DE2009115C3

DE2009115C3 - Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums

Info

Publication number: DE2009115C3
Application number: DE2009115A
Authority: DE
Inventors: Gertraud Dr. Bradler Geb. Roesel; Waltraud Effenberger Geb. Peter; Wolfgang Dr. Forberg; Heinz Dr. Fricke; Rosemarie Fuegner; Hans Prof. Dr. Knoell; Peter Dr. Kramer; Helmut Prauser; Eberhard Dr. Strumpf; Heinz Dr. Trum
Original assignee: VEB Jenapharm
Current assignee: Jenapharm GmbH and Co KG
Priority date: 1969-03-05
Filing date: 1970-02-26
Publication date: 1979-08-23
Also published as: DK130128C; DK130128B; NL7003002A; DE2009115B2; DE2009115A1; SU371705A3; CS162040B1; RO56850A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums mit wertvollen therapeutischen Eigenschaften.

Dieses Antibiotikum besitzt große Bedeutung als mykoplasmenwirksames Mittel.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung dieses Antibiotikums bereitzustellen.

Es wurde gefunden, daß in den Fermentationslösungen eines Stammes der Gattung Streptomyces dieses therapeutisch wichtige Makrolid-Antibiotikum mit Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien und Mykoplasmen gebildet wird und unter den im folgenden beschriebenen Verfahrensbedingungen isoliert werden kann. Der Mikroorganismus zur Gewinnung dieser Substanz gehört zu der Art Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman etHenrici 1948 und ist in der Stammsammlung des Instituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin unter der Nummer JA 6599 hinterlegt.

Da:, erfindungsgemäß isolierte Antibiotikum stellt einen Komplex aus mehreren Komponenten dar und kann in die Gruppe der Leucomycine eingeordnet werden, die bisher nur von Streptomyces-Stämmen der Art Streptomyces hitasatoensis HATA et al. 1953, Streptomyces reticuli (Waksman et Curtis 1916) Waksman et Henrici 1948 gewonnen werden konnte.

Erfindungsgemäß ist das Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums durch Züchtung eines

ίο Streptomyces-Stammes unter aeroben Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen dadurch gekennzeichnet, daß als produzierender Stamm Streptomyces hygroscopicus IMET JA 6599 eingesetzt wird, die Züchtung in geeigneten Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis 32° C während 2 bis 5 Tagen unter Belüftung und Rührung durchgeführt wird und schließlich das Antibiotikum nach Abtrennen der Feststoffe durch Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Butylacetat, nachfolgende Reextraktion mit sauren Pufferlösungen oder verdünnten Säuren, erneute Extraktion mit Halogenkohlenwassersloffen oder Estern, vorzugsweise mit Chloroform, Ausfällen der Bause aus dem Chloroformkonzentrat mit Petroläther und gegebenenfalls durch Säulenchromatographie in reiner Form gewonnen wird.

Der Stamm IMET JA 6599 wurde im Jahre 1959 aus einer Gartenerde von Tunghua (Chin?) isoliert. Er bildet

ίο weißliches, ockergelbes bis hellbraunes Substratmycel. Das weiße Luftmycel versport grau bis braungrau und zeigt stellenweise durch Autolyse entstandene schwarze feuchte Fleckenbildung. Die versporten Lufthyphen zweigen von einer langen Haupthyphe ausgehend, in

r> gleichmäßigen Abständen einzeln, vielfach zu mehreren auch pseudo-wirbelartig ab und enden in regelmäßigen und unregelmäßigen Spiralen, die teils dichte Knäule bilden. Elektronenoptische Aufnahmen zeigen'ovale, unregelmäßig geformte Abschnürungen mit glatter

4(i Oberfläche.

Es werden keine melanoiden Pigmente gebildet.
Der dieser Beschreibung zugrunde liegende Stamm IMET JA 6599 kann auf Grund seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften (im Sinne von

ν-, Tresner und Backus 1956) der umfangreichen Species Streptomyces hygroscopicus (Jensen 1931) Waksman et Henrici 1948 zugeordnet werden.

Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des JA 6599 sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Morphologische und physiologische Merkmale des Streptomyces-Stammes JA 6599

Sporophoren:
Sporenoberfläche:
Farbe des Luftmycels:
Farbe des Substratmycels:
Melaninbildung:

Nährboden

Substratmycel
Wuchsform

regelmäßige und unregelmäßige Spiralen

glatt

weiß, versport grau bis braungrau, zeigt stellenweise schwarze Fleckenbildung

cremefarben bis hellbraun

keine

Farbe

lösliches Pigment l.uftmyccl Farbe
Form

Bemerkungen

Mineral.
Medium 1 nach
Cause

rindig,
krustig

cremefarb.
nach ocker

keines samtig weiß bis hellgrau

I	I	Lackmurmilch	3	20	Farbe	09 1	15	4	Farbe	Bemerkungen
I	1 Glukose-Hefe-
B Fortsetzung	I extrakt-Agar		Substratmycel		cremefarb.			weiß
S Nährboden	1 Nähr-Agar		Wuchsform	bis ocker	lösliches	Luftmycel
I	1 Kartoffelkeil		schwach borkig		Pigment	Form
i Org. Med. 2		Saccharose-		gräulich.	keines	samtig	weiß bis hellgrau
H nach G a u s e	B Tyrosin-	medium		rötlich
I et al. 1957	"^l Medium		flach, glatt	ockergelb			weiß bis hellgrau
H Glukose-			rindig	oder	violett	dünn
H Asparagin-Agar	^ Dorset's		borkig	schmutzig	rot	samtig
CZAPEK-Agar	·,' Eiermedium	Dextrose-		oliv	keines	samtig
mit Sacch.		Nitrat-Brühe		weißlich			weiß und grau	Calciummalat-
	«ω Reine Gelatine							abbau: gut
	F	dünn, flach glatt
Calciummalat	■■ ,* Magermilch		weißlich	keines	samtig	weiß bis hellgrau,	Stärkeabbau: gut
Agar nach	;C		bis fahl			bekommt
Krai η sky		rindig, krustig	hell ocker			schwarzbraune
Salz-Stärke	•			keines	samtig	Stellen autoly-
Agar nach					sierten Luftmycels
Küster		elfenbein			hellgrau, braun-
		bis matt			grau, bekommt
	schwach erhaben,	ocker			dunkelbraune bis
Hafermehl-Agar	glatt		keines	samtig	bis schwarze
nach Küster					Flecken autoly-
1959					sierten Luft
					mycels
		hellbraun			weiß bis
					hellgrau
stark erhaben,	cremefarben			weiß
glatt	cremefarben	keines	samtig	weiß bis
flach, glatt				hellgrau
borkig	weißlich	keines	staubig	weiß
	cremefarb.	keines	samtig
kleine Ober-			oder mehl.
flächenkol., dicht	gelblich	keines	dünn	weiß	Nährboden
im Stichkanal			samtig		wird nicht
runzlig					verflüssigt
	elfenbein	keines	samtig	weiß	Verflüss.:
					mäßig bis gut
breiter Randring	weißlich			weiß	Koag.:
		keines	samtig		fragl.
dicker Ring					Pept.:
		keines	mehlig		mäßig
	weißlich			weiß	Koag.:
					fragl.
breiter Randring					Pept.:
		keines	mehlig		mäßig bis
					gut
	weißlich			weiß	keine

Oberflächen
wachstum, unter		keines	samtig
getauchte Flocken			oder
am Glas und am	weißlich		mehlig		starke Reduktion
Boden
große Flocken
	keines	keines

Fortsetzung	5	20 09 1	15 6	Bemerkungen
Nährboden	Substratmycel Farbe Wuchsform	lösliches Pigment	Luftmycel Farbe Form
Zellulose- Streifen	kein eindeutiges Wachstum sichtbar

Kohlenhydratverwertung: Gutes Wachstum: D-Glukose, Mannose, D-Galaktose, D-Fruktose, Trehalose, Maltose, Laktose, Saccharose, Raffinose, Dextrin, Stärke, Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glyzerin.

Mittelmäßiges Wachstum: D-Xylose, Salicin, Natriumeitrat, NatriumsuccinaL Geringes oder kein Wachstum: D-Arabinose, Rhamnose, L-Sorbose, Dulcit, Aesculin, Natriumacetat.

Die Kulturlösungen des Stammes IMET JA 6599 zeigen gute Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, schwache auch gegen Mykobakterien, mittlere bis gute Aktivität gegen Hefen und Pilze sowie auch gegen Mycoplasma gallisepticum.

Neben dem antibakteriell wirksamen Makrolid-Antibiotikum konnte ein antifungales Antibiotikum isoliert werden, das nicht zu den Polyenantibiotika gehört, in die Kulturlösung ausgeschieden wird, woraus es durch Extraktion mit Butanol gewonnen werden kann.

Auf Grund der Aktivitätsteste und papierchromatographischen Untersuchungen der Extrakte liegt ein Abtibiotikum der Cycloheximid-Gruppe vor.

Die Kultivierung des Stammes JA 6599 sowie von dessen Varianten oder Mutanten erfolgt unter aeroben jo Bedingungen. Ausgehend von an Erde getrocknetem Sporenmaterial werden geeignete Agarnährböden und anschließend ausgewählte flüssige Nährmedien beimpft. Diese Nährböden können als Kohlenstoffquellen z. B. Stärke, Saccharose, Glukose und als Stickstoffquelle ι=, z. B. Sojabohnenmehl, Hefe oder Maisquellwasser enthalten. Die Antibiotikumbildung erreicht ihr Maximum im allgemeinen zwischen drittem bis fünftem Tag, wenn Temperaturen von 28 bis 32° C, bevorzugt 30° C, gewählt werden.

Das Makrolid-Antibiotikum kann aus den Kulturfiltraten durch Extraktion mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln, wie Halogenkohlenwasserstoffen, Ketonen oder Estern, bevorzugt Butylacetat, extrahiert werden. Aus den Extrakten läßt sich das basische Antibiotikum durch Reextraktion mit wäßrigen, sauren Lösungen wie Pufferlösungen oder verdünnten Säuren als Salz in die wäßrige Phase überführen. Aus den eingeengten Reextrakten wird die wirksame Substanz im alkalischen Bereich ausgefällt oder mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Chloroform, extrahiert. Das Antibiotikum läßt sich aus den eingeengten Chloroformextrakten mit Petroläther ausfällen. Es wurde gefunden, daß hochgereinigtes Makrolid-Antibiotikum in Form der reinen Base erhalten werden kann, wenn acetonische Lösungen der rohen Base, gegebenenfalls nach einer Behandlung mit Aktivkohle, wobei das Antibiotikum nicht adsorbiert wird, einer Säulenchromatographie an Aluminiumoxid unterworfen werden. Dabei bleiben die farbigen Verunreinigungen auf _bo der Säule, während die aktiven Fraktionen nach Ersatz des Acetons durch Chloroform farblose Fällungsprodukte mit Petroläther liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung des Makrolid-Antibiotikums besteht darin, daß Antibioti- b^r> kum aus den durch Zugabe von Oxalsäure geklärten Kulturfiltraten bei pH — 8 mit Butylacetat extrahiert und aus dem Extrakt mit 0,01 η Schwefelsäure reextrahiert wird. Anschließend können die neutralisierten Reextrakte eingeengt werden, und danach wird das Antibiotikum bei pH = 8 mit Chloroform extrahiert Die konzentrierten Chloroformlösungen werden in Petroläther eingetropft, wobei die Base des Makrolid-Antibiotikums ausfällt Rohbasen lassen sich durch Säulenchromatographie einer acetonischen Lösung an Aluminiumoxid nach Brockmann reinigen. Die biologisch aktiven Acetoneluate werden evaporiert, in Chloroform aufgenommen und das Makrolid-Antibiotikum mit Petroläther gefällt

Nach einer anderen Ausbildungsform des Verfahrens lassen sich Rohbasen außerdem reinigen durch Adsorption an Kationenaustauscher in der H+-Form, vorteilhaft Wofatit CP (Handelsname), Elution mit sauren oder basischen Pufferlösungen, besonders Ammoniak-Ammoniumchlorid-Puffer (pH = 9,5) oder Citratpuffer (pH = 4,9), nachfolgende Extraktion der Base mit Chloroform bei pH = 8 und ausfällen des Makroiid-Antibiotikums in Petroläther. Sinngemäß läßt sich dieses Verfahren auch zur Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat anwenden.

Das Antibiotikum, das nach dem Stamm A 6599 genannt wird, bildet bei Fällung eine weiße, amorphe Substanz, bei Umkristallisation farblose Nadeln mit dem Schmelzpunkt 129 bis 134° C, der spezifischen Drehung von [ex.]','= -66,0° ± 0,2°, (c = 2 in Methanol), dem UV-Maximuin bei 232 und 278 bis 282 nm sowie dem Molgewicht 865. Es ist gut löslich in Chlorkohlenwasserstoffen, Estern, Äther, Ketonen, Methanol, Benzol, schwerlöslich in Wasser und Petroläther. Als Base bildet es mit Säuren Salze.

So kann z. B. das Tartrat des Antibiotikums A 6599 durch Gefriertrocknung einer wäßrigen Lösung von äquimolaren Mengen der Base des Antibiotikums und Weinsäure oder durch Ausfällen des Salzes aus einer Acetonlösung von äquimolaren Mengen Base und Weinsäure mit Äther erhalten werden. Das farblose Salz mit dem Schmelzpunkt von 135 bis 138° C ist gut in Wasser, Alkoholen und Aceton löslich, schwerlöslich in Äther und Petroläther.

Mit Pikrinsäure wird ein schwerlösliches Pikrat vom Schmelzpunkt 129 bis 131°Cerhalten.

Der Schmelzpunkt des Acetylderivates liegt bei 120 bis 127° C, des Thiosemicarbazons bei 138 bis 140° C und des 2,4-Dinitrophenylhydrazons bei 126 bis 130° C.

Nach dem chemisch-physikalischen Verhalten ist das Antibiotikum JA 6599 mit Leucomycin (Kitasamycin) vergleichbar, jedoch sind Unterschiede im chromatographischen Verhalten feststellbar.

Das Antibiotikum JA 6599 ur.ci ivitasamycin lassen sich durch absteigende Papierchromatographie mit butylacetatgesäuigteni Phosphaipuffcr (pH = 8) als

Liiufmittcl in 5 bis 8 Komponenten auftrennen. Dabei zeigt sich qualitativ eine Identität der einzelnen Komponenter, jedoch sind quantitativ Unterschiede zu verzeichnen.

Durch ■.!(i'^circhtchromatographischc Trennungen nach üer Keilstreifentechnik auf Kieselgelplaiten mit di_,η Laufmittelsystem

Benzol zu Essigester zu Methanol = 7:3:1

werden nach 3maligcr Entwicklung und anschließendem Anfärben mit 5°/oiger Phosphorwolframsäure in lO°/oiger Schwefelsäure des Antibiotikum JA 6599 und Kitasamycin in fünf identischen Komponenten mengen-

mäßig unterschiedlicher Zusammensetzung aufgetrennt, wobei bei dein Antibiotikum A 6599 noch eint, und bei Kitasamycin noch vier zusätzliche Komponenten auftreten, die nicht identisch sind.

Auf Grund dieser chromatographischcn Befunde ist das erfindungsgemäße Antibiotikum ebenso ein Komplex vie Leucomycin. Dabei zeigten sich neben qualitativer. Unterschieden einzelner Komponenten auch noch quantitative Unterschiede bei den identischen Komponenten.

Das Antibiotikum A 6599 zeigt im Agardiffusions- bzw. Röhrchentest folgendes Wirkungsspektrum:

Tabelle 2

Testorganismus
Prüfungsmethode

Kleinste Hemmkonzentration A 6599-Base mcg/ml

Agardiffusionstest

Bacillus subtitlis ATCC 6 633 8

Micrococcus pyegenes var. aureus SG 511 8

Sarcina lutea SG 125 4

Bacillus globifer OHIl 4

Bacillus globifer EH 11 (Erythromycin resistent) 16

Bacillus mycoides SG 756 8

Bacillus mycoides SG 756 TF (Oxytetraclin resistent) 4

Mycobacterium phlei SG 346 16

Mycobacterium smegmatis SG 987 64

Röhrchenverdünnungstest
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma hyorbinis

Toxizitäts-Test:

Die LD50 wurde an weißen Mäusen vom ABAFrHybrid-Stamm bestimmt

0,1 (bakteriostatisch) 3,8 (bakteriostatisch)

Art der Verabreichung

Injektion: intraperiteneal LD50

mg Tartrat des Antibiotikums A 6599/kg Maus

1050

Mit der Bereitstellung des Makrolid-Antibiotikum TURIMYCIN gemäß Erfindung wird eine Bereicherung des Standes der Technik, und damit eine Weiterentwicklung desselben, insofern erreicht, als die Wissenschaft noch ständig auf der Suche nach solchen im Veterinärbereich einsetzbaren Antibiotika ist, die keine Anwendung im humanen Bereich erfahren. Es werden in gewissen Zeitabständen ständig neue Antibiotika zur Therapie benötigt, da sich im Laufe der Jahre Resistenzerscheinungen einstellen, die eine Ablösung bislang erfolgreich eingesetzter Antibiotika erforderlich werden lassen.

Das antibakterielle Wirkungsspektnim des Makrolid-Antibiotikums Turimycin erstreckt sich hauptsächlich gegen grampositive Bakterien. Bei Vergleichs-Testungen von Turimycin mit Erythromycin, Oleandomycin und Tylosin, unter Verwendung von vorwiegend grampositiven Testorganismen zeigte das Turimycin im Agar-Diffusionsplattentest nahezu gleiche Wirksamkeit, ausgewiesen durch gute Übereinstimmung in den Werten der Hemmzonendurchmesser (siehe Vergleichstabelle). Bei Einsatz eines gegen Erythromycin resistent gezüchteten Bacillus globifer (EH 11) zeigte sich gegenüber Oleafldomycin und Erythromycin volle Kreuzresistenz, dagegen nur quantitativ etwas reduzierte Empfindlichkeit bei Tylosin und Turimycin. Ein gegen Tylosin resistent gezüchteter Staphylococcusaureus-Stamm (SG 511 TyI. f.) erbrachte im Vergleichstest, gegenüber dem obengenannten Macrolid-Antibiotica eingesetzt, vollkommene Kreuzresistenz.

Es wurde auch ein sehr guter Hemmeffekt gegen Mycoplasmen, bei in vitro-Testungen gegen Mycoplasma gallisepticum und Mycoplasma hyorhinis festgestellt Turimycin erbrachte bei der Bekämpfung der chronischen Respirationstrakt-Erkrankung des Geflügels, hervorgerufen durch Mycoplasmen, sehr gute Erfolge.

Bei Empfindlichkeitsprüfungen in vitro von isolierten Erregem der Schweinedysenterie (Borrelia-Gruppe) resultierten gute Hemmeffekte. Die Praxiserprobung von Turimycin hat ergeben, daß bei der Behandlung von an Dysenterie behandelten Schweinen innerhalb der ersten 5 bis 6 Tage nach Therapiebeginn eine klinische Ausheilung stattfand, das heißt es normalisierte sich dei Kotabsatz und es verbesserten sich Allgemeinbefinden und Gewichtszunahme signifikant

20Ö9 115

Vergleichstahelle: Wirksainkeitsspeklren von Makrolidantibiotica

Ergebnisse: Memmzonet: Piirehmesser

restkeime	Erythromycin meg	10	Base/ml	lieg Base/ml	2	0,4	Oleandomycin meg	10	Base/ml	10	2	0,4	1
	50	24	2	10	14	14p	50	19	2	19/21 ρ	12p	0	I
Bac. subtilis ATCC 6633	28,5	28	19	20/21 ρ	15	16,5	24	21	16P	23	16	14P
Bac. globifcr OH 11	31	0	23	22	0	0	28	0	16	16	0	0
Bac. globifer EH ι1	O		0	16			0		0				■j
(Erythromycin resist.)		23/32p			15	11/18p		14/22p		18/26p	ll/16p	0
Bac. mycoides SG 756	27/38p	40	15/23p	21	15	24	20/3 Ip	29	14p	29	18	0
Bac. mycoides SG 756 TF	46		32	20/23p			38		20
(Oxytetracycl. resistent)		21			0	11p		16		17	11p	0
Microc. pyogenes var. aureus SG 511	26	0	16	17	0	0	21	0	12p	0	0	0	1
Microc. pyogenes var. aureus SG 511 TyI. f.	O		0	0			0		0				S
(Tylosin resist.)		28			17/21 ρ	17		22		26	19	0	§
Sarcina lutea SG 125 A	33	0	23	20/26p	0	0	26	0	16	0	0	0	■A
E. coli mutabile SG 458	16	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	I ■ä
E. coli mutabile SG 458 SF	13		0	0			0		0				ti
fStreDtomvcin resistentl		16			0	0		13		0	0	0	'^
RcOIi(CoHo)	22	14	0	0	0	0	19	0	0	0	0	0
Pseudomonas spec. B7	20	17P	0	0	0	0	0	0	0	17	0	0	is
Mycobacterium phlei SG 346	24	0	0	0	0	0	0	0	0	14	0	0
Mycobacterium smegmatis SG 987	15		0	0			0		0
(Fortsetzung)
Testkeime	Tylosin \	0,4	Turimycin (Std. 1974) E/ml	0,4
	50	0	50	0	-:j\|
Bac. subtilis ATCC 6 633	22/25p	0	24/27p	0
Bac. globifer OH 11	25/26p	0	26/29p	0
Bac. globifer EH 11	24		24		\.
(Erythromycin resist.)		0		.0	%
Bac. mycoides SG 756	25	0	23/32p	A
Bac. mycoides SG 756 TF	26/3Op		36
(Oxytetracycl. resistent)		0		0	φ
Microc. pyogenes var. aureus SG 511	21	0	22,5	0
Microc. pyogenes var. aureus SG 511 TyI.	f. 0		0
(Tylosin resist.)		14/16p		13
Sarcina lutea SG 125 A	21/28p	0	30	0
E. coli mutabile SG 458	0	0	0	0
E. coli mutabile SG 458 SF	0		0
(Streptomycin resistent)		0		0
E. coli (CoHö)	14	0	17	0
Pseudomonas spec. B7	0	0	0	0
Mycobaterium phlei SG 346	13P	0	22	0
Mycobacterium smegmatis SG 987	13P	17

ρ = partielles Keimwachstum im Hemmhofbereich.
P = stark partielles Keimwachstum im Hemmhofbereich. Std. = Standard-Substanz.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert, aber nicht begrenzt

Beispiel 1

Für die Impfkultur werden durch lyophile Trocknung am Trägermaterial wie sterilisierte Erde oder Mager- es milch hergestellte Sporenkonserven des Stammes JA 6599 auf Agamährböden folgender Zusammensetzung vermehrt:

I. Hafermehl	2,0%
Agar-Agar	2,0%
dest Wasser pH 7,0
IL Saccharose	03%
Dextrin	1,5%
Harnstoff	0,01%
NaCl	0,05%
KH₂PO₄	0,05%
Hefeextrakt	0,1%
bakL Pepton	0,5%

FeSO₄ · 7 H₂O

Agar-Agar

dest. Wasser pH 6,8 bis 7,0

0,001%
3,0%

Als Vorkulturmedium für die Anzucht des Impfmaterials in Submcrskultur hat sich das folgende Nährsubstrat bewährt:

Glukose 1,5%

Maisquellwasser (Trockensubstanz) 1,0%

Hefeextrakt oder Trocken-Hefe 0,5%

CaCO₃ 0,3%
Trinkwasser pH 6,8 bis 7,0
nach Sterilisation.

Dieses Nährmedium wird zu 50 ml in 500 ml Steilbrustflaschen abgefüllt, 35 Minuten bei 120°C sterilisiert und nach dem Erkalten mit einer Sporensuspension von Schrägagarkulturen beimpft. Diese Kölbchen werden anschließend zwei Tage bei 29 bis 30⁰C geschüttelt und als Submerskultur (in einer Menge von 5 Vol.) zur Beimpfung des nachstehend aufgeführten Fermentationsnährbodens verwendet.

Zuckerrüben-Meiasse

Glukose

Kartoffelstärke

Sojabohnenmehl

Hefeextrakt

CaCOj

Sonnenblumenöl

Trinkwasser pH = 6,8 bis 7,0

(nach Sterilisation).

0,5%
0,5%
4,0%
2,0%
0,1%
0,2%
0,1%

Fermentationsmedium

Zuckerrüben-Melasse 0,5%

Dextrosesaft (auf Glukose berechnet) 0,5%

500 ml Steilbrustflaschen werden mit 50 ml der aufgeführten Nährlösung beschickt, 35 Minuten bei 120⁰C sterilisiert und nach dem Erkalten mit 5 VoI % der 48 Std. alten Vorkultur beimpft. Anschließend werden diese Kolben bei 29 bis 30⁰C geschüttelt. Nach 72, 96 und 120 Stunden wird die Antibiotikumbildung mikrobiologisch bestimmt Die Testung erfolgt im Agardiffusionsplattentest gegen Bacillus subtilis ATCC 6633. Das Maximum der Antibiotikumbildung liegt zwischen dem 3. und 5. Fermentationstag.

Beispiel 2

Die Kultivierung in größerem Maßstab erfolgt in Fermentern. Für die Anzucht des Impfmaterials wird dasselbe Nährmedium eingesetzt wie in Beispiel 1 angegeben. Es werden 1 bis 2 Vol.-% der 48 Std. alten 1. Vorkultur zur Beimpfung einer 2. Vorkultur mit dem gleichen Nährmediuin verwendet, das zu 400 ml in 2-Ltr.-Stehkolben abgefüllt ist und unter denselben Kulturbedingungen, wie beschrieben, geschüttelt wird.

Entsprechende Impftanks z. B. mit einem Nutzvolumen von 20 Ltr. bzw. 150 Ltr. werden mit dem genannten Vorkulturmedium beschickt, mit 0,5% einer 2. Vorkultur beimpft und unter Belüften und Rühren 24 Std kultiviert Die so gewonnene Subermskultur wird als Impfmaterial für größere Fermentationstanks in einer Menge von 5 VoL-% verwendet

Kartoffelstärke

Sojabohnenmehl

Trockenhefe

CaCO₃

Sonnenblumen-Rohöl

Trinkwasser pH 6,8 bis 7,0

nach Sterilisation

4,0%
2,0%
0,3%
0,2%
0,5%

Die Fermentation erfolgt bei 29 bis 30⁰C unter Belüften und Rühren. Nach einer Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen wird die maximale Antibiotikumbildung erreicht

Beispiel 3

Von 12001 Kulturlösung mit 275 y/ml wird nach Kühlen auf 5" C und Ansäuern mit Oxalsäure auf pH = 3 das Mycel durch Separieren abgetrennt. Nach der Neutralisation der wäßrigen Lösung mit Natronlauge wird klar separiert und das Kulturfiltrat nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8 mit 400 1 Butylacetat extrahiert Die Reextraktion des Butylacetatextraktes erfolgt mit 801 0,01 η Schwefelsäure. Der sofort neutralisierte Reextrakt wird auf 20 1 eingeengt und der pH-Wert mit Natronlauge auf 8 gebracht. Anschließend wird zweimal mit 5 und 2,5 1 Chloroform extrahiert und die vereinigten Chloroformextrakte auf 0,3 i eingeengt. Durch Eintropfen des Chloroformkonzentrates unter Rühren in 5 1 Petroläther fällt die Base des Antibiotikums A 6599 aus.

Ausbeute: HOg,Schmelzpunkt = 118bis122°C.

Beispiel 4

52 g ro'ae Base des Antibiotikums A 6599 werden in 200 ml Aceton geiöst, mit 20 g Aktivkohle gereinigt und über lkg Aluminiumoxid nach Brockman mit Aceton als Elutionsmittel Chromatographien. 1 I aktive Acetoneluate werden evaporiert, der Rückstand in 150 ml Chloroform gelöst und die Chloroformlösung unter Rühren in 3 1 Petroläther getropft Die gereinigte Base wird abgesaugt und getrocknet.

Ausbeute 41 g, Schmelzpunkt: 128 bis 134° C.

Beispiel 5

50 g rohe Base des Antibiotikums A 6599 werden in 150 ml Aceton gelöst, 10 g Aktivkohle zugegeben und über 500g Aluminiumoxid nach Brockmann chromatographiert Die aktiven Acetoneluate ergeben nach dem Evaporieren 45 g gereinigte Base als Trockenrückstand. Dieser wird in 50 ml Aceton aufgenommen und mit 13 g Weinsäure in 300 ml Aceton versetzt Unter Rühren wird dieses Gemisch in 4 1 Äther eingetropft, wobei das Tartrat des Antibiotikums A 6599 ausfällt

Ausbeute: 35 g, Schmelzpunkt: 134 bis 138° C.
Aus der Mutterlauge lassen sich weitere 7 g gewinnen.

Beispiel 6

51 g gereinigte Base des Antibiotikums A 6599 werden in einer Lösung von 133 g Weinsäure in 100 ml Wasser aufgelöst, die Lösung mit 10 g Aktivkohle entfärbt und nach dem Filtrieren lyophil getrocknet

Ausbeute: 58 g, Schmelzpunkt: 133 bis 137° C

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung eines Makrolid-Antibiollkums durch Züchtung eines Streptomyces-Stammes unter aeroben Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen, dadurch gekennzeichnet, daß als Stamm Streptomyces hygroscopicus IMET JA 6599 eingesetzt wird, die Züchtung in geeigneten Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis 32° C während 2 bis 5 Tagen unter Belüften und Rühren durchgeführt wird und schließlich das Antibiotikum nach Abtrennung der Feststoffe durch Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen, Ketonen oder Estern, nachfolgende Reextraktion mit sauren Pufferlösungen oder verdünnten Säuren, erneute Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, Ausfällen der Base aus dem so erhaltenen Konzentrat mit Peiroläther und gegebenenfalls durch Säulenchromatographie in reiner Form gewonnen wird.