CH624992A5 - - Google Patents

Description

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention d'un nouvel antibiotique par fermentation d'une souche du genre Actinoplanes appelée Actinoplanes sarveparensis. Cet antibiotique appelé désormais l'antibiotique L13365 est un composé cristallin jaune clair ayant des propriétés caractéristiques telles que son point de fusion, et ses maximums d'absorptions infra-rouges et ultraviolets.

Comme indiqué plus haut, on prépare l'antibiotique L 13365 par la culture d'une souche de fermentation appelée Actinoplanes sarveparensis. Cette souche identifiée avec notre numéro de collection A/13826 a été isolée dans un échantillon de terre récolté au village Sarvepar (Inde). La souche a été déposée le 1-6-1976 et elle fait partie de la collection de culture de CBS (Central Bureau Voor Schimmelcultures - Oosterstraat 1 - Baarn (Pays-Bas)) où on lui a assigné le numéro 305.76.

Pour la préparation de l'antibiotique L13365 on cultive le micro-organisme dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif aqueux contentant une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable et des sels inorganiques.

Habituellement, la souche produisant l'antibiotique est cultivée préalablement dans un ballon à secouer jusqu'à ce qu'une activité antibiotique importante soit présente, puis on utilise la culture pour innoculer des bocaux de fermentation contenant un milieu nutritif de fermentation.

On poursuit de préférence la culture à 25-35 °C dans des conditions aérobies pendant un temps suffisant pour produire un taux antibiotique important. Pendant ce temps, on conduit des essais microbiologiques par la méthode de diffusion sur agar-agar pour contrôler la concentration en substance antibiotique produite.

Après avoir séparé le gâteau de mycélium par filtration, on peut isoler la substance antibiotique du bouillon de fermentation filtré par des procédés connus, par exemple, par extraction avec un solvant organique dans lequel la substance antibiotique est soluble et qui est non missible avec le milieu aqueux. On conduit l'extraction après ajustage du pH du filtrat entre environ 2 et 4. Des solvants organiques appropriés pour l'extraction sont avantageusement choisis parmi des alcanols ayant de 1 à 6 atomes de carbone, des alcoyles esters (C[-C4) d'acides aliphati-ques inférieurs ou des hydrocarbures halogénées inférieures. On sépare alors le solvant du bouillon de fermentation par une centrifugation à grande vitesse, on concentre jusqu'à environ '/—'Am du volume original, on refroidit et on laisse reposer jusqu'à ce qu'il se forme un précipité qu'on isole par filtration. Ce précipité consiste en antibiotique L13365 assez pur. On récolte les eaux-mères et on les verse dans un excès de solvant non polaire inerte tel qu'un pétrole léger et l'on obtient une nouvelle quantité d'antibiotique L 13365 brut. On dissout le produit brut ainsi obtenu dans un mélange de méthanol et d'acétone et on le précipite de la solution en ajoutant de l'eau acide.

Les deux portions sont réunies et on les purifie encore par Chromatographie sur colonne en utilisant un mélange de chloroforme et de méthanol comme système d'élution.

Tableau io Souche

Staphylococcus aureus ATCC 6538 Staphylococcus aureus Tour 15 Streptococcus haemolyticus C 203 Diplococcus pneumoniae UC 41 Clostridium perfringens ISS 30543 Mycoplasma gallisepticum H21 C.Z.B.

Concentration inhibitrice minimum

(Hg/ml)

0,025

0,025

0,0062

0,00078

0,012

0,1

2o En outre, comme on a indiqué plus haut, l'antibiotique L13365 présente aussi une excellente activité in vivo contre des infections expérimentales chez des souris. Plus particulièrement les valeurs DE5Ü de l'antibiotique L13365 contre des infections expérimentales causées par Staphylococcus aureus, Streptococ-25 eus haemolyticus, et Diplococcus pneumoniae sont indiquées ci-dessous:

Souche d'infection Streptococcus haemolyticus 3o Staphylococcus aureus Diplococcus pneumoniae

DE5Ü mg/kg s.c. 0,2 10 0,4

La présente substance antibiotique est aussi active contre des souches de micro-organismes qui sont résistantes aux anti-35 biotiques couramment utilisés. A titre d'exemple, on rapporte dans le tableau I suivant les concentrations inhibitrices minimum (M.I.C.) de l'antibiotique L13365 contre des souches de Staphylococcus aureus résistantes à divers antibiotiques:

40 Tableau Souche

45 Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la pénicilline Staphylococcus aureus Tour résistant so à la streptomycine Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la tétracycline Staphylococcus aureus 55 ATCC 6538 résistant à la rifampicine Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la néomycine 60 Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à I'érythromycine Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant 65 au chloramphénicol Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la céphaloridine

M.I.C.

d'autres antibiotiques pénicilline >100 streptomycine >100 tétracycline >100 rifampicine >100 néomycine >100 érythromycine >100 chloramphénicol >100 céphaloridine > 100

M.I.C. de l'antibiotique L13365

0,4 0,078 0,15 0,01 0,005 0,04 0,02 0,078

3

624 992

Tableau Souche

Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la kanamycine Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la bacitracine Staphylococcus aureus ATCC 6538 résistant à la lincomycine

M.I.C.

d'autres antibiotiques kanamycine >100

bacitracine >100

lincomycine >100

M.I.C. de l'antibiotique L13365

0,04

0,02 0,15

Tableau II

Caractéristiques de culture Milieu de culture

; Milieu No 6

(peptone-extrait de levure-agar-agar-fer)

Milieu No 7 , (agar-agar-tyrosine)

agar-agar-farine d'avoine (selon Waksman)

La toxicité de l'antibiotique L13365 administrée par voie orale ou intrapéritonéale à des souris est très faible puisque les valeurs DL5o sont supérieures à 1000 mg/kg.

On décrit maintenant Actinoplanes sarveparensis A/13826 Examen macroscopique des colonies:

La souche croît bien sur divers agars-agars nutritifs. Dans l'agar-agar à la farine d'avoine, les colonies ont un diamètre de 3 à 4 mm, présentent des contours irréguliers et une surface rugueuse. Le mycélium aérien est toujours absent.

Examen microscopique

Des sporangies sont produites dans divers milieux d'agar-agar. Elles ont une forme globeuse régulière avec un diamètre allant de 13 à 20 pi. Les zoospores qui sont très mobiles sont de forme sphérique mais parfois légèrement allongée avec un diamètre de 1,5-2 |x. En se basant sur ces propriétés, on attribue la souche A/13826 aux genres Actinoplanes et on l'appelle Actinoplanes sarveparensis C.B.S. 305.76. Le tableau II indique les propriétés de culture d'Actinoplanes sarveparensis C.B.S. 305.76 cultivés sur divers milieux standard proposés par Shirling et Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact. 16,313-340,1966) et d'autres35 milieux recommandés par Waksman (The Actinomycetes, Vol. II, The Williams and Wilkins Co., 1961). On a déterminé les propriétés de culture après 6 à 14 jours d'incubation à 30 °C.

Agar-agar de Hychey et Tresner

Agar-agar-glucose de Czapek Agar-agar-asparagine-glucose

25

30

Le tableau III rapporte l'utilisation de sources de carbone examinées selon la méthode de Pridham et Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact. 56,107,1948).

Le tableau IV rapporte les propriétés physiologiques de la souche.

Actinoplanes sarveparensis C.B.S. 305.76.

40

45

Tableau II

Caractéristiques de culture Milieu de culture

Milieu No 2

(extrait de levure agar-agar-malt)

Milieu No 3

(agar-agar-farine d'avoine Milieu No 4

(sels inorganiques-agar-agar-amidon)

Milieu No 5

(glycérol-agar-agar-aspar-agine)

50

Caractéristiques de culture

Croissance abondante, surface ridée, orange à brun (la 55 partie centrale de la colonie est plus foncée)

croissance peu abondante, mince, hyaline à orange claire 60 Production de sporangies.

croissance modérée, surface croûteuse, orange claire (9/G/7) 65

croissance abondante, surface croûteuse, orange vif (9/1/11)

Agar-agar-nutritif Agar-agar-pommes de terre

Agar-agar de Bennett Agar-agar-maléate de calcium

Agar-agar-lait écrémé

Agar-agar de Czapek

Agar-agar-œuf

Agar-agar-glucose-Pept.

Agar-agar

Sérum de Lœffler

Pommes de terre

Gélatine

Cellulose

Caractéristiques de culture croissance peu abondante, surface croûteuse, brun (13/C/7)

croissance modérée, surface croûteuse, orange (ll/F/8) croissance abondante, surface rugueuse, orange (9/H/12), (la partie centrale de la colonie est plus foncée)

croissance modérée, surface ridée brune (18/A/12) croissance abondante, surface ridée orange (11/G/l 1) croissance abondante, surface rugueuse orange vif (9/1/11) croissance modérée, surface rugueuse orange (1 l/F/8) croissance modérée, surface ridée, orange à brun, Production de sporangies croissance modérée, surface ridée, orange clair (9/D/5) croissance peu abondante, mince hyaline à orange clair Production de sporangies croissance abondante, surface ridée, orange à brun clair, des ombres par «patch»

croissance abondante, surface ridée, orange (11/G/ll) croissance peu abondante, surface rugueuse, hyaline croissance modérée, surface ridée, orange foncé (ll/B/12) croissance très peu abondante, mince, hyaline croissance très peu abondante, orange croissance très peu abondante, ridée, orange foncé croissance peu abondante, orange clair pas de croissance.

On a déterminé la couleur par le procédé de Maerz et Paul (Maerz, A. et M. Reg. Paul 1950. A dictionary of color, 2ème éd. M. Graw — Hill Book Company, Inc., New York).

Les numéros de certains milieux de culture se rapportent à ceux donnés selon Shirling et Gottlieb (Intern. J. Syst. Bact., 16, 313-340,1966).

Tableau III

Utilisation de composés au carbone

Sources de Carbone

Utilisation

C5

Arabinose

+

Xylose

+

Q

Glucose

+

Fructose

+

Mannose

+

Mannitol

+

Inositol

+

Rhamnose

+

624 992

4

Tableau III

Utilisation de composés au carbone

Sources de Carbone Utilisation

C6 Saccharose (C6)2 +

Lactose +

Raffinose (C6)3 —

Cellulose (C6)4 —

Salicine spéciale — + signifie d'utilisation — signifie pas d'utilisation

Tableau IV

Propriétés physiologiques Essai

Hydrolyse de l'amidon Formation de H2S Production de Mélanine Réaction à la Tyrosinase Hydrolyse de la Caséine Hydrolyse du malate de calcium Réduction du Nitrate Coagulation du lait de tournesol Peptonisation du lait de tournesol Liquéfaction de la gélatine

10

Résultat positive positive négative négative positive positive positive négative positive positive

20

25

On décrit maintenant la production et l'isolement de la substance antibiotique.

Pour préparer la substance antibiotique, on cultive préalablement de manière aérobie la souche actinoplanes sarveparen- 30 sis C.B.S. 305.76 dans un milieu nutritif jusqu'à ce qu'une activité antibiotique importante soit présente à un pH compris entre environ 6 et 10. Par exemple, une culture dans un ballon à secouer peut avoir la composition suivante en g. par 1.

Extrait de viande

Tryptone

Extrait de levure

Glucose

Amidon soluble

Carbonate de calcium

Eau distillée

3,0 5,0 5,0 1,0.

24,0 4,0

q.s. jusqu'à 1000 ml.

35

40

On secoue les ballons pendant environ 24 heures à environ 28-30 °C et on utilise les cultures préalables (1 litre) pour inno-culer des bocaux de fermentation contenant chacun 10 litres du milieu nutritif suivant:

Extrait de viande Peptone

Extrait de levure Chlorure de sodium Farine de soya Glucose

Carbonate de calcium Eau du robinet

40 g.

40 g.

10 g.

25 g.

100 g.

500 g.

50 g.

q.s. jusqu'à 10 litres

45

50

55

«clarcel». On abandonne le gâteau de mycélium et on extrait deux fois la solution filtrée, acidifiée jusqu'à pH = 2,5 avec de l'HCI 10% avec une quantité d'acétate d'éthyle correspondant à environ 50% de son volume.

; On sépare la phase organique de la phase aqueuse par cen-trifugation à grande vitesse, puis on sèche sur du Na2S04, on concentre à 45-50 °C sous vide jusqu'à environ V™ du volume original et finalement on refroidit jusqu'à environ 0—10 °C.

Il se forme un précipité brut qu'on récolte sur un filtre qu'on lave avec une petite quantité d'acétate d'éthyle et qu'on sèche à 45 °C sous vide. On obtient 1,140 g. de la substance antibiotique L13365 avec une pureté de 70% déterminée spectrophoto-métriquement.

On verse les eaux-mères provenant de la filtration ci-dessus dans 20 volumes de pétrole léger et on obtient une nouvelle quantité de 2,550 g. de substance antibiotique ayant une pureté de 20-25% (déterminée spectrophotométriquement). On met en suspension cette substance dans une petite quantité de mélange 9:1 de méthanol:acétone, on filtre pour en séparer les substances insolubles éventuelles et on dilue avec de l'eau: on amène la solution à un pH d'environ 2,5 avec de l'HCI à 10% en agitant puis, on dissout encore le précipité obtenu récolté par centrifugation dans la quantité minimum de butanol à environ 45-50 °C. On concentre la solution sous vide jusqu'à environ 'A du volume original et on la refroidit à environ 4 °C; le précipité obtenu récolté et séché sous vide, est la substance antibiotique L 13365 (0,450 g.) ayant une pureté de 80% (déterminée spectrophotométriquement). On soumet alors les récoltes obtenues à des opérations de purification usuelles. Dans ce but, on les dissout dans la quantité minimum d'un mélange 85:15 de chloro-forme:méthanoI puis, on Chromatographie à travers une colonne de silice-«célite» (1:1 volume/volume), préalablement activée à 100 °C puis, on lave avec le mélange de chIoroforme:méthanoI ci-dessus.

On conduit l'élution et l'essai de contrôle des fractions par Chromatographie sur couche mince avec le même mélange. Les fractions récoltées et suivant les données d'analyses par Chromatographie sur couche mince sont concentrées sous vide jusqu'à un petit volume. Lorsqu'on ajoute du diéthyle éther, il se forme un précipité qui consiste en antibiotique L 13365 ayant une pureté de 95% (déterminée spectrophotométriquement). On dissout ce précipité dans un mélange 1:1 de méthanol:acétate d'éthyle, on le chauffe à 45 °C et on le filtre pour en séparer les substances insolubles éventuelles; après refroidissement, jusqu'à 4 °C et repos pendant une nuit à la même température, on obtient l'antibiotique L13365 pur sous forme d'aiguilles jaune clair.

On décrit maintenant les propriétés chimico-physiques de l'antibiotique L 13365.

L'antibiotique L13365 est une poudre cristalline jaune clair de nature acide. L'analyse d'un hydrolisat acide de l'antibiotique L13365 dans de l'acide chlorhydrique 6N dans un tube scéllé à 110 °C a révélée quatre amino-acides, dont trois ont été identifiés dans un auto-analyseur d'amino-acides comme étant l'acide aspartique, la thréonine et la glycine. En outre, l'antibiotique L13365 est caractérisé par les propriétés suivantes:

On incube les lots de fermentation dans des conditions aérobies en agitant à 28-30 °C. A des intervalles, on détermine mi- f crobiologiquement l'activité antibiotique par le procédé de diffusion sur agar-agar en utilisant Staphylococcus aureus comme organisme d'essai. On atteint l'acitivité maximum après 72-96 heures de fermentation.

1)p.f. = 210°C

2) Analyse élémentaire: C=51,35 H=5,05 N= 10,50 O (par différence)=22,05

S = 11,05

On décrit maintenant l'isolement et la purification de l'anti- fo Solvant

3) Spectre d'absorption ultraviolet et visible:

biotique L13365.

On filtre les 80 litres de bouillon de fermentation en utilisant comme agent favorisant la filtration 1 % (poids-volume) de

Acide chlorhydrique 0,1N

Xmax (nm)

360

290 (épaulement) 237

p i*

cm

103

326

5

624 992

Solvant Xmax(nm) Ej^,

Tampon 0,15M 408 (épaulement) pH=7,5 378 67

290 (épaulement)

237 326 Tampon 0,15M 408 99 pH=8,8 290 (épaulement)

238 336

On a déterminé les spectres d'absorption ultraviolet avec un spectrophotomètre ultraviolet «UNICAM Sp 800» en utilisant des solutions de L13365 dans du méthylcellosolve (MCS)-tampon à différents pH dans la proportion 1:1.

L'image complète du spectre est indiquée dans la Fig. 1.

4) Spectre de fluorescence:

L'antibiotique contient un chromophore fortement fluorescent et une solution du produit dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N excitée à 240 nm présente un spectre d'émission ayant des maximum, à 355 et 490 nm.

On a déterminé le spectre de fluroescence avec un spectrophotomètre de fluorescence «Perkin Elmer» «Mod. MPF-44».

5) Spectre infra-rouge:

On a observé des bandes d'absorption caractéristiques dans le nujol aux fréquences suivantes (cm- '): 3400 (épaulement), 3350 (aigu), 3200 (épaulement), 3100 (aigu), 2930 et 2870 (nujol), 2800-2400,2380 (anhydride carbonique atmosphérique), 1750 (aigu), 1670 (aigu), 1620 (aigu), 1540 (aigu), 1480 (aigu), 1460 et 1380 (nujol), 1420 (aigu), 1340 (aigu), 1320 (aigu), 1280 (aigu), 1240 (aigu), 1195 (aigu), 1170 (aigu), 1145 (aigu), 1120 (aigu), 1075 (large), 1015 (aigu), 990 (aigu), 935 (aigu), 920 (aigu), 900 (aigu), 865 (aigu), 840 (aigu), 800 (aigu), 770 (aigu), 755 (aigu), 740 (aigu), 720 (nujol).

On a déterminé le spectre infra-rouge avec un spectrophotomètre «Perkin-Elmer Mod. 157».

L'image complète du spectre est donnée dans la Fig. 2.

6) Rotation spécifique:

Mïift = + 125 ° (C=0,8% dans un mélange 1:1 de méthanolxhloroforme)

7) Solubilité:

Le composé est soluble dans le sulfoxide de diméthyle, le diméthylformamide et dans des mélanges de chloroforme/mé-thanol ; légèrement soluble dans le chloroforme, le méthanol,

des mélanges de méthanol/acétate d'éthyle, des solutions de bicarbonate de sodium et l'acide acétique glacial ; insoluble dans l'eau et les autres solvants organiques courants.

positive positive positive couleur brun foncé négative positive négative négative positive négative négative

9) Acidité:

Une fonction ionisable avec une valeur pKa = 7,8 est mise 20 en évidence par titrage potentiométrique avec de l'hydroxide de sodium 0,1N, de l'antibiotique L13365 dans une solution 4:1 de méthylcellosolve:eau. Le poids équivalent déterminé ainsi = 1400.

Rf*

0,75

0,80

0,70 0,0

0,0

0,90 0,90 0,35 0,0-0,31 0,51

(*) Chromatographie sur papier sur du papier Whatman No 1. Antibiotique visualisé sur des plaques d'agar-agar ensemencées avec S. aureus.

45 (**) Chromatographie sur couche mince sur des plaques de sili-cagel HF/UV254. Tache fluorescente à la lumière ultraviolette.

2510) Comportement chromatographique: Mélange de solvants

Tampon de pH=6,0 saturé de n-butanol N-butanoI saturé d'eau + 2% d'acide p-toluènesulfonique 30 N-butanol saturé d'eau + 2% d'ammoniaque concentré

Tampon saturé de butanol de pH=6,0 Chlorure d'ammonium (20% poids/volume dans l'eau)

35 Mélange 40:10:20 de n-butanol-méthanol: eau contenant 0,75 g. de méthyle orange n-butanol:méthanol:eau (40:10:30) Eau-acétone (1:1)

Acétate d'éthyle saturé d'eau 40 Chloroforme:méthanol (85:15) (**)

5 8) Réactions caractéristiques: Fehling Tollens KMn04 H2S04 conc.

10 Ninhydrine FeCl3 Millon Schiff Anthrone 15 Foline Ciocalteau Elson Morgan

C

2 feuilles dessins

Claims (2)

624 992 2 REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de l'antibiotique L13365, caractérisé en ce qu'on cultive actinoplanes sarveparensis C.B.S. No 305.76 dans un milieu de culture contenant une source de carbone assimilable, une source d'azote assimilable et des sels inorganiques dans des conditions d'aérobie submergée jusqu'à ce qu'une quantité importante d'antibiotique L13365 soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'en outre on isole l'antibiotique L13365 dudit milieu de culture.

Finalement, on cristallise l'antibiotique L13365 à partir d'un mélange 1:1 de méthanol:acétate d'éthyle.

La substance antibiotique L13365 présente une activité antibactérienne in vitro et in vivo remarquable. Plus particulière-5 ment, l'antibiotique L13365 présente une activité anti-micro-bienne in vitro remarquable, notamment contre des bactéries gram-positive comme l'indique le tableau suivant: