DE2724090A1

DE2724090A1 - Antibiotikum l 13 365, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung bei der bekaempfung bakterieller infektionen

Info

Publication number: DE2724090A1
Application number: DE19772724090
Authority: DE
Inventors: Carolina Coronelli; Hermes Pagani; Francesco Parenti; Giorgio Tamoni
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1976-06-29
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1978-01-12
Also published as: FR2356666A1; CH624992A5; SU680657A3; BE856273A; NO772225L; IL52063A0; US4100273A; GR63764B; HU174186B; AR212652A1; DD133573A5; YU159277A; PL105792B1; CA1086669A; IL52063A; SE7707467L; PL199238A1; ES460248A1; AU514594B2; AU2499177A

Description

DIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS
PATENTANWALT

9 V)ONCHEN K-, ) SIEBERTSTRASSE 4 P.O. BOX 8β 07 «7 PHONE: (0 89) 47 40 75

CABLE AOORESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29*53 VOPAT D

u.Z.: M 211
Case: Lp 547
GRUPPO LEPETIT S.p.A.
Mailand, Italien

"Antibiotikum L 13 365, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen"

Die Erfindung betrifft ein Antibiotikum, das sich durch Züchtung eines Stammes der Gattung Actinoplanes mit der Bezeichnung Actinoplanes sarveparensis herstellen läßt. Dieses Antibiotikum wird nachstehend als Antibiotikum L 13 365 bezeichnet. Es handelt sich um eine hellgelbe kristalline Verbindung mit charakteristischen Eigenschaften, wie Schmelzpunkt und Absorptionsmaxima im Infrarot- und UltraviolettSpektrum.

Wie vorstehend erwähnt, wird das Antibiotikum L 13 365 durch. Züchtung eines Stammes mit der Bezeichnung Actinoplanes sarveparensis gebildet. Dieser Stamm mit der internen Sammlungsnummer A/13 826 wurde aus einer in Sarvepar Village (Indien) gewonnenen Bodenprobe isoliert. Er wurde beim CBS (Central Bureau Voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, Niederlande) unter der Nummer 305-76

_^_ 2724O9Q

Zur Herstellung des Antibiotikums L 13 365 wird der genannte Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, gezüchtet. Im allgemeinen wird der das Antibiotikum bildende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet, bis eine wesentliche Aktivität des Antibiotikums vorhanden ist. Anschließend wird diese Kultur zum Beimpfen eines Nährmediums in Glasfermentern ("jar fermenter¹¹) verwendet. Die Züchtung wird bei 25 bis 35°C unter aeroben Bedingungen so lange vorgenommen, bis eine wesentliche Konzentration des Antibiotikums gebildet ist. Während dieser Zeit werden mikrobiologische Bestimmungen nach dem Agar-Diffusionsverfahren durchgeführt, um die Konzentration des gebildeten Antibiotikums festzustellen.

Nach dem Abfiltrieren des Mycels wird das Antibiotikum aus der filtrierten Gärbrühe nach an sich üblichen Verfahren gewonnen, beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, in dem das Antibiotikum löslich ist und das mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar ist. Die Extraktion wird nach Einstellung des pH-Werts des Piltrats auf etwa 2 bis etwa 4 durchgeführt. Beispiele für entsprechende organische Lösungsmittel zur Extraktion sind Alkenole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cj-C^-Alkylester von niederen aliphatischen Säuren und niedere halogenierte Kohlenwasserstoffe. Das Lösungsmittel wird anschließend von der Gärbrühe durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt, auf etwa 1/200 bis 1/400 seines ursprünglichen Volumens eingeengt, abgekühlt und stehengelassen, bis

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- ΐ-

sich ein Niederschlag bildet, der durch Filtration gewonnen wird. Dieser Niederschlag besteht aus relativ reinem Antibiotikum L 13 365· Die Mutterlauge wird gewonnen und in einen Überschuß eines inerten unpolaren Lösungsmittels, wie leichtes Petroleum, gegossen, wodurch man eine weitere Menge an rohem Antibiotikum L 13 365 erhält. Das auf diese Weise erhaltene rohe Produkt wird in einem Gemisch aus Methanol und Aceton gelöst und aus dieser Lösung durch Zusatz von angesäuertem Wasser ausgefällt. Die beiden Portionen werden vereinigt und saulenchromatographisch unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol als Elutionssystem gereinigt. Schließlich wird das Antibiotikum L 13 365 aus einer Mischung von Methanol und Essigsäureäthylester (1:1) kristallisiert.

Das Antibiotikum L 13 365 zeigt eine beträchtliche antibakterielle in vitro- und in vivo-Aktivität. Insbesondere weist das Antibiotikum L 13 365 eine ausgezeichnete antimikrobielle in vitro-Wirkung, vor allem gegen gram-positive Bakterien auf, wie aus nachstehender Aufstellung hervorgeht:

Mindesthemmkonzentration

Staphylococcus aureus ATCC 6538 0,025

Staphylococcus aureus Tour 0,025

Streptococcus haemölyticus C 203 0,0062

Diplococcus pneumoniae UC 41 0,00078

Clostridium perfringenc ISS 3054-3 0,012

Mycoplasma gallisepticum H21 C.Z.B. 0,2

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'I

Ferner weiet das Antibiotikum L 13 565, wie vorstehend erwähnt, auch eine ausgezeichnete in vivo-Aktivität gegen experimentelle Infektionen bei Mäusen auf. Nachstehend sind ED^Q-Werte des Antibiotikums L 13 365 gegen durch Staphylococcus aureus, Streptococcus Haemolyticus und Diplococcus pneumoniae hervorgerufene experimentelle Infektionen zusammengestellt:

infizierender Stamm ED^ ₀(mgAp;, s. c. ) Streptococcus haemolyticus 0,2

Staphylococcus aureus 10

Diplococcus pneumoniae 0,4-

Das Antibiotikum der Erfindung ist auch gegen Mikroorganismen-Stämme aktiv, die gegen allgemein verwendete Antibiotika resistent sind. Beispielsweise sind in der nachstehenden Tabelle I die Mindesthemmkonzentrationen des Antibiotikums L 13 365 gegen Stämme von Staphylococcus aureus, die gegen verschiedene Antibiotika resistent sind, zusammengestellt:

Tabelle I

Mindesthemmkonz entration Mindesthemmkon Stamm von anderen Antibiotika zentration des

Antibiotikums L 15 365

Staphylococcus aureus

ATCC 6538 resistent

gegen Penicillin Penicillin >100 0,4 Staphylococcus aureues

Tour resistent gegen

Streptomycin Streptomycin >100 0,078

Staphylococcus aureus

ATCC 6538 resistent

gegen Tetracyclin Tetracyclin >100 0,15 Staphylococcus aureus

ATCC 6538 resistent

gegen Rifampicin Bifampicin >100 0,01

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AO

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Stamm

Mindesthemmkonzentration Mindesthemmkonzenvon anderen Antibiotika tration des Antibiotikums L 13 365

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Neomycin

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Erythromycin

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Chloramphenicol

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Cephaloridin

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Kanamycin

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Bacitracin

Staphylococcus aureus ATCC 6538 resistent gegen Lincomycin

Neomycin >100 0,005

Erythromycin >100 0,04 Chloramphenicol >100 0,02 Cephaloridin >100 0,078 Kanamycin >100 0,04 Bacitracin >100 0,02 Lincomycin >100 0,15

Die Toxizität des Antibiotikums L 13 365 bei oraler oder intra peritonealer Verabfolgung an Mäuse ist sehr nieder, da die Werte höher als 1000 mg/kg liegen.

Nachstehend wird der Stamm Actinoplanes sarveparensis A/13826 beschrieben.

Makroskopische Untersuchung der Kolonien

Der Stamm zei-gt gutes Wachstum auf verschiedenen Nähragars. In Hafermehl-Agar weisen die Kolonien einen Durchmesser von

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3 bis 4- mm auf, zeigen unregelmäßige Händer und eine rauhe Oberfläche. Es wird durchweg kein Luftmycel beobachtet.

Mikroskopische Untersuchung

In verschiedenen Agar-Medien werden Sporangien gebildet. Sie haben eine regelmäßige gewölbte Form mit einem Durchmesser von 13 bis 20 11. Die Zoosporen sind hochgradig beweglich und haben Kugelform, gelegentlich auch eine leicht längliche Form mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2^. Aufgrund dieser Eigenschaften wird der Stamm A/13826 der Gattung Actinoplanes zugeordnet und als Actinoplanes sarveparensis CBS 305-76 bezeichnet. In der Tabelle II sind die Züchtungseigenschaften von Actinoplanes sarveparensis CBS 305«76 auf verschiedenen Standardmedien gemäß Shirling und Gottlieb (vgl. Intern. J. Syst. Bact., Bd. 16 (1966), S. 313 bis 340) und anderen Medien gemäß Waksman (vgl. The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and Wilkins Co., I96I) angegeben. Die Züchtungseigenschaften werden nach 6 bis tägiger Inkubation bei 30⁰C bestimmt.

In Tabelle III ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen gemäß dem Verfahren von Pridham und Gottlieb ( vgl. Intern. J. Syst. Bact., Bd. 56 (1W), S. 107) angegeben.

In Tabelle IV sind die physiologischen Eigenschaften des Stammes zusammengestellt.

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Actinoplanes sarveparensis CBS 305.76

Tabelle II ZüchtunKseigenschaften

Medium

Medium Nr. 2 (Hefeextrakt-Malz-Agar)

Medium Nr. 3 (Hafermehl-Agar)

Medium Nr. 4-(anorganische Salze-Stärke-Agar)

Medium Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar)

Medium Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Ei sen-

Agar)

Medium Nr. 7 (Tyrosin-Agar)

Hafermehl-Agar (gemäß Waksman)

Hyckey und Tresner-Agar Czapek-Glucose-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

Nähragar

ZüchtungseiKenschaften

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orange bis braun; (der in der Mitte liegende Teil der Kolonie ist dunkler).

spärliches Wachstum, dünn, klar bis leicht orangefarben; Bildung von Sporangien

mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, leicht orangefarben (9/G/7)

reichliches Wachstum, krustige Oberfläche, leuchtend orangefarben (9/1/11)

spärliches Wachstum, krustige Oberfläche, braun (13/C/7)

mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche, orangefarben (11/F/8)

reichliches Wachstum, rauhe Oberfläche, orangefarben (9/H/12); (der mittlere Teil der Kolonie ist dunkler)

mäßiges Wachstum, runzelige Oberfläche, braun (18/A/12)

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orangefarben (11/G/11)

reichliches Wachstum, rauhe Oberfläche, leuchtend orangefarben (9/1/11)

mäßiges Wachstum, rauhe Oberfläche, orangefarben (11/F/8)

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Medium Kartoffel-Agar

Bermett-Agar CaIciummälat-Agar

Magermi1ch-Agar

Czapek-Agar Eier-Agar Pepton-Glueοse-Agar Agar

Loeffler-Serum Kartoffel Gelatine Cellulose

ZüchtunKseigenschaften

mäßiges Wachstum, runzelige Oberfläche, orangefarben bis braun; Bildung von Sporangien

mäßiges Wachstum, runzelige Oberfläche, leicht orangefarben (9/D/5)

spärliches Wachstum, mäßig klar bis hell orangefarben; Bildung von Sporangien

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orangefarben bis hellbraun, fleckenartige Schatten

reichliches Wachstum, runzelige Oberfläche, orangefarben (11/G/11)

spärliches Wachstum, rauhe Oberfläche, klar

mäßiges Wachstum, runzelige Oberfläche, dunkel orangefarben (11/B/12)

sehr spärliches Wachstum, dünn, klar

sehr spärliches Wachstum, orangefarben

spärliches Wachstum, runzelig, dunkel orangefarben

spärliches Wachstum, leicht orangefarben

kein Wachstum

Die Farbbestimmung erfolgt nach dem Verfahren von Maerz und Paul (vgl. A. Maerz und M. Reg. Paul, 1950, "A dictionary of color", 2. Aufl., Mc. Graw - Hill Book Company, Inc., New York). Die bei einigen der vorstehenden Medien angegebenen Nummern beziehen sich auf die Angaben von Shirling und Gottlieb (vgl. Intern. J. Syst. Bact., Bd. 16 (1966), S. 313 bis 340).

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272A090 Ak

	Tabelle III	Verwertung
		⁺
	Verwertung von Kohlenstoffverbindungen	+
	Kohlenstoffquellen	+
^C6	Arabinose Xylose	+
	Glucose	+
	Fructose	+
	Mannose	+
	Mannit	+
	Inosit	+
(C₆;	Rhamnose	-
	L· Saccharose	-
/rf > \ ^C J O	Lactose
(C₆)	I, Raffinose
L Cellulose
Spezial-Salicin

+: bedeutet Verwertung; -: bedeutet keine Verwertung

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272A090 AS

Tabelle IV Physiologische Eigenschaften Test Ergebnisse

Stärkehydrolyse positiv

Hpß-Bildung . positiv

Melaninbildung negativ

Tyrosinase-Rekation negativ

Caseinhydrolyse positiv

Calciummalathydrolyse positiv

Nitratreduktion positiv

Koagulation von Lackmusmilch negativ

Peptonisierung von Lackmusmilch positiv

Verflüssigung von Gelatine positiv

Herstellung und Isolierung des Antibiotikums L 13 Zur Herstellung des Antibiotikums L 13 365 wird der Stamm Actinoplanes sarveparensis CBS 305-76 aerob in einem Nährmedium beim pH-Wert von etwa 6 bis etwa 10 vorgezüchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität vorhanden ist. Beispielsweise kann die Züchtung in einem Schüttelkolben in einem Medium folgender Zusammensetzung vorgenommen werden:

g/Liter

Pleichextrakt 3,0

Tryptone 5,0

Hefeextrakt 5,0

Glucose 1,0

lösliche Stärke 24,0

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_y(_ 272A090

κ/Liter

Calciumcarbonat 4,0

destilliertes Wasser ad 1000 ml

Die Kolben werden etwa 24 Stunden bei etwa 28 bis 50°C geschüttelt. Die erhaltenen Vorkulturen (1 Liter) werden zur Beimpfung von Glasfermentern mit einem Gehalt an jeweils 10 Liter des folgenden Nährmediums verwendet:

Fleischextrakt . 40 g

Pepton 40 g

Hefeextrakt 10 g

Natriumchlorid 25 g

Sojabohnenmehl 100 g

Glucose 500 g

Calciumcarbonat 50 g Leitungswasser ad 10 Liter

Die Züchtungsansätze werden unter Rühren aerob bei 28 bis 30^eC inkubiert. In Abständen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach einem Agar-Diffusionsverfahren unter Verwendung von Staphylococcus aureus als TestOrganismus festgestellt. Die maximale Aktivität wird nach 72- bis 96-stündiger Züchtung erreicht.

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Isolierung und Reinigung des Antibiotikums L 13 365 Die Gärbrühe (80 Liter) wird unter Verwendung von 1 Prozent (Gewicht/Volumen) Clarcel als Filtrierhilfe filtriert. Der Mycelkuchen wird verworfen, während das Filtrat mit lOprozentiger HCl auf den pH-Wert 2,5 angesäuert und 2 mal mit Essigsäureäthylester in einer Menge von etwa 50 Prozent des Filtrats extrahiert wird. Die organische Phase wird von der wäßrigen Phase durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation abgetrennt, über NapSO^, getrocknet, unter vermindertem Druck bei 45 bis 5O⁰C auf etwa I/3OO seines ursprünglichen Volumens eingeengt und schließlich auf etwa O bis 10⁰C gekühlt. Der gebildete rohe Niederschlag wird abfiltriert, mit einer geringen Menge Essigsäureäthylester gewaschen und unter vermindertem Druck bei 45⁰C getrocknet. Man erhält 1,140 g des Antibiotikums L 13 365 mit einem spektrophotometrisch ermittelten Reinheitsgrad von 70 Prozent.

Die bei der vorstehenden Filtration erhaltenen Mutterlaugen werden in das 20-fache ihres Volumens an leichtem Petroleum gegossen. Man erhält dabei eine weitere Menge von 2,550 g des Antibiotikums mit einem spektrophotometrisch bestimmten Reinheitsgrad von 20 bis 25 Prozent. Dieses Produkt wird in einer geringen Menge eines Gemisches aus Methanol und Aceton (9:1) suspendiert, von unlöslichen Bestandteilen filtriert und mit Wasser verdünnt. Die erhaltene Lösung wird mit lOprozentiger Salzsäure unter Rühren auf den pH-Wert von etwa 2,5 gebracht. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen und sodann in

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At

einer möglichst geringen Menge Butanol bei etwa 4-5 bis 5O°C gelöst. Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf etwa 1/5 des ursprünglichen Volumens eingeengt und auf etwa 4⁰C gekühlt. Der erhaltene Niederschlag wird gewonnen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,450 g Antibiotikum L 13 365 mit einem spektrophotometrisch bestimmten Reinheitsgrad von 80 Prozent, Die erhaltenen Produkte werden sodann üblichen Reinigungsverfahren unterzogen. Zu diesem Zweck werden sie in einer möglichst geringen Menge eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (85:15) gelöst und an einer mit Silica/Celite (1:1 Volumen/Volumen) beschickten Säule, die vorher bei 100⁰C aktiviert worden ist, chromatographiert und mit dem vorstehenden Gemisch aus Chloroform und Methanol gewaschen. Die Elution und die dünnschichtchromatographische Kontrolle der Fraktionen wird mit dem gleichen Gemisch durchgeführt. Die Fraktionen werden entsprechend den dünnschichtchromatographisehen Analysendaten unter vermindertem Druck zu einem geringen Volumen eingeengt. Nach Zusatz von Diäthyläther bildet sich ein Niederschlag, der aus dem Antibiotikum L 13 365 mit einem spektrophotometrisch bestimmten Reinheitsgrad von 95 Prozent besteht. Dieser Niederschlag wird in einer Mischung aus Methanol und Essigsäureäthylester (1:1) gelöst, auf 45^eC erwärmt und von unlöslichen Bestandteilen filtriert. Nach Abkühlen auf 4°C und Stehenlassen über Nacht bei der gleichen Temperatur erhält man das reine Antibiotikum L 13 365 in Form von hellgelben Nadeln.

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Physikochemi sehe Eigenschaften des Antibiotikums L 13 365 Das Antibiotikum L 13 365 weist die Form eines aus hellgelben Kristallen bestehenden Pulvers von saurem Charakter auf. Bei der Aminosäureanalyse eines in 6 η Salzsäure in einem verschlossenen Röhrchen bei 110°C hergestellten Hydrolysate des Antibiotikums L 13 365 lassen sich 4· Aminosäuren feststellen, von denen 3 im Aminosaureautoanalysator als Asparaginsäure, Threonin und Glycin identifiziert werden.

Ferner ist das Antibiotikum L 13 365 durch nachstehende Merkmale gekennzeichnet:

1) Schmelzpunkt: 210°C

2) Elementaranalyse:

C - 51,35 %, H = 5,05 %, N = 10,50 %, S = 11,05 % und 0 (durch Differenzbildung) = 22,05 %.

3) UV- und sichtbares Absorptionsspektrum:

Lösungsmittel λ (mn) E>·

° *max 1cm

0,1 η Salzsäure	360	(Schulter)	103
	290
	237	(Schulter)	326
0,15 m Puffer vom pH-Wert 7,5	408
	378	(Schulter)	67
	290
	237		326
0,15 m Puffer vom pH-Wert 8,8	408	(Schulter)	99
	290	238 709882/0695
		336

Die UV-Absörptionsspektren werden mit einem Unicam Sp 800-Ultravioletspektrophotometer unter Verwendung von L 13 365-Lösungen in Äthylenglykolmonomethyläther-Puffern bei verschiedenen pH-Werten im Verhältnis 1:1 bestimmt. Das vollständige Spektrum ist in Fig. 1 wiedergegeben.

4) FluoreszenzSpektrum:

Das Antibiotikum enthält einen stark fluoreszierenden Chromophor. Eine bei 240 nm angeregte Lösung des Produkts in 0,1 η Natriumhydroxidlösung zeigt ein Emissionsspektrum mit Maxima bei 355 und 490 nm. Das Fluoreszenzspektrum wird mit einem Perkin Eimer Modell MPF-44-Fluoreszenzspektrophotometer aufgenommen.

5) InfrarotSpektrum:

Es werden charakteristische Absorptionsbanden in NuJoI bei den folgenden Frequenzen ( cm" ) festgestellt: 3400 (Schulter), 3350 (scharf), 3200 (Schulter), 3100 (scharf), 2930 und 2870 (Nujol), 2800 bis 2400, 2380 (atmosphärisches Kohlendioxid), 1750 (scharf), 1670 (scharf), 1620 (scharf), 1540 (scharf), 1480 (scharf), 1460 und 1380 (Nujol), 1420 (scharf), 1340 (scharf), 1320 (scharf), 1280 (scharf), 1240 (scharf), 1195 (scharf), II70 (scharf), 1145 (scharf), 1120 (scharf), 1075 (breit), 1015 (scharf), 990 (scharf), 935 (scharf), 920 (breit), 900 (scharf), 865 (scharf), 840 (scharf), 800 (scharf), 770 (scharf), 755 (scharf), 740 (scharf), 720 (Nujol). Das Infrarotspektrum wird mit einem Perkin-Elmer Modell 157-

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Spektrophotometer bestimmt. Das vollständige Spektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben.

6) Spezifische Drehung:

= + 125° (c = 0,8 % in Methanol !Chloroform = 1:1).

7) Löslichkeit:

Die Verbindung ist in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und in Gemischen aus Chloroform und Methanol löslich. Sie ist geringfügig löslich in Chloroform, Methanol, Gemischen aus Methanol und Essigsäureäthylester, Natriumhydrogencarbonatlösungen und Eisessig. Sie ist unlöslich in Wasser und anderen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln.

8) Charakteristische Reaktionen:	positiv
Pehling	positiv
Tollens	positiv
KMnO^	dunkelbraune Färbung
H₂SO^ konz.	negativ
Ninhydrin	positiv
FeCl₅	negativ
Millon	negativ
Schiff	positiv
Anthron	negativ
Folin-Ciocalteau	negativ
Elson-Morgan

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9) Acidität:

Bei der potentiometrischen Titration mit 0,1 η Natriumhydroxid Lösung des Antibiotikums L 13 365 in einer Äthylenglykolmonomethyläther/Wasser-Lösung (4:1) ergibt sich eine ionisier bare Funktion mit einem pK -Wert von 7»8. Das Äquivalentgewicht wird dementsprechend zu 1400 bestimmt.

10) Chromatographisches Verhalten:

Lösungsmittelsystem R~*

mit n-Butanol gesättigter Puffer

vom pH-Wert 6,0 0,75

mit n-Butanol gesättigtes Wasser + 2%
p-Toluolsulfonsäure 0,80

mit n-Butanol gesättigtes Wasser + 2%
konzentriertes Ammoniak 0,70

mit Butanol gesättigter Puffer

vom pH-Wert 6,0 0,0

Ammoniumchlorid (20% Gewicht/Volumen

in Wasser) 0,0

n-Butanol:Methanol:Wasser = 40:10:20
mit einem Gehalt an 0,75 g Methylorange 0,90

n-Butanol:Methanol:Wasser =40:10:30 0,90 Wasser:Aceton =1:1 0,35

mit Wasser gesättigter Essigsäureäthylester 0,0 bis 0,31

Chloroform:Methanol - 85:15 (♦·) 0,51

Papierchromatographie an Whatman-Papier Nr. 1; Antibiotikum auf mit S. aureus beimpften Platten sichtbar gemacht

Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten Fluoreszierender Flecken unter UV-Licht.

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Lee

Claims

DIPL-CHEM. DR. VOLKER VOSSIUS PATOTTAHWALT

ε München ce, ' * eiEBERTSTRASSE 4 P.O. BOX ββ 07 Ν PHONE: (O W) «7 40 75

CABLE ADDRESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN

TELEX S-23453 VOPAT D

u.Z.: M 211 Case: Lp 54-7 GRUPPO LEPETIT S.p.A.

Mailand, Italien

"Antibiotikum L 13 365, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen¹

Priorität: 29. Juni 1976, Großbritannien, Nr. 26 92V1976

Pat entansTjrüche

Antibiotikum L 13 365i gekennzeichnet durch folgende Merkmale:

a) Schmelzpunkt: 210⁰C

b) etwa folgende elementare Zusammensetzung:

51,35 Prozent Kohlenstoff, 5,05 Prozent Wasserstoff, 10^50 Prozent Stickstoff, 11,05 Prozent Schwefel und 22,05 Prozent Sauerstoff

c) UV-Spektrum:

charakteristische UV-Absorptionsbanden in den nachstehend aufgeführten Lösungsmittelsystemen (vgl. auch Fig. 1)

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Lö sungsmi 11 el 0,1 η Salzsäure

0,15 m Puffer vom pH-Wert 7,5

0,15 m Puffer vom pH-Wert 8,8

^J1cm

360 103

290 (Schulter)

237 326

408 (Schulter)

378 67

290 (Schulter)

237 326

408 99

290 (Schulter)

238 336

d) IR-Spektrum:

charakteristische IR-Absorptionsbanden in Nujol bei folgenden Frequenzen (cm~ ) (vgl. auch Fig. 2): 3400 (Schulter), 335Ο, 32ΟΟ (Schulter), 3IOO, 293Ο und 2870 (Nujol), 2800 bis 2400, 2380 (atmosphärisches Kohlendioxid), 1750, 1670, 1620, 1540, 1480, 1460 und 1380 (Nujol), 1420, 1340, 1320, 1280, 1240, 1195, 1170, 1145, 1120, 1075 (breit) 1015, 990, 935, 920 (breit), 900, 865, 840, 800, 770, 755, 740, 720 (Nujöl)

e) spezifische Drehung: /~a_7/^g (0,8 Prozent in Methanol:

Chloroform = 1:1) - + 125°

f) Löslichkeit:

löslich in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und in Gemischen aus Chloroform und Methanol, geringfügig löslich

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272409Q

in Chloroform, Methanol, Gemischen aus Methanol und Essigsäureäthylester, Natriumhydrogencarbonatlösungen und Eisessig, unlöslich in Wasser und in anderen üblichen organischen Lösungsmitteln,
g) charakteristische Reaktionen:

Fehling positiv

Tollens positiv

KMnO^ positiv

H^O^ konz. dunkelbraune Färbung

Ninhydrin negativ

FeCl, positiv

Millon negativ

Schiff negativ

Anthron positiv

Folin-Ciocalteau negativ

Elson-Morgan negativ

h) ionisierbare Funktionen:

eine ionisierbare Funktion mit einem pK =7,8 (Äthylenglykolmonomethyläther:Wasser = 4:1) läßt sich potentiometrisch nachweisen,

i) R_f-Werte:

die Chromatographie wird an Whatman-Papier Nr. 1 durchgeführt. Die Flecken werden durch mikrobiologische Entwicklung mit Staphylococcus aureus sichtbar gemacht:

Elutionssystem R»-Wert

Puffer vom pH-Wert 6,0

mit n-Butanol gesättigt 0,75 mit Wasser gesättigtes

n-Butanol + 2 % p-Toluol-

sulfonsäure 0,80

mit Wasser gesättigtes

n-Butanol + 2 % konzen- _Q „q

triertes Ammoniak 709882/0695

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Elutionssystem R~-Wert

mit Butanol gesättigter

Puffer vom pH-Wert 6,0 O₁O

Ammoniumchlorid (20 %

Gewicht/Volumen in Wasser) 0,0

n-Butanol:Methanol: Wasser = 40:10:20 mit einem Gehalt an 0,75 S Methylorange 0,90

η-Butanol: Methanol: Wasser =

40:10:30 0,90

Wasser: Aceton =1:1 0,35

mit Wasser gesättigter

Essigsäureäthylester 0,0 bis 0,31

Dünnschichtchromatographie an Kieselgelplatten; Sichtbarmachung des fluoreszierenden Fleckens unter UV-Licht

Elutionssystem R~-Wert

Chloroform:Methanol =85:15 0,51
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums L 13 365 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Actinoplanes sarveparensis CBS 305*76 in einem Nährmedium mit einem Gehalt an assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickst off quell en und anorganischen Salzen unter aeroben Submersbedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums. L 13 365 gebildet worden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich das Antibiotikum L I3 365 aus dem Nährmedium isoliert.

709882/0695
4. Kultur, bestehend im wesentlichen aus dem Mikroorganismenstamm Actinoplanes sarveparensis CBS 305·76 und einem wäßrigen Nährmedium mit einem Gehalt an assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganischen Salzen, wobei die Kultur in der Lage ist unter aeroben Fermentationsbedingungen das Antibiotikum L 13 365 in isolierbaren Mengen zu bilden.
5. Actinoplanes sarveparensis CBS 305*76.
6. Verwendung des Antibiotikums gemäß Anspruch 1 bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

709882/069*