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" Perfectionnements à la préparation de substances antibiotiques ".
La présente invention concerne la production d'une nouvelle substance antibiotique .
Au cours des dernières années on a réussi à isoler un certain nombre de produits métaboliques de la culture de bactéries et de champignons, produits auxquels on a re- connu des propriétés thérapeutiques appréciables. Parmi ces produits on peut mentionner la pénicilline, la strep- tomycine, la gramicidine, la tyrocidine, la bacitracine, la subtiline, l'actinomyCine, la clavasine, la strepto- thricine et de nombreux autres produits . Certains ont
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démontré leur grande valeur en raison de leur efficacité contre des organismes pathogènes. Chez d'autres ,on n'a trouvé qu'une utilité limitée en raisonne leur toxici- té ou de la faible étendue de leur activité bactéricide.
Certains parmi les antibiotiques mentionnés ci-dessus sont surtout efficaces contre les organismes prenant le gram ou à gram positif et n'ont aucune activité ou une acti- vité très faible contre de nombreux pathogènes de la classe ne prenant pas le gram. La pénicilline est un corps qui émerge particulièrement dans cette classe . Jusqu'ici, très peu parmi les antibiotiques indiqués ont une efficacité quelconque contre les organismes ne prenant pas le gram ou à gram négatif et ces substances possèdent en général des propriétés indésirables comme, par exemple, celles d'être toxiques pour certains malades, de manques d'effica- cité lorsqu'ils sont administrés par voie buccale et d'avoir tendance à perdre leur efficacité par suite du développe- ment d'efforts de résistance de l'organisme à la drogue.
Suivant la présente invention, on a prévu un procédé de préparation d'une substance antibiotique désignée sous le nom d'auréomycine qui consiste à ensemencer un milieu nutritif aqueux avec une culture de streptomyces aureofa- ciens, en laissant se produire une fermentation aérobie et en récupérant ensuite l'auréomycine de la liqueur de fer- mentation.
Toujours grâce à l'invention, on a prévu un milieu de culture amélioré permettant d'augmenter le rendement en auréomycine . L'invention comporte également différentes va- riantes du mode opératoire de récupération de l'auréomycine à partir de la liqueur de fermentation.
Le champignon streptomyces aureofaciens, qu'on pourrait appeler à juste titre "supermoisissure", était désigné
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dans le temps par le symbole A-377, et fut isolé pour la première fois du sol d'un champ de fléole dans l'Etat de Missouri, aux U.S.A. Il est typiquement aérobie, avec croissance limitée lorsqu'il est immergée Un mycellium se forme et au début des colonies appréciables dans un milieu de culture asparagine-extrait de viande-gélose (qu'on appellera ci-après gélose AMD) révèle la présence . d'hyphes branchés, qui se croisent rapidement en formant une colonie dense, analogue à un bouton, les extrémités libres des hyphes étant généralement souples et continues.
Des colonies de surface se forment, avec souvent un léger creux au centre . Des milieux de culture de gélose ensemencée de nombreuses spores bien réparties déterminent une culture confluente, autrement dit une couche mycéliale continue et en "prostrate" dans la couche exposée ou extérieure du milieu nutritif, ce type de culture étant communément appelé cul- ture en surface .
Les colonies qui se trouvent dans cet état de culture sur de la gélose AMD sont généralement hyalines pendant au moins 48 h et deviennent progressivement jaune- orange (en passant de terne à brillant) et, dans les diffé- rentes formes que l'on peut séparer, la pigmentation de la masse d'hyphes peut être décrite comme étant jaune persan hydrophane, jaune-abricot, jaune-mais..; (Oberthür et Dauthe- nay, Répertoire de couleurs), jaune-chamois, ou bien comme pré sentant des variantes troubles des qualités plus claires.
La gélose AMD est seulement faiblement pigmentée, si elle l'est, par la culture de streptomyces aureofaciens.
Sur la gélose AMD , une surface de croissance continue sur une culture inclinée révèle des hyphes aériens dont les conidies sont d'abord blanches et deviennent gris-foncé et abondantes au fur et à mesure que la sporulation pro- gresse (7 à 10 jours). Au cours de cette phase, la vue du côté inférieur présente une couleur basanée . Les résidus
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d'hyphes fragmentés sont également gris.
Les hyphes jaunes ne prennent pas le grandies plus vieux réagissent de manière variable) et ne résistent pas à l'acide; ces hyphes plus jeunes mesurent de 0,7 à 0,8 microns de diamètre et jusqu'au double de ces chiffres lorsqu'on différencie les conidies. Celles-ci ont une forme allant de sphéroïde à ovoïde et leur plus grand diamètre atteint jusqu'à 1,5 micron.
La croissance sur la gélose AMD est excellente et la production de conidies abondante, lorsque la température est favorable .
La croissance sur un bouillon nutritif d'agar-agar ou gélose est bonne mais la production de conidies et d'hyphes aériens est empêchée . En ajoutant du N03Na il n'y a aucune amélioration ; une très faible amélioration seu- lement est obtenue en ajoutant du dextrose.
La croissance sur agar-agar (milieu de culture solide) de liqueur de mais macéré est excellente, la formation de conidies est lente mais à la fin (15 jours) assez abondante.
La culture sur de l'agar-agar synthétique ( asparagine d'Uschinsky) donne un micelium en prostrate, lourd, hygro- phane, jaune-tan, sans conidies le milieu offrant une pigmentation ambrée et trouble.
La culture sur des milieux à base de pommes de terre cuites à la vapeur est jaune-orange (atteignant le jaune- brunâtre dans certaines espèces mutantes), est considérable- ment accrue et la surface devient noduleuse à la fin.
Les barr,ettes de gélatine ne révèlent aucune liquéfac- tion en 15 jours à 26 C environ.
Le bouillon de culture présente un collier de culture presque hyaline à la surface du verre ; ajoutant du nitrate la culture est semblable mais @n ajoutant du dextrose, ou de l'amidon, le collier est brun-jaunâtre.
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Le lait de tournesol présente également un léger col- lier de culture jaune-brun sur le dessus, mais en 15 jours il ne se produit ni un changement appréciable du pH, ni une peptonisation apparente.
Dans les tubes de fermentation (en utilisant du rouge de phénol comme indicateur-pH 6,8-7), il ne se produit aucune accumulation gazeuse lorsqu'on ajoute au bouillon de culture du xylose, glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, glycérol ou bien du mannitol. Il n'y a une acidité indiquée sur une période d'environ 5 jours qu'avec du glucose ou de saccharose , ce changement de couleur étant progressivement suivi d'un lent changement vers l'alcalinitéo En présence d'autres sources de carbone, il se produit ou bien aucun changement (maltose,glycérol) ou un accroissement d'alcalinité, qui atteint son maximum avec n le manitol .
Parmi les autres substances susceptibles de céder du carbone, le dextrose, le saccharose, le maltose, le lacto- se, la dextrine, l'amidon, le glycérol, et la mannitol supportent la culture.
Dispersé dans l'agar-agar , l'amidon soluble est hydrolysé dans une zone autour de la colonie (pH = 5,8 à 6). L'hydrolyse de l'amidon se trouve également induite lorsque la dispersion a lieu dans le bouillon de culture.
La croissance optimum et la formation optimum de spores pour un type représentatif de streptomices auréofaciens se produisent dans l'intervalle de température de 28 à 37 C. La croissance est lente à 17 C. La limite supérieure de croissance se situe autour de 42 C. La tolérance thermi- que ou LD50, est d'environ 55 C avec des périodes de temps standard (10 minutes) en utilisant comme récipient d'immer- sion des tubes de verre (étiré) spéciaux à parois minces.
La destruction complète s'obtient à environ 65 C.
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On pense que les caractéristiques ci-dessus diffé- rencient lesjstreptomices auréofaciens et ses formes de toute espèce américaine décrite antérieurement.
Pour isoler les streptomices aureofaciens en vue de les utiliser dans le procédé suivant l'invention, on suspend un échantillon de terre dans de l'eau et on le chauffe à 54 C pendant dix minutes pour éliminer plu- sieurs types qui se développent de moisissure noire ainsi que certaines bactéries sensibles à la chaleur,On fait un essai parallèle en utilisant un échantillon non chauffé . Un agar-agar ou gélose (milieu de culture soli- de) nutritif composé de 2 gr d'extrait de viande, 0,5 gr d'asparagine, 10 gr de dextrose, 0,5 gr de PO HK et 18 gr d'agar-agar ou gélose par litre d'eau est préparé ensuite puis versé en plaques comme d'habitu- de .La suspension de terre est diluée et étalée sur les plaques d'agar puis on fait incuber celle-ci à 26-28 C.
Certaines zones des plaques de dilution peuvent être recouvertes avec précaution d'un organisme d'essai appro- prié tel que des Escherichia coli pour faciliter l'isole- ment d'une culture.
Lorsqu'on a isolé de l'échantillon de terre, .-en colonies séparées un organisme ayant les caractéristiques exposées ci-dessus., on peut le transférer ensuite sur d'autres milieux de culture et l'utiliser ensuite pour ensemencer de grands volumes de milieu de fermentation en vue de produire commercialement l'auréomycine.
L'auréomycine est efficace contre de nombreuses bactéries, aussi bien à gram positif qu'à gram négatif et 9 démontré certaines caractéristiques remarquables quant à son effet sur certaines maladies dues à des virus et des "rickettsia" (corps analoguesù à des bactéries trouvés dans les poux et les acarins et dans le sang et
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les tissus de personnes atteinte du typhus).
Parmi les organismes à gram-négatif qui ne parviennent pas à se propager in vitro en présence d'auréomycine on peut mentionner : Escherichia coli , Eberthella typhosa , Salmonella pullorum , Shigella gallinarum , Proteus vulgaris , Klebsiella pneumoniae , Aerobacter aerogenes, Neisseria catarrhali, et Brucella abortus . Parmi les organismes à gram positif dont la croissance est inhibée in vitro par l'auréomycine, on peut citer : Bacillus cereus, Mycobacterium tuberculosi , Staphylococcus aureus , Bacillus subtilis et streptococcus pyogènes. D'autres microorganismes pathogènes sont également affectés par l'auréomycine à des degrés divers.
L'auréomycine forme des sels avec les acides et est soluble dans les acides dilués, mais elle tend à précipiter des solutions au voisinage de la neutralité. Elle se décom- pose lorsqu'on la chauffe dans des solutionsaqueuses d'acide ou d'alcali fort. Elle contient les éléments car- bone, hydrogène, azote, chlore et oxygène, L'analyse chimique d'un certain nombre d'échantillons du monochlor- hydrate purifié a donné en moyenne 51,49 % de carbone, 5,44 % d'hydrogène, 5,53 % d'azote, 13,51 % de chlore, pas de cendres, par différence 24,03 % d'oxygène .
D'autres sels acides de la base libre se forment aisément pr simple neutralisation avec des acides tels que les aci- des sulfurique , phosphorique, acétique et similaires. Ces sels acides constituent une forme préférée du nouveau produit en raison de leur plus grande facilité de préparation et de manipulation On forme également dans des solutions aqueuses des précipités avec de l'acide picri- que, l'acide de Reinecke (chromi diammoniotétra sulfocyanurés et du molybdate d'ammonium.
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tes cristaux du chlorhydrate se présentent sous une forme tubulaire ou orthorhombique équidimention- nelle avec parfois un profil rhomboïde. Il n'y a pas de clivage marqué et à la fragmentation les cristaux révè- lent une fracture conchoïdale Leur couleur est un jaune citron clair et vitreux.
A l'examen au microscope pola- risant, on a constaté que les cristaux sont biaxiaux avec un angle optique > 60 , signe optique négatif.,Les indices de réfraction sont Ó=, 1,633¯ 0,005, ss= 1,705 ¯ 0,005 Y = 1,730 + 0,005. Toutes les ex- tinctions étaient soit parallèles, soit symétriques. Les cristaux de la base libre sont très petits, sont générale- ment aciculaires (en forme d'aiguille) lamellaires et ont un indice de réfraction parallèle à l'allongement légère- ment supérieur à 1,674 mais ne différant pas de plus d'environ 0,020 . Le pouvoir rotatoire de la base libre dans du méthanol était [[alpha]]D23 = - 274,9. Le pouvoir rotatoire du chlorhydrate dans le méthanol était de [Ó] D = - 295,9 et dans l'eau [Ó]23 = - 227,9.
La base libre est très soluble dans de la pyridine et soluble dans le méthanol et l'acétone à 25 C jusqu'à une teneur de 13 à 15 mmg environ par centimètre cube.
Elle est sensiblement moins soluble dans l'éthanol et dans l'eau elle a une solubilité d'environ 0,55 milligram- me par ce à 25 C. D'autre part, le chlorhydrate est soluble dans l'eau et dans le méthanol, légèrement solu- ble dans l'éthanol et soluble dans l'acétone à 25 C à la teneur d'environ 0,13 mgr par cc.
L'auréomycine révèle des bandes d'absorption carac- téristiques aussi bien dans la zone de l'ultra-violet que dans l'infrarouge du spectre . Dans la zone de l'ul- tra-violet, lorsqu'on a dissous le chlorhydrate dans une solution aqueuse à pH 2, contenant 0,1 mol d'acide
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phosphorique, la courbe d'absorption montre une absorp- tion maximum à environ 365 m , 264 rnet 228 m . Le minimuz d'absorption se produit à 305 m , 242 m et 215-. A pH 4,3, en utilisant 0,1 équivalent moléculaire de PH4H2K comme agent tampon, l'absorption maximum se
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produit à 370 m* , 265 m,u , 251 m,v et 229 .
A pH 8,9, dans une solution aqueuse de 0,1 équivalent moléculaire de Po4HK2 comme agent tampon, l'absorption maximum se pro-
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duit à 276 m , 240 m , 240 m et 223 m . L'absorp- tion minimum avait lieu à 325 m , 262 m , 245 m et 233 m . En général, ces bandes d'absorption maximum et minimum ne sont pas nettement définies et différents observateurs peuvent déterminer le point précis d'inflexion à des longueurs d'ondes légèrement différentes.
Des spectres caractéristiques d'absorption dans la zone de l'infrarouge établis avec un échantillon de chlor- hydrate malaxé dans de l'huile hydrocarbonée présentent les caractères suivants : Une bande d'absorption 0-H ou N-H au voisinage de 3295 cm-1, absorption C-H phényle à 3050 cm-1, un groupement carbonyle amide possible à 1665cm-1, une fréquence étalée indiquant la présence possible de la liaison C = C à 1615 cm-1, un fléchissement marqué indiquant la présence possible de N-H à 1575 cm-1 une absorption phényl para-substitué au voisinage de 1523 cm-1, un fléchissement marqué indiquant la présence possible R-CH = CH-R, CH à 969 cm-1, et peut être une bande para-phényle à 840 cm-1 avec des substitutions sup- plémentaires suffisantes (3 symétriques) comme le démon- tre l'absorption à 851 et 863 cm-1.
Les spectres d'absorption à l'infa-rouge pour le chlorhydrate dans de l'huile minérale révèlent de nombreu- ses autres bandes d'absorption non identifiables,surtout dans la région comprise entre 650 et 1350 cm-l, que
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l'on appelle parfois la zone des "empreintes digitales" du spectre infra-rouge La courbe d'absorption dans cette zone du spectre d'absorption à l'infra-rouge est indiquée sur la figure 1 (abscisse : fréquence en cm-1; ordonnée : pourcentage de transmission) du dessin annexé. Ces bandes d'absorption indiquent que l'auréomycine est différente de toute autre substance antibiotique précédemment décrite.
Par analogie avec ce précède, la base libre révèle une forte bande d'absorption 0-H ou N-H au voisinage de 3420 cm-1, très probablement une absorption 0-H, et d'autres bandes d'absorption 0-H ou N-H entre 3200 et 3300 cm-1.
La courbe d'absorption révèle en outre la présence d'une bande d'absorption C-H phényl à 3050 cm-1, un groupe carbonyl amide possible à 1643cm" , une fréquence étalée indiquant la présence possible de C=C à 1609 cm-1, un la fléchissement marqué indiquant/présence possible de N-H à 1580 cm-1, une absorption de phényl p-substitué au voisi- nage de 1523 cm-1, un fléchissement marqué indiquant la présence possible de R-CH :CH-R, à 969 cm-1 et une bande p-phényle à 825 cm-1 avec des substitutions additionnelles à 844 cm-1 et 867 cm-1, comme on le voit sur la courbe de la figure 2 (abscisse : fréquence en cm-1; ordonnée :pourcen tage de transmission). Des bandes d'absorption caractéris- tique supplémentaires sont également visibles dans la gamme de 650 à 1380 cm-1 sur la figure 2.
Dans la mise en application de l'invention en vue de produire de l'auréomycine, on effectue une croissance aérobie d'une culture de streptomyces aureofaciens, de préférenceune culture en cuve profonde dans un milieu nu- tritif sonvenable , dans des conditions de temps, tempéra- ture, pH, etc., comme indiquées plus loin. Le milieu nutritif contient, comme les milieux dans lesquels on effec- tue la culture d'autres champignons pour la'production
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de substances antibiotiques, une source de carbone telle qu'un hydrate de carbone soluble une source d'azote orga. nique ou minérale, certains sels minéraux tels que des phosphates et des traces de différents métaux que l'on trouve d'ordinaire sous forme d'impureté dans les autres substituants du milieu .
Comme source de carbone on peut employer de l'amidon ordinaire, les amidons dits solubles et des sucres tels que saccharose, glucose, maltose, dextrose et substances analogues et d'autres hydrates de carbone solubles ou partiellement solubles dans l'eau, tels que les alcools de sucre, etc.. La quantité de ces sources de carbone; , en vue d'obtenir la meilleure production d'antibioti- que, dans le milieu,peut varier considérablement de 0,5 à 5 % environ, en poids, calculés sur le'poids total du milieu de fermentation.
Les sources d'azote qui conviennent pour le procédé de fermentation comprennent une grande variété de substan ces telles que les aminoacides , la caséine hydrolysée et non-hydrolysée, la farine de poisson, la farine de soja, des extraits de viande, pâte de foie et diffé- rentes autres substances azotées d'origine végétale et animale . Des produits chimiques tels que l'urée, nitrate et composés d'ammonium peuvent être aussi ajoutés au mi- lieu nutritif comme source d'azote . Des "précurseurs" chimiques peuvent être ajoutés en tant que source de groupements particuliers préformés d-e la molécule de façon à obtenir des rendements plus grands en pro- duit.
La liqueur de macération du mais, en raison de la grande variété de substances organiques et minérales qu'elle contient, s'est révélée comme une substance précieuse à ajouter aux milieux de fermentation. Il est impossible, naturellement, en raison du caractère
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de produits bruts de la plupart des substances azotées, d'indiquer des proportions définies de la matière à ajouter.
Une quantité d'environ 0,1 à 5 % en poids, sur la base des solides contenait l'intervalle utile des quantités de substances azotées à ajouter aux milieux dans la plupart des cas.
De même que pour la plupart des procédés de fermenta- tion, le procédé suivant la présente invention est mis en oeuvre en utilisant un milieu liquide contenant certains sels minéraux tels que des phosphates Parmi les éléments qui peuvent être favorables en faibles quantités, on peut citer le potassium, le calcium, le magnésium, le soufre, le fer et des traces de certains éléments. Toutefois, lorsqu'on emploie des substances brutes comme source d'azo- te ou de carbone, par exemple dans le cas de la liqueur de macération du mais , celle-ci contient plusieurs élé- ments indiqués de sorte qu'il n'y a pas lieu de les ajouter au milieu .
En utilisant un milieu de fermentation selon la des- cription ci-dessus, le pH devrait se trouver, de préférence, de côté acide, autour de pH 6 à 7 au début de la fermenta- tion . On peut abtenir cela par un réglage du milieu, si nécessaire, en utilisant des agents tampons appropriés tels que des phosphates. Au fur et à mesure que la fermen- tation progresser le pH du milieu tend à diminuer pour atteindre jusqu'à 4,0. Les meilleurs résultats semblent pouvoir s'obtenir lorsque le pH du milieu tombe au-dessous de de 5,6, attendu que pour certaines raisons les valeurs/pH plus élevées à la fin de la fermentation correspondent généralement à des rendements plus faibles en substance antibiotique .
La température préférée du procédé de fermentation se situe autour de 26 à 28 C, bien que l'on puisse obtenir
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des températures aussi basses que 20 C environ ou aussi élevées que 35 C en 30 à 40 h de fermentation lorsque les conditions de température et de pression d'air sont optimum; mais eee on pourrait obtenir des rendements inférieurs en une période plus courte, naturellement, tandis qu'une période plus longue pourra même être souhaitable dans certaines conditions.
On a obtenu des rendements d'auréomycine à l'échelle commerciale en utilisant le milieu de fermentation décrit plus haut, mais on a constaté que les produits métaboli- ques recherchés et peut,être d'autres produits de la cultu- re du microorganisme streptomices aurofaciens semblent agir comme produits "vieillissemtets" qui empêchent non seule- ment la croissance ultérieure de toute bactérie présente mais aussi du micro-organisme générateur lui-même. L'addi- tion de certains sels de certains métaux comme cations semble déterminer la précipitation ou séparation de ces produits dès qu'ils se forment. Les cations qui convien- nent dans ce cas sont certains cations bivalents, à savoir le calcium, le baryum, le strontium et le magnésium.
On peut les ajouter soit sous forme de sels des métaux parti- culiers ou sous forme d'hydroxydes de ces métaux. Il est généralement souhaitable qu'une quantité relativement grande de ces cations soit présente, calculée, en général, sur la base du cation lui-même au voisinage de 0,1 % ou davan- tage. Normalement, des quantités considérablement plus grandes ne nuisent pas à la culture et d'ordinaire des quantités de cations métalliques aussi grandes que celles qui peuvent en rester en solution ne sont pas nuisibles.
Il se peut que le mécanisme soit celui-ci parce que l'auréomycine est une base faible modérément soluble, qu'elle est précipitée comme le sel métallique et par consé- quent m'antibiotique, dès qu'il est formé, se trouve ainsi éliminé du milieu de fermentation, son élimination
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permet une croissance plus dense du ..micro-organisme géné- rateur et la formation supplémentaire résultante d'auréo- mycine.
Pour obtenir la croissance maximum, il est indispensa- ble de régler le pH du milieu de fermentation dans des limites très étroites . On peut obtenir des cultures extrê- mement efficaces dans la gamme d'environ 5,0 à 8,0. Les meilleurs résultats s'obtiennent entre 6,4 et 7 environ. le pH de la liqueur de fermentation doit être stabilisé car pendant le cycle de fermentation il se forme des produits acides qui/normalement, rendent le milieu trop aci- de . Pour surmonter cette tendance inhérente à l'acidifica- tion, il est nécessaire soit d'ajouter une substance alca- line à une cadence telle que le pH soit réglé, soit qu'une substance agissant comme une réserve efficace d'alcali soit présente dans une proportion suffisante pour maintenir le pH dans l'intervalle indiqué.
Pour obtenir un produit ayant des caractéristiques thérapeutiques désirables, il est nécessaire que la fermen- tation soit effectuée dans des conditions stériles de façon que le micro-organisme désiré soit le seul présent pendant la culture . Le réglage d'une manière aseptique du pH est une opération extrêmement difficile, de sorte que, bien que la présente invention puisse être mise en oeuvre en maintenant le réglage du pH, par exemple/en retirant d'une manière aseptique des portions du milieu de fermentation le pH et en :en mesurant/pour ajouter ensuite d'une manière aseptique suffisamment de substance alcaline pour mainte- nir le pH à la valeur désirée, cette opération introduit des complications du point de vue manipulation.
Une phase particulièrement avantageuse de l'invention est le contrôle du pH par l'introduction d'une substance qui, grâce à ses caractéristiques inhérentes, permet de maintenir le pH dans les limites désirées. A cet effet,
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on a constaté que le carbonate de calcium est particulière- ment favorable et que le phosphate de magnésium donne des résultats très satisfaisants . Ces produits introduisent à la fois les cations métalliques désirés et la réserve d'alcali . Le carbonate de calcium est particulièrement efficace dans les limites de 0,25 à 1 %,en poids , du milieu de culture .
On obtient des rendements extrêmement élevés lorsque 0,625 % environ du carbonate de calcium est présent. es quantités supérieures à 1% sont inutiles et peuvent donner lieu à des difficultés au cours de la récupération de l'auréomycine . Moins de 0,25 % de carbona- te de calcium n'est pas suffisant seul pour maintenir un réglage efficace du pH recherché pour assurer le rendement maximum. Si l'on utilise moins de cette quantité de carbonate de calcium, il faut régler le milieu de fermenta- tion en ce qui concerne son pH en recourant à d'autres moyens, car autrement le milieu atteindra un degré d'acidi- té tel qu'il empêchera la production d'auréomycine avant d'obtenir le rendement qui serait autrement le rendement maximum.
Le bouillon de fermentation doit contenir des traces de certains éléments pour une croissance efficace du micro- organisme . A cet effet, il est désirable que le bouillon contienne sous forme d'impuretés et comme sels d'addition des quantités de sel approximativement correspondant à 0,00033 % de manganèse sous forme de Cl2Mn, 4H20; 0,00033% de cuivre sous forme de S04Cu, 5 H2O et 0,005 % de -zinc soàs forme de SO4Zn, 7H2O. Dans de nombreuses conditions de fermentation on constatera la présence d'une quantité suffisante de ces éléments traces sous forme d'impuretés ou bien dans certaines fractions nutritives telles que la liqueur de macération de maïs, la caséine, etc.., de sorte qu'il devient inutile d'ajouter des quantités supplémen-
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taires des sels.
Les quantités de différentes matières nutritives peuvent être modifiées dans une large mesure tout en fournissant encore une quantité d'auréomycine convenable au point de vue pratique. Pour obtenir les meilleurs ré- sultats, on peut se servir de la liqueur de macération de mats comme source partielle de l'azote utilisablecomme source de certains parmi les éléments présents sous forme de traces et enfin comme source de certains hydrates de carbone . Un mode favorable d'addition de la liqueur de ma cération du mais consiste à utiliser celle-ci sous forme de la liqueur "qualité" pénicilline, contenant environ 50 % de particules solides. On utilise environ 2% de li- queur de cette qualité contenant 50 % de particules solides pour obtenir les meilleurs résultats.
On peut uti- liser jusqu'à 3 % d'une façon économique, mais au-dessus les conditions opératoires sont moins favorables. Il n'est pas indispensable d'utiliser de la liqueur de macé- ration du mais mais au moins 1 % est raisonnablement bon marché et constitue une source efficace de matières nutri- tives.
Le saccharose constitue une source bon marché et facilement disponible d'hydrate de carbone . Pour obtenir une production maximum on peut recommander un pourcentage de 3 %,en poids. On peut utiliser d'une manière efficace jusqu'à 5 % et le saccharose peut être complètement rem- placé par d'autres matières comme source d'hydrate de carbone .
Comme agent d'ensemencement on peut utiliser une sou che ou autre source de culture mais la production la plus économique s'obtient en utilisant suffisamment d'a- gent d'ensemencement pour qu'il constitue de 1 à 5 % environ du volume du bac de fermentation principal .Un
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mode approprié d'opérations consiste à utiliser les mêmes types de milieux nutritifs et à commencer avec une souche du micro-organisme sur l'agar-agar et d'ensemencer des fla- cons à secouer avec les streptomyces aurêofaciens provenant de la souche à l'agar.
Pour réduire l'effet dû aux variations dans les espèce: et pour s'assurer que chaque cuve successive est mise en route dans les conditions aussi identiques que possible dans une production industrielle, et pour protéger contre toute contamination on commence généralement la culture séparée de chaque cuve . Il est bien entendu qu'une partie de chaque cuve peut être destinée comme milieu de culture pour la cuve suivante .
On a constaté dans de nombreux cas qu'une période d'environ 36 heures est la plus favorable . Entre 24 et 60 on obtient des résultats très Satisfaisants en utilisant de 1 à 5 % de milieu pour l'ensemencement préparé d'avance.
Si on laisse reposer trop longtemps la cuve, les rendements peuvent diminuer. Des variantes dans des limites raisonna- bles de temps, de température et de quantités viendront facilement à l'esprit des spécialistes.
Pour mieux expliquer l'invention, on trouvera ci- après quelques exemples particuliers de sa mise en oeuvre, Il est bien entendu que ces exemples particuliers n'ont d'autres buts que d'expliquer certains modes de réalisa- tion du procédé suivant l'invention en général et que les exemples préférés peuvent se prêter à des variations sensibles tout en donnant également des résultats satisfai- sants.
Exemple 1.-
Pour plus de facilité, on a utilisé un milieu contenant de l'eau de robinet. On a préparé un milieu d'ensemence- ment intermédiaire en utilisant des spores extraits d'une
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bouche en tube sur pommes de terre et on a utilisé ce milieu pour ensemencer 8 flacons agitateurs de milieux d'ensemencement. Ces milieux d'ensemencement contenaient :
Liqueur de macération du mais 2 %
Saccharose 3 %
C03Ca 0,5 %
Après 24 h. d'incubation à 28 C pendant lesquelles le milieu d'ensemencement a été constamment agité, on a réuni quatre flacons pour former deux milieux d'ensemen- cement.
A partir de ces milieux on a ensemencé des cuves identiques de manière que les résultats obtenus constituent une moyenne de plusieurs cuves et de plusieurs milieux d'inoculation de façon que toute erreur de manipulation, d'estimation ou d'essai, apparaisse dans le résultat final et serve ainsi à vérifier les modes opératoires et à éli- miner les effets dûs à des incidents fortuits.On a pré- paré une cuve finale de fermentation contenant de l'eau de robinet comme diluant,
Liqueur de macération du mais, qualité pénicilline 507 de particules solides 2 %
Saccharose 3 %
C03Ca 0,625 %
Sulfate d'ammonium 0,2 %
On a ajouté des quantités suffisantes de sels de manganèse, de cuivre et de zinc pour assurer la présence de ces éléments à l'état de traces à la teneur indiquée plus haut.
On a réglé le pH de la cuve à 6,0 avec de la potasse normale, puis on a stérilisé,Au cours de la stérilisation, le pH s'est élevé à environ 7,2 à 7,4, pour retomber entre 6,3 et 6,6 pendant la période de croissance . On a ensemencé la cuve en utilisant les mi- lieux d'ensemencement préparés d'avance comme décrit plus haut, en utilisant 5 % en volume de ces milieux, heures puis on a laissé la croissance d'opérer pendant 36/à
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28 C avec une agitation et une aération constante . En plus de ses autres conséquences, cette agitation main- tient le carbonate de calcium en suspension. On peut noter qu'une grande quantité de substance antibiotique a été éliminée du milieu pendant la fermentation grâce àu carbonate de calcium présent.
Une partie du moût final a ' été portée à un pH d'environ 3 en ajoutant de l'acide sulfurique, filtrée et titrée . L'analyse de la cuve a démontré qu'elle contenait 376 microgrammes (millième de milligramme) d'auréomycine par cc.
Exemples 2 à 27.
Des opérations semblables ont été effectuées dans les mêmes conditions mais à une échelle plus réduite que celle de l'exemple précédent pour déterminer l'effet des différents facteurs sur la production d'auréomy- cine .Excepté ce qui est indiqué, toutes les conditions étaient sensiblement les mêmes que celles de l'exemple précédent. On a modifié le pourcentage de saccharose et de carbonate de calcium ainsi que le temps, en fonction l'un de l'autre pour déterminer l'effet produit par chacune de ces variables. La durée @et les concentrations sont celles indiquées par le ta- bleau ci-après :
Tableau I Rendement en microgrammes par centimètre cube de moût.
EMI19.1
<tb>
24 <SEP> h. <SEP> d'incubation <SEP> 36 <SEP> h. <SEP> d'incubation <SEP> 48 <SEP> h.d'incubation
<tb>
<tb> C03Ca <SEP> % <SEP> saccharose <SEP> % <SEP> saccharose <SEP> % <SEP> saccharose
<tb>
EMI19.2
6/o 30 4.0 z0 po z0 5,0 3r0 4;0 5,0 ot25 142 125 116 230 200 19 186 228 213
EMI19.3
<tb> 0.625 <SEP> 140 <SEP> 167 <SEP> 180 <SEP> 235 <SEP> 280 <SEP> 264 <SEP> 247 <SEP> 249
<tb>
EMI19.4
1 r0 180 162 149 204 272 279 278 z$ 220
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D'après les résultats ci-dessus on constate que les résultats de l'exemple 1 donnent des conditions d'opéra- tion préférablespour obtenir les rendements maximum à partir de l'espèce particulière utilisée dans cet exem- ple .
Exemple 28.
On a préparé un milieu de fermentation en utilisant de l'eau du robinet et caséine 1% saccharose 3%
SO4Mg, 7H20 0,02 % S04Fer7H20 0,001 %
SO4Cu,5H2O 0,00033 % Cl2Mn.4H20 0,00033 %
SO4Zn,72HO 0,005 %
C03Ca 0,5 %
SO4K2 0 , 6 % NH40H 0,35 % on a introduit 100 cc du milieu dans un flacon de 500 cc, @ a stérilisé puis ensemencé avec 5 ce d'un milieu d'ense- mencement préparé suivant l'exemple 1. On a agité constam- ment la matière de façon à fournir à la fois une aération et une agitation dans des conditions aseptiques pendant une période de 40 h.
Au terme de cette période, on a porté l'échantillon de moût à pH 3 au moyen d'acide sulfurique, filtré et analysé- L'analyse a démontré la présence dans le moût de 274 microgrammes d'auréomy- cine par cc.
Exemple 29.
On a préparé un milieu de fermentation contenant : caséine 1,0 % saccharose 30 % ammoniaque 0,18 %
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S04(NH4)2 0,166 % S04Fe,7H20 0,001% Cl2Mn,4H20 0,00033 % S04Cu,5H20 0,00033 % SO4Zn,7H2O 0,005 % C1K 0,05 % SO4Mg,7H2O 0,05 % C03Ca 0,25 % hydroxy-isobutyrate de calcium 0,14 %
On a préparé comme dans l'essai précédent les flacons contenant ce milieu et après stérilisation on a ensemencé le flacon avec 5 cc du milieu d'ensemencement préparé d'avan- ce comme exposé dans l'exemple 1. Le pH initial était de 8 et après 40 h de 6,8. Après 40 h à 28 C, on a porté le pH du milieu à 3 avec de l'acide sulfurique, puis on a filtré et analysé.
L'analyse a démontré la présence dans le flacon de 269 microgrammes d'auréomycine par ce.
Exemple 30.
On a préparé un milieu de fermentation, et on l'a fait fermenter dans les mêmes conditions que celles exposées dans l'exemple précédent sauf que le milieu contenant 0,0004 % de C12CO, 6H20 au lieu d'hydroxy-isobutyrate de calcium. Le pH initial était de 7,7 et le pH final de 7,1 ; l'analyse du moût a indiqué la présence de 245 micro- grammes par cc.
Exemple 31.
On a préparé un milieu de fermentation contenant liqueur de fermentation de mais 2 % saccharose 3 % sulfate d'ammonium 0,2 %
EMI21.1
( Fo4 ) zIg3 7HZ0 1.54 % On a introduit 100 cc du milieu de fermentation dans un flacon de 500 cc, puis stérilisé et ensemencé avec 5 cc d'un milieu d'ensemencement comme dans l'exemple 1. On a
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secoué constamment la substance pour fournir à la fois une agitation et une aération dans des conditions asepti- ques pendant une période de 40 h. Le pH était de 6,2 au début et de 5,8 à la fin* Au terme de cette période, l'analyse a révélé la présence de 217 microgrammes d'auréo- mycine par cc.
Exemple 32.
On a préparé et laissé fermenter, comme dans l'exem- ple précédent, un milieu de fermentation contenant 0,925 % de carbonate de strontium au lieu du phosphate de magné- sium, pendant 40 h. à 28 C comme exposé dans l'exemple précédent. Toutes les autres conditions étaient les mêmes que dans cet exemple précédent ; à l'analyse, on a consta- té la présence dans le moût de 209 microgrammes d'auréo- mycine par cc, le pH initial étant de 6,4 tandis que le pH final était de 5,8.
Exemple 33.
On a préparé un milieu de fermentation comme dans l'exemple 31 mais contenant 1,25 % de carbonate de baryum au lieu de phosphate de magnésium . Le pH initial était de 7,3 et le pH final de 7,1. Au terme de la fermentation on a constaté la présence de 192 microgrammes d'auréomy- cine par cc de moût.
Exemple 24.
On a préparé un milieu de fermentation contenant : liqueur de macération du maïs 2 % sulfate d'ammonium 0,2 % carbonate de calcium 0,5 % S04Fe.7H20 0,001 % S04Cu,5H20 0,00033 % Cl2Mn 4H2O 0,00033 SO Zn, 7H2O 0,006 % SO4Mg,7H2O 0,05 % hydrate de carbone 3 %
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On a introduit 100 cc du milieu dans un flacon de 500 cc stérilisé et ensemencé avec 5 cc d'un milieu d'ensemence- ment préparé comme dans l'exemple 1. Le pH initial était de 6,8. On a fait fermenter la substance sous agitation et aération dans des conditions aseptiques pendant 40 h à 28 C et à la fin de cette période on a analysé le moût.
Lorsque l'hydrate de carbone utilisé était de la dextrine, on a obtenu un pH final de 6,4 et un rendement de 132 microgrammes par cc.
Exemple 35.
On a préparé un milieu de fermentation suivant le mode opératoire exposé dans l'exemple 34 sauf que l'hydrate de carbone était du maltose, le pH final de 7,3 et que le moût a donné un rendement de 130 microgrammes d'auréomyci- ne par cc.
Exemple 36.
On a préparé un milieu de fermentation conformément au mode opératoire exposé dans l'exemple 34, sauf que l'hydrate de carbone était du saccharose , le pH final de 6,2 et que le moût a donné un rendement de 225 micro- grammes d'auréomycine par ce.
Il y a lieu de remarquer que la variété particulière de Streptomices auréofaciens déterminera certaines varia- tions de rendements et que les espèces ne restent pas nécessairement ce qu'elles sont, mais elles peuvent varier par suite de changements inhérents dûs au temps. De même, des espèces différentes travailleront mieux dans des milieux légèrement différents ; les résultats décrits ci-dessus donnent une indication quant à ce qu'on peut attendre et l'expérience du métier permettra d'appor- ter des changements de moindre importance dans les milieux et les conditions de fermentation, comme le suggèrent les conditions indiquées plus haut, pour donner à chaque espèce les conditions particulières lui permettant de se dévelop- per le plus favorablement.
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La description ci-après concerne trois variantes de modes opératoires pour la récupération de l'auréomy- cine, à partir du milieu de fermentation ainsi que sa purification .
Mode opératoire A.
Ce mode opératoire nécessite l'adsorption c hroma- tographique .
Le moût fermenté contenant l'auréomycine peut être recueilli en ajoutant de l'acide, si c'est nécessai- re, pour solubiliser la totalité de l'auréomycine, puis en éliminant les mycelia et autres produits insolubles résultant de la culture par filtration, Ensuite, on peut adsorber complètement la solution claire sur plusieurs matières actives, telles que : oxyde d'aluminium, oxyde de magnésium, charbon de bois ou terre d'infusoire.
Certaines marques déposées, qui conviennent à des espèces particulières et se sont démontrées utiles sont : Flori- sil, Superfiltral(argile activée), Nuchar (charbon ac- tif), Darco-C-60 (charbon actif) et d'autres encore . Le filtrat clair après avoir traversé la substance d'adsorp- tion peut être éliminé, puis on lave la colonne à l'eau pour enlever le moût résiduel et les autres impuretés. On peut ensuite laver la colonne avec un solvant appro- prié des matières grasses tel que de l'acétone, qui élimi- ne la plupart des matières grasses qui autrement pour- raient gêner, ainsi qu'une quantité considérable d'impu- retés colorées- D'autres solvants de matières grasses tels que le méthanol ou l'éthanol, le chloroforme, etc.. conviennent également. De préférence, le solvant est un peu soluble dans l'eau .
Le solvant qui se trouve dans l'eau de lavage peut être récupéré et réutilisé, l'eau étant ensuite jetée . La colonne contient alors la substance active, c'est-à-dire l'auréomycine , ainsi que certaines impuretés- En raison de la difficulté
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de déterminer où se trouve l'ingrédient actif à la lumière ordinaire on développe la colonne sous un éclairage aux rayons ultra-violets* On peut utiliser le lavage à l'al- cool acide pour le développement,les acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique ou sulfurique dans de l'alcool méthylique convenant particulièrement bien,quoi qu'on puisse utiliser d'autres alcools y compris l'alcool éthyli- que, les alcools butyliques, propyliques, ou bien les al- cools supérieurs ou l'acétone, ainsi que les cétones supé- rieures, le méthyl-cellosolve (2-méthoxyéthanol)
et les cellosolves supérieurs (éther oxydes supérieurs du glycol), à condition le maintenir le pH du solvant au- dessous de 6,0 au moyen d'un acide . Ce pH peut être aussi bas que 1 environ, mais il ne fournit pas une sépara- tion aussi favorable dans les gammes plus acides, La première bande qu'on extrait de la colonne est bleue à la lumière ultra-violette, elle contient peu d'éléments actifs et peut être éliminée . La deuxième bande est d'un jaune brillant et contient la masse principale de la par- tie active .
La troisième bande est brun clair et contient une faible quantité de la substance active mais elle est généralement tellement faible que son traitement ulté- rieur n'est pas rentable, bien qu'on puisse facilement récupérer la matière si on le désire . L'éluatcontenant la matière active correspondant à la bande jaune bril- lant, est concentré sous vide jusqu'à siccité et l'on soumet le produit sec à l'extraction avec de l'alcool n-butylique, celui-ci contenant toute la matière active.
On lave à l'eau l'extrait d'alcool n-butylique en utili- sant de petites quantités d'eau et la phase butanol conte- nant la partie active est concentrée sous- vide à un faible volume à partir duquel on peut précipiter la matière active par l'addition d'éther absolu. La précipitation de cette
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matière peut s'effectuer par phases/successives. On lave le précipité à l'éther puis on le sèche. Le produit séché peut être ensuite dissous dans de l'eau, acidifié à l'acide chlorhydrique pour donner au pH une valeur de 2 à 3, ' On glace ensuite le produit et enfin on élimine l'eau par sublimation. Le produit séché ainsi obtenu a une force biologique de 2.900 unités par milligramme en l'essayant suivant l'essai normal oc utilisé pour la pénicilline G contre la Staphyloccocus auréus.
On peut "salifier" la matière active dans diffé- rents solvants en utilisant des sels tels que le sulfate d'ammonium ou le chlorure de sodium, y compris certains esters tels que l'acéta/b.e de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, etc. des alcools tels que les alcools isopropyliqua, butylique, etc.., ainsi que l'acétone ou une autre cétone. Si la matière active est extraite en utilisant les solvants ci-dessus sans employer de sels, il en résulte un rendement beaucoup plus faible sont et de plus certains de ces solvants/miscibles à l'eau, à moins d'y ajouter du sel. Quelles que soient les condi- tions l'emploi du sel diminue la solubilité du solvant et de l'auréomycine dans l'eau .
!,Iode opératoire B.
Bien que le procédé généralisé d'adsorption chroma- tographique puisse être appliqué comme l'un des plus Mariés et des plus puissants de tous les procédés d'iso- lement de substances antibiotiques à partir de mileux de fermentation , il nécessite naturellement une quantité énorme de matières et donne des rendements comparative- ment faibles.
La variante B du mode opératoire est basée sur le fait que l'auréomycine possède des propriétés particuliè- res telles que certains sels métalliques ne sont ue faiblement solubles dans des solutions aqueuses dans la
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gamme de pH comprise entre 6,0 et 10. Les plus utiles parmi ces sels sont ceux de calcium, baryum, magnésium et strontium.
Le sel de calcium résultant de l'usage d'oxyde ou d'hydroxyde de calcium est particulièrement convenable en raison du faible prix de la matière première que l'on trouve à l'échelle industrielle* D'autres hydroxy- des métalliques divalents, tels que celui de baryum, stron- tium et magnésium donnent également des résultats extrême- ment avantageux, mais en raison de leur toxicité ou de leur prix élevé, il est généralement préférable d'utiliser de l'hydroxyde de calcium. On peutùajouter l'hydroxyde tel quel, ou l'obtenir sur place par la réaction d'un Les. sel soluble du métal et d'une basees/hydroxydes de so- dium , potassium, lithium et ammonium peuvent être utilisés pour rendre la substance alcaline si l'un des métaux di- valents est déjà présent, l'hydroxyde étant principalement utilisé pour le réglage du pH.
La gamme préférée de pH pour la séparation est re- lativement étendue. Elle dépend du moût particulier utili- sé, de la concentration d'auréomycine dans le moût,des cations présents, de la température et d'autres variables.
Dans un moût particulierpar une séparation initiale effec tuée à un pH de 6,2 on a laissé 25 % environ du produit total dans le filtrat, alors qu'à un pH de 7 on ne laissait que 15 %. Un pH de 8,5 à 10 permet une plus grande récupération et réduit la perte à ce point de vue .
Lorsque le pH du moût de fermentation est réglé entre 6 et 10, on peut filtrer le moût ou séparer les particules solides d'une façon différente,la majeure partie de l'auréomycine étant présente à l'état insoluble et retenue avec le mycélium dans la gâteau du filtre,ce qui permet d'éliminer le filtrat qui contient la majeure
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partie des impuretés solubles. On constate fréquemment qu'une petite quantité d'un corps facilitant la filtra- tion fournit un gâteau filtrant plus rapidement.
Il est préférable de laver le gâteau, l'eau ordinaire du robinet pouvant être utilisée.
On peut séparer l'auréomycine du gâteau en utili- sant deux méthodes appropriées* L'une d'elles est basée sur la formation d'un sel soluble d'auréomycine avec des acides au-dessous d'un pH de 3, l'autre méthode étant basée sur la solubilité de l'auréomycine dans cer- tains solvants organiques* Les deux méthodes ne sont pas toutefois complètement indépendantes du fait que dans le procédé de purification à l'acide, normalement l'ex- trait acide est rendu de nouveau alcalin, avec le même groupe d'ions métalliques, et à ce moment on peut traiter au solvant le précipité provenant de la deuxième précipitationet extraire l'auréomycine de ce gâteau en u- tilisant des solvants. On constate que le gâteau ne contient pratiquement pas de graisse de sorte que la sépa ration ultérieure des graisses n'est alors pas indis- pensable.
Purification à l'acide.
Le gâteau lavé peut être mis en suspension dans de l'eau et acidifié à un pH d'environ 1 à 3, un pH pro- che de 1,5 étant préférable . On peut utiliser l'un quel- conque des acides-minéraux ou des acides organiques forts. La limite inférieure de pH 1 est généralement déterminée davantage d'après les caractéristiques de corrosion de l'installation de production que par des limitations inhérentes à la méthode. Si l'on utilise un appareillage an verre, on peut utiliser une valeur de pH sensiblement inférieure à 1 en toute sécurité
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mais cela n'offre aucun avantage particulier et demande davantage d'acide .Ensuite on filtre les solides en suspension .
L'auréomycine est plus soluble à chaud et des températures atteignant jusqu'à 80 C ne déterminent généralement pas une décomposition excessive L'extrait peut être simple ou multiple et pour obtenir les meil- leurs résultats il peut occuper un volume total allant du 1/4 au double environ du volume général du moût.Les solides en suspension sont ensuite filtres, lavés avec un acide dilué ayant approximativement la même concentra- tion, puis on enlève les solides* Le filtrat qui con- tient l'auréomycine peut être rendu alcalin à l'aide des substances alcalines énoncées plus haut, en présence d'un des métaux bivalents indiqués, puis on recueille les particules solides. On peut remplacer le filtre par une centrifugeuse.
On peut jeter le filtrat et récupérer les particules solides recueillies- Si l'on a utilisé de l'acide chlorhydrique comme acide et de l'hydroxyde de calcium comme alcalino-terreux, à ce moment les solides seront constitués dans la proportion de 25 % au moins par de l'auréomycine pure .On peut sécher les solides et les utiliser pour administration par voie buccale ou pour usage vétérinaire sans autre puri- fication, surtout si ce sont les sels de calcium ou de magnésium qui sont ainsi isolés* Pour usage parentéral' pour l'homme il est nécessaire d'effectuer une purifi- cation ultérieure .
Les solides, avec ou sans séchage, peuvent être ensuite mis en suspension dans de l'acétone ou un autre solvant organique, en présence d'eau, d'un sel tel que le chlorure de sodium, sulfate d'ammonium ou autre sel soluble qu'on ajoute pour relarguer l'auréomy.- cine et obtenir une séparation plus nette de la couche
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aqueuse et de la couche de solvant, puis on sépare la couche de solvant de la couche aqueuse et des solides.
Pour obtenir de bons rendements, il y a lieu de répéter encore au moins une fois l'extraction . Ou bien les sels acides ou bien les sels basiques avec l'ammonium et le groupe des alcalins sont plus solubles que le produit neutre ou le sel alcalino-terreux et l'on peut ajouter un alcali, y compris l'hydroxyde d'ammonium, ou bien un acide, pour augmenter la solubilité de l'auréomycine,Les filtrats de solvant sont ensuite réunis, le solvant évaporé et la matière concentrée rendue acide,le précipité cristallissé et séparé par filtration sous forme de sel acide d'auréomycine.
Purification/par solvant.
Suivant une variante du procédé de purification,on peut purifier le gâteau de filtration provenant de la précipitation originale, sous forme d'un sel métallique divalent, à un pH de 6 à 10, en opérant l'extraction au moyen d'un solvant. Certains solvants dissolvant l'auréo- mycine présente et laissent le gâteau résiduel contenant la plus grande partie des impuretés* L'extraction peut être effectuée avec un solvant soluble ou miscible à l'eau, tel que -acétone, méthyl-éthyl-cétone, d'autres cétones, alcool méthylique, alcool éthylique ou autres alcools etc. et peut être conduite, de préférence,à un pH soit de 8 à 10, soit inférieur à 3. Le solvant est légèrement moins efficace dans la gamme plus proche de la neutralité, bien qu'aux dépens d'une récupération aussi satisfaisante on puisse utiliser le solvant dans cette gamme.
Si l'on sèche le gâteau pour éliminer l'eau , on peut opérer l'extraction au moyen d'un solvant non misci- ble dans lequel l'auréomycine est soluble, cette phase particulière s'opérant en milieu anhydre, Les meilleurs rendements exigent l'adoption de méthodes à extractions
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répétées trois extractions ou davantage étant normale- ment le plus économique . On peut appliquer la méthode à contre-courant et l'on dispose toutefois de l'équipe- ment nécessaire . On jette le gâteau extrait.
L'extrait de solvant ou filtrat contenant l'auréomycine brute est ensuite transféré à un évaporateur où l'on élimine de l'auréomycine le solvant à une température relative- ment basse et par l'emploi du vide .Le solvant peut être récupéré et remis dans le cycle après une purifica- tion appropriée, y compris l'élimination de l'excès d'eau si nécessaire . Lorsqu'on a éliminé le solvant, il y a normalement une certaine quantité d'eau rési- duelle présente avec l'auréomycine ; on rend cette eau résiduelle acide à un pH compris entre environ 3 et celui d'une solution acide décinormale, puis à ce degré d'aci- dité on la dilue à un volume suffisant pour dissoudre l'auréomycine .
Ensuite on soumet à l'extraction la solu- tion aqueuse à l'aide d'un solvant des matières grasses non miscible à l'eau, puis on sépare l'extrait. Parmi les solvants qui conviennent à cette extraction on peut ci- ter le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, etc...
La phase aqueuse raffinée est ensuite ajustée à un pH compris entre 6 et 10 en ajoutant l'un des ions métalliques bivalents mentionnés plus haut. A ce stade, il est généralement préférable d'utiliser des ions calci,- ou magnésium car leurs sels sont moins toxiques que les sels de baryum ou de strontium, et il est plus facile d'obtenir un produit non toxique si l'on évite les sels toxiques plutôt que d'avoir à les séparer plus tard.
Le précipité séparé par l'addition de la matière alcalin- est ensuite séparé. Les solides séparés sont ensuite remis en suspension dans l'eau et acidifiés avec de l'acide chlorhydrique. Il est préférable d'employer
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une quantité d'eau relativement petite. L'acide préféré est l'acide chlorhydrique, l'auréomycine se séparant par cristallisation au refroidissement sous forme de chlorhy- drate d'auréomycine . Le sulfate ou le phosphate ou autres sels acides peuvent être préparés et utilisés à des fins thérapeutiques. Le chlorhydrate est mieux accepté par le corps médical et c'est pour cela qu'on la choisi en général.
On peut répéter les phases d'extraction et de purifi- cation mais normalement cette répétition n'est pas nécessai- re attendu qu'elle n'augmente pas suffisamment la pureté du produit pour justifier la perte de rendement.
L'auréomycine ainsi isolée peut être transformée en sel de calcium et de sodium si le médecin utilisant la substance thérapeutique désire plus particulièrement un sel métallique .
Pour permettre de bien comprendre le mode opératoire B, en voici une description avec référence à quelques exemples :
Exemple 37.
On a préparé un lot de 1800 litres de mmût en ré- glant le pH à 8,5 au moyen de chaux vive en poudre fine.
Puison a ajouté au moût 1 %, en poids, d'un adjuvant de filtration, terre d'infusoire , vendue dans le commerce sous l'appellation de "Hy-Flo". Un filtre-presse a été en- duit préalablement avec une petite quantité d"Hy-Flo", puis on a fait passer le moût à travers le filtre-presse.
On a lavé le gêteau obtenu avec 100 litres d'eau du robi- net. Le poids du gâteau dépassait légèrement les 315 kg. et contenait environ 36 % d'humidité. Ensuite, on a mis en suspension le gâteau dans 800 litres d'eau et on a aci- difié jusqu'à un pH de 1,5 avec de l'acide chlorhydrique, et filtré . On a remis le gâteau en suspension dans 400 litres d'eau et filtré à nouveau, opération suivie d'une troisième mise en suspension dans 400 litres d'eau et d'une filtration, les deux derniers filtrats étant utilisés
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comme acide initial pour la mise en suspension du lot suivant.
On a réglé le filtrat à un pH de 8,5 avec de l'hydro- xyde de calcium, puis on a recueilli les particules soli- des dans une centrifugeuse. L'emploi d'un adjudant de filtration est inutile dans une centrifugeuse. On a obte- nu 20 kg d'un produit impur contenant environ 75 % d'eau.
L'auréomycine ainsi précipitée a été mise ensuite en suspension dans un mélange de 80% d'acétone et 20 % d'eau, le pH a été ajusté à 1,5 avec de l'acide chlorhydrique et le volume amené à 150 litres, et on a filtré. On a de nouveau traité le gâteau avec une solution semblable acétone-eau, on a réuni les filtrats, on a éliminé l'acé- tone par distillation et finalement on a cristallisé l'auréomycine ainsi obtenue en présence d'acide chlorhy- drique .On a obtenu un rendement de 52 grs.
Exemple 38.
On a préparé un lot de moût fermenté contenant 323 grs. d'auréomycine, quantité déterminée par analyse biologique, dans 1. 650 litres de moût, en réglant le pH à 8,5 par addition de soude caustique 10 fois normale, dont il a fallu environ 1 litre 1/2. Puis on a ajouté 1 %, en poids, d'un adjuvant de filtration terre infusoi- re du commerce connu sous le nom "Hy-Flo" et filtré le moût à travers un filtre presse . On a mis le gâteau en suspension dans 175 litres d'acétone, réglé le pH à 10,0 par addition de soude caustique 10 fois normale dont il a fallu 500 cc. environ ; on a ajouté 16,5 kg de sel, on a délayé et on a filtré .
Le gâteau a été ex- trait de nouveau d'une façon analogue en utilisant 150 li- tres d'acétone, dont le pH était réglé à 10 et contenait 16,5 kg. de chlorure de sodium, et enfin on a réuni les filtrats.
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Les solutions à l'acétone ont été concentrées sous vide à 26 litres et l'on a réglé le pH de la phase aqueuse restante à 2 à l'aide d'acide chlorhydrique concentré dent il a fallu 160cc environ. La liqueur acidifiée a été soumi- se 3 fois à l'extraction à l'aide de 5 litres de chloro- forme. On a lavé chaque extrait au chloroforme en utili- sant son propre volume d'eau acidifiée à un pH de 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique . Les phases aqueuses ont été réunies, filtrées et ajustées à pH 7,05 en ajoutant de la soude 10 fois normale, 130 cc environ étant nécessai- res pour cela. Le précipité ainsi formé a été passé dans une centrifugeuse, mis en suspension dans 250 cc. d'eau distillée, et lavé, séparé de nouveau et ensuite mis en suspension dans 600 cc. d'eau distillée .
La bouil- lie ainsi formée a été acidifiée avec de l'acide chlorhy- drique concentré ajouté goutte à goutte jusqu'à un pH de 1,2-1,5. On a d'abord dissous le précipité puis on l'a fait cristalliser sous forme de chlorhydrate d'auréomyci- ne. On a lavé les cristaux avec 650 cc d'alcool absolu froid, puis avec la même quantité d'éther froid. On a obte- nu un rendement de 127 gr. de chlorhydrate d'auréomycine avec une pureté de 96 %, ce qui représente un rendement total de 39,3 %.
Mode opératoire C.
La variante C du procédé suivant l'invention constitue un système plus économique et plus pratique que celui de l'adsorption chromatographique, permettant d'utiliser de plus faibles quantités de substances peu coûteuses.
L'auréomycine, que contient le moût de fermentation est principalement sous forme de solution ou peut être mis en solution en abaissant la valeur du pH, en rendant le moût nettement acide, A la fin du processus de fermen- tation le pH peut varier d'environ 7 à environ 4, suivant
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les méthodes utilisées et le bouillon debulture . Alors que dans la zone des pH inférieur de cet intervalle, la majeure partie de l'auréomycine existe à l'état soluble, on constate qu'en abaissant le pH au voisinage de 3 ou au-dessous, la totalité de l'auréomycine tend à passer en solution et là offre moins de tendance à être adsorbée ou maintenue par les mycelia et autres parties solides du moût de fermentation.
Un pH s'élevant jusqu'à 5 donnera des rendements maxima dans le cas de moûts à faible rendement, mais lorsqu'on utilise un moût à rendement élevé, certaines pertes peuvent se pro- duire à moins que le pH ne soit plus acide que 5. Les con- centrations de sel, la nature des cations présents, la natu- re de l'adjuvant de filtration, etc.. ont toutesune influence sur la récupération lorsqu'on opère à des acidités limitées.
S'il y a présence de calcium, baryum, magnésium, strontium, etc., l'auréomycine est moins soluble, dans la zone de pH supérieure, que si le moût contient relativement plus de sodium, potassium ou substance analogue comme composant cationique et moins de cation du groupe des alcalino-ter- reux:. Contrairement à de nombreux autres produits de fermen- tation, on a constaté qu'un acide utilisé pour acidifier ne détruit pas, par lui-même, l'auréomycine . Lacide sul- furique, l'acide chlorhydrique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique, et les acides organiques forts tels que l'acide acétique et leurs mélanges sont satisfaisants bien que pour une raison de prix de revient on utilise normale- ment de l'acide sulfurique dans cette phase par suite de son bas prix commercial.
Le moût peut être acidulé à un pH de 3 à 2,5 avec des résultats très satisfaisants, Une plus forte acidité est inutile, attendu qu'elle s'augmente pas d'une manière appréciable les rendements et occasionne une consommation inutile d'acide . Le moût de fermentation est filtré ou centrifugé pour séparer les liquides des soli-
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des; les solides sont lavés, de préférence, avec de l'eau acidulée, puis rejetés.
Ensuite, le filtrat est rendu plus alcalin, S'il n'y a pas déjà un alcalino terreux présent, il est favorable d'ajouter comme substance d'alcalinisation l'un des hydro- xydes alcalino-terreux. Les hydroxydes de calcium ou substances formant de l'hydroxyde de calcium dans la solu- tion, conviennent plus particulièrement en raison de leur bas prix et de la facilité d'obtenir des substances de raisonnablement pures.Les hydroxydes de strontium,/ magné- sium ou de baryum , ou bien de substances qui donnent des hydroxydes dans une solution alcaline, sont également d'un emploi satisfaisant. Si un ion bivalent est présent,comme cela se produit généralement dans les procédés de fermenta- tion, on peut employer dé l'hydroxyde de sodium de potassium ou de l'ammoniaque ou autres substances basiques pour élever le pH.
Suivant la température et la concentration-, l'auréo- mycine commence à précipiter lorsque le pH atteint 6 environ, bien que la substance filtre plus rapidement et se manipule plus facilement si le pH est élevé jusqu'à 10.On peut même dépasser 10 sans déterminer une solubilisation indésirable de la matière . On obtient plus facilement des fractions offrant une pureté supérieure lorsque le pH est compris entre 9 et 10. Les solides précipités pen- dant que/la matière est rendue plus alcaline sont éliminés par filtration ou centrifugeage ; peut utiliser à cet effet, si on le désire, un adjuvant de filtration; on lave les solides et jette les filtrats.
A ce moment, les particu- les solides contiennent l'auréomycine impure. L'aureomyci- ne impure ainsi recueillie peut être utilisée à des fins thérapeutiques, surtout pour absorption par voie buccale pour les animaux. La toxicité à ce point du procédé peut va-
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rier suivant l'espèce utilisée dans la fermentation.
La pureté dépend à un tel point du moût employé, des rende- ments du moût et d'autres variables, que le degré d'utili- té varie beaucoup, mais en général avec un moût à haut rendement, les aolides peuvent contenir 25 % d'auréomycine pure. -
Lorsque l'auréomycine doit être administrée aux ani- maux la substanse peut être acidifiée à l'aide d'une petite quantité d'un acide enùvue d'obtenir lesùsels acides les plus favorables, comme par exemple le chlorhydrate. Pour l'usage parentéral ou pour l'hommeil est désirable de purifier ultérieurement l'auréomycine.
On peut employer différentes méthodes pour cette purification ultérieure .
Purification à l'acide.
Une méthode convenable consiste à aciduler de nou- veau les particules solides recueillies, par exemple avec l'un quelconque des acides qui conviennent pour la phase d'acidification initiale . Pour plus de facilité, on peut appliquer une méthode à contre-courant. Le pH peut se situer entre bien au-dessous de 1 et 3 environ, bien quun pH de 2 à 2,5 donne des résultats particulièrement satis- faisants.
Les insolubles sont filtrés, lavés et éliminés, La solution acide régénérée est ensuite rendue plus alca- line .On peut éliminer certaines impuretés en réglant le pH à 5,2 ; à 5,5 à l'aide de la soude, en ajoutant un volume égal d'acétone, en prélevant par filtration le précipité ainsi formé et en rinçant le précipité avec un petit volume d'acétone à 50. Normalement cette phase n'est pas indispensable si l'on a pris suffisamment de précautions en cours des phases précédentes.
La solution acide régénérée à l'origine ou la solution ainsi purifiée est ensuite alcalinisée à un pH compris entre 8 et
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10 au moyen de la soude et après avoir mélangé avec son propre volume d'acétone, l'auréomycine est relarguée en utilisant un sel tel que le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium, ou autres sels solubles dont l'effet sera de séparer nettement la couche d'acétone et de réduire la solubilité de l'acétone dans la couche aqueuse On peut examiner la séparation à la lumière ultra-violette et si l'on a correctement opéré la couche d'acétone sera d'un jaune brillant tandis que la couche épaisée ou inférieure sera bleueOn sépare la couche d'acétone, on soumet de nouveau à l'extraction la phase aqueuse,
jusqu'à ce qu'il soit possible de déterminer par la lumière ultra- violette que l'on en a bien extrait la partie active, on élimine la couche aqueuse résiduelle et on concentre sous vide les extraits d'acétone jusqu'à ce que l'acétone ait été sensiblement éliminée. En raison de la présence d'eau résiduelle dans la couche d'acétone, il reste un li- quide aqueux qui contient l'auréomycine sous forme de précipité. On filtre ou on soumet à la centrifugation la solution, puis on lave le précipité. L'auréomycine ainsi formée peut être utilisée telle quelle, ou dissoute convenablement dans de l'alcool méthylique et acidifiée avec de l'acide chlorhydrique , l'alcool méthylique étant éliminé sous vide .
Si cela est désirable ou néces- saire on peut ensuite laver le produit séché en utilisant de l'alcool absolu afin d'éliminer les substances colo- rées ; ensuite on lave à l'éther et on sèche.
Une purification supplémentaire peut être éventuel- lement exécutée par cristallisation du sel d'acide picri- que, bien qu'une telle purification ne soit pas normale- ment nécessaire, mais sert de contrôle pour s'assurer que la substance isolée présente un degré suffisamment élevé de pureté pour satisfaire aux exigences de la pharmacopée.
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Purification par solvant.
Au lieu de dissoudre dans l'acide les particules solides soit séparées, soit séchées, à partir de la préci- pitation alcaline originale, on peut les extraire à l'aide d'un solvant, organique acide tel que les acides mentionnés ci-dessus dans de l'acétone, de la méthyl- éthyl-cétone ou autre cétone, de l'alcool méthylique ou éthylique ou autre alcool, tout en maintenant à un pH de 3 ou au-dessous, 1,5 étant la valeur préférée . La quantité de solvant utilisée sera excessivement variable, suivant le moût utilisé, les rendements d'auréomycine dans la fermentation et le degré de pureté à ce point.On peut utiliser la lumière ultra-violette pour distinguer l'auréomycine qui est extraite .
Un volume de solvant com- pris entre 5 et25 % du volume du moût, en deux ou plu- sieurs extractions successives,donnera normalement les résultats désirés.Le solvant, que contient l'extrait, est ensuite soumis à l'évaporation , les particules dis- soutes dans de l'eau acidulée, soumises à l'extraction avec un solvant de corps gras, l'extrait de solvant jeté et la substance raffinée est ajustée à un pH de 6 à 10 à l'aide d'alcali caustique ; on recueil- le les particules solides, on élimine le filtrat, acidi- fie les particules solides avec de l'acide chlorhydrique, on délaye avec de l'eau, lave et sèche pour obtenir par ce moyen du chlorhydrate d'auréomycine.
Ainsi qu'il apparaîtra clairement aux spécialistes de la question, pour des applications spéciales on peut répéter l'une quelconque du toutes les phases de purifica- tion et pendant un lavage ou une extraction quelconque, on peut remettre dans le cycle les extraits ou liquides peuvent être de lavage, les extraits ou les liquides de lavage/obtenus par des phases successives ou par une méthode à contre-
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courant, ce qui permet d'augmenter un peu les rendements.
Toutes ces modifications d'ordre inférieur ne sortent pas du cadre de l'invention et doivent être considérées comme faisant partie de celle-ci. Certaines modifications secondaires peuvent être prévisibles en raison des variations, que subissent en particulier les moûts exploi- tés, du prix de revient et de la disponibilité ou de la difficulté d'approvisionnement de certains solvants et/ou d'acides et alcalis, par exemple dans les phases d'alcalinisation où l'on indique l'emploi d'hydroxyde
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de sodium ou de soude caustique ,,L. 'hydroxyde de potassium ou potasse caustique est satisfaisant du point de vue théorique mais il est légèrement plus coûteux, de sorte qu'à l'échalle industrielle 1' emploi du composé du sodium plutôt que celui du potassium est normalement plus avan- tageux .
De même, les hydroxydes de baryum, de strontium ou de magnésium peuvent être utilisés à la place de celui de calcium, mais ce dernier doit être utilisé de préfé- rence lorsqu'on opère à l'échelle industrielle car il est meilleur marché et d'un approvisionnement plus facile, Toutefois, si pour une raison quelconque on n'en trou- vait pas, les autreshydroxydes peuvent être utilisés. Lors qu'on utilise du baryum ou du strontium il faut avoir bien sein de s'assurer de l'élimination de la totalité de ces substances au cours des phases ultérieures, afin que la matière finale ne contienne aucun de ces poisons.
Pour permettre de mieux comprendre le mode opératoi- re C, on va le décrire maintenant avec référence aux exemples ci-après.
Exemple 39
On a acidifié un moût fermenté à un pH de 2,5 à
3 avec de l'acide sulfurique contenant 2 équivalents molé- culaires par litre, on a ajouté 1% d'adjuvant de filtra-
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tion vendu dans le commerce sous l'appellation de "Hy-Flo" SuperCel" , et filtré. A 5 litres du filtrat contenant 1.000 unités par cc de substance active on a ajouté une solution à 20 % contenant 5 grammes de chlorure de baryum et une quantité suffisante de soude caustique 10 fois normale pour amener le pH entre 9,7 et 10. On a ajouté une petite quantité d'adjuvant de filtration, filtré le mélange et jeté le moût épuisé. La liqueur jetée contenait environ 8,4% de l'activité totale .
Le gâteau obtenu pou- vait être utilisé pour les applications vétérinaires,cepen- dant pour l'usage parentéral sur l'homme on a mis en sus- pension la précipité résultant dans de l'eau et on a acidi- fié avec de l'acide sulfurique à un pH de 2, un volume total de 590 cc étant obtenu . La solution acide régénérée a été ajustée à un pH compris entre 5,2 et 5,5 à l'aide de soude caustique 5 N et on ajouté un volume égal d'acé- tone le précipité formé a été éliminé et le pH du filtrat résultant ajusté à un pH entre 9,2 et 9,5. On peut facile- ment mesurer la valeur du pH en mélangeant une certaine quantité d'acétone avec un volume égal d'eau pure et en me- surant le pH avec une électrode de verre . On a ajouté 250 grs. de chlorure de sodium par litre de solution et la couche d'acétone s'est séparée .
On a éliminé cette couche d'acétone et l'on a extrait de nouveau la phase aqueuse avec un volume plus faible d'acétone, on a séparé la couche d'acétone et exécuté une troisième extraction . On a réuni les trois extractions d'acétone, puis on les a concentrées par distillation sous vide jusqu'à élimination de l'acéto- ne . L'auréomycine ainsi précipitée dans l'eau résiduelle a été séparée par centrifugation , lavée avec un petit volume d'eau et dissoute dans de l'alcool méthylique, puis avec de l'acide chlorhydrique , acidifiée à un pH de 2,5.
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Le chlorhydrate d'auréomycine ainsi formé a été concentré sous vide à siccité et l'on a constaté qu'il était suffisamment pur pour un usage thérapeutique . Pour ac- croître encore la pureté, on a dissous la substance dans de l'alcool éthylique et précipité la matière acti- ve au moyen d'éther absolu . Une récupération totale de 25 % a été obtenue .
Cette dernière phase n'est normalement pas nécessai- re mais elle constitue une phase de vérification pour s'assurer de la préparation d'un produit pur.
Exemple 40.
On a ajusté à 1,5 le pH de 1. 600 litres d'un moût de fermentation avec de l'acide sulfurique, on a filtré, ajusté le filtrat à un pH de 10 avec de l'hydroxyde de cal cium, recueilli les particules solides, qu'on a lavées. On a formé une bouillie avec le gâteau, puis on l'a soumise à l'extraction avec un total de 200 litres d'acétone, en 3 fractions , à un pH de 1,5, en utilisant de l'acide chlorhydrique pour régler le pH. On a ajusté l'extrait à un pH de 1,5 puis on a évaporé le solvant. La couche aqueuse résiduelle a été diluée à 30 litres avec de l'eau , réajustée à un pH de 1,5 puis on a procédé à l'extraction à l'aide de 30 litres de chloroforme. On a éliminé le chloroforme pour récupérer plus tard le sol- vant. Le résidu aqueux a été ajusté à un pH de 9,5 avec de la soude, et on a recueilli les particules solides sur un filtre .
On a remis les solides en suspension dans l'eau, ajusté le pH à 1 avec de l'acide chlorhydri- que, on a obtenu un total de 20 litres.e chlorhydrate d'auréomycine résultant a été filtré et séché. On a récupéré environ 30 % de l'auréomycine contenue dans le moût de départ.