketone, with alcohols, such as butyl alcohols or amyl alcohols, with ethers, for example with ethyl ether, diisopropyl ether,
with dibutyl ethers or glycol ether and the like. Instead of the ex-% action of the cultures using a solvent, or in combination with such an extraction, as an additional purification operation, one can also obtain 1 antibiotic by adsorption, for example with activated carbon. or with activated earths, such as fuller's earth or floridin, and by subsequent extraction of the adsorbate, for example using an organic solvent at least partially soluble in water, such as acetone, butanol or methyl ethyl ketone.
Cultures can also be extracted directly as indicated, without prior separation of the mycelium.
Further enrichment can also be obtained by re-extracting the organic extracts containing the antibiotic, first with an aqueous acidic solution of pH less than 5, and then extracting with an aqueous alkaline solution, at pH. greater than 8, most of the antibiotic activity remaining in the organic phase, from which echinomycin is isolated. Lesser amount of activity is found in aqueous alkaline extracts from?
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which can be obtained by extraction with the organic solvents indicated above, at a pH below 5, an organic acid active as an antibiotic.
Suitable aqueous acidic solutions are dilute acids such as acetic, hydrochloric or single tallow acids, or buffer solutions, such as buffers based on citrates or phosphates, and as aqueous alkaline solutions dilute alkalis such as hydroxide solutions. sodium or potassium hydroxide, or buffer solutions such as phosphate buffers and the like.
Partitioning between an aqueous alcoholic solution and a water-immiscible solvent is a good purification process for the new antibiotic. The distribution takes place preferably by the countercurrent process in suitable apparatus. Chromatography is also very well suited for purification. Obtaining the pure antibiotic in crystalline form takes place, for example, in organic solvents such as acetone, methanol, ethanol, chloroform, mixtures of acetone and methanol, mixtures of acetone and d ether or mixtures of acetone and petroleum ether. For recrystallization, the same solvents are used or also aqueous organic solutions, for example dilute alcohols, dilute acetone, etc.
The antibiotic is obtained in the form of a colorless microcrystalline seam, melting at 217 - 218, and
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EMI11.1
possessing a specific optical rotation [Q] D = - µ10.
Elemental analysis provides the following values g C = 55.79%, H = 5.74%, N = 15.20%, S = 5.24%, (N) CH3 = r ,, 2n, tc, ' , (C) CH3 = 2.63%. These values lead to the formula C29H37O7N7S, according to which the substance does not contain 0-methyl groups, but two N-methyl groups and two C-methyl groups. Its ultra-violet absorption spectrum
EMI11.2
shows two bands at 242 ma (log E = S.76) and a322 mi 1 cm (log E 1% = 2.02). In the infrared spectrum, we can
1 cm observe bands, among others, at wavelengths
EMI11.3
following ô, J1 1 ü 12a8 9 'U "8 6.8l' 8 Y 9" "" IW8 8 "'^ 1> 7 85 - 8.00 (very wide band). 8.75 9, 9.06, iz, 78 y and 13.16 Ma Echinontyoine does not have basic properties and no easily acylable hydroxyl groups.
During the acid hydrolysis of echinomycin, it is
EMI11.4
forms the amino acids called D-serine and L-alan1n9 as well as other cleavage products which provide a positive color reaction with ninhydrin. On the other hand, when mild treatment of echinomyeinee with alkali, it forms
EMI11.5
an acidic hydrolysis product, dchinomic acid. Its ultra-violet absorption spectrum shows two bzz bands, 242 m (log Ê.1% '"' '. - 2.83) and 322 Ru Qg a = 2.11).
1 cm 1 cm acid hydrolysis of this acid, it forms, among other things, alanine, but not serine.
When boiled with a concentrated solution of sodium hydroxide, echinomyein
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provides about 1.2 mol of ammonia, while from the alkaline reaction mixture one can, after acidification and extraction with ethyl acetate, isolate the quinoxaline acid-
EMI12.1
carboxylic- (2). According to these researches, Aech1no-rnyin is apparently a compound of the structure in which, alongside L-alanlne, D-sevîne, quinosalin-2-carboxylic acid and armoniso vr &! Cb18bleont linked under amldic forum, there is still a trimmed residue of formula C141 O, N: aS.
The antiblotigue d6nor: éehinonycin has a very strong antibiotic activity vie-a-v1 # of. (3ives's organ1ames- testa. 31 dilution series (by power of 10) are used as n-6thoda-tGote in Vitro. in glucose broth incubated by 37 laying 24 hours, we have the following concentrations which are still inhibiting
EMI12.2
0rganisixes-tests Concentration - .. "I inhibiting jUg / CRr 'Hicrococcus pyogenes var.aureus 0.1 micrococcuB pyogenes, var.8.ureua penlcllllno-resistant 0.1
EMI12.3
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0.1
<tb>
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb>
EMI12.4
Corynebacterium dlphtherlae 0,
1
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<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb>
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> -10
<tb>
<tb>
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb>
EMI12.6
Yecobacterium tuberculoals -! -) 100 Entamoeba hlatolytica ++) 1000
EMI12.7
<tb> Trichomonas <SEP> fetus <SEP> +++) <SEP> <4
<tb>
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+) cultured in Kirchner's synthetic medium with 5% bovine albumin, examination of growth after two weeks.
++) culture in a medium of Bacto-Entamoebai examination of 18 amebicidal effect after 24 hours.
+++) cultivated in 37 broth containing 10% horse serum - examination after 4 days.
The development of the Influenzà virus on membranes isolated from chorioallantois chicken from eggs having 14 days of incubation is further inhibited at a concentration of less than 1 g / cm3, whereas the chorioallantois tissue itself is not is not toxic damaged by 100 g / cm3.
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The antibiotic called echinomycin is also active in vivo. Five subcutaneous injections of 5 mg / kg carried out on mice infected with Streptococcus make it possible to delay the exit by two days. In mice, with subcutaneous applications of 1 mg / kg, an effect is obtained which completely suppresses Borrelia recurrens infections.
In addition, peroral administration of 5 mg / kg in the case of rats infected with amoebae has a 100% effect.
Local treatment of vaginally infected hamsters with fetal Trichomonas shows a good curative effect with a 1% echinomyony solution.
Apart from the process for preparing the antibiotic called echinomycien. A subject of the present invention is also the compound mentioned itself, as well as its transformation products obtained by hydrogenation or oxidation, as well as the cleavage products such as are obtained for example by hydrolysis of the antibiotic called echinomycin.
The antibiotic called echinomycin, the transformation and cleavage products included above, or corresponding mixtures can be used as medicaments,
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for example in the form of pharmaceutical preparations containing the compounds indicated in admixture with a pharmaceutical excipient, organic or inorganic, suitable for enteral, parenteral or local application.
As excipients are taken into account the substances did not react on the new compounds, for example gelatin, lactose, starch, magnesium stearate ;, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums polyalkylene glycols, petroleum jelly, cholesterin or other known excipients, Pharmaceutical preparations can be presented, for example in the form of tablets, dragees, powders, ointments, creams, suppositories or in liquid form to the state of solutions, suspensions or emulsions.
Where appropriate, they are sterilized and / or contain auxiliary substances, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers. They may also contain other therapeutically valuable substances.
The invention is described in more detail in the non-limiting examples which follow. In these examples, temperatures are given in degrees centigrade.
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Example 1 -----------
A nutrient solution of the following composition is prepared: 20 g of soybean flour, 20 g of mannite and one liter of tap water, then adjusted to a pH of 7.8. This solution or a multiple of the latter is transferred to conical flasks with a volume of 500 cm3 (each filled with 100 cm3 of nutrient solution) or into 500 liter fermenters (each filled with 300 liters of solution. nutrient), then sterilize for 20 to 30 minutes under a pressure of 1 atmosphere.
It is then inoculated with up to 10% of a vegetative, partially sporulating culture of Streptomyces eahinatus and incubated, while shaking well or stirring, in the fermenters, at 27, passing air (about one volume sterile air per volume of nutrient solution per minute). After 70 to 120 hours of growth, the cultures are filtered, adding a filter aid, depending on the volume either through a filter funnel or through a filter press or a rotary filter, and thus frees mycelium and other solid components the antibiotically active aqueous solution.
Example 2
If, instead of the medium indicated in Example 1, the nutrient solutions a, b, c or d described below are used, one obtains after having, in a similar manner,
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sterilized, inoculated with Streptomyces echinatus, incubated at 27, and filtered, aqueous solutions active as antibiotics. a) 10 g of raw glucose, 5 g of peptone, 3 g of meat extract (Oxo Lab Lemco), 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH before sterilization: 7.5. b) 10 g of crude glucose, 10 g of the product known commercially under the name of "Distillera soluble", 1 g of sodium nitrate, 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water;
pH before sterilizations 7.5 c) 10 g of raw glucose, 20 cm3 of corn swelling water (corn steep liquor), 2 g of secondary potassium hydrophosphate and 1 liter of tap water; pH before sterilization 7.5. d) 20 g of glycerin, 10 g of soy flour, 5 g of sodium chloride, 1 g of sodium nitrate, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH before sterilization; 7.5.
Example 3 --------------
With 25 liters of acetone, the filtration residue of a 150 liter charge obtained according to example or 2 is stirred, then filtered again. This operation is repeated twice, after which the acetomene solutions containing
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antibiotic, concentrate them in vacuo to 5 liters and combine them with the culture filtrate. This solution is then extracted with 70 liters of ethyl acetate in a "Westfalia" extractor, all of the antibacterial activity passing into the organic phase.
The extract is then washed with water, concentrated under vacuum to 5 liters and then extracted several times with semi-normal acetic acid, then with a binormal solution of sodium hydroxide. Finally, the ethyl acetate solution is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo, giving an oily residue. By treatment with petroleum ether, the crude antibiotic called "echinomycin" is obtained in the form of yellowish flakes.
The above-mentioned extracts, obtained with the sodium hydroxide solution, have a weak antibiotic activity. They are brought to a pH of 3 and extracted with ethyl acetate. The extracts are washed with water, dried and evaporated in vacuo. The amorphous yellow residue is anti-biotically active.
Example 4 -----------
5.7 g of the crude antibiotic called "echinomycin", obtained according to Example 3, are subjected to a countercurrent distribution comprising 82 stages, using the following mixture of solvents: 2.63 parts by volume of tetrachloride
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of carbon, 0.37 part by volume of chloroform, 2.4 parts by volume of methanol and 0.6 part by volume of water. After evaporating in vacuo to the contents of the various distribution vessels, most of the substance and activity is found at stage 35. Fractions 30 to 40 are combined and 1.20 g of echinomycin is obtained which, by chromatography on paper, turns out to be unitary.
It is recrystallized from methanol and forms a colorless microcrystalline powder, melting at 217-218 and exhibiting a specific optical rotation [a] D = -3100 (in chloroform). Analysis: C 55.79% w H 5.74%, N 15.20%, S 5.24%, (N) CH3 5.20%, (C) CH3 2.63%, H act.
0.68%. Ultraviolet absorption spectrum, without absolute alcohol. Bands are observed at 242 m (log E 1 cm = 2.76) and at 322 m (log E a1 cm = 2.02); infrared absorption spectrum in nujol; bands are observed, among others, at the following wavelengths: 5.74, 6.00, 6.81, 7.06, 7.22, 7.85 - 8.00 (very wide band) 8.75 , 9.06, 12.79 and 13.16.
Example 5 - 5 g of the crude antibiotic called "echinomycin" which is obtained according to Example 3 are chromatographed on a 150 g column of aluminum oxide (activity III), eluting with benzene, chloroform, mixtures of chloroform and methanol and with methanol. We evaporate
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vacuum the various fractions (400 cm3 each) and examine them for their antibiotic activity. The benzene and chloroform fractions contain only inactive accompanying substances, while the fractions eluted with mixtures of chloroform and methanol (99: 1) are highly active.
They are combined and crystallized from methanol. 900 mg of "echinomycin" with a melting point of 217-218 and a specific optical rotation [a] D = - 3100 (in chloroform) are obtained.
Echinomycin can, for example) be used in the form of the following pharmaceutical preparations intended for topical application: a) 1% solution o in a mixture of water and N-methylpyrrolidone (80:20 parts by volume) b ) 1% o solution in castor oil c) 0.1% o solution in peanut oil.
Example 6 ------------
A solution of 20 mg of echinomycin in 5 cm 3 of 20% hydrochloric acid is heated for 16 hours at 100, in a sealed tube, then evaporated to dryness in vacuo, at 35. The residue is examined by paper chromatography and alongside other ninhydrin positive substances. serine and alanine can be detected.
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Example 7
To a solution of 250 mg of echinomycin in 20 cm3 of ethanol, a solution of 1 g of potassium hydroxide in 30 cm3 of ethanol is added and the mixture is left to stand for 14 hours at 200. One then adds l water and extract the solution several times with ethyl acetate.
The extracts were washed with water, dried and evaporated to give 3 mg of the starting material. The aqueous alkaline phase is acidified by the addition of dilute hydrochloric acid and extracted again with ethyl acetate. After having washed and dried them, the extracts are evaporated in vacuo. 200 mg of colorless echinomycic acid are obtained.
Ultraviolet absorption spectrum: bands are observed at 242 m (log E 1 cm = 2.83) and at 322 m (log E 1 cm = 2.11),
As described in Example 6, 20 mg of echinomycic acid is hydrolyzed with 5 em3 of 20% hydrochloric acid. In addition to the hydrolyzate, alanine can be detected in addition to other ninhydrin positive substances during a chromatographic examination on paper.
Example 8 -----------
Was heated for 20 hours at 100, in a sealed tube, 500 mg of echinomycin in a mixture of 5 cm3 of concentrated hydrochloric acid and 5 cm3 of water. The reaction solution colored green-black is diluted with water and a
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little activated carbon. After filtration, the solution is evaporated all vacuum to 40, which gives a brown residue.
The latter is taken up again in 15 cm3 of water. To this solution is first added 500 mg of sodium bicarbonate, and then a solution of 500 mg of 2,4-dinitro-fluorobenzene in 30 cm3 of alcohol. After leaving to stand for two hours at room temperature, the solution is concentrated in vacuo to a quarter of its volume, then extracted with ether. The resulting aqueous phase is then acidified and extracted again with ether. From the extracts, after washing, drying and evaporation, a viscous oil is obtained which, according to chromatographic examination on paper, contains the 2,4-dinitrihenyl derivatives of serine and alanine. It can be broken down into its components by partition chromatography.
For this purpose, a column of 40 g of silicic acid is prepared which is kneaded with 16 g of water and which is then suspended with chloroform. The oil, dissolved in a little chloroform, is then poured onto the column and then eluted first with a mixture of chloroform and butanol (99: 1) and then with a similar mixture in the ratio 19: 1, this which causes 2,4-dinitrophenyl-alanine and 2,4-dinitrophenyl-serine to be dissolved out. The latter crystallizes, in a mixture of ether and petroleum ether, in the form of yellow needles with a melting point of 175-176.5 and a specific optical rotation [a] D 18 - + 19
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(c = 1.09 in acetone). It is therefore 2,4-dinitro-phenyl-D-serine.
The fraction containing 2,4-dinitrophenyl-alanine is purified again by countercurrent partitioning between ether and MacIlvaine's buffer (pH 4.9).
During a distribution in 62 stages, the maximum of the substance is at stage 26. Stages 20 to 32 are combined and extracted with ether. After washing, drying and evaporating the extracts, a residue is obtained which crystallizes from a mixture of ether and petroleum ether. Melting point 173-176, [a] D 18 = - 15.5 (c = 1.07 in acetone). It is therefore 2,4-dinitrophenyl-L-alanien.
Example 9
In a distillation vessel, 2 g of echinomycin are slowly heated with a solution of 4 g of sodium hur in 35 cm3 of water, then heated to the boil while adding, when about 30 cm3 of distillate have been removed by evaporation, again 30 cm3 of water in the vessel and again removing this amount by distillation.
The distillate is collected in 50 cm3 of decinormal hydrochloric acid.-The volatile fractions which pass contain 1.2 mol of ammonia, which can be determined by titrating the content of the length and isolating the ammonium chloride .
.- The alkaline distillation residue is taken up in 30 cm3 of water, acidified with hydrochloric acid and extracted four times with ethyl acetate. We wash
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the extracts in water, dried and evaporated in vacuo.
By crystallization from ethyl acetate, 410 mg of quinoxaline- / carboxylic- acid (2) are obtained from the extraction residue in crystalline form. To further purify it, it is sublimated under a high vacuum. Melting point 212-2130, 181 weight equivalent, Analysis: C 62.07%, H 3.47%, N 16.09%.
The methyl ester formed by allowing diazomethane to act on quinoxaline-carboxylic acid- (2) melts at 110-110.50. Analysis: C 64.15%, H 4.10%, N 14.88%, OCH3 16.76%.