Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku L-13365 na drodze fermentacji szczepu, nalezacego do rodzaju Actinoplanes o nazwie Actinoplanes «arveparensis. Nowy antybiotyk, dalej zwany luksomycyna, jest jasnozóltym krystalicznym zwiazkiem o charakterys¬ tycznych wlasciwosciach takich, jak punkt „ topnienia, maksyma absorpcji w podczerwieni i ultrafiolecie.Jak podano wyzej, luksomycyne wytwarza sie w trakcie liodowli szczepu fermentacyjnego o nazwie Actinoplanes :sarveparensis. Szczep ten zidentyfikowany pod numerem A/13826 naszej kolekcji, wyizolowano z próbki gleby po¬ branej w Sarvepar Village (Indie). Szczep zlozono i tworzy on czesc hodowli podstawowej CBS (Central Bureau Voor Schimmelcultures Oosterstraat — Baarn — Holandia), gdzie oznaczono go numerem 305 76.W trakcie wytwarzania luksomycyny mikroorganizm hoduje sie w warunkach tlenowych w wodnym podlozu •odzywczym, zawierajacym przyswajalne zródlo wegla, przyswajalne zródlo azotu, i sole nieorganiczne.Ogólnie szczep, wytwarzajacy antybiotyk, hoduje sie wstepnie we wstrzasanej kolbie do chwili pojawienia sie wiekszej aktywnosci antybiotycznej, po czym hodowle stosuje sie do zaszczepienia szklanych fermentatorów, zawierajacych odzywcze podloze fermentacyjne. Hodowle prowadzicie w temperaturze 25—35°C w warunkach tle¬ nowych w czasie, wystarczajacym do uzyskania wysokiego poziomu antybiotyku. Równolegle prowadzi sie badania mikrobiologiczne, stosujac do kontroli stezenia wytwarzanej substancjiantybiotycznej metoda dyfuzyjna na agarze.Po usunieciu ciasta grzybni za pomoca saczenia, substan- qe antybiotyczna wyodrebnia sie z przesaczonego bulionu fermentacyjnego znanymi sposobami, takimi jak na przy¬ klad za pomoca ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym, w którym rozpuszcza sie substancja antybiotyczna, a który nie miesza sie z wodnym srodowiskiem. Ekstrakcje przepro¬ wadzasie po doprowadzeniupHprzesaczu do wartosci 2—4.Jako rozpuszczalniki organiczne do ekstrakqi stosuje sie alkanole, zawierajace od 1 do 6 atqmów wegla, estry alki¬ lowe o 1—4 atomach wegla nizszych kwasów alifatycznych, lub nizszych chlorowcowanych weglowodorów. Rozpusz¬ czalnik wydziela sie nastepnie z bulionu fermentacyjnego, stosujac szybkoobrotowe wirowanie, zateza do okolo 1 /200— 1 /400 jego wyjsciowej objetosci, chlodzi i pozostawia w spo¬ koju do chwili utworzenia sie osadu, który wyodrebnia sie przez saczenie. Osad ten sklada sie z prawie czystej lukso¬ mycyny.Lugi macierzyste zbiera sie i przelewa do nadmiaru obojetnego niepolarnego rozpuszczalnika, takiego jak lekka ropa naftowa, uzyskujac dalsza ilosc surowej luksomycyny.W ten sposób uzyskany surowy produkt rozpuszcza sie w mieszaninie metanol-aceton i wytraca z roztworu dodat¬ kiem zakwaszonej wody. Dwie porcje laczy sie razem i dalej oczyszcza za pomoca chromatografii kolumnowej z uzyciem jako eluenta mieszaniny chloroform-metanol. Na koniec luksomycyne krystalizuje sie z mieszaniny metanol — octan etylu (1:)1.Substancja antybiotyczna luksomycyny wykazuje zwra¬ cajaca uwage aktywnosc przeciwbakteryjna in vivo i in vitro. Bardziej szczególowo, luksomycyna wykazuje wybitne 105 792105 792 dzialanie przeciwbakteryjne in vitro, szczególnie wobec gram-dodatnich bakterii, jak to jest pokazane w tablicy I.TablicaI cd. tablicy ir Szczep Staphylococcus aureus ATCC6538 Staphylococcus aureus Tour Streptococcus haemolyticus C 203 Diplococcus pneumoniae UC 41 Clostridium perfringens ISS 30543 Mycoplasma gallisepticum H21 C.Z.B.Minimalne stezenie hamujace (ug/ml) 0,025 0,025 0,0062 0,00078^ 0,012 0,2 Ponadto, jak podano, luksomycyna wykazuje równiez doskonale dzialanie in vivio wobec doswiadczalnych in¬ fekcji myszy. Bardziej dokladne wartosci ED50 luksomycyny wobecdoswiadczalnychzakazen,wywolanychStaphylococcus aureus, Streptococcus liaemoliticus i Diplococcus pneu¬ moniae podano w zestawieniu.Szczep infekujacy Streptococcus haemolyticus Staphylococcus aureus Diplococcus pneumoniae ED 50 mg/kg 0,2 0,4 Nowy antybiotyk jest aktywny równiez przeciwko szczepom mikroorganizmów, opornym na powszechnie stosowane antybiotyki. Jako przyklad ilustrujacy przed¬ stawiono w tablicy II minimalne stezenie hamujace (MIC) antybiotyku, oznaczonego L13365, przeciwko szczepowi Staphylocosccus aureus opornemu na liczne antybiotyki.Tabl Szczep Staphylococcus aureus ATCC 6538 opornosc na penicyline Staphylococcus aureus Touropornosc na stre¬ ptomycyne Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc na tetracykline Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc na ryfampicyne Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc" na neomycyne i ca II MIC innych antybiotyków penicylina 100 strepto¬ mycyna100 tetra- cyklina100 ryfampi- cyna100 - neomy- cyna100 MIC antybio¬ tyku L13365 0,4 0,078 015 0,01 0,005 40 45 5D Szczep Staphylococcus aureus *" ATCC6538 opornosc na erytromycyne Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc na chloramfenikol Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc na cefalorydyne Staphylococcus aureus ATCC 6538 opornosc na kanamycyne Staphylococcus aureus ATCC6538 opornosc na bacytracyne Staphylococcus aureus ATCC 6538 opornosc na 1 linkomycyne MIC innych antybiotyków erytromy¬ cyna 100 chloramfe¬ nikol 100 cefalory- dyna100 kanamycy- na100 s bacytra- cyna100 linkomy- cyna100 MIC [ antybio- f tyku 1 L 13365.1 I 0,04 r i 0,02 f | t 0,078 l | i' ' 0,04 [ f 0,02 l [ 045 Toksycznosc luksomycyny, podawanej myszy doustnie albo dootrzewnowo jest bardzo niska, tak, ze wartosci LDS( sa wyzsze od 1000 mg/kg.Szczep rosnie dobrze na róznych odzywczych agarach.W agarze z maczka owsiana kolonie maja 3 do 4 mm sred¬ nicy, wykazuja nieregularne ksztalty i szorstka powierzch¬ nie. Brak jest zawsze grzybni powietrznej.Zarodnie tworza sie w licznych podlozach agarowych.Maja one regularny kulisty ksztalt o srednicy, wahajacej sie od 13 do 20 u. Zeospory, bardzo ruchliwe, sa sferyczne, ale czasami lekko wydluzone o srednicy 1,5—2 u. Na pod¬ stawie tej charakterystyki szczep A/13826 zaliczono do rodzaju Actinoplanes i nazwano Actinoplanes sarveparen- sis C.B.S. 305 76.W tablicy III podaje sie charakterystyki hodowli Actino¬ planes sarveparensis C.B.S. 305 76, hodowanego na róznych standardowych podlozach, sugerowanych przez Shirlinga i Gottlieba (Intern. J. Syst* Bact., 16, 313—340,1966 i innych podlozach, polecanych przez Waksman*a (Th* Actinomycetes, Vol. II, The Williams and Wilkins Co.* 1961). Charakterystyki hodowli okreslane po 6—14 dniach, inkubacji w 30 °C.Tablica IV podaje wykorzystanie zródel wegla metoda Pridham'a i Gotlieba (Intern. J. Syst. Bact., 56,107,1948).Tablica V podaje charakterystyki fizjologiczne szczepu.Actinoplanes sarveparensis C.B.S. 305 76.165 792 TablicaIII Charakterystyki hodowli c.d. tablicy III Podloze hodowli Podloze Nr 2 (ekstrakt drozdzy-agar brzeczkowy) Podloze Nr 3 (agar z maczki owsianej) Podloze Nr 4 (sole nieorganiczne-agar skrobiowy) Podloze Nr 5 (gliceryna-agar -aspara¬ ginowy) Podloze Nr 6 (pepton-ekstrakt drozdzy- agar zelazisty) Podloze Nr 7 (agar tyrozynowy) Agar z maczki owsianej (wedlug Waksmana) Agar Hyckey'a i Tresnera Agar glukozowy Czapka Agar glukozowo- asparaginowy Agar odzywczy Agar ziemniaczany Agar Benett'a Agar jablczanu wapnio¬ wego Agar mleka odtluszczo¬ nego Charakterystyki hodowli Obfity wzrost, pomarszczo¬ na powierzchnia, barwa pomaranczowa do brazo¬ wej, (czesc srodkowa kolonii ciemniejsza).Skapy wzrost, cienki, szklista do jasnopomaran- czowej.Wytwarzanie zarodni.Umiarkowany wzrost,twarda powierzchnia, barwa jasno-| pomaranczowa (9/G/7).Obfity wzrost, twarda po¬ wierzchnia, barwa blysz¬ czaca pomaranczowa (9/1/11).Skapy wzrost, twarda po¬ wierzchnia, barwa brazo¬ wa (13/C/7) Umiarkowany wzrost, twarda powierzchnia, bar¬ wa pomaranczowa (11/F/8) Obfity wzrost, szorstka powierzchnia, barwa po¬ maranczowa (9/H/12), (czesc srodkowa kolonii ciemniejsza).Umiarkowany wzrost, po¬ marszczona powierzchnia, barwa brazowa (18/A/12) Obfity wzrost, pomarsz¬ czona powierzchnia po¬ maranczowa (11/G/11).Obfity wzrost, szorstka powierzchnia, barwa bly¬ szczaca pomaranczowa (9/1/11).Umiarkowany wzrost, szorstka powierzchnia, bar¬ wa pomaranczowa (11/F/8).Umiarkowany wzrost, po¬ maranczowa powierzchnia barwa pomaranczowa do brazowej — Wytwarzanie zarodni.Umiarkowany wzrost, po¬ marszczona powierzchnia, barwa jasnopomaranczowa (9/D/5).Skapy wzrost, slabo szklis¬ ty do jasnopomaranczowego| — Wytwarzanie zarodni.Obfity wzrost, pomar¬ szczona powierzchnia, bar¬ wa pomaranczowa do ja- snobrazowej, plamiste clenie, 40 50 51 60 1 1 Agar Czapka • Agar jajeczny Agar pept. glukozowy Agar Serum Loefflera Ziemniak Zelatyna Celuloza 2 Obfity wzrost, pomarsz¬ czona powierzchnia, barwa pomaranczowa (11/G/11).Skapy wzrost, szorstka po¬ wierzchnia, szklisty.Umiarkowany wzrost, po¬ marszczona powierzchnia, barwa ciemnopomaran- czowa (11 /B/12).Bardzo skapy wzrost, cien¬ ki, szklista.Bardzo skapy, wzrost, bar¬ wa pomaranczowa.Skapy wzrost, pomarsz¬ czona, barwa ciemnopo- maranczowa.Skapy wzrost, jasnopo¬ maranczowa.Brak wzrostu | Oznaczenie barwy wykonane metoda Maerza i Paula (Maerz, A. i M. Rag. Paul 1950. A. Dictionary of color, 2nd ed. M. Grow-Hill Book Company, Inc., New York).Numery niektórych podlozy hodowli odnosza sie do tych podanych wedlug Shirling'a i Gottlieba (Intern. J.Syst. Bact., 16, 313—340, 1966).T a b 1 i c a IV Wykorzystanie zwiazków wegla . Zródla wegla C5Arabinoza Ksyloza C6 Glukoza Fruktoza Mannoza Mannitol Inozyt Ramnoza (C6)2 Sacharoza Laktoza (C6)3 Rafinoza (C6)4 Celuloza Salicyna Wykorzystanie 1 + + + + v + + + + + + — — — 1 + oznacza wykorzystanie — oznacza brak wykorzystania Tablica V Charakterystyki fizjologiczne | Test Hydroliza skrobi Wytwarzanie H2S Produkcja melaniny Reakcja tyrozynazy Hydroliza kazeiny Hydroliza jablczanu wapniowego Redukcja azotanu Koagulacja mleka lakmusowego Peptonizacja mleka lakmusowego | Przeprowadzenie w stan ciekly zelatyny Wyniki dodatni dodatni ujemny ujemny. dodatni dodatni [ dodatni [ ujemny I dodatni [ dodatni |105 792 Przyklad. Wytwarzanie i wyodrebnianie substan¬ cji antybiotycznej.W celu wytworzenia substancji antybiotycznej hoduje sie wstepnie w warunkach tlenowych na podlozu odzyw¬ czym szczep Actinoplanes sanreparensis' C.B.S. 305 76 do chwili pojawienia sie duzej aktywnosci antybiotycznej przy wartosciach pH wahajacych sie od okolo 6 do okolo 10.Przykladowo hodowla w wytrzasanej kolbie moze miec nastepujacy sklad w g/l: Ekstraktmiesa 3,0 Trypton 5,0 Ekstraktdrozdzy 5,0 Glukoza "1,0 Rozpuszczalnaskrobia 24,0 Weglanwapniowy 4,0 Wodadestylowana do 1000 ml.Kolby wytrzasa sie okolo 24 godzin w okolo 28—30°C i stosuje sie wstepne hodowle (jeden litr) do zaszczepienia szklanych fermentatorów, z których kazdy zawiera 10 litrów nastepujacego podloza fermentacyjnego: Ekstraktmiesa 40 g Pepton 40g Ekstraktdrozdzy 10 g Chloreksodowy 25 g Maczkasojowa 100 g * Glukoza 500 g Weglanwapniowy 50 g Wodawodociagowa do 10 litrów Porcje fermentacyjne inkubuje sie w warunkach tleno¬ wych w temperaturze 28—30 °C. W odstepach czasu bada sie sposobem mikrobiologicznym aktywx^osc antybiotyczna, stosujac agarowa metode dyfuzyjna z uzyciem Staphylo- coccus aureus w roli organizmu testowego. Maksymalna aktywnosc osiaga sie po 72—96 godzinach fermentacji.Wyodrebnianie i oczyszczanie luksomycyny. Bulion fermentacyjny przesacza sie z uzyciem jako srodka pomagaja¬ cego saczeniu 1 % clarcel (W/V). Ciasto grzybni odrzuca sie, a przesaczony roztwór po zakwaszeniu do pH=2,5 10% roztworem HO ekstrahuje sie dwukrotnie octanem etylu w ilosci, odpowiadajacej 50% jego objetosci. Faze orga¬ niczna oddziela sie od wodnej za pomoca szybkoobrotowego wirowania, anastepniesuszy nadNa2S04,zateza w 45—50°C pod zmniejszonym cisnieniem do okolo 1/300 wyjsciowej objetosci i chlodzi na koniec do okolo 0—10 °C. Tworzysie surowy osad, który zbiera sie na filtrze, przemywa niewielka iloscia octanu etylu i suszy w 45 °C pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Otrzymuje sie 1,140 g substancji antybiotycznej luksomycyny o stopniu czystosci rzedu 70%, oznaczonym spektrofotometrycznie.Lugi macierzyste, otrzymane z opisanego saczenia, przelewa sie do 20 objetosci lekkiej frakcji ropy naftowej i uzyskuje dodatkowa ilosc (2,550 g) substancji antybioty¬ cznej. o stopniu czystosci 20—25% (oznaczony spektro- grafotometrycznie). Ta substancja roztwarza sie w malej ilosci mieszaniny metanol: aceton (9:1), odsacza sie ciala nierozpuszczalne i rozciencza woda; roztwór doprowadza sie mieszajac do wartosci pH okolo 2,5 za pomoca 10%-wego HC1, a otrzymany osad, zebrany przez wirowanie, rozpusz¬ cza sie w minimalnej ilosci butanolu w temperaturze 45—50 °C. Roztwór zateza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem do okolo 1/5 objetosci wyjsciowej i schladza do okolo 4°C; otrzymany osad, zebrany i suszony pod zmniejszonym cisnieniem, jest substancja antybiotyczna luksomycyna (0,450 g) o stopniu czystosci 80% (oznaczonym spektro¬ fotometrycznie).Otrzymane porcje poddaje sie nastepnie zwyklym pro¬ cesom oczyszczania. W tym celu rozpuszcza sie je w mini¬ malnej ilosci mieszaniny chloroform metanol (85 :15) i poddaje chromatografii na kolumnie krzemionkowo-celi- towej (1:1 V/V), uprzednio zaktywowanej w temperaturze 100 °C, przemytej podana powyzej mieszanina chloroform/ metanol. Eluowanie i chromatografie cienkowarstwowa przeprowadza sie za pomoca tej samej mieszaniny.Frakcje, zbierane zgodnie z danymi analitycznymi, uzyskanymi z chromatografii cienkowarstwowej, zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci. Pod wplywem dodania eteru dwuetylowego tworzy sie osad, skladajacy sie z luksomycyny, której stopien czystosci wynosi 95% (oznaczono spektrofotometrycznie).Opisany osad rozpuszcza sie w mieszaninie metanol :octan etylu (1 : 1), ogrzewa do temperatury 45 °C, odsacza nie¬ rozpuszczalne czesci; pod wplywem oziebienia do 4°C i stania przez noc w tej temperaturze otrzymuje sie czysta luksomycyne w postaci zóltych igiel.'Wlasciwosci chemtczno-fizyczne luksomycyny,.Luksomycyna jest jasnozóltym krystalicznym proszkiem o charakterze kwasnym. Analizy kwasnego hydrolizatu luksomycyny w 6 N kwasie chlorowodorowym w zatopionej rurce w I10°C wykazaly cztery aminokwasy, z których trzy zidentyfikowane w automatycznym analizatorze amino¬ kwasów jako kwas asparaginowy, treonine i glicyne. Po¬ nadto luksomycyne charakteryzuja nastepujace wlasci¬ wosci. 1. Punkt topnienia: 210 °C 2. Analiza elementarna: C = 51,35 H=5,05 N = 10,50 S =11,05 0=( z róznicy) 22,05 3. Widmo absorpcji ultrafioletowej i widzialnej czesci widma: Rozpuszczalnik max (mm) El% 1 cm Kwas chlorowodorowy 0,1 N 360 103 290 (plaskie) 237 326 40 Bufor 0,15 M 408 (plaskie) pH =7,5 378 67 290 (plaskie) 237 326 Bufor 0,15 M 408 99 45 pH = 8,8 290 (plaskie) 238 336 Widma absorpcji w ultrafiolecie zostaly wykonane na spetrofotometrze ultrafioletu UNICAM Sp 800 z uzyciem 50 roztworów luksomycyny w eterze jednometylowym glikolu etylenowego (MCS) — bufory w róznych wartosciach pH w stosunku 1:1. Calkowity obraz widma pokazany jest na fig. 1. 4. Widmo fluorescencyjne: antybiotykposiada silnyfluore 55 scencyjny chromofor i roztwór produktu w 0,1 N wodoro¬ tlenku sodowym wzbudzony w 240 nm wykazuje widmo emisyjne z maksimami przy 355 i 490 nm. Widmo fluore¬ scencyjne zostalo wykonane naspektrofotometrzefluorescen- cyjnym Perkin Elmer Med. MPF — 44. 60 5. Widmo w podczerwieni: charakterystyczne pasma absorpcji w nujelu obserwowano w nastepujacych czesto¬ tliwosciach (cm-1); 3400 (plaskie), 3350 (ostre), 3200 (plaskie), 3100 (ostre), 2930 i 2870 (nujol), 2800—2400, 2380 (dwutlenek wegla z atmosfery), 1750 (ostry), 1760 65 (ostre), 1620 (ostre), 1540 (ostre), 1480 (ostre, 1460 \105 712 i 1380 (nujol). 1420 (ostre), 1340 (ostre), 1320 (ostre), 1280 (ostre), 1240 (ostre), 1195 (ostre), 1170 (ostre), 1145 (ostre), 1120 '(ostre), 1075 (szerokie), 1015 (ostre), 990 (ostre); 935 (ostre), 920 (szerokie), 920 (ostre), 865 (ostre),840 (ostre),800 (ostre), 770 (ostre),755 (ostre), 740 (ostre) 720 (nujol).Widmo w podczerwieni wykonano na spektrofoto¬ metrze Perkin-Elmer Med. 157. Calkowity obraz widma podano na fig. 2.^. Specyficzna skrecalnosc: C=0,8% w ukladzie (0)43* = +125° metanolrchloroform (1:1) 7. Rozpuszczalnosc: zwiazek rozpuszcza sie w dwumetylo- sulfotlenku, dwumetyloformamidzie i w mieszaninach chloroform/metanol; slabo rozpuszcza sie w chloroformie, metanolu, mieszaninach matanol/octan etylu, roztworach kwasnego weglanu sodowego i w lodowatym kwasie octo¬ wym; nie rozpuszcza sie w wodzie i innych powszechnie stosowanych rozpuszczalnikach organicznych. 8. Charakterystyczne reakcje: 21 Fehlinga Tollensa zKMn04 zestez. H2S04 z ninhydryna z FeCl3 Millena Schiffa Antrone'a Pelin Ciocalteau Elsen Morgana dodatni dodatni dodatni ciemnobrazowa barwa ujemny dodatni ujemny ujemny dodatni ujemny ujemny st 9. Kwasowosc: funkcja zdolnosci do jonizacji z pka 7,8 uwidacznia sie w trakcie potenqometrycznego miareczko¬ wana 0,1 N wodorotlenkiem sodowym luksomycyny w roz- wize eter dwumetylowy glikolu etylenowego : woda (4:1). Ciezar wynoi 1400. czasteczkowy odpowiednio oznaczony Tablica VI Zachowanie w trakcie chromatografii Uklad rozpuszczalników Bufor 0 pH=6,0 nasycony n-butanolem Woda nasycona n-butanolem + 2% kwa¬ su p-toluenosulfonowego Woda nasycona n-butanolem +2% stez. amoniaku Butanol nasycony buforem pH=6,0 Chlorek amonowy (20% W/V w wodzie) n-butanol : metanol : woda (40:10:20), zawierajacy 0,75 g oranzu metalowego n-butanol : metanol : woda (40:10:30) wodaraceton (1:1) woda nasycona octanem etylu chloroform : metanol (85:15) (**) Rf(*) 0,75 0,80 0,70 0,0 0,0 0,90 0,90 0,35 0,0—0,31 0,51 | * Chromatografia bibulowa na bibule Whatman nr 1.Antybiotyk uwidacznia sie na plytach agarowych, zaszczepionych S» aureus.** Chromatografia cienkowarstwowa na plytkach pokry¬ tych zelem krzemionkowym HF/UV254. Plamy fluore scencyjne w swietle UV. PL PL PL PL