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La présente invention se rapporte à un antibiotique nouveau et utile dénommé Lmégam, cine et plus souvent tétracycline, et à sa préparation
Elle concerne plus spécialement des procédés de préparation de cet anti- biotique par fermentation, des procédés pour le séparer et le concentrer de ses solutions brutes, notamment des bouillons de fermentation, et sa purification. L'invention s'étend a l'antibiotique en solution diluée, en suspension dans l'huile -, en produits concentrés bruts, en formes cristallines solides plus pures, et sous la forme de cristaux-purs.
Au cours de ces dernières années, on a isolé un certain nombre de produits métaboliques du développement des bactéries et champignons inférieurs et on a constaté que ces produits,possédaient des propriétés thérapeutiques intéressantes. On peut citer notamment la pénicilline, la streptomycine, la gramicidine, la tyrocidine, la bacitracine, la'subtiline, la streptothricine, l'auréamycine (chlorotétracycline), la terramycine (oxytétracycline) et d'autrès. Certains de ces produits se sont révélés extrêmement utiles par leur efficacité contre les-organismes pathogènes.
D'autres ne possèdent qu'une utilité limitée pour diverses raisons, par exemple à cause de leur toxicité La chlorotétracycline et l'oxytétracycline sont particulièrement utiles par leur spectre d'activité étendu. '
Le but de l'invention est de procurer un nouvel anti-biotique à spectre étendu donnant de meilleurs niveaux sanguins et moins de réactions secondaires que la chlorotétracycline et l'oxytétracycline et, en particulier, plus stable que la chlorotétracycline en milieu alcalin. Un autre but de l'invention est de,procurer des procédés de préparation de ces substances antibiotiques pouvant être appliqués industriellement.
On a découvert, suivant la présente invention, l'antibiotique dénommé Omégamycine et un procédé de préparation de l'Omégamycine suivant lequel on cultive une espèce d'organisme produisant l'Omégamycine jusqu'a ce que la solution de culture présente une activité antibactérienne appréciable.
Suivant un aspect de la présente invention et dans un procédé de préparation de l'Omégamycine, on cultive une espèce de Streptomyces produisant l'Omégamycine dans une solution aqueuse d'hydrates de carbone contenant des éléments nutritifs azotés dans des conditions aérobies submergées jusqu' a ce que la solution présente une activité antibactérienne appréciable, puis on sépare l'Omégamycine ainsi obtenue du bouillon de fermentation.
On a découvert suivant la présente invention une substance pouvant inhiber le développement de bactéries a Gram-positif et a Gram-négatif susceptible de former des sels avec des acides et des métaux, cette substance contenant les éléments carbone hydrogène, azote et oxygène et présentant le spectre de valeur Rfdécrit plus loin.
La substance ainsi découverte suivant la présente invention est un composé de la formule:
EMI1.1
Le produit de la présente invention) l'Omégamycine, exerce une action inhibitrice sur le développement de nombreuses bactéries comme décrit en détail ci-dessous.
Ce nouvel antibiotique est préparé entre autres procédés par culture dans des conditions déterminées particulières d'une espèce de micro-or- ganisme non décrite jusqu'à present, à laquelle on a provisoirement donné le
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EMI2.1
nom de Stre-ptoulyces.13L 5672Ul et qu'on a isolée d'un échantillon de sol. La aescription de cet organisme est donné ci-dessous.
L'organisme BL 567201 sp. nov. qui produit l'Omégamycine appar-' tient au genre appelé Streptomyces. Le développement de cet organisme est
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satisfaisant sur un mélange de g7,yyrérol-asparagine-extrait de boeuf-agar à 30 C. Sur ce milieu, des nypnesaériennes gris souris se forment et un pigment vert jaunâtre est secrété dans l'agar. Le mycélium est composé d' hyphes ramifiées dont les éléments jeunes sont Gram-positifs. Des conidies
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se forment sur les hypnes aériennes.
La nouvel antibiotique peut être également préparé entre autres procédés par culture dans des conditions déterminées particulières de l'une ou l'autre espèce d'un certain nombre de micro-organismes non décrits jusqu'
EMI2.4
a présent qui ont été appelés provisoirenent ,trsptomyces BL 657714, Streptomyces bel 673033, Streptomyces BL 678035, Streptomyces t3L 678Qp. Streptomy- ces HD 678046, Streptomyces BL 678079, Streptomyces BL 678110. Tous ces organismes ont été isolés d'échantillons de sol. Ils appartiennent tous au genre couramment appelé Streptomyces. Le développement de chacun'de ces organismes sur un milieu glucose-asparàgine-extrait de viande-agar pendant 14 jours
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à -je-00 a été effectué et les résultats ont été notés.
Les observations faites sur chacun de ces organismes sont reprises dans le tableau ci-dessous.
EMI2.6
<tb>
<tb> Organisme <SEP> Type <SEP> et <SEP> couleur <SEP> du <SEP> mycélium <SEP> Couleur <SEP> du <SEP> pigment <SEP> sécrété <SEP> dans
<tb>
EMI2.7
¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯..¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ le milieu a base d'agar. tii. z7714 Mycélium aérien abondant et Pigment soluble couleur ananas
EMI2.8
<tb>
<tb> spores <SEP> de <SEP> couleur <SEP> blanche <SEP> perle <SEP> fumée
<tb>
EMI2.9
d 678011 Mycélium aérien moins gris Pigment soluble couleur ananas
EMI2.10
<tb>
<tb> clair
<tb>
EMI2.11
BL 678035 Colonie incolore sans myca.
Pigment soluble couleur ananas lium aérien sL 67tst7:0 Colonie incolore sans mycé- Pigment soluble couleur ananas
EMI2.12
<tb>
<tb> lium <SEP> aérien
<tb> BL <SEP> 678046 <SEP> Colonie <SEP> incolore <SEP> avec <SEP> mycé- <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> couleur <SEP> ananas
<tb> lium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> très <SEP> rare
<tb> BL <SEP> 678079 <SEP> Colonie <SEP> incolore <SEP> avec <SEP> mycé- <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> couleur <SEP> ananas
<tb> lium <SEP> aérien <SEP> gris <SEP> ciment <SEP> très
<tb> rare
<tb> BL <SEP> 678110 <SEP> Colonie <SEP> incolore <SEP> avec <SEP> mycé- <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> couleur <SEP> ananas.
<tb> lium <SEP> aérien <SEP> gris <SEP> ciment <SEP> très
<tb> rare
<tb>
Les descriptions des couleurs sont empruntées au Dictionnaire des couleurs de Maers & Paul, lère édition.
EMI2.13
Pour la préparation de l'Omégamycine, la Demanderesse ne désire pas se limiter à cet organisme particulier ou aux organismes répondant entièrement a la description ci-dessus, qu'on a donnée uniquement à titre d' illustration. Elle désire spécialement comprendre 3.'emploi d'organismes qui
EMI2.14
sont des produits d mutation de l'organisme décrit, obtenu par des agents de mutation tels que les rayons-X, les rayons ultra-violets, les gaz azotés etc.
L'Omégamycine est un agent thérapeutique de valeur, par exemple en médecine humaine ou véterinaire. L'Omégamycine possède comme avantages particulier un spectre étendu, des niveaux sanguins élevés et une faible
EMI2.15
toxicité. L'0mµgamycine présente une résistance extrêmement utile à la de- gradation--' par la chaleur ou l'eau dans des milieux alcalins ou acides. Certains métaux et sels d'addition acides de tétracycline sont encore plus utiles que la tétracycline de base par leur nygroscopicité plus réduite et leur
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rlus grande solubilité dans l'eau.
EMI3.1
L'antibiotique 0mégamycine est actif in vitro contre un certain nombre de bactéries Gram-positives et -négatives.
Le tableau ci-dessous mon-
EMI3.2
tre l'activite antibiotique de l'Omégamycine (lot Z5)e de l'Auréomycine lCy, ue la Terramyoine liCl et de la tétracycline placées dans une tranchée découpee dans une plaque d'infusion de coeur et d'agar (pH 7,0)a SPECTRE DE PLAQUE DE L) ONGAMOINE -------¯¯¯¯¯¯i2--2mj)¯------------
EMI3.3
n m Zone d'inhibitiQn en ma.
Urbanisme Omegamycine Tétracycline Aureomwclne Terramycine lot 7 (preparée par (j mg/e,3) (1 mg/cm3) (5mg/cmô) décnloration de
EMI3.4
<tb>
<tb> la <SEP> cnlorotetracycline
<tb>
EMI3.5
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯. i 5 rnd cm3 ) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI3.6
<tb>
<tb> Organisme <SEP> de
<tb> bodenneimer <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 9
<tb>
EMI3.7
Proteus Ál 'j 7 8 8 10 sn. ionnei 5 8 10 11
EMI3.8
<tb>
<tb> S. <SEP> enteritidis <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 13
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 15
<tb> S. <SEP> pullorum <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 13
<tb> A. <SEP> aeorogènes <SEP> 5 <SEP> b <SEP> 9 <SEP> 11
<tb> Ps. <SEP> fluorescens <SEP> 1 <SEP> 7 <SEP> 13
<tb>
EMI3.9
Alc. fe calis 6 11 z3 8 Pr. vulgaris u 6 4
EMI3.10
<tb>
<tb> V. <SEP> choieras <SEP> 8 <SEP> 11 <SEP> 11 <SEP> 14
<tb> Neisseria <SEP> sp.
<SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 11
<tb> C. <SEP> xerosis <SEP> 11 <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> > <SEP> 27
<tb>
EMI3.11
..mycoides 10 10 16 z7 .6.cereus 10 11 13 17 a.marcsscens U 2 z 0 M.tetragenus 11 15 z7 z'7 .f1exneri 14 11 10 14 .aysenteriae 11 10 15 G.alDicans 6 0 0 0 btanh.aureus 10 13 13 18 . typhosa 7 9 10 13 . coli 4 7 11 11 i.Daratyphi 3 9 il 16 14
EMI3.12
<tb>
<tb> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 16 <SEP> 14
<tb> Ps.aeruginosa <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> 9 <SEP> 7 <SEP>
<tb>
EMI3.13
.ga11inarum 8 11 12 13 B.anthracis 7 10 19 > z7 S.schottmulleri 10 12 12 15 D.subtilis 10 11 13 D.mycoides 0 1-1 8 15 20 Le spectre est obtenu comme suit :
On place environ JO cmj d'un bouillon d' infusion sterile de coeur (Difco) avec 2 % d'agar comme agent de solidification dans un vase de Petri stérile de 3 1/2 pouce (88 mm) de diamètre et on laisse durcir. Un pratique ensuite dans l'agar une tranchée de 8 mm x 40 mm a l'aide d'une spatule stérile. Le fond de la trancnée est fermé par une ou deux gouttes d'agar fondu. On applique ensuite à l'aide d'une petite boucle
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une trace d'un bouillon ce culture nutritif de 4 heures de chacune des bac- teries d'essai préalaolement incubées a 37 C, depuis le bord de la tranchée jusqu'a la paroi du vase de Petri. Jn remplit ensuite la tranchée d'une so-
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lution àe l'antibiotique a 5 my/cmj. Le vase est placé a 370 C'pendant 18-4 Heures.
Un mesure ensuite la longueur de la zone d'inhibition depuis
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le bord de la trancnee jusqu'au point où l'organisme d'essai s'est dévelop-
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pe, après le nombre ilneures cnoisi dans la période indiquée.
La metnode d'essai de diffusion sur plaque pour déterminer l'ac- tivité de l'Omégamycine est décrite ai-dessous.
Milieu de culture .
On utilise suivant les indications' de' l'étiquette ¯de l'agar pour essai de la
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streptomycine, (avec extrait de-levure) fabriqué par la Bàltimôre Biolsgical Laa-- tories, Baltimore, Maryland. Une préparation appropriée peut être obte- nue en mettant en suspension dans 1 litre d'eau distillée à un PH final de
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6,2 ou s, G un mélange de 1,5 g d'extrait de boeuf, 3 g d'extrait de levure 6,0 g de peptone (par exemple Gelysate) et 15 g d'agar. On laisse reposer la suspension pendant 5 minutes, on mélange jusqu'a ce que'on obtienne une suspension uniforme et on chauffe modérément en agitant.
On fait bouillir la suspension pendant une ou deux minutes ou jusqu'a ce qu'on obtienne une solution Un verse ensuite le milieu de culture et on le stérilise à 1210 C (pression de vapeur de 1 kg/cm2 au manomètre pendant 15 minutes).
Inoculum.
L'organisme d'essai est le Bacillus subtilis type américain n
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éo.3 de la Collection de Cultures. On ajoute une suspension de spores contenant j0.uùU.0uU de spores viables par emi a l'agar fondu décrit ci-dessus (refroidi a 5jQ C) pour obtenir un inoculum final à 2 %. Preparation des plaques
EMI4.5
On place 21 cm de l'agar stérile préparé ci-dessus dans chaque plaque d'une série de plaques de Pétri stériles rases et on les solidifie. un répartit ensuite uniformément 4 cm3 d'agar inocule sur la surface de la couche de base de chaque plaque. On place sur le milieu, des couvercles en acier inoxydable percés d'une série de trous après que le milieu ait été refroidi a la tempétature ordinaire et on dépose les échantillons d'antibiotique à essayer dans les trous.
Tampon.
EMI4.6
On utilise un tampon au pli 6,Z ou 8,0 suivant les cas pour ef- fectuer les dilutions. Au pH 6,2 , on utilise un tampon au citrate pour les dilutions. Un le prépare en mélangeant 192,12 g d'acide citrique anhydre avec
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lûbej g d'hydroxyde de sodium dans 1 litre d'eau distillée et en diluant le mélange a 1/10 de sa concentration par de l'eau distillée. Le pd du tampon doit être vérifié par la méthode potientiométrique et, si nécessaire, ramené au pli 6,2 par additon d'acide citrique ou d'hydroxyde de sodium. Les variations de pH ou de la concentration du tampon modifient fortement les dimensions des zones a'inhibition. On n'a pas trouvé nécessaire de stériliser le tampon.
La solution mère est conservée dans du cnloroforme ou du toluène et des solutions de travail fraîches sont préparées journellement. '
EMI4.8
Au prï 8,0 , on utilise un tampon au phosphate pour effectuer les dilutions. On le prépare en mélangeant 5 cm de riPQ molaire avec ' z 4 5 cmj de Kri Pu molaire et on dilue le mélange a 1/lûe de sa concentration thermique par de l'eau distillée. Le pd du tampon doit être vérifié par la métnode potentiométrique et, si nécessaire, ramené au pH 8,0 par addition de
EMI4.9
l'une ou de l'autre dissolutions de pnospnate. Les variations du pd ou de la concentration du tampon modifier Fortement les dimensions des zones d'innibition. On n'a pas trouvé nécessaire de stériliser le tampon.
La solution mère es-, conservée avec du chloroforme ou du toluène et les solutions de
EMI4.10
travail fraicaes sont préparées journellement.
Essai .Les échantillons inconnus sont dilués en cas de besoin dans le tampon. On utilise trois trous de cnaque plaque pour recevoir un même
EMI4.11
dilution de l'écnantillon. Après incuoation à .),-,0 G, on mesure les dia- metres des zones et on fait la moyenne de ces diamètres.
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EMI5.1
ùn a établi une différence entre le atreptomycète EL 567201 et une coucne de 1.auroJiaciens (NRRL &z09) obtenue du Nortnern Regional Re- search Laboratory, Péoria, Illinois, où elle était déposée comme une couche authentique productrice d'auréomycine, en observant les caractéristiques de développement sur un milieu glycérol-aparagine-extrait de boeufagar et agar Czapek-Dox contenant 1% de dextrine.
Les mélanges à base d' agar utilisés et les résultats obtenus sont les suivants :
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îlvoérol-asparaine-extrait da boeuf-aar.
EMI5.3
<tb>
<tb>
Glycérol <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb> Asparagine <SEP> 0,05%
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 02,%
<tb>
EMI5.4
K,liPO 4 0, 5
EMI5.5
<tb>
<tb> Agar <SEP> 1.5%
<tb>
EMI5.6
au stérile pour faire 100% pH 7,2.
EMI5.7
¯567¯Ul, Streptomyces.
EMI5.8
<tb>
<tb> aureofaciens
<tb> Developpement <SEP> : <SEP> Bon <SEP> Bon
<tb> Sporulation:: <SEP> Bonne <SEP> Bonne
<tb>
EMI5.9
16illen uirfusible : Vert jaunâtre Pas
EMI5.10
<tb>
<tb> .formation <SEP> de <SEP> spirales <SEP> : <SEP> Abondantes, <SEP> peu <SEP> enroulées <SEP> Pas
<tb>
EMI5.11
iîyplies aériennes : Gris souris Gris rosé
EMI5.12
<tb>
<tb> Inverse <SEP> : <SEP> Brun <SEP> Khaki <SEP> olive
<tb>
EMI5.13
Dextrine Czapek-.Dox Q!E!3¯2E: Nain03 O,4% KtlP04 # -., 1.U U, U j 4 KC1 , U7 p :
Fe.:. 04 trace Agar 1, 5
EMI5.14
<tb>
<tb> Eau <SEP> stérile <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 100%
<tb>
EMI5.15
pfl 7,
EMI5.16
<tb>
<tb> Streptomyces
<tb> BL <SEP> 56701 <SEP> aureofaciens
<tb> Développement <SEP> : <SEP> Assez <SEP> bon <SEP> à <SEP> bon <SEP> Assez <SEP> bon
<tb> Sporulation <SEP> : <SEP> .donne <SEP> Faible
<tb> Pigment <SEP> diffusible <SEP> : <SEP> Pas <SEP> Pas
<tb> Formation <SEP> de <SEP> spirales:Abondantes, <SEP> peu <SEP> enroulées <SEP> Rares, <SEP> très <SEP> peu <SEP> enroulées
<tb>
EMI5.17
hyphes aériennes :
Gris souris Chamois à gris
EMI5.18
<tb>
<tb> Inverse <SEP> : <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> Chamois <SEP> a <SEP> brun <SEP> rouge
<tb>
EMI5.19
Le streptonycète dL 567el est encore caractérisé par la production d'un pigment vert bleuâtre intense en culture submergééù dans un milieu contenant 1% ae sucrose, 1% de farine de soya, 1% de peptone de soya, 1,5 de KrlP04 et 0.5% ae (Nii4)?- iiPO4. Le Streptomyces aureofaciens (NRRL 2U) ne produit pas ce pigment.
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Le streptomyces BL 567201 se distingue également du Streptomyces aureofaciens par les observations suivantes.
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<tb>
<tb>
Milieu <SEP> s.aureofaciens <SEP> Streptomyces <SEP> BL <SEP> 567201
<tb> NRRL <SEP> 2209)
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> Développement <SEP> satisfaisant. <SEP> Développement <SEP> satisfaisant.
<tb>
La <SEP> formation <SEP> d'nyphes <SEP> aérien- <SEP> Pas <SEP> de <SEP> mycélium <SEP> aérien, <SEP> colones <SEP> et <SEP> de <SEP> spores <SEP> est <SEP> quelque <SEP> nie <SEP> brun <SEP> rouge <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair.
<tb> peu <SEP> inhibée <SEP> et <SEP> sa <SEP> couleur <SEP> est <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> couleur <SEP> cinblanc <SEP> a <SEP> gris. <SEP> Pigment <SEP> soluble <SEP> namone.
<tb> couleur <SEP> paille.
<tb>
Asparagine- <SEP> Développement <SEP> satisfaisant. <SEP> Développement <SEP> satisfaisant.
<tb> extrait <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> et <SEP> spores <SEP> aériens <SEP> Mycélium <SEP> et <SEP> spores <SEP> aériens
<tb> viande-dex- <SEP> abondants, <SEP> couleur <SEP> gris <SEP> ci- <SEP> abondants., <SEP> couleur <SEP> mouette,
<tb> trose-agar <SEP> ment <SEP> à <SEP> gris <SEP> givré. <SEP> Pigment <SEP> pigment <SEP> 'soluble <SEP> chamois.
<tb> soluble <SEP> chamois.
<tb>
Pommes <SEP> de <SEP> Développement <SEP> en <SEP> hauteur, <SEP> no- <SEP> Développement <SEP> en <SEP> hauteur,
<tb> terre <SEP> dulation <SEP> superficielle, <SEP> cou- <SEP> nodulation <SEP> superficielle,
<tb> leur <SEP> chamois <SEP> couleur <SEP> beige <SEP> écru.
<tb>
Lait <SEP> de <SEP> tourne- <SEP> Aucun <SEP> cnangement <SEP> significatif <SEP> Alcalin <SEP> avec <SEP> peptonisation.
<tb> sol <SEP> du <SEP> pH <SEP> et <SEP> aucune <SEP> peptonisation <SEP> Très <SEP> bon <SEP> développement.
<tb> apparente <SEP> en <SEP> 15 <SEP> jours. <SEP> Léger
<tb> développement.
<tb>
L'invention s'étend a un procédé de culture d'espèces de microorganismes a 240 - 30 C environ dans des conditions submergées d'agitation et d'aération sur un milieu formé d'eau stérile contenant une source de carbone, une source d'azote, une source de substances de développement, des sels minéraux comme le chlorure de sodium, le phosphate de potassium, le sulfate de magnésium, le nitrate de sodium et, si on le désire, un agent tampon comme le carbonate de calcium.
Gomme source-de carbone dans le milieu nutritif, les nydrates de carbones sont très satisfaisants. On peut utiliser l'un ou l'autre des composés suivants :
Amidon ordinaire Xylose
Amidon soluble Arabinose
Sucrose Rhamnose
Glucose Fructose
Maltose Lactose
Dextrose Inuline
Glycérol Dextrine
Galactose Mannitol Ces sources de carbone sont introduites dans le milieu à l'état pur ou sous forme de produits concentrés. La quantité de ces sources de carbone pour une préparation antibiotique optimum varie considérablement dans le milieu, de 1/2% à 5 %'en poids'du poids total du milieu de fermentation.
Les sources d'azote appropriées comprenant certaines sources de substances de développement sont notamment des composés organiques et inorganiques contenant dd l'azote et des matières protéiques particulières, sont très nombreuses et on peut citer entre autres : les amino-acides la caséine,
hydrolysée et non hydrolysée la farine de poisson la farine de soya les extraits de viande le tourteau de foie l'urée
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les nitrates les composés d'ammonium les bouillies de grain pour la distillation la liqueur de macération de mars la liqueur de macération de froment le petit lait ou les concentrés de petit lait le gluten de mais traité bar hydrolyse acide le gluten de froment traité par nydrolyse acide le peptone les abatis la levure de brasserie la farine de graines de coton le lactalbumine le tryptone la farine d'huile de palme la farine de copran la farine de lin la farine d'arachide la farine de tournesol Ces ingrédients protéiques ne doivent pas être appliqués à un haut degré de pureté.
Les matières moins pures qui .contiennent des traces de facteurs de développement et des quantités considérablas d'agents nùtritifs minéraux peu vent convenir. Il n'est évidemment pas possible, a cause de la nature brute de la plupart de ces substances azotées de spécifier des proportions aéfinies ae la matière a ajouter, une quantité d'environ 0,1% a 5.0% en poids sur base solide correspond à la gamme utile de substances azotées à ajouter au milieu dans la plupart des cas. On obtient des rendements particulièrement élevés par l'emploi de milieux contenant des protéoses de soya ou des peptones de soya, c'est-a-dire aes produits obtenus dar dégradation des fèves de soya, notamment la farine de soya hydrolysée.
Le pH du milieu de fermentation doit être environ 5,0 à 5,5 et de préférence 5,8 a b, au début de la fermentation. La température préférée
EMI7.1
pour le procédé de fermentation est environ 6 a <8 0. Le rendement ma- ximum du produit est habituellement obtenu en 1 a 3 jours, suivant le procédé de culture du Streptomyces.
EMI7.2
L'Omégamycine est active ln vivo etin vitro et exerce une activite ehimicothérapeutique marquée sur les infections expérimentales cnez les souris. Les résultats de ces essais et déterminations de toxicité sont rEpro- duits dans le tableau ci-dessous.
EMI7.3
Omegamycine Essai àe plaque Toxicité aigüe CD 50 mg/kg Lot nO Réaction en mm LD5ü mg/kJ-souris souris intraveineuse intrapéritonéale 1 2D a 1 mg/cmJ 98 - 171 z5 8 a 1/16e DWCMJ - - - - - ., 6
EMI7.4
La GD¯ (Dose curative -50) est la dose minimum d'Omegamycine qui guérit jU a9un groupe de souris ayant subi des injections intrapéritonéales de 100 a 1000 doses LD de Diplococcus pneumoniae. cnaque dose LD U étant suffisante, administrée seule, pour tuer :?0 % d'un groupe de souris. L'infec- tion est communiquée immédiatement après la seconde dose du médicament d'essai.
Le médicament d'essai est administre en deux doses égales à 18 heures d'intervalle environ. Les animaux sont observes pendant 4 jours et les morts de chaque groupe sont exprimés en proportion du total des animaux du groupe. La proportion des morts est transformée en valeurs de probit et ces valeurs sont comparaes au logarithme de la dose en mg/kg de souris. Le point d'intersection de la courbe 5 de probit et de la meilleure courbe passant par les points expérimentaux indique la concentration d'un médicament qui doit protéger la
EMI7.5
moitié des animaux dans les conditions de l'expérience. L'anti-logartthme
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de ce terme est appelé la valeur CD 50.
Exemple 1.Pour préparer l'Omégamycine en laboratoire, on effectue la fermentation dans des flacons agités, ouverts a l'air, mais protégés de la contamination par un couvercle en coton ou en gaze. Le trettomyces BL ,67Ol est cultivé dans un milieu nutritif approprié par la méthode de culture submergée,l'agitation et l'aération de la culture étant obtenues en plaçant les flacons aans un agitateur a va-et-vient qui pulvérise et projette la bouillie dans une atmosphère contenant de l'oxygène. Dans un cas typique, on introduit 500 cm3 d'un milieu de culture composé de
1% de sucrose
1 % de farine de soya 1 % de peptone de soya
EMI8.2
1,5 % de KH.2POl.
9,5 % de (NH4)2HPOl.
Eau pour faire 100 % dans des flacons de 4 litres ét on stérilise. Après passag à l'autoclave, on inocule le milieu avec 1% en volume environ d'une suspension aqueuse trouble ae spores de Streptomyces provenant d'une soucne sur agar. Le pH est 6,0 - 6,2 au début de la fermentation. On incube ensuite le contenu du flacon a
EMI8.3
6 - 280C pendant 48 heures, tout. en agissant a IjO secousses par minute, les secousses ayant une amplitude de 1 1/4 de pouce (30 mm). Après la rério- de d'incuoation, la liqueur ae fermentation est vert bleuâtre et, soumisea l'essai décrit ci-dessus, donne des zones a'innibitiôn d'environ 27 mm lorsque le bouillon est dilué trente fois.
Ce bouillon contient de l'Omégamycine qui neut être isolée comme décrit ci-dessous.
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i;xemple II.Pour une préparation de l'Omêgamycine à plus grande échelle, on prépare un inoculum dans un milieu de fermentation contenant en poids 1% de liqueur de macération de mais 1% de sucrose
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0,5% de (NH4)ZriP04 1,5% ae KHzpù4 0,2% de Y4.'n4- 7 Hz0
Eau pour faire 100% pH 6,2-6,4 étendu a 2500 cm3 et introduit dans un flacon ae 2 1/2 gallons. Le milieu
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est stérilisé par la vapeur a 118 -1200C pendant 1 heure. Refroidi, on l'inocule a'environ 0,5% en volume d'une suspension aqueuse trouble de spores de treptomyces provenant d'une souche sur agar. Le contenu du flacon est incuoé a <o -z8Qî pendant 48 heures dans un agitateur du type a va-et-vient et on souffle de l'air stérile sur la surface du liquide.
On fait passer le bouillon de Streptonyces sp. de la bouteille d'inoculation dans un reservoir de fermentation dans des conditions parfaitement aseptiques (voir exemple III) Au moment voulu, la liqueur peut être traitée comme aécrit ci-dessous et 1'0-
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mégamycine peut être isolée. exemple III.Jn peut préparer a grande écnelle le produit antibiotique dérivé ae ëtreptoffivces BL 5d'iUl , l'0mégamycine, en culture profonde ou submergée. Des cuves de fermentation fixes munies de dispositifs appropriés d'agitation et d'aération peuvent convenir a cette fin. On peut utiliser un milieu nu-
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tritif contenant J6,8 litres de liqueur de macération de mais, 56, 3 kg de sucrose, 28,4 kg de (HH4) riP l. , z37, z kg de Kù P0 11, 3 kg de I.50. 7 Il
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et d'eau pour faire 1500 gallons (4.600 1 env.).
Ce milieu peut être préparé dans un récipient ae fermentation de 2 000 gallons (7.500 1 env. doublé de verre et muni d'une chemise a circulation d'eau pour le'réglage de la température, d'un agitateur en acier inoxydable et d'un dispositif arroseur approprié pour aérer le milieu. Celui-ci est stérilisé par chauffage avec de la vapeur sous pression, puis refroidi. Après stérilisation, le concentration en ions Hydrogène du milieu doit correspondre approximati- vement au pH 6,2. Le milieu nutritif est inoculé avec 15 % en volume d'une culture végétative effectuée soit dans un appareil de fermentation similaire préalablement inoculé avec un inoculum décrit plus haut ou avec un inoculum préparé en laboratoire. La culture dans l'appareil de fermentation de 2000 gallons est incubée a 83 F pendant deux ou trois jours.
Pendant cette incubation, on fait tourner l'agitateur à 90 tours par minute et on introduit de l'air stérile dans le milieu par l'arroseur a raison de 100 pieds cubes par minute. A la fin de la période d'incubation, le liquide de culture possède normalement une activité antibiotique suffisant pour donner une zone a'inhibition d'environ 2j mm de diamètre dans les organismes d'essai, lorsqu'on utilise un bouillon dilué 16 fois suivant le procédé d'essai décrit plus naut. L'Omégamycine est isolée comme décrit plus loin.
Exemple IV.-
Un prépare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine en suivant le procédé de l'exemple I avec le milieu-de culture suivant :
1% de gluten de froment
1% de glycérol
0,5% de NaC1
0,5% d'éléments solubles de distillation 0,1% de CaC03
Eau pour faire 100% Exemple V.-
On prépare uns liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine en suivant le procédé de l'exemple 1 avec le milieu de culture suivant :
1% de farine de coton
1% de glucose
0,05% d'éléments solubles de distillation
0,5% de NaCl
0,1% de CaCO3
Eau pour faire 100 % Exemple VI. -
On prépare une liqueur de fermentatioa contenant de 1'Omégamy cine suivant le procédé de l'exempl I avec le milieu de culture suivant :
1% de liqueur de macération de mais
1% de cérélose
0,5% de NaCl
0,1% de CaC03 au pour faire 100 % Exemple VII.-
On prérare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine suivant le procédé de l'exemple I avec le milieu de culture suivant :
I% de farine de soya
1% ls cérélose
0,5% de NaC1
0,05 % d'extrait de levure
0,1% de CaCO
Eau pour faire 100 %
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xemnle VIII.On prérare une liqueur de fermentation contenant de l'Oméamycine suivant le précédé de l'exemple I avec le milieu de culture suivant :
3% de farine de soya 0,5% d'amidon de mais
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0,1% de N-2-Amine :3 (produit de digestion enzymatique de la caséine) 0,3% de NaN03
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0,5% de Ca CO j Eau pour faire 100 % &cemple u.-
On prérare une liqueur de fermentation contenant de l'Omégamycine suivant le procédé de l'exemple I avec le milieu de culture suivant :
1% de N-Z-Amine B
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1% de éërélose 0,5% d'extrait de levure 0,5% de NaC1 0,1% de CaC03 Eau pour faire 100 %
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Lorsque la fermentation est achevée on sépare l'omégangwaine du bouillon, par exemple en filtrant pour enlever le mycélium, en agittant le bouillon ( de préférence au pH 8,5 environ) avec du butanol ou de la méthyl-isobutyl-cétone, en séparant la coucne de solvant contenant l'Omégamycine, en la réduisant à un faible volume par distillation et en la mé-
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langeant avec un ndydrocarbure inférieur liquide par exemple, le Skellysolve C, pour précipiter l'Omégamycine solide sous forme de base, si le bouillon extrait est à un pH alcalin, par exemple au pd j,5p'o. saa.sJ:
'orme.-de chlorhydrate si le bouillon a été acidifié avant extraction par l'acide
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chlorhydrique. 'Omé5acine solide ainsi obtenue peut être encore puri- fiée en formant un magma avec de l'hydroxyde d'ammonium et également par adsorption a partir d'une solution de la base libre sur un adsorbant cnromatographique (par exemple une silice comme le Florisil), suivie de lavage (par exemple a l'acétone ou au métnanol) pour éliminer les impuretés puis a'un entraînement par un acide. Le sel d'acide d'Omégamycine purifié dans le liquide d'entraînement est ensuite séparé par cristallisation, précipitation, lyophilisation ou analogues.
Les hydrocarbures inférieurs liquides utilisés comme agents de précipitation sont des éthers de pétrole existant dans le commerce, par exemple le Skellysolve A, point d'ébullition
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3 -3i C; le ùkellysolve $,Point d'ébullition 60 -71 C; le Skellysolve C, point d'ébullition bila-10000.
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Divers sels a'adaition acides de l'0Négauycine peuvent être pré- parés très simplement en ajoutant l'acide désiré, inorganiquement (y compris des acides minéraux) ou organique, à l'antibiotique dans l'eau jusqu'a ce qu'on obtienne une solution limpide. Les sels solides peuvent être préparés en réglant le pH d'une telle solùtion de sel d'Omégamycine à un point lmmédiatement inférieur à celui du début de la séparation de l'antibiotique .
La solution peut être alors séchée, par exemple en exposant la solution congelée au vide. Les sels acides d'Omégamycine sont obtenus par évaporation
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d'une solution du sel dans l'eau à un pif peu élevé. Les acides mtàéraux qui peuvent être utilisés sont l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosDhorique. Les aciaes organiques qui peuvent être utilisés soit l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide gluconique, l'acide benzoique, l'acide acétique, l'acide ascorbique, l'acide succinique, l'aciae nicotinique, l'acide formique, l'acide maléique, etc.
Comme l'Omégamycine est amphotère, on peut préparer des sels de divers éléments métalliques avec l'anti-biotique, par exemple de sels de soaium, de potassium, ae calcium et de magnésium.
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Les sels de métaux alcalins de l'Omégamycine sont formés en traitant une suspension aqueuse de l'antibiotique par deux equivalents d'un hydroxyde alcalin. Les sels solides de métaux d'Omégamycine sont obtenus en évaporant sous vide une solution- aqueuse de l'antibiotique au pH approprié.
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La préparation delméga#ycin$ partir d'unesolution neutre par exemple par lyophilisation, fournit la base libre généralement sous forme trihydratée si on se trouve en présence d'eau et qu'on n'applique pas de chaleur. La tétracycline trinydratée est également ootenue en dissolvant la base dans un solvant organique soluble dans l'eau par exemple le méthanol ou l'éthanol, et en versant la solution obtenue dans l'eau.
La tétracycline calcique solide est transformée en tétracycline trinydratée en la dissolvant dans une solution aqueuse acide, par exemple au pH 3 au moins avec de l'acide
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sulfurique ou de l'acide chlorhydrique, puis en ajoutant un agent fixant le calcium, par exemple du Versenate de sodium (acide éthylènediamine-tétraacétique) et finalement en ajoutant un alcali pour porter le pH a 6 au moins sans dépasser sensiblement le pH 8 afin de précipiter la tétracycline trihydratee. La tetracycline trinydratée peut être recristallisée de solutions nydroalcooliques, de méthanol par exemple, et transformée en forme anhydre par application de chaleur modéree dans le vide sur un agent dessiccateur.
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Les sels d'addition acides d'Omégamycîne sont préparés de diverses manieres. Par exemple, on ajoute des quantités stoechiometriques d'a- cide a une solution de oase d'Omegamycine dans l'eau ou dans un solvant organique, par exemple le butanol, l'acetone, le methanol, pour former le sel d'addition acide ;
au moment voulu, le sel solide est isolé en lyophilisant le melange obtenu (par l'eau par exempl ), ou en recueillant le sel précipite par filtration ( a partir d'acetate d'etnyle par exemple), en precipitant le sel par addition d'un autre solvant organique (par exemple par
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addition d'un iiydrocarbure comme le Skellysolve, au butanol ou le cyclD- nexane à l'acétate d'éthyle), en réduisant lé volume du solvant par distillation dans le vide jusqu'a ce que le sel precipite par refroidissement
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(par exemple du butanolf).
De nombreux autres procédés sont utilisés pour préparer ces sels, et on peut transformer par exemple l'Omégamycine en cnlorhydrate d'Umegamycine par adsorption de l'ùmegazycine sur un adsor- bant chromatograpnique ( par exemple une silice comme le Florisil) suivie
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d'entraînement de leùmégamycine par un acide, par exemple l'acide chlorhy- arique en solution aqueuse methanolique ou butanolique.
Suivant un autre
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procédé, la base d'0mégamycine provenant d'un bouillon de fermentation ayant un pH d'environ 8-9 est extrait par le butanol ; le butanol est séparé et la base d'Jmegamycine transformée en cnlorhydrate d'0mégazycine et passee en puase aqueuse par extraction, par de l'acide chlorhydrique et so-
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lution aqueuse; ce chlorhydrate d'Omegamycine ainsi préparé peut être isolé si on le désire, par exemple par lyophilisation.
Dans un procédé préféré,
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la base d'Omegamycine est transformée en sels dlùmegamycine en dissolvant la case par l'acétone ou le n-propanol annydres et en ajoutant l'acide an-
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nyare c'est-a-dire l'acide cnlornydrique gazeux, l'acide sulfurique, l'a- cide sulfurique aans l'acétone annyare, l'acide pnosphorique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide nitrique dans la methyl-isobutyl-acétone anhydre et en receuillant le sel qui precipite par filtration, par exemple
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le chlorhydrate ou le sulfate,le phosphate, le tartrate, le citrate etc; de0mégamycine. Exemple x.-
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On extrait facilement lomegamycine des liqueurs de fermenta- tion alcalines par des solvants organiques non polaires. Le procédé suivant a eté utilise.
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On extrait 1 litre de bouillon de fermentation de ùtreptomyces dL 5b7J1 au pd 6,5 par 0,5 litre de metnyl-isooutyl-cétone. Le solvant organique est separé, lavé a l'eau, réduit par distillation azéotropique a un volume d'environ 0 cmj et ajouté à 50 cm3 de Skellysolve C. 20 mg d'0méga-
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mycine (lot 26).précipitent et sont recueillis par filtration ; ils possèdent une activité de 19,5 mm (diamètre de la zone sur plaque d'essai de B. subtilis au pH 6,2 dans l'agar) à une concentration a 1 mg/cm3, dilution 1 : 64 ; de 24,2 mm pour une dilution de 1 : 16 et de 27,7 mm pour une dilution de 1 : 4. Le bouillon original donne 27,3 mm pour une dilution de 1 : 4.
Exemple XI.-
Dans un autre procédé, on amène au pH 5,5 , 4,5 litres d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 au pH 6,7 et on extrait par 3 litres de butanol,. L'extrait par le butanol est séparé, lavé à l'eau, son volume est réduit à 35 cm3 environ par distillation azéotropique et on y ajoute 35u cm3 de Skellysolve C (neptanes pureté technique). L'Omégamyci- ne (lot 27) précipite sous forme solide et est recaeillie par filtration , (1,2 g possédant une activité de 23,2 mm a 1 mg/cm3, dilution 1:16; diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH - 6,2)-
Le bouillon au pH 5,5 restant après l'extraction par le butanol est amené au pH 8,5 et extrait par 3 litres de butanol.
Le butanol est séparé, lavé a l'eau et réduit a un volume d'environ 30 cm3, puis ajouté a 350 cm3 de Skellysolve C. L'Omégamycine brute (lot 28) précipite sous forme d'un solide jaune orange ayant une activité de 25,2 mm à 1 mg.cm3, dilution 1:16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2). Le bouillon original donne 27,3 mm pour une dilution de 1:4.
Exemple XII. -
Dans un troisième procédé, on règle au pH 6,4 un bouillon de fermentation de 2,5 litres de Streptomyces BL 567201 donnant 25,7 mm à l'essai avec une dilution de 1:4 et on l'extrait par 2 litres de butanol.
On sépare le butanol, on lave à l'eau, on réduit le volume à environ 50cm3 par distillation azéotropique et on ajoute a 1 litre de Skellysolve C.
L'Omégamycine solide jaune foncé (500 mg) (lot 24) précipite et est receuillie par filtration; elle présente une activite de 18 mm à 1 mg/cm3, dilution 1:6 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B.,subtilis au pH 6,2) et de 33 mm pour une dilution de 1:4.
Le bouillon au pH 6,4 après extraction par le butanol est maintenu en chambre froide pendant 3 jours, puis amené au pH 8,5 par l'hydroxyde de sodium et extrait par 2 litres de butanol. Le butanol est séparé lavé a l'eau, réduit en volume à environ 30 cm3 par distillation azéotropique et ajouté a 600 cm3 de Skellysolve C. L'Omégamycine solide, brun foncé (140 mg) (lot 25) précipite et est receuillie par filtration; elle présente une activité de 28 mm à 1 mg/cm3, dilution 1 :16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2).
.Exemple XIII.-
Dans un autre procédé, on extrait par 380 cm3 de n-butanol, 760 cm3 d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL 567201 réglé au pH 9,4 par de l'nydroxyde de sodium. On sépare le n-butanol, on l'ajoute a ±de l'acide cnlorhydrique aqueux pour obtenir un pH de 7,35 et on élimine le outanol par distillation sous vide; le concentré aqueux résiduel est étendu a 38 cm3 environ par de l'eau, et lyopnilisé, pour obteir 339 mg d'Omégamycine solide présentant une activité de 25 mm à 1 mg par cm3 de tampon (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) et de 18,7 mm pour une dilution de 1 :3.
Le bouillon original donne 26,3 mm (et 20,0 mm à une dilution de 1:3) et le bouillon épuisé donne 19,0 mm (et 12,7 mm pour une dilution de 1:3) Exemple XIV.-
Dans un autre procédé, on extrait par 3 litres de n-butanol, 5,5 litres d'un bouillon de fermentation de Streptomyces BL567201 réglé au pH 5,5. Le solvant est séparé, lavé a l'eau, réduit en volume à 35 cm3 environ par distillation azéotropique et ajouté a 350 cm3 de Skellysolve C.
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L'Omegamycine solide jaune d'or (1,2 g) précipite et est recueillie par fil- tration (solide A). Elle présente une activité à 1 mg/cm3 dilution 1 :16 de23,2 mm (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. sub- tilis au ph 6,2) et de 26,9 mm à une dilution de 1:4.
Le bouillon restant après l'extraction par le butanol au pH 5,5 est amené au pd 8,5 et extrait par j litres de butanol. Le butanol est sé- paré, lavé a l'eau, reduit en volume a 30 cm3 environ par distillation azéotropique et ajouté a 350 cm3 de Skellysolve C (heptanes pureté techni- que). Une nouvelle quantité d'Omégamycine solide jaune orangé (0,5 g) (lot
30) précipite et est recueillie par filtration (solide B). Elle présente une activité a 1 mg/cm3, dilution 1:16, de 25,2 mm (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtilis au pH 6,2) et de 28,5 mm pour une dilution de 1:4.
L'Omégamycine produite dans ces procédés est caractérisée de fa- çon certaine, même lorsqu'elle est contaminée par des composés organiques analogues, par son spectre d'activité (c'est-a-dire le degré de migration ou valeurs R ) avec une série de solvants dans le procédé appelé chromatograpnie sur bande de papier. Cette technique est relativement nouvelle, mais déja bien établie pour l'identification des composés organiques, comme dans le cas des maxima dans l'infra-rouge, les valeurs Rf dans une série de systèmes solvants constituent une caractéristique unique et reproduc- tible d'un produit chimique déterminé et sont en quelque sorte ses emprein- tes digitales.
Le procédé utilisé est le suivant. On suspend au bord d'une cu- vette des bandes de papier filtre, dense, exempt de cendres, a forte capa- cité de rétention (par exemple le papier 589 Blue Ribbon Spécial de Carl
Scnleicher & Scnnell Co., Keene, N.H.) d'un demi pouce (13 mm) de largeur et de 58 cm de longueur a une température ambiante, constante, dans une zone protégée (par exemple dans un grand bocal).
Le sommet, de chaque ban- de est en contact avec une réserve d'un système solvant particulier appelé la phase de développement) contenu dans la cuvette ; chacune des bandes est suspendue a une cuvette différente contenant un système solvant différent pour l'essai; la partie inférieure de chaque bande pend librement et n'at- teint pas la quantité de système solvant (ou,.de ses éléments volatils) pla- oee en aessous de la bande suspendue pour faciliter la saturation de l'air par le solvant choisi.
Le produit a examiner (c'est-a-dire dans un bouillon de fermen- tation ou sous forme de solide isolé) est placé sur un point marqué a la partie superieure de la portion de la bande qui pend librement dans l'air.
Dans le cas d'un solide, en le dissout dans un solvant utilisable quelconque Les quantités utilisées sont celles qui donnent une zone de grandeur pra- tique lors de l'essai final et on peut les déterminer par des expériences simples. Par exemple, une quantité utile est 5 microlitres (0,005 cm3)d'une solution contenant 1 mg d'Omégamycine par cm3 de solvant pourri'essai'sur B. subtilis. La bande est séchée, puis placée avec son extrémité supérieure en position dans la cuvette qui contient le système solvant choisi. On laisse migrer le solvant vers le bas, c'est-a-dire développer la bande jusqu'a ce que le front du solvant atteigne la partie inférieure de la bande.
Il faut pour cela environ 15 neures; l'atmosphère environnante est maintenue a une température constante, sans courant d'air, et saturée de la vapeur du sol- vant placé au fond du @ocal.,
Cnaque bande est ensuite retirée, séchée a l'air et placée sur une plaque d'agar à un pH déterminé (6,2 dans le cas présent), inocule par un organisme d'essai, dans ce cas le B. subtilis. Après un séjour jusqu'au lendemain dans un réfrigérateur, les bandes développées dans les différents systèmes solvants sont enlevées et les plateaux marqués pour identifier et situer les bandes, incubés jusqu'au lendemain, puis relevés directement au photographies pour obtenir un document permanent
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La silhouette de la bande toute entière est généralement visible sur la surface d'agar et souvent sur la photographie.
La situation de chaque agent antibiotique sur la bande est marquée par une zone claire qui contraste avec la zone trouble ou l'organisme d'essai s'est développé. La bande re- présentée sur la photographie est divisée en zones représentant 5,10,10, 10, 10, 10,10, 10, 10 et 15 % ae la distance entre le point de l'application de l'échantillon et la partie inférieure de la bande et ces zones sont décrites comme possédant des valeurs Rf de l a 10 inclus. Une petite tache au centre exact de la bande aurait donc une valeur R 6, tandis qu'une tache plus grande s'étendrait dans les zones adjacentes et aurait des valeurs Rf 5, 6,7 en comptant la zone toute entière.
Suivant ce procédé, le spectre de valeurs Rf de l'Omégamycine lot 30) est le suivant,en utilisant 5 microlitres d'une solution de l'anti- biotique a 1 mg/cm3 comme échantillon pour chaque bande et en effectuant l'es- sai avec le B. subtilis dans de l'agar au pH 6,2 les bandes étant développées dans les douze systèmes solvants ci-dessous :
Système solvant A B C D E F G H I J K L ------------------------------------------------------------------------ Valeurs Rf 6,7 5,6 4,5 4,5,6 1 8,9,10 6,7.8 5 9,10 6,7,8 3,4,5 ------------------------------------------------------------ ----------
La composition de ces systèmes solvants s'établit comme suit :
A - Eau
B - Citrate de sodium en solution aqueuse à 10%
C - Citrate de sodium en solution aqueuse à 40%
D- Butanol saturé d'eau - Méthyl-isobutyl-cétone anhydre
F - Mélange de 100 parties de méthanol a 80% et de 10,5 parties de pipéridine, réglé au pH 9,5 par l'acide acétique
G- Mélange en volume de 80 parties de méthanol, 5 parties d'a- cide acétique glacial.-15 parties d'eau.
H- Butanol saturé d'eau et contenant 2 % d'acide p-toluène-sul- fonique
I - Mélange de 100 cm3 de outanol saturé d'eau et de 5 cm3 d'a- cide acétique glacial.
J - Butanol saturé d'eau et contenant 2 % d'acide p-toluène-sul- fonique et 2 % de piperfdine.
K- 100 parties de butanol saturé d'eau et 2 g d'acide p-toluène- sulfonique plus 2 cm3 de pipéridine plus 2 g d'acide laurique
L - Mélange de 2 parties d'alcool isoamylique et 1 partie de chlo- roforme, saturé d'une solution aqueuse de citrate de sodium à 10 %. Dans ce cas, avant application de l'échantillon, les bandes sont saturées d'une solu- tion aqueuse de citrate de sodium, a 10 % réglée au pH 5,7 a l'aide d'acide citrique, et sechees.
Exemple XV. -
On extrait le solide A de l'exemple XIV par 50 cm3 d'hydroxyde d'ammonium en solution aqueuse au pH 6,4, ce qui laisse 220 mg d'un solide brun. On extrait le solide B (0,5 g) de l'exemple XIV par 30 cm3 d'hydro- xyd3 et'ammonium en solution aqueuse au pH 6,4, en laissant 120 mg de ma- tières solides. Les solutions aqueuses basiques d'Omégamycine sont réunies et versées dans une colonne chromatograpnique (0,5 x 4 pouces) (13 x 100 mm) contenant 7,5 g de Florisil (silice cnromatograpnique). On sépare de l'ef- fluent brun environ 600 mg de matières solides brunes ne possédant qu'une
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faible activité.
On lave ensuite la colonne avec 125 cm3 d'acétone puis 125 cm3 d'etnanol et on rejette les produits de lavage jaunes. On lave ensuite la colonne par de l'acide calorhydrique a 1% (100 cm3). La solution de lavage etnanolique acide est déplacée par 1l'eau (c'est-à-dire distillée dans le vide avec addition d'eau jusqu'a ce que tout le solvant organique ait eté éliminé) et l'eau est neutralisée par l'hydroxyde d'ammonium, puis lyophi= lisée pour donner l'Omégamycine solide lot 32) pesant 0,5 g et possédant une activite de 24 mm a 1 mg/cnu, dilution 1:16 (diamètre de la zone dans l'essai de claque sur agar avec B.subtilis au pH b,2).
Exemple XVI. -
De la même façon que dans l'exemple XV ci-dessus, on extrait un bouillon adsobé sur Florisil par du butanol au pH 8,5 et on sèche l'extrait par distillation azéotropique..En le versant dans du Skellysolve G, l'Omégamycine solide est précipitée et on peut le séparer 500 mg ; lot j6). Elle possède une activité supérieure a 30 mm à 1 mg/cm3, dilution 1:16 (diamètre de la zone dans l'essai de plaque sur agar avec B. subtili au pH 6,2).
Exemple XVII.
On peut transformer une Omégamycine d'une pureté quelconque en sel de sodium en traitant la matière dans l'eau par de l'hydroxyde de sodium jusqu'a ce que le pH dépasse y,5. La solution est ensuite congelée et sechée sous vide pour obtenir le sel de sodium sec sous forme d'une poudre stable soluble dans l'eau.
Exemple XVIII.
Le coefficient de répartition de la tétracycline entre le butanol et l'eau (concentration dans le butanol divisée par la concentration dans l'eau) est inférieur a 1 a tout pH mais peut être fortement modifié par ad- dition d'ion calcique. C'est ainsi que le coefficient de répartition de la tétracycline entre le butanol et le chlorure de calcium en solution aqueuse a 2,0% est inferieur à 2 (et souvent inférieur a 1) du pd 1 a 6,6 environ, . mais s'élève rapidement lorsque le pH augmente et est supérieur a 5 du pH
7,4 au pd 11 environ, atteignant un maximum de 9-10 entrait pH 9 et le pH
10.
bn rapport très analogue entre le coefficient de répartition de la tetracycline et le pH est obtenu avec du butanol et une solution aqueuse de chlorure.de calcium à 0,5 %, le maxime de 20 environ se situant près du pH 10. On n'obtient aucun coefficient de répartition pour la tétracycline supérieur à 1,5 entre le butanol et des solutions aqueuses contenant 5 ou
10% de sulfate de sodium ou 2,5 ou 10 % de chlorure de sodium du pH 4 au pH 9. Des coefficients de répartition entre 2 et 4 peuvent être obtenus uniquement avec du NaCl à 2-10 % au pH très acide de 2, ce qui rend les opérations industrielles difficiles sinon impossibles.
L'extraction d'une solution aqueuse (bouillon) .contenant au moins 250 mcg/cm3 de tétracycline par 1/4 de volume de butanol au pH 8,5 en presence de cnlorure de calcium a 0,5 % donne un haut rendement (40-
50 %) de tétracycline sous la forme de matières solides d'une activité satisfaisante après séparation et concentration du butanol, extraction en retour par un acide en solution aqueuse, l'acide chlorhydrique par exemple, et isolation de cette solution. La tétracycline est ensuite extraite comme decrit plus haut.
Dans un tel procédé, on utilise l'ion calcium naturellement present dans le bouillon (par exemple dans la liqueur de macération de mais) ainsi que des ions calcium ajoutés. Les ions calcium peuvent être ajoutés sous la forme d'un sel quelconque par exemple le cnlorure de calcium, le carbonate de calcium, et on utilise de preférence une concentration totale en ion calcium dans le bouillon comprise entre 0,01 et 2,0 %. On peut ajouter utilement environ 0,1% de cnlorure de calcium; la quantité a ajouter
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peut être également la quantité nécessaire pour obtenir dans le bouillon l'équivalence stoécniometrique de la tétracycline présente déterminée par essai du oouillon, afin de déterminer la quantité de tétracycline et laquantité d'ion calcium.
Des quantités excessives d'ion calcium ne sont pas désirables a certains moments parce qu'elles précipitent des pnosphates de calcium qui ont tendance à aasorber la tétracycline. On ne peut séparer celle-ci qu'au prix d'opérations supplémentaires.
D'autres renseignements sur l'efficacité plus grande de l'extraction de la tétracycline dans le butanol a partir d'un bouillon de fermentation contenant des ions calcium sont foursis par l'observation que l'addition au bouillon d'un agent séquestrant l'ion-calcium réduit l'extraction de la tétracycline dans le butanol en dessous de la valeur obtenue lorsqu' on n'ajoute pas de chlorure de calcium au bouillon.
Un bouillon de fermentation contenant de la tétracycline et de la liqueur de fermentation de blé dans le milieu est réglé au pH 8,5 et divisé en trois parties égales auxquelles on ajoute les quantités indiquées de chlorure de calcium. L'extraction par le butanol est augmentée par les ions calcium ajoutés comme l'indiquent les résultats ci-dessous obtenus par un essai biologique.
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<tb>
<tb>
Portion <SEP> n <SEP> % <SEP> CaC12 <SEP> Tétracycline <SEP> presente <SEP> en <SEP> Mcg/cm3
<tb> dans <SEP> le <SEP> butanol <SEP> dans <SEP> le <SEP> bouillon
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> épuisé <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 136 <SEP> 21
<tb> 2 <SEP> 0,1 <SEP> 196 <SEP> < <SEP> 20
<tb> 3 <SEP> 0,5 <SEP> 196 <SEP> 220
<tb>
Exemple XIX.
On ajoute a un bouillon de fermentation contenant au moins 100 mcg/cm3 de tétracycline environ 0,1 % de CaC12 et on règle le bouillon au pH 8,5-9,0 par un alcali caustique ou de l'ammoniac, puis on l'extrait par environ 1/5e de son volume de n-butanol par une extraction en plusieurs phases. Le mélange est filtré et le butanol contenant la tétracycline est concentré par distillation dans le vide avec addition éventuelle d'assez d'eau vers la fin de l'opération pour permettre la formation d'hydrates.
Les matières solides contenant la tétracycline (au moins 600 mcg/mg) précipitent sous la forme de la base ou du sel de calcium et sont recueillies par filtration ét dissoutes dans une quantité minimum de n-propanol. On fait ensuite passer de l'acide chlorhydrique gazeux dans le n-propanol pour précipiter du chlorhydrate de tétracycline cristallisé ayant une activité approximativement tnéorique.
Exemple XX. - On ajoute a un bouillon de fermentation contenant de la tétracycline 0,1 % de CaC1, et on règle le bouillon au pH 8,5-9.0 environ par de la soude ou de la potasse caustique ou de l'ammoniac et on l'extrait par du n-Dutanol, en utilisant 1/2 volume pour l'extraction par lots ou 1/4 - 1/5e de volume pour l'extraction en plusieurs phases. Le mélange est filtré et la phase de butanol est séparée dans le cas du procédé par lots. Le bu- tanol contenant la tétracycline est concentré au 1/200e du volume initial du bouillon par distillation dans le vide. Le concentré de butanol et les matières insolubles qu'il contient sont extraites par 3 volumes égaux successifs d'eau réglée au pH 2,5 par de l'acide cnlornydrique.
Ces extraits aqueux sont reunis, filtres et concentrés par distillation dans le vide pour obtenir 1/4UOe - 1/500e du volume du bouillon. A ce concentré aqueux, on ajoute 1% de chlorure de calcium (poids :volume) en on règle le pH a 7,8 - 8,5 environ par addition d'nydroxyde d'ammonium. Le précipité de tétracycline calcique solide obtenu est recueilli par filtration et séché
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après lavage a l'acétone, a l'air ou dans le vide.
Exemple XXI. -
On dissout la base libre de tétracycline (1 g) dans un volume minimum d'acétone anhydre et on fait passer a l'état gazeux la quantité stoé- chiometrique d'acide cnlorhydrique nécessaire pour former le sel. Le cnlorbydrat de tétracycline jaune solide et cristallisé précipite et est receuilli par filtration.
Exemple LUI.-
On purifie la tétracycline pour la débarrasser de la chlorotétracycline ou de l'oxytetracycline éventuellement presentes, par répartition à contre-courant comme dans l'appareil de Craig en utilisant un système de nbutanol et d'acide acétique a 2,5% décrit par exemple par Weisberger dans Technique of Organic Cnemistry, Vol. III, Interscience Publ. Co. N.Y. 195U, pages 171-jll et Anal. Vol. 24, pages 66-70 (1954) et Vol. 23, p.41-44 (1951) Exemple XXIII-
On ajoute des agentscationques, anioniques et non ioniques à des bouillons de fermentation de tétracycline pour augmenter l'efficacité de 1' extraction de la tétracycline des bouillons par le butanol ou l'alcool amyligue ou la métnyl-isobutyl-cetone.
Le pH est réglé soigneusement dans chaque cas pour obtenir la répartition maximum dans le solvant organique, déterminée) par une expérience simple. Des exemples d'agents et de concentrations utiles sont l'aérosol OT (1,0 %), le Tween 21 (0,5 %) et le Tergitol (0,1%) La concentration utilisee peut atteindre 5 % D'autres agents utiles sont des agents mouillants anioniques comme l'acide laurique, l'acide stéarique, les esters d'acide sulfurique, les acides napntalène-sulfoniques, les acides alkyl-aromatique-solfoniques supérieurs, des agents mouillants cationiques comme les sels d'ammonium quaternaires (par exemple (CH3)3NCH2CONH-C2B400CR Cl- où OGR représente des acides gras mélangés d'huile de copran) ;
etdes agents mouillants non ioniques comme les etners d'alkyl-phénol et de poly- glycol.
Dans un procédé simple suivant cette méthode, on utilise un agent d'entraînement pour faire passer la tétracycline du bouillon de fermentation contenant au moins 100 mcg/cmj de tétracycline, dans la méthyl-isobutylcetone. Ce solvant est separé ; l'addition d'acide chlorhydrique gazeux précipite le chlornydrate de tétracycline solide et cristallisé.
Dans un autre procédé suivant cette méthode, la tétra-cycline est " entraînée " du bouillon dans la méthyl--isobutyl-cétone par addition au bouillon au pH 2-4 d'environ 0,2 % d'un agent mouillant anionique comme le Tergitol 4 tetradécyl-sulfate de sodium), le Tergitol 7 (heptadecyl-sulfate de sodium) ou l'Aérosol OT (dioctyl-suifosuccinate de sodium).
Exemple XXIV. -
Un procédé tres simple, peu coûteux et efficace pour isoler la tétracycline orute de volumes importants de bouillon de fermentation est le suivant. Un règle un bouillon de fermentation contenant au moins 250 mcg/cm3 de tetracycline et de preference 1000 meg/cm3 de tetracycline ou plus, a un pH acide et on élimine le mycélium par filtration. Le bouillon filtre est ensuite règle au pH 8 ou a un pH supérieur par addition de soude caustique ou d'ammoniac par exemple. La tetracvcline solide, active, brute, precipite sous forme de base libre ou de sel de calcium, avec contamination par des pnosphates calciques et d'autres impuretés , et est recueillie par filtration. Le produit brut peut être encore purifié si on le désire par un des procédés decrits plus naut.
Par exemple, on peut le dissoudre dans l'acide chlorhydrique au pH < contenant 10% de cnlorure de sodium, l'extraire par le butanol et séparer le butanol puis le concentrer par distillation dans le vide pour precipiter le chlorhydrate de tétracycline.
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Exemple XXI. -
Un purifie la tétracycline calcique en l'extrayant par le méthanol dans lequel elle est insoluble, puis en la dissolvant dans un méthanol contenant du cnlorure de calcium. Les impuretés non dissoutes sont éliminées par filtration et on ajoute de l'eau et de l'ammoniac au pH 8 a la solution pour précipiter le tetracycline calcique purifiée.
Exemple XXVI.-
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On peut transformer de l'Omégamycine de pureté quelconque en chlornydrate en traitant la matière dans l'eau par de l'acide chlorhydrique
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jusqu'a ce qu'on obtienne une solution limpide et que le pH soit Unférieur a 3-4. La solution est congelée et séchée sous vide pour obtenir une poudre facilement soluble.
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L'0méjamycine de la présente invention est lâ même substance qu.' on appelle actuellement la tétracycline et dont les propriétés ont été décrites dans le Journal of the American Chemical Society, Volume 75, pages 4621-
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.i, 1953.
On attribue à l'Omégamycina ou la tétracycline (I), l'oxytétracycline (II) et la chlorotétracycline (III) les structures suivantes :
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un échantillon de base libre de la tétracycline préparé suivant
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les indicatiolsde la littérature à partir de cnlorotétracycline fond a 1700 -1750C et contient 0,71 % de chlore, ce qui indique une contamination d'environ 10 % de ch1ortétracyclina n'ayant pas réagi.
Cet échantillon et un autre, exempt de cnlore, de tétracycline pure (fondant à 169 -171 C avec
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décomposition) sont identiques a un échantillon d'Omégamycine (lot 30 ; préparée suivant l'exemple XIV ci-dessus) et toutes les impuretés sont
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distinguées par examen de ces échantillonset d'échantillons de chlorotétracyËLhseet d'oxytétracycline, seuls et en mélange, par chromatograpnie sur bande de papier particulièrement avec les systèmes solvants D et L).
Le fait que l't3mégamycin (lot go) est identique â la tétracycline est également indiqué par une vitesse identique de perte d'activité dans un tampon au pti t, Ü à .7oG a environ 0, 7 mg/cm3 (perte de t3 en 48 heures) la chlorotétracycline perdenviron 50 % de son activité enl4 heures et l'oxy- tétracycline perd environ 50% de son activité en 26 heures dans les mêmes con-
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ditions. En outre, 1-'Omégamycîne se différencie clairement de la chloroté- tracycline et de l'oxytétracycline par un essai sur de l'agar au pd 8,0 dans lequel la cnlorotétracycline et l'oxytétracycline se révèlent beaucoup mDins
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actives que l'Omégamyelne.
Des essais avec des matières solides ont été exécutés sur des plaques de 8. subtilis avec de l'agar au pH 6,2 et au pd d,0 et on a utilisé les tampons décrits plus haut comme diluants correspondant au pd de l'agar. Les résultats d'essais caractéristiques sont les suivants :
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Antibiotique Concentration introduite Dimension, de la zone dans le cylindre -mcg/cmj en mm dans l'essai de plaque avec B. i3ubti1is ¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ H 6.2) H 8.0) Chlorotétracycline 0,5 19 NR 2 20,2 NR Uxytétracyclîne 4 15,5 NR Tétracycline 50 21,5 19, 0 Cnlorotétracycline 2155 18,2 plus 21,5 18,2 Tétracycline 50 Omégamycine (lot 5 ) 100 20, 2 16, 6 Omëgamycina (lot 30) 25 23,3 15,1 12,5 20,8 12,9 Omé5amycini (lot j6) 16 z5,9 10,2
L'Omégamycine peut être débarrassée des quantités contaminantes de chlorotétracycline ou d'oxytétracyline en maintenant une solution aqueuse au pH 8,0 environ jusqu'a ce que toute la chlorotétracycline ou l'oxytétracycline se soit décomposée, puis en isolant l'Omégamyoine purifiée comme cidessus.
La tétracycline (Omégamycine) de la présente invention est utile sous la forme de la base libre y compris les formes anhydre- et hydratée et particulièrement sous celle du trinydrate, pour combattre de nombreuses maladies causées par des infections bactériennes cnez l'homme et chez les animaux. Pour cette application, on associe la tétracycline a une quantité significative d'un excipient pharmaceutique acceptable qui peut être une matière solide ou une matière liquide. Les compositions peuvent avoir la forme de comprimés, de comprimés effervescents, de poudres, de granules, de capsules (capsules a coque dure et a coque molle), ou de suspensions dans des huiles comestibles, ou d'autres présentations convenant particulièrement pour l'administration par voie buccale.
Des diluants liquides sont utilisés à l'état stérile pour application parenterale, c'est-a-dire par injection..
Ce milieu peut être un solvant stérile ou un agent de suspension stérile comme l'eau ou une nuile injectable. Les compositions peuvent avoir la forme de la matière active, c'est-à-dire de tétracycline-terme utilisé dans la présente description pour indiquer la base libre ou ses hydrates), en mélange avec des diluants soliaes et/ou des, adjuvants de la formation de comprimés tels que l'amidon de mais, le lactose, le talc, l'acide stéarique, le stéarate de magnésium, les gommes, etc... Toutes les matières servant a faire des capsules, cachets ou comprimés, utilisées en pharmacie, peuvent être employées lorsqu'il n'y a pas incompatibilité avec la tétracycline. Ces matières peuvent être transformées en comprimés avec ou sans adjuvants.
La tetracycline peut être egalement placée dans une capsule en matière résorbable, par exemple une capsule ordinaire en gélatine et administrée sous cette forme. Dans une autre forme d'exécution, la tétracycline peut être conditionnée en poudres emballees, et administrée de cette manière. La tétracycline peut être préparée sous la forme d'une suspension agréable au goût dans une matière dans laquelle la tétracycline n'est pas soluble, par exemple l'huile de coprah. Dans ce cas, on peut utiliser de l'huile de copran modifiée pour lui donner un point de durcissement inférieur a 60 oF et/ ou gélifiée à l'aide d'un stéarate d'aluminium. Cette suspension peut ètre administrée par voie buccale, telle quelle,ou aise en capsule.
Des onguents et lotions a la tétracycline sont utiles localement; on peut utiliser en thérapeutique topique des gouttes a instiller dans le nez, des trocnisques et des suppositoires.. La tétracycline de la présente invention
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est particulierement utile lorsqu'elle est administrée par voie buccale ou infra-musculaire , ane gamme de dosages utile chez l'homme est de 10 a 1000 mg par dose. Les doses sont administrees une a six fois par jour suivant l'etat du patient, l'infection la voie cnoisie, etc..
La proportion d'ingrédient actif dans ces compositions peut varier..Il est nécessaire que l'ingrédient actif constitue une proportion telle qu'on puisse obtenir un dosage approprié. Plusieurs formes de dosage unitaire peuvent être administrées à peu près en même temps. Bien qu'on ait constatë, particulièrement dans le cas d'injection intra-veineuse, qu'une proportion de moins de 0,10 % de tétracycline soit efficace il est préférable d'utiliser au moins 0,10 % de tétracycline. L'activité augmente avec la concentration de tétracycline. La proportion d'agent actif peut être 10 % ou même 25%, ou davantage, de la substance administrée.
Par exemple, on peut préparer des comprimés contenant une proportion mineure de diluant et une proportion-majeure de matière active. Les comprimés contenant 10 a 1000 mg de tétracycline sont particulièrement utiles. L'excipient pharmaceutique solide utilisé peut être une enveloppe contenant de la tétracycline pure, par exemple de la tétracycline pure trihy- dratée dans une capsule de gelatine.
La solutilité de la tétracycline dans l'eau entre le pH 5 et le pH 7 est très faible, (environ 0,4 mg/cmj). L'aadition de chlorure de calcium, par exemple a raison de 1 % en poids/volume, permet d'obtenir des concentrations beaucoup plus élevées ayant une solubilité supérieure à 5 mg/ cm3 par exemple au pH 6 ou dans la gamme de pH 5 a 7. Ces solutions sont très visqueuses, mais leur viscosité peut être modifiée en agissant sur le pH dans la gamme de forte solubilité. Des solutions ou suspensions stables contenant une proportion élevée de tétracycline peuvent être ainsi facilement obtenues et sont très utiles pour préparer des produits pharmaceutiques.
Bien que diverses formes de l'invention aient été décrites en détail, on comprendra que des modifications peuvent être apportées aux procéaés indiqués et,aux produits décrits sans s'écarter du principe de l'invention. Certains agents, composés ou mélanges (par exemple des acides, des milieux, des solvants, etc.) et d'autres détailes décrits en relation avec un exemple ou procède déterminé, peuvent être utilisée dans d'autres exemples ou procédés.