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Publication number: BE556196A
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Description


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   La présente invention concerne un nouvel   antibio-   tique qui,. dans ce qui va suivre, sera désigné par la dénomi- nation "échinomycine", ses dérivés et produits de scission, ainsi que les préparations pharmaceutiques renfermant ces composés. L'invention.concerne aussi un procédé de préparation de ces substances et.mélanges de substances. 

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   L'antibiotique dénommé "échinomycine" se forme lors de la culture d'une nouvelle souche d'actionomyctes de la famille des Streptomyces, qui n'est identique à aucune des souches indiquées dans l'ouvrage de Bergey intitulé "Manual of Determinative   Bacteriology",   6ème édition, ou dans l'ouvrage de Waksman et Lechevalier intitulé "Actinomycetes and their 
Antibiotics" (1953); cette nouvelle souche sera décrite ci- après sous le   nom de   "Streptomyces echinatus   nov.sp."   Elle a été isolée à partir d'une prise d'essai faite dans le sol de   l'Angola   et elle est conservée dans les Laboratoires de la 
Demanderesse et à l'Ecole Polytechnique Fédérale (Zurich, 
Suisse), Institut de botanique spéciale, sous la désignation 
A 8331. 



   Le Streptomyces echinatus forme un mycélium aérien gris-cendre. Il porte des chaînes de conidies qui sont une caractéristique typique de la famille des Streptomyces. Les ,pores sont elliptiques à ovales. Leur surface est couverte de longues et minces épines, et leur taille atteint   0,9   x   0,6   
0,7  . La croissance dépend relativement peu de la température et le champignon se développe aussi bien à 18  qu'à 40 ; toutefois la croissance optimum se situe entre 25 et 32  
Pour.donner d'autres caractéristiques, on décrira dans ce qui va suivre la croissance du Streptomyces echlratus sur différents milieux nutritifs. Les milieux nutritifs 1 à 8, ainsi que 12, ont été préparés suivant W. Lindenbein, 

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 "Arch. Mikrobiol." 17, 361 (1952). 



  1) Gélose synthétique Croissance grêle, voilée, jaune- verdâtre ou jaune-citron à vert-poireau mycélium aérien velouté, blanc comme neige au bout de 4 jours, jaune-citron au bout de 7 jours, pigment jaune- verdâtre à   vert-pré   au bout de 14 
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 ' ..'1¯ ¯="1' . jours. 



  2) Milieu synthétique liquide Croissance peu abondante, léger louche. 



  3) Bouillon   glucosé   Croissance flottante,   punctiforme,   brun-clair, pas de pigment. 



  4) Gélose-glucose mycélium végétatif rugueux, jaune d'oeuf; mycélium aérien velouté, blanc comme neige au centre, jaune-brunâtre au bord-au bout de 4 jours, laineux blanc-gris à gris-cendre au bout de 
7 jours; pigment jaune-foncé à jaune   d'or.   



  5) Gélose-glucose à l'asparagine : mycélium végétatif mince, lisse,   jaune.d'or   à jaune verdâtre,      également gris-verdâtre au bout de 
7 jours; mycélium aérien velouté, gris-cendre à violet-rougeâtre en allant du haut   vera   le baa dans 

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 l'éprouvette, gris-blanc au bout de 
4 jours, gris-cendre au bout de 7 jours sur toute la longueur du gélose; pas de pigment notable. 



  6) Gélose au malate de calcium :croissance grêle, voilée, jaune-pâle au bout de 4 jours, jaune- verdâtre au bout de 7 jours, mycélium aérien pulvérulent blanc-laiteux à      jaune-pâlepas do pigment. 



  7) Milieu gélosé (gélatine) à 18  C : croissance superficielle, grêle, brun-foncé; mycélium aérien velouté, gris-verdâtre au bout de   14   jours;pigment brun-foncé; pas de liquéfaction au bout de 31 jours. 



  8)   Gélose   à l'amidon : croissance pustuleuse, jaune-foncé, mycélium aérien velouté, gris-cendre, pas d'hydrolyse ou tout au plus des traces au bout de 5 jours. 



  9) Gélose nutritive : croissance   punctiforme,   jaune-clair, pas de mycélium aérien; pas de pigment. 



  10) Pomme de   terre: .   mycélium végétatif lichéneux, noir- verdâtre à noir-corbeau; mycélium aérien peu abondant, pulvérulent gris- blanc au bout de 4 jours, bleu-gris au bout de 7 jours; substratum bunâere 

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 à noir de brai. 
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 11) Carotte bzz croissance,gr8le--jaune-clair; mycélium aérien pulvérulente gris-blanc au bout      de 4 jours, gris-verdâtre au bout de   7   jours; pas de pigment diffusant. 



  12) Lait de tournesol : croissance annulaire et tégument; -mycélium aérien pulvérulent, gris- blanc à gris-cendre; coagulation et   -peptonisation   au bout   de*-5,   complètes au bout de 12 jours . 



   Le Streptomyces echinatus croît de la façon suivante, d'après la méthode de T.G.Pridham et D.Gottlieb, "J.Bacteriolo- gy" 56 107   (1948).   lorsqu'on utilise diverses sources de   carbone :    
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<tb> L-xylose <SEP> + <SEP> inuline <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> L-arabinose <SEP> + <SEP> D-mannite
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> L-rhamnose <SEP> + <SEP> D-sorbite
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> D-fructose <SEP> dulcite
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> D-galactose <SEP> + <SEP> mésoinosite
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> saccharose <SEP> - <SEP> - <SEP> salicine <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> maltose <SEP> + <SEP> acétate <SEP> de <SEP> sodium
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> lactose <SEP> + <SEP> citrate <SEP> de <SEP> sodium
<tb> 
 
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 raffinose + succinate de sodium 
Les signes ont la signification suivante : + :

   bonnes croissance, utilisation certaine de la 

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 source de carbone mentionnée, (+) : croissance faible, utilisation douteuse de la source de carbone mentionnée, (-) : croissance très faible, utilisation improbable de la source de carbone mentionnée, - : pas de croissance, pas d'utilisation de la source de carbone mentionnée. 



   Le Streptomyces echinatus présente certaines analogies avec le Streptomyces   griseoflavus     (Krainsky)   Waksman et Henrici et avec le Streptomyces flaveolus (Waksman) Waksman et Henrici, qui possèdent tous les deux également un mycélium aérien gris-cendre et des spores avec des appendices. Dans le cas du Streptomyces flaveolus, ces appendices sont constitués toutefois,d'après T.R. Vetnon [Nature 176, 935   (1955)]   par des filaments pouvant atteindre jusqu'à 1   de longueur. Par ailleurs, le Streptomyces griseoflavus possède sur les spores des épines d'une longueur maximum de 0,2   ,     c'est-à-dire   notablement plus courtes que dans le cas du Streptomyces echinatus.

   En outre, le Streptomyces griseoflavus ne forme pas de pigment jaune et fournit une liquéfaction totale de la gélatine, ainsi qu'une hydrolyse moyenne de l'amidon. 



   La présente invention n'est pas limitée, en ce qui concerne la préparation de l'antibiotique dénommé " chinomycine"   a   l'utilisation du Streptomyces echinatus ou d'autres souches correspondant à la description, mais elle concerne également 

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 l'utilisation de variétés de ces organismes, telles qu'on les obtient par exemple par sélection ou mutation, en particulier sous l'influence du rayonnement ultra-violet ou des rayons X, ou sous l'action de moutarde à l'azote. 



   Pour obtenir l'antibiotique dénommé "échinomycine" p on cultive de manière aérobie une souche de Streptomycètes présentant les propriétés du Streptomyces   echinatus,   par exemple dans une solution nutritive aqueuse renfermant des sels inorganiques, des composés azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone, jusqu'à ce que cette solution présente une action   antibactérielle   notable, puis on isole l'antibioti- que dénommé   "échinomycine".   



   La solution nutritive renferme comme sels   inorgani-   ques par exemple des chlorures, nitrates, carbonates, sulfates de métaux alcalins ou   alcalino-terreux,   de magnésium, de fer, de zinc,.de manganèse. Comme composés azotés et le cas échéant hydrates de carbone et substances favorisant la croissance qu'on peut ajouter, on citera par exemple -.

   des acides aminés et leurs mélanges, des peptides et des protéines, ainsi que leurs hydrolysats, comme les peptones ou tryptones, des extraite de   viande,   des fractions solubles dans l'eau de graines de céréales comme le maïs et le froment, de résidus de   distilla-   tion provenant de la préparation de l'alcool, de levures, de fèves, notamment de soja, de graines, par exemple de coton, ainsi que du glucose, du saccharose, du lactose,   de   l'amiden,etc 

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La culture a lieu de manière aérobie, c'est-à-dire par exemple en culture de surface au repos ou, de préférence, de manière immergée avec secouage ou agitation avec de l'air ou de l'oxygène dans les flacons agités ou dans les fermenteurs connus.

   Comme température s'avère appropriée une température comprise entre 18 et 40 . En opérant ainsi, la solution nutri- tive accuse un effet antibactériel notable en général au bout d'un jour et   demi à   cinq jours. 



   Pour isoler l'antibiotique, on peut par exemple se servir des procédés suivants On sépare le mycélium du filtrat de culture, après quoi on trouve dans ledit filtrat la majeure partie de l'antibiotique. Il reste toutefois des quantités notables d'antibiotique qui sont adsorbées sur le mycélium. Il est en conséquence avantageux de bien extraire ce dernier par lavage. A cet effet, sont appropriés notamment des solvants or- ganiques au moins partiellement solubles dans l'eau, tels que des alcools, comme par exemple le méthanol, l'éthanol et les butanols, ou des cétones, comme par exemple l'acétone et la méthyléthylcétone. Ces extraits de mycélium sont ajoutés au fil- trat de culture soit directement, soit après une concentration préalable.

   On extrait avantageusement le mélange à l'aide d'un solvant organique non miscible à l'eau, par exemple avec des esters d'acides gras inférieurs, par exemple avec de l'acétate d'éthyle ou de l'acétate d'amyle, avec des hydrocarbures, par exemple avec du benzène, avec des hydrocarbures chlorés, par 

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 exemple avec du chlorure   d'éthylene,   du chlorure de méthulène ou du chloroforme, avec des   cétones,   par exemple avec de la   méthylpropylcétone,   de la   méthylamylcétone   ou de la dilsobutyl- cétone, avec des alcools, comme les alcools butyliques ou les alcools amyliques, avec des éthers, par exemple avec l'éther éthylique, l'éther   diisopropylique,

     avec des éthers   dibutyli=   ques ou des éther du glycol et analogues. A la place de l'ex-   % action   des cultures à l'aide d'un solvant,ou en combinaison avec une telles extraction, comme opération de purification complémentaire, on peut aussi obtenir 1 antibiotique par adsorption, par exemple à du charbon actif ou à des terres activées, comme la terre à foulon ou la floridine, et par extraction subséquente de l'adsorbat, par exemple a l'aide d'un solvant organique au moins partiellement soluble dans l'eau, comme   l'acétone,   le butanol ou la méthyléthylcétone. 



   On peut aussi extraire les cultures directement de le manière indiquée, sans séparation préalable du mycélium. 



   On peut également obtenir un autre enrichissement en extrayant à nouveau les extraits organiques renfermant l'anti- biotique, d'abord avec une solution acide aqueuse d'un pH      inférieur à 5, et ensuite en extrayant avec une solution alcaline aqueuse, à un pH supérieur à 8, la majeure partie de l'activité antibiotique restant dans la phase organique, de laquelle   l'échinomycine   est isolée. Une quantité moindre d'activité se trouve dans les extraits alcalins aqueux à parti? 

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 desquels on peut obtenir, par extraction avec les solvants organiques indiqués ci-dessus, à un pH inférieur à 5, un acid organique actif comme antibiotique.

   Comme   solutions   aqueuses acides sont appropriés des acides   dilues   comme les acides acétique, chlorhydrique ou   suif unique,   ou des solutions- tampons, comme les tampons à base de citrates ou de phosphates, et comme solutions alcalines aqueuses des alcalis dilués comme des solutions d'hydroxyde de sodium ou d'hydroxyde de potassium, ou des solutions-tampons comme les tampons à base de phosphates et analogues. 



   La répartition entre une solution alcoolique aqueuse et un solvant non miscible à l'eau constitue un bon procédé de purification pour le nouvel antibiotique. La répartition a lieu de préférence suivant le procédé à contre-courant dans des appareils appropriés. La chromatographie est également très bien appropriée pour la purification. L'obtention de   l'antibiotique   pur sous forme cristalline a lieu par exemple dans des solvants organiques comme l'acétone, le méthanol,   l'éthanol,   le chloroforme, des mélanges d'acétone et de méthanol, des mélanges d'acétone et d'éther ou des mélanges d'acétone et d'éther de pétrole. Pour la recristallisation, on se sert des mêmes solvants ou aussi de solutions organiques aqueuses, par exemple d'alcools dilués, d'acétone diluée, etc. 



     On   obtient l'antibiotique sous la forme d'une coudre microcristalline incolore, fondant à 217 - 218 , et 

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 possédant un pouvoir rotatoire spdcî'flque [Q]D = - µ10 . 



  L'analyse élémentaire fournit les valeurs suivantes g C = 55,79%, H = 5,74%, N = 15,20%, S = 5,24%, (N)CH3 = r,,2n,tc,', (C)CH3   = 2,63%.   Ces valeurs conduisent à la formule C29H37O7N7S, d'après laquelle la substance ne renfermerait pas de groupes   0-méthyles,   mais deux groupes N-méthyles et deux groupes C-méthyles. Son spectre d'absorption ultra-violet 
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 montre deux bandes a 242 ma (log E = S.76)eta322 mi   1 cm (log E 1% = 2,02). Dans le spectre infrarouge, on peut   
1 cm observer des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes 
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 suivantes ô ,J1 1 ü 12a8 9' U"8 6,8l '8 Y 9""" IW8   8"'  ^ 1> 7 85 - 8.00 (bande très large). 8,75 9, 9,06 , iz,78 y et 13,16 Ma L'echinontyoine ne possède pas de propriétés basiques et pas de groupes hydroxyles facilement acylables. 



   Lors de'l'hydrolyse acide de l'échinomycine, il se 
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 forme les acides aminés dénommés D-sérine et L-alan1n9 ainsi que d'autres produits de scission qui fournissent une réaction colorée positive avec la   ninhydrine.   Par ailleurs, lors du   traitement doux   de l'échinomyeinee avec un alcali, il se   forme   
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 un produit d'hydrolyse acide, faeide  dchinomcique '. Son spectre d'absorption ultra-violet montre deux bandes bzz, 242 m (log Ê.1%'" '' .- 2,83) et 322 Ru Qg a = 2,11). Lors de 
1 cm 1 cm l'hydrolyse acide de cet acide, il se forme, entre autres, de   l'alanine,   mais pas de sérine.

   Lorsqu'on la fait bouillir avec une solution concentrée d'hydroxyde de sodium, l'échinomyeine 

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 fournit environ 1,2 mol d'ammoniac,   tandis     qu'à   partir du mélange de réaction alcalin, on peut, après   acidification   et extraction à l'acétate   d'éthyle,   isoler l'acide quinoxaline- 
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 carboxylique-(2). D'après ces recheroheGj lAéch1no-rnyine est, apparemment un composé de structure dans lequel à cote de la L-alanlne, de la D-sévîne, de l'acide quinosa- line-2-carboxylique et de l'armoniso vr&!cb18bleont lié sous forum amldique, il existe encore un reste trimaient de formule C141 O,N:aS. 



  L'antiblotigue d6nor:ié éehinonycine possède une très forte activité antibiotiquo vie-a-v1# de .(3ives's organ1ames- testa. 31 l'on utilise comme n-6thoda-tGote in Vitro des séries de dilution (par puissance de 10)   dans   du bouillon glucose incubées par 37  pondant 24 heures, on a les concentration suivantes qui sont encore inhibantes 
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 0rganisixes-tests Concentration -.."I inhibant jUg/CRr 'Hicrococcus pyogenes var.aureus 0,1 r1icrococcuB pyogenes, var.8.ureua pénlcllllno-résistant 0,1 
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<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 0,1
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 0,1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis
<tb> 
 
 EMI12.4 
 Corynebacterium dlphtherlae 0,

  1 
 EMI12.5 
 
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> el <SEP> Tor <SEP> 100
<tb> 
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> -10
<tb> 
<tb> 
<tb> Candida <SEP> vulgaris <SEP> 100
<tb> 
 
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 Yecobacterium tuberculoals -!-) 100 Entamoeba hlatolytica ++) 1000 
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<tb> Trichomonas <SEP> foetus <SEP> +++) <SEP> <4
<tb> 
 

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 +) cultivé dans le milieu synthétique de   Kirchner   avec de l'albumine bovine à 5%, examen de la croissance au bout de deux semaines. 



   ++) culture dans unmilieu de   Bacto-Entamoebai   examen de   18 effet   amibicide au bout de 24 heures. 



   +++) cultivé dans du bouillon   à   37  renfermant   10%   de   sérum,de   cheval.- examen au bout de 4 jours. 



   Le développement du virus de   l'Influenzà   sur des membranes Isolées du chorioallantois du poulet provenant d'oeufs ayant 14 jours   d'incubation   est encore   inhibé   à une concentration inférieure à 1  g/cm3,   tanças   que le tissu de chorioallantois lui-même n'est pas   toxiquement   endommagé par   100    g/cm3. 

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   L'antibiotique dénommé échinomycine est également actif in vivo. Cinq injections sous-cutanées de 5   mg/kg   prati- quées sur des souris infectées au Streptococcus permettent de retarder l'exitus de deux jours. Chez les souris, lors des applications sous-cutanées de 1 mg/kg, on obtient un effet supprimant à 100% les infections au Borrelia   recurrens.   



  De plus, des administrations par voie perorale de 5   mg/kg   dans le cas de rats infectés avec des amibes ont un effet de   100%.   



   Le traitement local de hamsters   vaginalement   in-   fectés   avec du Trichomonas foetus accuse un bon effet curatif avec une solution   d'échinomyoine   à   1%.   



   En dehors du procédé de préparation de l'anti- biotique dénommé échinomycien. la présente invention a également pour objet le composé mentionné lui-même, ainsi que ses produits de transformation obtenus par   hydrogénation   ou oxydation, de même que les produits de scission tels qu'on les obtient par exemple par hydrolyse de l'antibiotique dénommé échinomycine. 



   L'antibiotique dénommé échinomycine, les produits de transformation et de scission inc ués ci-dessus, ou des mélanges correspondants peuvent être utilisés comme médicaments, 

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 par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques renfermant les composés indiques en mélange avec un excipient pharmaceutique, organique ou Inorganique, appropriée pour une application entérale, parentérale ou locale.

   Comme exci- pients entrent en ligne de compte les substances ne réagissait pas sur les nouveaux composés, par exemple la gélatine, le lactose, l'amidon, le stéarate de   magnésium;,   le talc, des huiles végétales, des alcools benzyliques, des gommesdes polyalcoylène-glycols,la vaseline, la   cholestérine   ou d'autres excipients connus,Les préparations pharmaceutiques peuvent se présenter, par exemplesous la forme de comprimés, de dragées, de poudres,   d'onguents,   de crèmes, de   suppositoires   ou sous forme liquide à l'état de solutions, de suspensions ou d'émulsions.

   Le cas échéant, elles sont stérilisées et/ou renferment des substances   auxiliaires,   telles que des agents de conservation, de   stabilisation,   'des agents mouillants ou   émulsifiants.   Elles peuvent encore renfermer d'autres substances thérapeutiquement précieuses. 



     L'invention   est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans ces exemples, les températures sont Indiquées en degrés centigrades. 

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   Exemple 1 ----------- 
On prépare une solution nutritive de la compo- sition suivante : 20 g de farine de soja, 20 g de mannite et un litre d'eau du robinet, puis l'ajuste à un pH de   7,8.   On transvase cette solution ou un multiple de cette dernière dans des fioles coniques d'un volume de 500 cm3 (remplies chacune avec 100 cm3 de solution nutritive) ou dans des fer- menteurs de 500 litres (remplis chacun de 300 litres de so- lution nutritive), puis stérilise pendant 20 à 30 minutes sous une pression de 1 atmosphère.

   On ensemence ensuite avec jusqu'à   10%   d'une culture végétative, partiellement   sporulante,   de Streptomyces   eahinatus   et incube, tout en secouant bien ou en agitant, dans les fermenteurs, à 27 , en faisant passer de l'air (environ un volume d'air stérile par volume de solution nutritive et par minute). Après 70 à 120 heures de croissance, on filtre les cultures, en ajoutant un adjuvant de filtration, suivant le volume soit à travers un entonnoir filtrant, soit à travers un filtre-presse ou un filtre rotatif, et débarrasse ainsi du mycélium et d'autres composants solides la solution aqueuse   antibiotiquement   active. 



   Exemple 2 
Si lion utilise, à la place du milieu indiqué dans l'exemple 1, les solutions nutritives a, b, c ou d décrites ci-après, on obtient après avoir, d'une manière analogue, 

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 stérilisé, ensemencé avec du Streptomyces echinatus, incubé à 27 , et filtré, des solutions aqueuses actives comme anti- biotiques. a) 10 g de glucose brut, 5 g de peptone, 3 g d'extrait de viande (Oxo Lab   Lemco),   5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant   stérilisation :  7,5. b) 10 g de glucose brut, 10 g du produit connu dans le commerce sous le nom de "Distillera solubles", 1 g de nitrate de sodium, 5 g de chlorure de sodium, 10 g de carbonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet;

   pH avant   stérilisations   7,5 c) 10 g de glucose brut, 20 cm3 d'eau de gonflement du maïs (corn steep liquor), 2 g d'hydrophosphate secondaire de potassium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant   stérilisations     7,5.   d) 20 g de glycérine, 10 g de farine de soja, 5 g de chlorure de sodium, 1 g de nitrate de sodium, 10 g de car- bonate de calcium et 1 litre d'eau du robinet; pH avant stéri-   lisation;   7,5. 



   Exemple 3 -------------- 
Avec 25 litres d'acétone, on agite le résidu de   filtration'd'une   charge de 150 litres obtenu suivant l'exemple ou 2, puis filtre à nouveau. On répète cette opération deux fois, après quoi on réunit les solutions acétomniques renfermant 

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   l'antibiotique,   les concentre sous vide à 5 litres et les réunit avec le filtrat de culture. On extrait alors cette solution avec 70 litres d'acétate   d'éthyle   dans un extracteur "Westfalia", la totalité de l'activité antibactérielle passant dans la phase organique.

   On lave alors l'extrait à   l'eau,   con- centre sous vide à 5 litres et extrait ensuite à plusieurs reprises avec de l'acide acétique   demi-normal,   puis avec une solution   binormale   d'hydroxyde de sodium. Finalement, on sèche la solution d'acétate d'éthyle sur du sulfate de sodium et   l'évapore   sous vide, ce qui fait qu'on obtient un résidu huileux. Par traitement avec de l'éther de   pétrole,   on obtient l'antibiotique brut dénommé "échinomycine" sous forme de flocons   jaunâtres.   



   Les extraits sus-mentionnés, obtenus avec la so- lution d'hydroxyde de sodium, possèdent une faible   activité   antibiotique. On les   amène   à un pH de 3 et les extrait à l'acétate d'éthyle. On lave les extraits à l'eau, les sèche et les   évapore   sous vide. Le résidu jaune amorphe est anti-   biotiquement   actif. 



   Exemple 4   -----------   
On soumet   5,7   g de l'antibiotique brut dénommé "échinomycine", obtenu suivant l'exemple 3, à une répartition à contre-courant comportant 82 stades, en utilisant le mélange de solvants   suivant :  2,63 parties en volume de tétrachlorure 

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 de carbone, 0,37 partie en volume de chloroforme, 2,4 parties en volume de méthanol et 0,6 partie en volume d'eau. Après avoir évaporé sous vide à 30  le contenu des divers récipients de répartition, on trouve au stade 35 la majeure partie de la substance et de l'activité. On réunit les fractions 30 à 40 et obtient 1,20 g d'échinomycine qui, par chromatographie sur papier, s'avère unitaire.

   On la recristallise dans le méthanol et elle forme une poudre microcristalline incolore fondant à 217-218  et présentant un pouvoir rotatoire spéci- tique [a]D=   -3100   (dans le chloroforme). Analyse :C   55,79%p   H   5,74%,   N   15,20%,   S   5,24%,   (N)CH3   5,20%,   (C)CH3   2,63%,   H act. 



    0,68%.   Spectre d'absorption ultra-violet,àans l'alcool absolus On observe des bandes à 242   m   (log E l cm = 2,76) et à 322 m  (log E a1 cm = 2,02); spectre d'absorption infra-rouge dans le nujol; on observe des bandes, entre autres, aux longueurs d'ondes suivantes: 5,74   ,   6,00  , 6,81  , 7,06   ,   7,22  , 7,85   - 8,00   (bande très large) 8,75  , 9,06  , 12,79   et   13,16    .    



  Exemple 5-      On   chromatographie 5 g   de l'antibiotique   brut dénommé "échinomycine" qui est obtenu suivant   l'exemple   3, sur une colonne.de 150 g d'oxyde d'aluminium (activité III), en éluant avec du benzène, du chloroforme, des mélanges de chloroforme et de méthanol et avec du méthanol.   On   évapore 

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 sous vide les diverses fractions   (de   400 cm3 chacune) et les examine quant à leur activité antibiotique. Les fractions benzéniques et   chloroformiques   renferment seulement des subs- tances accompagnatrices   inactives,   tandis que les fractions   éluées   avec des mélanges de chloroforme et de méthanol   (99:1)   sont hautement actives.

   On les réunit et   les   cristallise dans le méthanol. On obtient   900   mg d' "échinomycine"   d'un   point de fusion de   217-218    et   d'un   pouvoir rotatoire   spéci-   fique [a]D = -   3100  (dans le chloroforme). 



   L'échinomycine peut, par exemple) être utilisée sous la forme des préparations pharmaceutiques suivantes destinées à une application topique: a) solution à 1%o dans un mélange d'eau et de   N-méthylpyrrolidone   (80:20 parties en volume) b) solution à 1%o dans l'huile de ricin c) solution à 0,1%o dans l'huile   d'arachide.   



   Exemple 6 ------------ 
On chauffe pendant   16   heures à 100 ,dans un tube      scellé, une solution de 20 mg d'échinomycine dans 5 cm' d'acide chlorhydrique à 20%, puis l'évapore à sec sous vide, à 35 . On examine le résidu par chromatographie sur papier et, à côté d'autres substances positives à la ninhydrine. on peut déceler de la serine et de   l'alanine.   

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   Exemple 7      
A une solution de 250 mg d'échinomycine dans 20 cm3   d'éthanol,   on ajoute une solution de 1 g d'hydroxyde de potassium dans 30 cm3 d'éthanol et laisse le mélange reposéx pendant 14 heures à 200. On ajoute alors de l'eau et extrait la solution à plusieurs reprises avec de l'acétate d'éthyle. 



  On lave les extraits à l'eau, les sèche et les évapore, ce qui fait qu'on obtient 3 mg de la matière de départ. On acidi- fie la phase alcaline aqueuse par addition d'acide chlorhydrique   dilué   et l'extrait à nouveau avec de l'acétate d'éthyle. Après les avoir lavés et les avoir séchés, on évapore les extraits sous vide. On obtient 200 mg d'acide   échinomycique   incolore. 



  Spectre d'absorption ultra-violet: on observe des bandes à 242 m  (log E 1 cm = 2,83) et à 322 m  (log E 1 cm = 2,11), 
Comme décrit dans l'exemple 6, on hydrolyse 20 mg d'acide échinomycique avec 5 em3 d'acide chlorhydrique à   20%.   pans l'hydrolysat on peut, lors d'un examen chromatographique sur papier, à   coté   d'autres substances positives à la ninhydrine, déceler de l'alanine. 



  Exemple 8 ----------- 
On chauffe pendant 20 heures à 100 , dans un tube scelle, 500 mg d'échinomycine dans un mélange de 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré et de 5 cm3 d'eau. On dilue à l'eau la solution réactionnelle colorée en vert-noir et y ajoute un 

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 peu de charbon actif. Après filtration, on évapore la solution tous vide à 40 , ce qui fait qu'on obtient un résidu brun. 



  On reprend à nouveau ce dernier dans 15 cm3 d'eau. On ajoute à cette solution d'abord 500 mg de bicarbonate de sodium, et ensuite une solution de 500 mg de 2,4-dinitro-fluorobenzène dans 30 cm3 d'alcool. Après avoir laissé reposer deux heures à la température ambiante, on concentre la solution sous vide au quart de son volume, puis l'extrait à l'éther. On acidifie ensuite la phase aqueuse résultante et l'extrait à nouveau à l'éther. A partir des extraits on obtient, après lavage, séchage et évaporation, une huile visqueuse qui, d'après un examen chromatographique sur papier, renferme les dérivés 2,4-dinitriohényliques de la sérine et de l'alanine. On peut la scinder en ses composants par une chromatographie de répar- tition.

   Dans ce but, on prépare une colonne de 40 g d'acide silicique qu'on malaxe avec 16 g d'eau et qu'on met ensuite en suspension avec du chloroforme. On verse ensuite l'huile, en solution dans peu de chloroforme, sur la colonne et élue ensuite d'abord avec un mélange de chloroforme et de butanol (99:1) et ensuite avec un mélange analogue dans le rapport   19:1,   ce qui fait que la 2,4-dinitrophényl-alanine et la 2,4-dinitrophényl-sérine sont extraites par dissolution. Cette dernière cristallise, dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole,  gous   la forme d'aiguilles jaunes d'un point de fusion de   175-176,5    et d'un pouvoir rotatoire spécifique [a]D 18 - + 19  

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 (c = 1,09 dans l'acétone). Il s'agit donc de la   2,4-dinitro-   phényl-D-sérine.

   La fraction renfermant la 2,4-dinitrophényl- alanine est purifiée à nouveau par une répartition à contre- courant entre de l'éther et un tampon de Mac Ilvaine (pH   4,9).   



  Tors d'une répartition en 62 stades, le maximum de la substance se trouve au stade 26. On réunit les stades 20 à 32 et les extrait à l'éther. Après lavage, séchage et   évapora lion   des extraits, on obtient un résidu qui cristallise dans un mélange d'éther et d'éther de pétrole. Point de fusion   173-176 ,   [a]D 18 = - 15,5  (c = 1,07 dans l'acétone). Il séagit donc de la 2,4-dinitrophényl-L-alanien. 



   Exemple 9      
Dans un récipient de distillation, on chauffe lentement 2 g d'échinomycin avec une solution de 4 g d'hur de sodium dans 35 cm3 d'eau, puis on chauffe à l'ébullition en ajoutant, lorsque 30 cm3 environ de distillat ont été éliminés par évaporation, à nouveau 30 cm3 d'eau dans le réai- pient et en éliminant à nouveau cette quantité par distillation. 



  On recueille le distillat dans 50 cm3 d'acide chlorhydrique   décinormal.-Les   fractions volatiles qui passent renferment 1,2 mol d'ammoniac, ce qu'on peut déterminer en titrant le contenu de l'allonge et en isolant le chlorure d'ammonium. 



     .-On   reprend dans 30 cm3 d'eau le résidu alcalin de distillation, l'acidifie avec de l'acide chlorhydrique et l'extrait à quatre reprises avec de l'acétate d'éthyle. On lave 

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 les extraits à l'eau, les sèche et les évapore sous vide. 



  Par cristallisation dans l'acétate d'éthyle, on obtient, à partir   du   résidu d'extraction, 410 mg d'acide quinoxaline-/ carboxylique-(2) sous forme cristalline. Pour le purifier davantage, on le sublime sous un vide poussé. Point de fusion   212-2130,   équivalent-poids   181,   analyse :C   62,07%,     H   3,47%, N   16,09%.   



   L'ester méthylique formé en faisant agir du   diazométhane   sur l'acide quinoxaline-carboxylique-(2) fond à   110-110,50.   Analyse : C 64,15%, H 4,10%, N   14,88%,   OCH3 16,76%.

Claims

Revendications EMI25.1 --¯.-cII"""U----oM#-- I. Un procédé de préparation d'un nouvel antîblotlque, caractérise par le fait qu'on cultive une souche de Streptomyces présentant les propriétés du Streptomyces échina tus nov.sp., jusqu'à ce que la solution nutritive accuse un effet antiblacvté- riel notable,et qu'on isole ensuite l'antibiotique dénomme EMI25.2 fléch1r.LomycineU Le présent procède peut encore être caractérisé par les points suivants: 1) On cultive dans des conditions aérobiesde préférence en culture immergea dans une solution nutritive aqueus,e renfermant des sels inorganiques des composes azotés et, le cas échéant, des hydrates de carbone.

2) La solution nutritive renferme des substances favorisant la croissance.

3) La culture a lieu pendant 36 à 120 heures, à une température comprise entre 18 et 40 .

4) On extrait l'antibiotique du filtrat de sulfure à l'aide de solvants organiques non miscibles à l'eau.

5) On extrait l'antibiotique du mycélium séparé, à l'aide d'un solvant organique au moins partiellement miscible à l'eau.

6) On purifie l'antibiotique par adsorption, de préférence à l'aide de charbon actif, et par extraction <Desc/Clms Page number 26> de l'absorbât à l'aide d'un solvant organique au moins par- tiellement miscible à l'eau.

7) On purifie l'antibiotique par répartition entre une solution aqueuse et un solvant organique non miscible à l'eau.

8) La répartition à lieu suivant le procède à contre- courant.

9) L'antibiotique est purifie par chromatographie.

10) L'antibiotique est purifia par chromatographie sur de l'oxyde d'aluminium.

Il) L'antibiotique est obtenu sous forme cristalline dans un solvant organique.

II. A titre de produits industriels nouveaux: 12) Le nouvel antibiotique cristallin dénommé "échino- mycine".

13) Les produits qu'on peut obtenir par oxydation ou par réduction de l'antibiotique dénommé "échinomycine".

14) Les nouveaux produits de scission tels qu'on les obtient par hydrolyse de l'antibiotique dénomsé "échinomycine".

15) L'acide échinemycique, produit de scission hydroly- tique.

16) Les préparations pharmaceutiques renfermant l'an- tibiotique dénommé "échinomycine", les produits qu'on peut obtenir par oxydation ou réduction de l'échinomycine et/ou les <Desc/Clms Page number 27> produits de scission tels qu'on les obtient par hydrolyse de l'échinomycine..

17) Les préparations pharmaceutiques sous forme de comprimés: de dragées, en ampoules,, sous forme d'onguents, de crèmes, de poudres; de suppositoires, de solutionsde suspensions ou d'émulsions, qui renferment l'antibiotique dénommé "échinomycine", les produits qu'on peut obtenir par oxydation ou réduction de l'échinomycine et/ou les produits de scission tels qu'on les obtient par hydrolyse de l'échino- mycine.

18) Les préparations pharmaceutiques sous forme de solutions renfermant l'antibiotique dénommé "échinomycine" dans un solvant approprié pour une application topique.

III. L'utilisation d'une souche do Streptomyces pré- sentant les propriétés du Streptomyces echinatus nov.ap. pour l'obtention de l'antibiotique dénommé "échinomycines".