<B>Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique</B> La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique, la chalco- mycine.
La chalcomycine, qui est une substance nouvelle, est un composé cristallin, blanc et neutre contenant uniquement les éléments carbone, hydrogène et oxy gène.
Elle est soluble dans les esters alcoyliques d'aci des gras inférieurs tels que l'acétate d'éthyle et l'acé- tate d'amyle, dans les alcanols inférieurs tels que le méthanol et l'éthanol, dans les hydrocarbures aro matiques tels que le toluène .et le benzène, dans le chlorure d'éthylène et dans le chloroforme. Elle est légèrement soluble dans le tétrachlorure de carbone, dans l'eau et dans l'éther et relativement insoluble dans l'éther de pétrole.
La chalcomycine est optiquement active, avec une rotation spécifique (a) b = - 43,50 (c = 1 % dans l'éthanol). Le point de fusion est variable suivant la vitesse de chauffage et l'appareil utilisé, mais sur un bloc chauffé on observe une valeur de 1210-1230 C.
La chalcomycine contient environ 60 % de carbone (limites des valeurs expérimentales : 59,50 à 59,97 0/0) ; environ 8 % d'hydrogène (limites des va- leurs expérimentales : 8,08 à 8,32 0/0) et environ 32 #% d'oxygène (limites des valeurs expérimentales 31,43 à 32,05 0/0).
Le poids moléculaire de la chal- comycine est @d'en:viron 600 (limites des valeurs expé rimentales : 575 à 592).
Dans le dessin, la fig. 1 représente le spectre dans l'ultraviolet de la chalcomycine en solution à 0,00228 % dans l'éthanol absolu. Un maximum d'ab- sorption apparaît à 218 mu, E 1 hr = 319. Il y a un épaulement dans la région 240 mu. Le spectre d'absorption de la chalcomycine dans l'infrarouge est éminemment caractéristique de cette substance.
La fig. 2 montre le spectre dans l'infra rouge de la chalcomycine en solution chloroformi- que. Des maximums d'absorption principaux appa raissent à environ 2,83, 3,34, 3,40, 5,83, 5,89, 6,00, 6,13, 6,86, 7,23, 7,40, 7,53, 7,78, 8,00, 8,54, 8,70, 9,00, 9,22, 9,41, 9,67, 10,20,<B>10,71,</B> 11,20, 11,57 et 11,69 microns. La fig. 3 montre le spectre d'ab sorption dans l'infrarouge de la chalcomycine, déter miné dans un disque de bromure die potassium.
Des maximums d'absorption principaux apparaissent à environ 2,84, 3,35, 3,40, 5,81, 5,89, 6,02, 6,12, 6,84, 7,20, 7,38, 7,51, 7,77, 8,08, 8,52, 9,22, 9,40, 9,63, 10,15,<B>1</B>1,19, 11,59 et 12,70 microns.
La chalcomycine décolore une solution aqueuse de permanganate à température ordinaire, fixe du brome par addition en solution dans le tétrachlorure de carbone à température ordinaire, est donne direc tement un test à i'hydroxamate positif. La chalcomy- cine donne un test de To11en négatif, un test de Feh ling et un test au iodoforme négatif.
La chalcomycine présente les propriétés chimi ques d'une lactone. De 1.'insaturation et des groupes hydroxyles estérifiables sont également présents. Par acétylation de la chalcomycine avec l'anhydride acé tique dans la .pyridine à température ordinaire, on obtient un diacétate de chalcomycine cristallin.
La chalcomycine absorbe l'hydrogène en présence d'un métal noble comme catalyseur, dans des con ditions ménagées, en formant une série de produits d'hydrogénation. L'un de ces produits d'hydrogéna tion est la tétrahydrochalcomycine, qui est formée par hydrogénation de la chalcomycine en solution étha= nolique à température ordinaire et à pression atmo sphérique en présence d'un catalyseur au palladium,
et qui est facilement identifiée sous forme de diacé- tate de @tétrahydrochalcomycine cristallin.
L'activité anti-bactérienne de la chalcomycine, de solutions et de compositions contenant de la chal- comycinc, et de dérivés de la chalcomycine, est faci lement déterminée par la -mesure, de l'effet inhibiteur de ces préparations contre Sarcina lutea. La haute activité de la chalcomycine contre cet organisme est détruite par hydrolyse acide ou alcaline,
plus parti culièrement par chauffage de la chalcomycine à re flux pendant dix minutes avec une solution 1-molaire d'acide chlorhydrique dans du méthanol aqueux, ou en la laissant reposer à température ordinaire pen dant 24 heures dans une solution 0,1-molaire d'hy droxyde de sodium dans du méthanol aqueux.
Les produits de dégradation résultant de l'hydro lyse acide et alcaline de la chalcomycine sont des substances cristallines également utilisables pour l'identification et la caractérisation de la chalco- mycine.
Ces dérivés et produits de dégradation de la chal- comycin:e sont décrits plus en détail dans les exem ples ci-après.
La chalcomycine peut encore être caractérisée par son spectre d'activité anti-bactérienne. Le spectre anti-bactérien de la chalomycine, exprimé en concen tration inhibitrice minimum (microgrammes/ml) con tre :divers micro-organismes est indiqué dans le ta bleau I.
Les positions multiples données sous cer taines espèces dans le tableau I correspondent à dif- férentes souches de l'organisme et montrent les va riations observées pour différentes souches d'une espèce donnée.
Le bouillon de soja utilisé dans ces expérience est le bouillon de soja Trypticase, dont la composition est donnée dans Products for the Mi crobiological Laboratory y>, 4e édition, Baltimore Biological Laboratory, Inc., Baltimore, Maryland.
Une forte activité contre un organisme se traduit par l'inhibition de la croissance de l'organisme à une concentration de :chalcomycine inférieure à 1 micro- gramme/ml, alors qu'une inactivité relative contre un organisme se traduit par l'inhibition de la croissance de l'organisme à une concentration de chalcomycine non inférieure à 25 microgramm.es/ml.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on ensemence un milieu nutritif aqueux conte nant .des sources de carbone et d'azote assimilables avec une souche mutante de<I>Streptomyces</I> bikiniensis, et en ce que l'on incube le milieu ensemencé en con ditions aérobies.
Après cette période de culture ou incubation, la chalcomycine peut être retirée du mi lieu comme décrit plus loin, et peut être soumise à une purification subséquente, dans la -mesure désirée. Des souches de Streptomyces bikiniensis aptes à la production de chalcomycine ont été obtenues par irradiation ultraviolette d'actinomycètes :provenant de terrains cubains.
L'un de ces organismes utilisa ble pour la mise en oeuvre :du présent procédé dérive d'un actinomycète qui a été initialement isolé par dilution en série sur des plaques d'aga- nutritif à par tir d'un échantillon de terre prélevé dans un champ de maïs à San Vicente, Cuba. Cet actinomycète pa rent.n'a montré qu'une faible activité antibiotique con tre les organismes gram-négatifs. Son aptitude à la production d'antibiotique a été modifiée en le sou mettant à une irradiation ultraviolette et en cultivant les organismes survivant à cette irradiation.
Le trai tement a été effectué comme suit: On a ensemencé la culture parente d'actinomycète sur une surface oblique d'aga- de maltose et on a incubé pendant 7 jours. On a ajouté les spores de cette culture oblique à 10 ml de solution stérile de chlorure de sodium à 0,85 %, et on a secoué la suspension pendant 30 min.
On a placé la suspension de spores dans une boite de Petri stérile, avec le couvercle enlevé, et on a irradié pendant une minute sous une lampe germicide à lumière ultraviolette de 4 Watts, avec l'ampoule placée à 11,5 cm de la suspension. On a étendu la suspension irradiée sur de l'aga- au maltose d'Ander- so:n et on a incubé pendant 7 jours à 280 C.
On a réfrigéré les plaques pendant 10 jours, puis on a sélectionné des colonies isolées et on les a transfé rées sur des plaques obliques préparées avec de l'aga au maltose d'Anderson. On a incubé les plaques pen dant 8 jours à 28,1 C.
L'actinomycète provenant de l'une de ces plaques est l'une des souches de Strepto- myces bikiniensis utilisables pour la production de chalcomycine conformément à l'invention. D'autres souches semblables peuvent être obtenues de la même manière.
Des cultures de cet organisme ont été déposées dans la Northern Utilization Research and Develop- ment Division du Département de l'Agriculture des Etats-Unis d'Amérique, .Peoria, Illinois et sont con servées dans la collection de cultures permanentes sous le chiffre NRRL 2737.
L'organisme .est un membre aérobie et à sporula- tion aérienne de l'ordre Actinomycetales et appartient en genre<I>Streptomyces</I> comme décrit dans la 7e édi tion du Manual of Determinative Bacteriology de Bergey. Ses caractéristiques macroscopiques de cul ture sur des milieux utilisables pour l'identification de membres de ce genre sont indiquées dans le tableau II.
<I>Tableau 11</I> Caractéristiques macroscopiques des cultures de la souche productrice de chalcomycin.e de<I>Streptomyces</I>
EMI0003.0001
<I>Tableau <SEP> 1</I>
<tb> <I>Spectre <SEP> anti-bactérien <SEP> de <SEP> la <SEP> chalcomycine <SEP> <SEP> in <SEP> vitro <SEP> </I>
<tb> Jours <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice
<tb> Micro-organisme <SEP> Milieu <SEP> du <SEP> test <SEP> minimum
<tb> d'incubation
<tb> <U>(microgrammes/rrïl</U>
<tb> Coryn. <SEP> diphteriae <SEP> <B>............</B> <SEP> SB'* <SEP> -f- <SEP> serum'''r <SEP> 2 <SEP> 50,0
<tb> Diplo. <SEP> pneumoniae <SEP> ............ <SEP> SB <SEP> 1 <SEP> 0,19
<tb> Micro. <SEP> pyog.
<SEP> aureu.s <SEP> <B>..........</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,05
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,19
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,19
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,39
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,19
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,78
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,09
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,09
<tb> > <SEP> 1 <SEP> 0,09
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,39
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,19
<tb> <SEP> C. <SEP> Williams <SEP> <B>........</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 100,0
<tb> Neisseria <SEP> catarrhalis <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> <B>......</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 100,0
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> <B>..........</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,09
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> <B>............</B> <SEP> . <SEP> .
<SEP> <SEP> 1 <SEP> <B>0,19</B>
<tb> <SEP> >> <SEP> 1 <SEP> 100,0
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,78
<tb> S > <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Strep. <SEP> salivarius <SEP> .. <SEP> ... <SEP> ...... <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Strep. <SEP> faecalis <SEP> <B>....</B> <SEP> . <SEP> <B>...........</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 100,0
<tb> Strep. <SEP> Group <SEP> C <SEP> sp. <SEP> . <SEP> <B>...........</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 0,78
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> <B>..........</B> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Brucel.la <SEP> suis <SEP> . <SEP> <B>.......</B> <SEP> . <SEP> <B>......</B> <SEP> SB <SEP> --f- <SEP> sérum <SEP> 2 <SEP> 25,0
<tb> Esch. <SEP> col! <SEP> <B>....</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>..........</B> <SEP> SB <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Klebs. <SEP> pneumoniae <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <SEP> 1 <SEP> 12,5
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 100,0
<tb> Pasteurella <SEP> multocida <SEP> <B>..........</B> <SEP> SB <SEP> -f- <SEP> sérum <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...........</B> <SEP> SB <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Pseudomonas <SEP> species <SEP> <B>..........</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> .... <SEP> <SEP> 1 <SEP> 25,0
<tb> Salm. <SEP> typhimurium <SEP> <B>............</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Salm. <SEP> paratyphi <SEP> <B>..............</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Salm. <SEP> typhosa <SEP> <B>................</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> <B>100,0</B>
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> <B>.........</B> <SEP> ..
<SEP> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> <B>....</B> <SEP> . <SEP> <B>..... <SEP> .....</B> <SEP> <SEP> 1 <SEP> 50,0
<tb> Myco. <SEP> smegmatis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>...........</B> <SEP> synthétique <SEP> 7 <SEP> 50,0
<tb> Myco..tuberculosis <SEP> ............ <SEP> <SEP> 7 <SEP> 25,0
<tb> <SEP> synth. <SEP> -I- <SEP> sérum <SEP> 7 <SEP> 50,0
<tb> ^\ <SEP> SB <SEP> = <SEP> bouillon <SEP> de <SEP> soja
<tb> . <SEP> .@ <SEP> 10 <SEP> % <SEP> <B>(V</B>w)
EMI0004.0001
Couleur <SEP> de
<tb> Milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> mycélium <SEP> substrat <SEP> substrat <SEP> Autres <SEP> caractéristiques
<tb> aérien <SEP> mycélien
<tb> Glycérol, <SEP> asparagine, <SEP> agaT <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> blanc <SEP> à <SEP> jaune <SEP> inchangé. <SEP> Colonies <SEP> convexes <SEP> à <SEP> pulvi;
nées,
<tb> à <SEP> gris <SEP> marge <SEP> étalée, <SEP> filamenteuse
<tb> Amidon, <SEP> agar <SEP> synthétique <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> tan <SEP> à <SEP> gris <SEP> inchangé <SEP> Hydrolyse <SEP> modérée
<tb> Calcium, <SEP> malate, <SEP> agar <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> jaune <SEP> inchangé <SEP> Hydrolyse <SEP> modérée
<tb> Czapek <SEP> Dox, <SEP> agar <SEP> blanc <SEP> blanc <SEP> inchangé <SEP> Croissance <SEP> pauvre
<tb> Agar <SEP> nutritif <SEP> blanc <SEP> gris <SEP> brun <SEP> gris <SEP> foncé <SEP> Croissance <SEP> aérienne <SEP> pauvre, <SEP> colo nies <SEP> convexes, <SEP> marge <SEP> filamenteuse
<tb> Glucose, <SEP> agar <SEP> nutritif <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> gris <SEP> jaune <SEP> gris <SEP> Colonies <SEP> pulvinées <SEP> ;
<SEP> certaines <SEP> à <SEP> cen à <SEP> gris <SEP> brun <SEP> tres <SEP> déprimés <SEP> et <SEP> plis <SEP> radiaux, <SEP> marge
<tb> ondulée
<tb> Glucose, <SEP> trypton.e, <SEP> agar <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> gris <SEP> à <SEP> noir <SEP> noir <SEP> Colonies <SEP> pulvinées <SEP> ;
<SEP> certaines <SEP> à <SEP> cen tres <SEP> déprimés <SEP> et <SEP> plis <SEP> radiaux, <SEP> marge
<tb> ondulée
<tb> Agar <SEP> de <SEP> sporulation <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> brun <SEP> à <SEP> noir <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> Colonies <SEP> protubérantes <SEP> à <SEP> centres
<tb> d'Anderson <SEP> déprimés <SEP> et <SEP> plis <SEP> radiaux, <SEP> marge
<tb> ondulée <SEP> à <SEP> filamenteuse
<tb> Tranche <SEP> de <SEP> pomme <SEP> de <SEP> terre <SEP> blanc <SEP> gris <SEP> brun <SEP> brun <SEP> près
<tb> de <SEP> la <SEP> culture <SEP> Croissance <SEP> aérienne <SEP> pauvre
<tb> Glucose, <SEP> agar <SEP> synthétique <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> tan <SEP> à <SEP> gris <SEP> inchangé <SEP> Colonies <SEP> convexes <SEP> à <SEP> pu,lvinées,
<tb> marge <SEP> filamenteuse
<tb> Gélatine <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> brun <SEP> brun <SEP> foncé <SEP> Liquéfiée <SEP> sur <SEP> 1 <SEP> cm <SEP> environ <SEP> après
<tb> 7 <SEP> jours
<tb> Lait <SEP> neutralisé <SEP> gris <SEP> anneau <SEP> bleu <SEP> foncé <SEP> Peptonisation <SEP> modérée
<tb> gris <SEP> brun
<tb> Bouillon <SEP> au <SEP> nitrate <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Réduit <SEP> en <SEP> nitrite Lorsque l'organisme est cultivé sur certains mi lieux à l'agar, le mycélium aérien est .tout d'abord blanc, puis devient gris. Le mycélium aérien est ve louté, parfois légèrement duveteux et porte fréquem ment des gouttelettes hyalines. Le mycélium submergé est blanc à jaune ou beige et devient ultérieurement gris.
Sur des milieux contenant des sources com plexes d'azote, le mycélium submergé devient ordi nairement brun, gris brun ou noir, et un pigment brun foncé ou noir soluble se forme dans le milieu.
Les hyphes aériens sont hyalins, droits ou ondu leux, avec parfois des boucles terminales sur cer tains milieux tels que l'agar-asparagine-glycérol et l'agar nutritif au glucose. Les hyphes aériens sont de longueur variable et sont ramifiés de façon hétéro gène. Les parties distales des hyphes aériens se sub divisent en chaînes de spores de longueur variant de 10 à 200 microns environ. Les hyphes végétatifs sont hyalins et leur largeur est d'environ 0,6 à 1,4 mi cron. Les spores sont ordinairement oblongues, par fois ovales ou sphériques, leur diamètre varie d'en- viron 0,6 à 1,5 micron et leur longueur varie de 0,8 à 2,0 microns.
Au cours de tests d'utilisation du carbone, on a obtenu une croissance assez bonne à bonne avec les uniques sources de carbone suivantes : dextrose, mal tose, D-mannose, et amidon. On a obtenu une crois sance médiocre ou nulle avec le L-arabinose, l'ado- nitol, la cellulose, l'i-inositol, l'inuline, le lactose, le D-mannitol, le mélèzitose, le mélibiose, le raffinose, le rahmnose, le D-sorbitol,
le sucrose et le tréhalose.
Par sa couleur mycélienne aérienne et, à plusieurs égards, par sa micromorphologie hyphale, l'organisme ressemble au<I>Streptomyces</I> bikiniensis décrit par D.B. Johnstone et S.A. Waksman (J. Bact. 55, 317 (1948)). Par certaines autres caractéristiques, l'orga nisme diffère notablement du S. bikiniensis décrit par Johnstone et Waksman (tableau III), ainsi que de l'organisme ressemblant au<I>S.</I> bikiniensis décrit par Hamada (tableau IV).
Notre organisme est donc con sidéré comme une souche nouvelle et distincte du <I>S.</I> bikiniensis, la nouvelle souche étant représentée par le chiffre de culture NRRL 2737.
EMI0005.0001
<I>Tableau <SEP> 111</I>
<tb> Comparaison <SEP> d'une <SEP> souche <SEP> productrice <SEP> de <SEP> chalcomycine <SEP> de <SEP> <I>Streptomyces <SEP> bikiniensis</I> <SEP> correspondant
<tb> à <SEP> NRRL <SEP> 2737 <SEP> avec <SEP> le <SEP> <I>S. <SEP> Bikiniensis</I> <SEP> de <SEP> Johnstone <SEP> et <SEP> Waksman
<tb> Caractéristiques <SEP> <I>S. <SEP> bikiniensis</I> <SEP> correspondant <SEP> à <SEP> NRRL <SEP> 2737 <SEP> <I>S. <SEP> bikiniensis</I> <SEP> de <SEP> Johnstone <SEP> et <SEP> Waksman
<tb> J.
<SEP> Bact., <SEP> 55, <SEP> 317 <SEP> (1948)
<tb> Morphologie <SEP> aérienne <SEP> Boucles <SEP> terminales <SEP> occasionnelles <SEP> sur <SEP> Non <SEP> décrite
<tb> certains <SEP> milieux
<tb> Conidies <SEP> Ordinairement <SEP> oblongues, <SEP> parfois <SEP> ova- <SEP> Ovales
<tb> les <SEP> ou <SEP> sphériques
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> l'agar <SEP> Médiocre, <SEP> blanc; <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> Luxuriante, <SEP> blanc <SEP> devenant <SEP> gris <SEP> neutre
<tb> synthétique <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> spores <SEP> rares <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> gouttelettes <SEP> ; <SEP> pas <SEP> pâle <SEP> avec <SEP> nuance <SEP> blanche;
<SEP> mycélium
<tb> de <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> aérien <SEP> et <SEP> spores <SEP> formés <SEP> abondamment <SEP> ;
<tb> gouttelettes <SEP> superficielles <SEP> de <SEP> coloration
<tb> ambrée <SEP> ; <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> l'agar <SEP> Bonne <SEP> avec <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> médiocre<B>;</B> <SEP> Luxuriante <SEP> avec <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> mo nutritif <SEP> pigment <SEP> gris <SEP> sombre <SEP> soluble. <SEP> déré <SEP> ; <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> brun <SEP> foncé.
EMI0005.0002
<I>Tableau <SEP> IV</I>
<tb> Comparaison <SEP> d'une <SEP> souche <SEP> productrice <SEP> de <SEP> chalcomycine <SEP> de <SEP> <I>Streptomyces <SEP> bikiniensis</I> <SEP> correspondant
<tb> à <SEP> NRRL <SEP> 2737 <SEP> avec <SEP> l'organisme <SEP> de <SEP> Hamada, <SEP> ressemblant <SEP> à <SEP> S. <SEP> <I>bikiniensis</I>
<tb> Souche <SEP> ressemblant <SEP> à <SEP> S. <SEP> <I>bikiniensis</I> <SEP> F-300,
<tb> Caractéristiques <SEP> <I>S. <SEP> bikiniensis</I> <SEP> correspondant <SEP> à <SEP> NRRL <SEP> 2737 <SEP> Masa <SEP> Hamada <SEP> J.
<SEP> Antibiotics
<tb> Série <SEP> A <SEP> 10, <SEP> 74 <SEP> (1957)
<tb> Conidies <SEP> Ordinairement <SEP> oblongues, <SEP> parfois <SEP> ova- <SEP> Elliptiques
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> l'agar <SEP> les <SEP> ou <SEP> spériques <SEP> Epaisse <SEP> et <SEP> élevée, <SEP> jaune <SEP> pâle<B>;</B> <SEP> pas <SEP> de
<tb> synthétique <SEP> de <SEP> Czapek <SEP> Médiocre, <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> pigment <SEP> soluble <SEP> ou <SEP> pigment <SEP> gris <SEP> jaunâtre
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> l'agar <SEP> au <SEP> soluble <SEP> Brun <SEP> jaunâtre <SEP> pâle; <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> malate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> Jaune <SEP> ;
<SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> blanc
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> agar <SEP> nu- <SEP> Faible <SEP> mycélium <SEP> .aérien <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> pigment <SEP> Pas <SEP> de <SEP> mycélium <SEP> aérien<B>;</B> <SEP> pigment <SEP> soluble
<tb> tritif <SEP> soluble <SEP> gris <SEP> foncé <SEP> brun <SEP> noirâtre
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> gélatine <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> brun <SEP> pâle
<tb> Utilisation <SEP> de
<tb> Rhamnose <SEP> 0 <SEP> -I Sucrose <SEP> 0 <SEP> -I- <SEP> -I Lactose <SEP> <SEP> -;- <SEP> +.
<tb> Raffinose <SEP> 0 <SEP> -f Inuline <SEP> 0 <SEP> -I Inositol <SEP> 0 <SEP> <B>++</B> Le procédé selon l'invention peut être effectué comme suit :
on ensemence un milieu nutritif aqueux stérile avec une souche productrice de chalcomycine de<I>Streptomyces</I> bikiniensis, on conduit une fermen tation en conditions aseptiques et .aérobies, à une tem pérature comprise entre 20 et 350 C environ, jusqu'à ce qu'une activité antibactérienne substantielle ait été conférée au mélange de fermentation, et on isole la chalcomycine désirée du mélange de fermentation.
Pour l'ensemencement, on peut utiliser des spores ou des conidies de la culture sélectionnée de Strepto- nayces bikiniensis. Des suspensions aqueuses des spo res ou conidies contenant une petite quantité de sa von ou autre agent mouillant peuvent être employées avec avantage. Pour les fermentations à grande échelle, il est préférable d'utiliser des cultures en bouillon jeunes, vigoureuses aérées et agitées du micro-organisme.
Les milieux nutritifs aqueux appropriés sont ceux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et ont de préférence un pH compris entre 6 et 8,5 environ. Parmi les sources de carbone assimi lables et qui donnent satisfaction, on peut citer les hydrates de carbone purs utilisables par l'organisme ainsi que les mélanges d'hydrates de carbone que l'on trouve dans le commerce. Comme exemples de subs tances convenant à ce but, on peut citer le glucose, le maltose, le mannose, l'amidon et les amidons mo difiés, le sirop de maïs, les liqueurs de malt, la mé lasse de canne, le glycérol, etc.
La quantité d'hydrates de carbone présents dans le milieu nutritif n'est pas particulièrement critique et peut varier entre environ 0,5 et 5 % en poids du milieu. Des quantités quelque peu en dehors de ces limites peuvent aussi être uti lisées.
Les sources d'azote du milieu nutritif peuvent être de nature organique, inorganique ou mixte. Comme exemple des nombreuses substances azotées pouvant être employées dans le milieu nutritif on peut citer des acides aminés, des peptones, des protéines hydro lysées et non hydrolysées, la farine de poisson, la farine de soja, J'a liqueur de macération de maïs, la liqueur de macération de maïs déshydratée, les extraits de viande, la farine d'arachide, des nitrates inorganiques, l'urée, des sels d'ammonium, etc. En raison de la nature brute de la plupart des sources d'azote que l'on trouve facilement, la quantité à ajou ter au milieu varie suivant la pureté et on ne peut pas spécifier a priori une quantité définie de la source azotée devant être ajoutée au milieu.
On peut cependant préciser qu'il n'est pratiquement pas né cessaire que la proportion des matières azotées dé- passe 6 % du poids du milieu de fermentation total, et qu'elles peuvent être présentes en proportion beau coup plus faible.
La présence d'une certaine proportion de sels minéraux et de traces de facteurs de croissance de composition inconnue est désirable afin d'obtenir les meilleurs rendements en chalcomycine. De nombreu ses matières brutes très répandues, telles que la li queur de macération de maïs, les résidus de la fer mentation butanolique-acétonique, des préparations de levure, la farine d'huile de soja et autres produits de nature semblable contiennent ces sels inorganiques et facteurs de croissance, et l'addition d'au moins l'une de ces substances au milieu de fermentation est désirable.
Pour assurer la présence de quantités suffi santes de composants minéraux dans le milieu, il est également avantageux dans bien des cas d'ajouter certains sels inorganiques tels que le chlorure de so dium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de cal cium, l'acétate de sodium, etc. La concentration pré- férée des sels minéraux est de 0,1 à 1 % en poids du milieu nutritif.
La culture de la souche sélectionnée de<I>Strepto-</I> <I>myces</I> bikiniensis dans le milieu nutritif aqueux peut être réalisée de diverses façons. Par exemple, l'orga nisme peut être cultivé en conditions aérobies sur la surface du milieu, ou il peut être cultivé en dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire en culture submer gée, à condition qu'une arrivée d'oxygène suffisante soit assurée.
La méthode préférée de production de la chalco- mycine à grande échelle est la fermentation d'une souche productrice de chalcomycine de<I>Streptomyces</I> bikiniensis en culture submergée ou profonde. Suivant ce mode d'exécution, on ensemence un milieu nutritif aqueux stérile avec la culture sélectionnée et on in cube avec agitation et aération à une température comprise entre 20 et 350 C environ, de préférence au voisinage de 23-30 C, jusqu'à ce qu'une concentra tion élevée de chalcomycine soit présente dans le liquide de culture.
Le laps de temps nécessaire au rendement maximum en chalcomycine varie avec les dimensions et le type de l'appareillage utilisé, l'inten sité de l'agitation et de l'aération, la culture parti culière de l'organisme et d'autres facteurs. Dans les fermentations industrielles à grande échelle mises en couvre dans des fermenteurs du type à cuve, la pro duction maximum de chalcomycine est ordinairement atteinte en 1 à 4 jours environ.
Des durées de fermen tation plus brèves peuvent aussi être utilisées, mais il en résulte d'habitude un rendement inférieur en chalcomycine. Lorsque la fermentation est effectuée dans les flacons secoués, le temps nécessaire à la pro duction maximum de chalcomycine peut être un peu plus long que dans le cas des cuves de fermentation de grandes dimensions.
En culture submergée, le micro-organisme se dé veloppe sous forme de particules relativement sépa rées et dispersées dans toute la masse du milieu nutri tif, par opposition à la pellicule relativement conti nue présente à la surface du milieu dans la méthode de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans toute la masse du milieu, de grands volumes de milieu nutritif ensemencé peuvent être utilisés pour la culture de l'organisme dans les bacs et cuves employés ordinairement dans l'industrie des fermentations.
Des cuves de fermentation fixes munies de dispositifs d'agitation et d'aération conviennent particulièrement à la production à grande échelle de la chalcomycine, bien que des appareils de fermen tation de construction différente soient également uti lisables. Pour la production de plus petites quantités de chalcomycine ou pour la préparation de cultures de l'organisme à utiliser pour l'ensemencement de fermentations à grande échelle, la culture submergée peut être mise en oeuvre dans de petits flacons ou vases qui sont secoués ou dont le contenu est agité par des moyens mécaniques appropriés.
Dans la méthode par culture submergée, l'agita tion et l'aération de la culture peuvent être réalisées de diverses façons. L'agitation peut être assurée au moyen de turbines, palettes, impulseurs ou autres dispositifs d'agitation mécaniques, en faisant tourner ou en secouant le fermenteur lui-même, à l'aide de dispositifs de pompage variés ou par le passage d'air ou d'oxygène dans le milieu. L'aération peut être obtenue par injection d'air ou d'oxygène dans le mélange de fermentation par des tuyaux ouverts, des tuyaux à perforation ou des tuyaux contenant une section de diffusion poreuse.
Elles peut encore être obtenue par pulvérisation ou par projection du milieu ou en faisant couler celui-ci dans ou à travers une atmophère contenant de l'oxygène.
La méthode par culture en surface est une va riante de la méthode préférée par culture submergée. Dans la méthode par culture en surface, une cou che peu profonde, d'habitude de moins de 2 cm, d'un milieu aqueux nutritif stérile est ensemencé avec une souche productrice de chalcomycine de<I>Streptomyces</I> bikiniensis et le mélange ensemencé est incubé dans des conditions aérobies, à une température comprise entre 20 et 35 C environ. Le produit est ensuite isolé de manière semblable à celle décrite plus loin pour la méthode par culture submergée.
La quantité ou concentration de chalcomycine présente après la fermentation ou à ,n'importe quel moment au cours de la fermentation peut être déter minée par dosage biologique. A cet effet, on prélève une prise aliquote représentative du mélange de fer mentation et on la filtre pour éliminer la matière solide.
L'activité antibiotique du bouillon peut ensuite être déterminée en mesurant l'inhibition de la crois sance du micro-organisme Sarcina lutea dans les con ditions normalement favorables à la croissance de cet organisme. Pour effectuer ce dosage biologique, on prépare une culture de l'organisme d'épreuve sur plaque ou plateau d'agar. On place des disques de papier filtre contenant une quantité mesurée d'une dilution déterminée du bouillon contre la surface de la culture sur agar et on observe l'inhibition de la croissance de l'organisme après une période d'incu bation.
Le dosage biologique est basé sur le fait que la chalcomycine est typiquement antagoniste de la croissance de l'organisme ce dont il résulte que la zone d'inhibition entourant le disque de papier filtre varie avec la quantité de chalcomycine dispersée dans le disque. L'estimation de l'activité est basée sur la dilution du bouillon nécessaire pour produire un diamètre de la zone d'inhibition choisi arbitrairement, dans les conditions de l'essai, comme décrit plus com plètement dans les exemples qui suivent.
L'activité des bouillons de chalcomycine peut aussi être déterminée par d'autres méthodes, par exemple en mesurant la dilution du bouillon néces- saire pour donner une inhibition de 50 % de la crois- sance dans un test turbidimétrique contre Agrobacte- riunt
tumefaciens après une incubation de 2 3/4 h à 37,) C sur bouillon d'infusion de c#ur et de cerveau.
Lorsque la phase de fermentation du procédé est terminée, le produit désiré est présent en majeure partie dans le liquide de la culture, et on l'isole de ce liquide. Par exemple, dans le cas de la production de la chalcomycine par culture submergée, il convient de séparer le mycélium, par exemple par filtration ou par centrifugation, puis d'extraire le bouillon filtré au moyen d'un solvant non miscible à l'eau tel que le chlorure d'éthylène, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'acétate d'amyle, etc. On soumet l'extrait résultant, qui contient la chalcomycine, à un traite ment subséquent qui dépend de la pureté désirée pour le produit final.
Par exemple, on lave l'extrait orga nique avec une base diluée, un acide dilué et de l'eau, et on évapore à sec. On extrait le résidu de chalcomycine brute avec un solvant non polaire comme le benzène, et on fait descendre la solution benzénique dans une colonne de chromatographie garnie d'alumine. Par développement et élution de la colonne au moyen de solvants et mélanges de sol vants de polarité croissante, on obtient des éluats contenant de la chalcomycine en haute concentration.
Si désiré, on purifie encore par une nouvelle chroma tographie, par recristallisation dans des solvants, par répartition entre des solvants, par extraction à con tre-courant, ou par combinaison de ces moyens et de moyens semblables. Après une purification pré liminaire par chromatographie sur alumine ou répar tition entre solvants, ou peut poursuivre la purifica tion par chromatographie sur charbon actif éventuel lement mélangé à de la terre de diatomées. Le déve loppement et l'élution de la colonne de charbon peu vent être effectués à l'aide de solvants hydroxylés .et cétoniques, comme le méthanol ou le méthanol aqueux et l'acétone ou l'acétone .aqueuse.
La chalcomycine est un antibiotique de valeur pour le traitement d'infections bactériennes. Par exemple, elle est active contre divers organismes gram-positifs. Elle est généralement .active contre les staphylocoques et les pneumocoques et est active con tre certaines souches de streptocoques. La chalcomy- cine est spécialement intéressante pour le traitement d'infections bactériennes causées par de nombreux staphylocoques qui résistent à d'autres antibiotiques. A titre d'exemple de l'emploi de la chalcomycine, elle peut être incorporée à un onguent pour l'application locale dans le cas d'une infection staphylococcique localisée.
<I>Exemple 1</I> <I>Préparation et dosage de bouillons antibiotiques</I> <I>contenant de la</I> chalcomycine On prépare un milieu nutritif de composition sui vante Glucose monohydraté ................ 0,5 % Glycérol .......................... 0,5 0/0 Caséine, hydrolysai acide<B>..............</B> 0,3 0/0 Peptone, hydrolysat enzymatique<B>........</B> 0,25% Levure de bière<B>... ..............</B> . .
0,1 0/0 Liqueur de macération de maïs déshydratée 0,25% Résidu de fermentation butanolique-acé- tonique <B>........</B> .<B>........... 0,250/0</B> Farine de soja, extraite par solvant . . . . . 0,25% Chlorure de sodium -<B>--- ......
0,5</B> 19/o Carbonate de calcium<B>.......</B> .<B>........</B> 0,1 0/0 Eau de conduite, complément à 100 0/0.
On répartit 21 de ce milieu par portions de 250 ml dans huit flacons d'Erlenmeyer à col large de <B>11,</B> bouchés avec de la gaze de coton et de la fibre de coton et stérilisés à 1200 C pendant 25 min. On laisse les flacons refroidir puis on les ensemence cha cun avec 0,5 ml d'une suspension de spores de<I>Strep-</I> <I>tomyces</I> bikiniensis correspondant à NRRL 2737.
Cette suspension de spores est préparée à partir d'une culture oblique sporulée sur agar au maltose d'An derson, en suspendant les spores dans 12 ml d'une solution stérile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,1%. On incube les flacons ensemencés à 270 C pendant 72 h,
durant lesquelles on .agite et on aère au moyen d'une secoueuse rotative décrivant un cer cle de 6 cm de diamètre à 160 t/min. A la fin de la période d'incubation, on dose la teneur du bouillon en chalcomycine par une méthode de diffusion de disque en papier sur plateau d'agar semblable à celle décrite pour le dosage de la viomy- cine par Ehrlich, Iverson et Kohberger, Antibiotics and Chemotherapy , 1, (3) :
211-216 (juin 1951). Pour adapter cette méthode au dosage de la chalco- mycine, on la modifie de la façon suivante. L'orga nisme d'épreuve utilisé est Sarcina lutea PCI 1001 W. On prépare l'inoculum pour la couche d'ensemence ment en faisant croître la culture sur un milieu tel que le Penassay seed agar (Difeo) dans des bouteilles de Roux à 280 C pendant 18 h.
Les cellules sont en suite récoltées dans un milieu tes que le bouillon de Penassay (Difco). Les compositions du Penassay Seed agar et du bouillon de Penassay sont décrites dans Difco Manual of Dchydrated Culture Media and Reagents for Microbiological and Clinical Labo- ratory
Procedures , 9e édition, et dans Compila tion of Tests and Methods of Assay for Antibiotic Drugs , Federal Security Agency, Food & Drug Administration.
Des agars et bouillons de composition analogue peuvent également être utilisés. On dilue ensuite la suspension de cellules avec une nouvelle quantité de bouillon de Penassay de façon qu'une nouvelle dilution de 1 : 10 donne une transmission de lumière de 16 % dans un spectrophotomètre de Col- man Jr., modèle 6A, à une longueur d'onde de 555 mu.
La suspension de cellule obtenue préalable ment à la dilution de 1 : 10 destinée à la détermina tion spectrophotométrique est utilisée pour le dosage biologique.
On procède à une dilution à 1 : 600 de cette sus pension de cellules dans du Penassay seed agar, et on coule 25 ml dans chaque plateau. On .n'emploie aucune couche de base dans ce dosage. On effectue l'incubation à 37 C pendant 18 h.
On attribue au bouillon antibiotique obtenu dans cet exemple une activité de 8 unités par ml. Cette attribution d'activité est basée sur le fait qu'une di lution de 8 fois du bouillon dans un tampon au phos phate au pH 7,8 (concentration finale du tampon 0,1 M) donne un diamètre de zone d'inhibition moyen choisi arbitrairement de 13,9 mm, dans le test dans les conditions de dosage indiquées précédemment. Sur la base des unités d'activité ainsi définies, la chalcomycine cristalline pure donne une valeur de 1025 unité par mg.
Une unité d'activité représente donc environ 1 microgramme de chalcomycine. Dans le dosage des bouillons de chalcomycine, l'étalon de référence et les échantillons sont dilués dans des tampons de phosphate au pH 7,8 jusqu'à une concentration finale du tampon de 0,1 M. Lors que des fluides du corps sont dosés, l'étalon de réfé rence et les échantillons sont dilués dans le fluide du corps, dans lequel on effectue le dosage.
<I>Exemple 2</I> <I>Préparation et isolement de la</I> chalcomycine On prépare un milieu nutritif de composition sui vante Glucose monohydraté <B>.... ...</B> 0,5 0/0 Glycérol .......................... 0,5 % Caséine, hydrolysat acide<B>... ......</B> . 0,3 0/0 Peptone, hydrolysat enzymatique . . . . . . 0,25% Levure de bière<B>...............
....</B> 0,1 0/0 Liqueur de macération de maïs déshydratée 0,25'% Résidu de fermentation butanolique-acé- tonique <B>....................</B> 0,25% Farine de soja, extraite par solvant . . . . . 0,25% Chlorure de sodium<B>......</B> . .<B>...</B> .<B>....</B> 0,5 0/0 Carbonate de calcium .
....... ...... 0,1 % Eau, complément à 100 %. On place 121 de ce milieu dans un vase de 301 agité, muni d'un diffuseur, d'un impulseur, d'écrans et d'une conduite de prélèvement d'échantillons. On stérilise le milieu par chauffage à 1210 pendant 90 min.
On prépare une suspension de spores à par tir de deux cultures sur agar obliques de<I>Streptomy-</I> <I>ces</I> bikiniensis sporulé correspondant à NRRL 2737 sur de l'agar au maltose d'Anderson, et à partir de 20 ml d'une solution stérile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,1 0/0. On utilise la suspension de spores pour ensemencer le milieu de fermentation refroidi, qui est ensuite incubé à 260 C pendant 46 h. Au cours de l'incubation, on maintient l'agitation à la vitesse de 210 t/min et on fait arriver de l'air au débit de 121/min. On ajoute un agent anti-mousse selon les besoins.
On répartit 641 du milieu nutritif ayant la com position donnée au commencement de cet exemple, par portions égales, dans 4 vases de fermentation à agitation de 30l. Après stérilisation et refroidisse ment, on ensemence chaque vase avec 800 ml du mé lange de fermentation de 46 h obtenu ci-dessus. On effectue l'incubation à 26o C pendant 24 h en agitant à 200 t/min, et on aère à raison de 161 d'air par minute. On ajoute un agent anti-mousse selon le besoin. On réunit les mélanges de fermentation et on filtre, obtenant ainsi environ 57,5l de bouillon.
On extrait deux fois ce bouillon avec des portions de 2,25 1 de chlorure d'éthylène et on lave l'extrait orga nique successivement avec une solution aqueuse de carbonate de sodium à 2 %, avec de l'acide chlor- hydrique 0,01 N et avec de l'eau, après quoi on éva pore le solvant et on extrait le résidu au benzène. On fait couler la solution benzénique filtrée sur une colonne de chromatographie garnie de 350 g d'alu mine (pH 6,9) provenant d'une suspension dans le benzène.
Après développement de la colonne avec 250 ml d'acétate d'éthyle, on l'élue avec du méthanol. On recueille séparément les éluats de méthanol, et on dose l'activité antibiotique du résidu de chaque éluat. On réunit les éluats actifs et on les concentre jusqu'à siccité.
On fait couler une solution du résidu dans 30 ml d'acétone aqueuse à 18 % sur une co- lonne de chromatographie préparée avec 5,5 g de charbon actif,
qui peut être du charbon Darco G-60 . On développe la colonne avec de l'acétone aqueuse à 18 % et on recueille le produit par élu- tion avec de l'acétone.
On réunit les éluats acétoni- ques doués d'activité antibiotique, et on évapore à sec pour obtenir la chalcomycine désirée ; (a) 27 = D - 43,5 (c = 1 % dans l'éthanol). Par microanalyse,
on constate que cette préparation contient 59,84 % de carbone et 8,3 % d'hydrogène. <I>Exemple 3</I> <I>Préparation, purification et caractérisation</I> <I>de la</I> chalcomycine On prépare un milieu nutritif (désigné ci-après milieu C ) de la composition suivante Caséine,
hydrolysat acide ............ 0,5 % Levure de bière<B>.....</B> .<B>..............</B> 0,5 0/0 Chlorure de sodium<B>................</B> 0,5 0/0 Carbonate de calcium<B>................</B> 0,25% Maltose .......................... 1,0 % Eau, complément à 100%.
Solution d'hydroxyde de sodium (10 N) pour amener le pH à 7,5. On introduit 37,851 de milieu C dans un fer menteur en acier .inoxydable de 1141. Après addi tion de 175 ml d'un agent anti-mousse consistant en un mélange d'axonge brut et d'huiles minérales, con tenant des mono- et des diglycérides, on stérilise le milieu pendant une heure à 121 C, on refroidit, puis on ensemence avec 30 ml d'une suspension de spores.
La suspension de spores est préparée à partir de 3 cultures obliques de<I>Streptomyces</I> bikiniensis spo rulé, correspondant à NRRL 2737 en suspendant les spores de chaque culture dans 10 ml de solution sté rile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,1 0/0. On in cube le mélange de fermentation pendant 32 h à 26 C avec aération et agitation résultant de l'intro duction d'un rapide courant d'air au débit de 1821/ min. On ajoute si nécessaire un supplément d'agent anti-mousse.
On prépare un second milieu nutritif (désigné ci- après milieu D ) de la composition suivante Glucose monohydraté ......... . ...... 2,0 % Caséine, hydrolysat acide ............ 0,5 % Levure de bière<B>--- .......... .
...<I>0,5</I></B> Vo Chlorure de sodium ........ ------ <B>-</B> 0,5 % Carbonate de calcium ---- . ........... 0,25% Eau, complément à 100 0/0.
Solution d'hydroxyde de sodium (10 N) pour ame ner le pH à 7,5.
On place environ 11401 de milieu D dans un fermenteur en acier inoxydable de 19001 et, après addition d'un litre d'agent anti-mousse, on stérilise pendant une heure à 1210C. On laisse refroidir le milieu, on ensemence avec 37,851 du mélange de fer- mentation de 32 h, puis on incube le mélange pendant 24 h à 26o C. L'agitation est produite par un agita teur tournant à 84 t/min et on introduit de .l'air dans le mélange de fermentation à un débit de 12601/min. Si nécessaire, on ajoute encore de l'agent anti-mousse.
On place environ 45501 de milieu D et 101 d'agent anti-mousse dans un fermenteur d'acier inoxy dable de 76001 et on stérilise le mélange pendant une heure à 1210 C. On le refroidit -et on l'ense mence avec 5701 du mélange de fermentation de 24 h provenant du fermenteur de 19001. On effectue l'in cubation pendant 40 h à 260 C avec une .aération de 33001 d'air par min et une agitation supplémen taire au moyen d'un agitateur tournant à 125 t/min. On ajoute encore 8,21 d'agent anti-mousse, ou la quantité nécessaire pour atténuer la formation de mousse.
Après l'incubation, on recueille le mélange de fermentation (environ 50701) et on le filtre. On ex trait le filtrat avec de l'acétate d'éthyle dans un extracteur centrifuge à contre-courant (tel qu'un extracteur de Podbielniak) à raison .d'une partie de solvant pour 4 parties de filtrat aqueux. On réunit l'extrait dans l'acétate d'éthyle avec les extraits dans l'acétate d'éthyle obtenus de la même façon à partir de 3 fermentations semblables totalisant 142501 de bouillon. On lave soigneusement à l'eau les solutions dans l'acétate d'éthyle réunies, puis on chasse l'acé tate d'éthyle par vaporisation, et on le remplace par 24,11 de chlorure d'éthylène.
On garnit une colonne de chromatographie de 15,25 cm de diamètre avec 18 kg d'alumine (pH 4) provenant d'une suspension dans du chlorure d'éthylène. On sèche sur du sul fate de sodium anhydre une portion de 13,91 de la solution dans le chlorure d'éthylène (séparée de la solution du produit de fermentation dans 24,11 de chlorure d'éthylène) puis on la fait couler sur la co lonne d'alumine.
On développe la colonne et on l'élue par addition successive de (a) 4,51 de mélange acétate d'éthyle-chlorure d'éthylène 1 : 1, (b) 18,251 d'acétate d'éthyle, (c) 201 de mélange méthanol-acé- tate d'éthyle 1 : 9, (d) 6,41 de mélange méthanol- acétate d'éthyle 1 : 1, et enfin (e) 81 de mélange eau éthanol 1 : 1. Les rapports indiqués sont en volume. On .recueille l'éluat de la colonne par fractions, on réunit les fractions révélant une activité antibiotique notable par dosage biologique, et on les concentre à sec.
On dissout le résidu dans de l'acétone de ma nière à former une solution titrant environ 60 000 unités de chalcomycine par ml de solution.
On ajoute une portion de 1,51 de cette solution acétonique à 6,51 d'eau et on fait couler la suspen sion trouble résultante dans une colonne de chroma tographie garnie de 1,6 kg de charbon actif et 1,6 kg de terre de diatomées. Des matières telles que .le Darco G-60 et la Celite 545 peuvent être uti lisées. On développe la colonne et on élue avec de l'acétone aqueuse contenant des concentrations crois santes d'acétone, et finalement avec de l'acétone. On recueille l'éluat par fractions, on réunit les fractions douées d'activité antibiotique, et on les concentre à sec.
On lyophilise une solution du résidu dans un petit volume de benzène pour obtenir la chalcomy- cine sous forme d'une poudre amorphe. Cette prépa ration présente une rotation spécifique (a) D = - 43,5 C (c = 1 % dans l'éthanol). Une microana- lyse répétée donne 59,
72 % et 59,97 % de carbone ; 8,32 et 8,29 % d'hydrogène.
La pureté de cette matière est confirmée par une extraction à contre-courant. Par exemple, en utilisant un extracteur à contre-courant de Craig à 25 plateaux et un système solvant consistant en n-butanol, cyclo- hexane et eau (9 : 41 : 50 ; k = 0,7), on isole la chalcomycine du plateau numéro 13.
Par microana- lyse de ce produit, on obtient 59,84 % et 59,56 % de carbone ;
8,15 et 8,08 % d'hydrogène, et 32,05 % d'oxygène.
Un dosage de groupe C-méthyle donne une valeur de 10,9 %. Le spectre d'absorption dans l'ultraviolet d'une solution dans l'éthanol donne un maximum à 218 mu, E 1 hn = 319 et un épaulement dans la région de 240 m#4.
En solution chloroformique, la chalcomycine pré sente des maximums d'absorption dans l'infrarouge à environ 2,83, 3,34, 3,40, 5,83, 5,89, 6,00, 6,13, 6,86, 7,23, 7,40, 7,53, 7,78, 8,00, 8,54, 8,70, 9,00, 9,22, 9,41, 9,67, 10,20, 10,71, 11,20, 11,57 et 11,69 microns. Déterminé dans un disque de bro mure de potassium, le spectre d'absorption dans l'in frarouge présente des maximums à environ 2,84, 3,35, 3,4.0, 5,81, 5,89, 6,02, 6,12, 6,84, 7,20, 7,38, 7,51, 7,77, 8,08, 8,52, 9,22, 9,40, 9,63, 10,15, 11,19, 11,59 et 12,70 microns.
<I>Exemple 4</I> <I>Production industrielle de la</I> chalcomycine On prépare le milieu nutritif suivant Glucose monohydraté .......... . . . . . . 2,0 % Caséine, hydrolysat acide<B>.....</B> .<B>......</B> 0,5 0/0 Levure de bière . . . . . .
............. 0,5 % Chlorure de sodium<B>..................</B> 0,5 0/0 Carbonate de calcium ................ 0,25% Eau (désionisée à chaud) complément à 100 0/0. On ajuste environ 1200 ml de ce milieu au pH 7,5 par addition d'une solution d'hydroxyde de so dium 10N et on en introduit 600 ml dans chacun de deux flacons d'Erlenmeyer de 21.
Après stérilisa tion pendant 15 min à 1210 C, on ajoute à chacun des flacons 5 ml d'une suspension de spores pré parées en suspendant les spores d'une culture sur agas oblique de<I>Streptomyces</I> bikiniensis sporulé corres pondant à NRRL 2737 et cultivé sur de l'agar au maltose d'Anderson, dans 10 ml d'une solution sté- rile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,
1%. On effectue ensuite l'incubation pendant 32 h à 270 C avec .agitation et aération .au moyen d'une plate-forme rotative tournant à 200 t/min dans un cercle de 6 cm de diamètre. On mélange 75,71 d'un milieu de la composition ci-dessus avec 175 ml d'agent anti-mousse et on sté rilise pendant 62 min à 1210 C dans un fermenteur en acier inoxydable de 1901. On ensemence ensuite le mélange refroidi avec 200 ml du produit de fer mentation de 32 h et on laisse incuber pendant 40 h à 26 C avec une agitation efficace et un débit d'aéra tion de 272 I/min.
On mélange 11401 d'un milieu ayant la compo sition indiquée au début de cet exemple avec 1 litre d'agent anti-mousse, et on stérilise pendant 65 min à 121o C dans un fermenteur en acier inoxydable de 1900 1. On ensemence le mélange refroidi avec 75,7 1 du produit de fermentation de 40h provenant du fermenteur de 1901, et on procède à une fermenta tion pendant 24 h à 261, C avec agitation à 91 t/min et aération au débit de 12601 d'air par min. On ajoute de l'agent anti-mousse selon les besoins ; il en faut environ 300 ml.
On stérilise environ 136001 d'un milieu ayant la composition indiquée au début de cet exemple, pen dant 66 min à 121 C dans un fermenteu.r en acier inoxydable de 190001, avec addition d'agent anti- mousse selon les besoins. On ensemence le mélange refroidi avec 11401 du produit de fermentation de 24 h provenant du fermenteur de 19001. On effectue la fermentation pendant 40 h à 26 C en agitant à 112 t/min et en aérant au débit de 61601 d'air par min. On ajoute de l'agent anti-mousse selon les be soins.
On filtre le mélange de fermentation (environ 144001) récolté de ce fermenteur sur deux filtres à tambour en utilisant 56,6-68,0 kg de terre de dia tomées comme couche préliminaire pour chaque tam bour et 181-226 kg de terre de diatomées comme aide de filtration. Un produit tel que la Celite 545 peut être utilisé. On extrait le bouillon filtré avec la moitié de son volume de chlorure d'éthylène. On réunit cet extrait avec les extraits dans le chlorure d'éthylène obtenu de la même manière d'une quan tité additionnelle de 3910001 d'un mélange de fer mentation semblable. On réunit les extraits dans le chlorure d'éthylène et on les concentre jusqu'à con sistance sirupeuse, sous pression réduite et à 35(l C ou en dessous.
On dissout le sirop dans 1781 de mé thanol et on extrait la solution, dans un extracteur centrifuge à contre-courant, avec 67401 d'heptane saturé de méthanol. L'extrait heptanique, qui ne pré sente qu'une faible activité antibiotique, est aban donné.
On concentre la phase méthanol,ique sous pres sion réduite en dessous de 20 C jusqu'à un volume de 37,81. On garnit une colonne de chromatogra phie de 30,5 cm avec 37,4 kg de charbon de bois actif et 37 kg de terre de -diatomées provenant d'une suspension dans du méthanol. On peut utiliser du Darco G-60 et de la Celite 545 . On fait cou ler les 37,81 de solution méthanolique sur cette co lonne de chromatographie, que l'on développe et élue avec un total de 20801 de méthanol et un .total de 11201 d'acétone.
On recueille les éluats méth.anoli- ques en 11 fractions et les éluats acétoniques en 7 fractions. On soumet chacune des 18 fractions d'éluat au dosage biologique pour la détermination de l'activité antibiotique, et on concentre séparément les fractions présentant une activité élevée, à sec sous pression réduite et en dessous de<B>250C.</B> On dissout les résidus de cas fractions dans du butanol tertiaire, puis on lyophilise les solutions. On recristallise dans du butanol tertiaire les produits solides réunis.
On recueille le produit cristallin sur un filtre, on le lave avec du butanol tertiaire et on le sèche sous un vide de 300 microns pendant 56 h. Le produit ainsi ob tenu est de la chalcomycine contenant du butanol tertiaire de cristallisation. Ce butanol tertiaire ne peut pas être chassé par séchage à température ordinaire sous une pression de 100 microns pendant une se maine. Le produit ainsi obtenu présente un maximum d'absorption dans l'ultraviolet à 220 m#t, en solution dans l'éthanol absolu, E i cm = 294.
Rotation spéci- fique (a) 2D = - 39,5o (c = 1 % dans l'éthanol). Par microanalyse, après perte de 12,77 % par volatili- sation,
on obtient les valeurs suivantes : 59,50 et 59,78 % de carbone ; 8,15 et 8,14 % d'hydrogène ; 31,43 % d'oxygène ; 0,32'% de cendres.
La chalcomycine contenant du butanol tertiaire de cristallisation présente, par dosage biologique, une activité contre Sarcina lutea PCI 1001 W correspon- dant approximativement à 85,% de l'activité de la chalcomycine pure.
Pour obtenir la chalcomycine, on dissout une portion de 1445 g de la chalcomycine cristalline con tenant du butanol tertiaire de cristallisation, dans 2890 ml d'éthanol absolu chauffé à 55,1 C. On ajoute 11,561 d'eau avec agitation constante, puis encore 300 ml d'éthanol. On filtre la solution limpide et on maintient le filtrat à 20-24o C pendant 20 h, puis à 5-8o C pendant 24 h. On recueille sur un filtre les grands cristaux bien définis qui se séparent, on les lave à l'eau glacée et on les sèche sous vide.
Le pro duit ainsi obtenu est la chalcomycine, qui fond à en viron 121-123o C sur un bloc chauffé et est prati quement identique, quant à sa composition et ses pro priétés physiques, à la chalcomycine purifiée obtenue dans les exemples précédents. <I>Préparation du</I> diacétate <I>de</I> chalcomycine On laisse reposer à environ<B>250</B> C pendant 48 h une solution de 200 mg de chalcomycine dans 3 ml de pyridine et 2 ml d'anhydride acétique, puis on concentre à sec sous vide.
On cristallise le résidu dans du méthanol aqueux et on obtient le diacétate de chalcomycine, p.f. 148,5-150o C. Par microana- lyse, ce produit se montre contenir 59,02 et 58,85 % de carbone ;
7,51 et 7,67 '% d'hydrogène ; 10,50 et 11,42 % d'acétyle. Le spectre d'absorption dans l'ul- traviolet d'une solution dans l'alcool présente un maximum à<B>217</B> mu, E i / on = 281.
En solution chlo- roformique, on observe des maximums principaux d'absorption dans l'infrarouge à 2,83, 3,30, 3,37, 5,74, 5,84, 5,92, 6,04, 6,14, 6,85, 7,25, 7,38, 7,50, 7,80, 8,00, 8,51, 8,90, 9,17, 9,37, 9,50, 9,68, 10,19, 10,35, 11,20, 11,53 et 11,68 microns. Ce composé est inactif contre Sarcina lutea à une concentration de 500 microgrammes par ml.