DE3104886A1

DE3104886A1 - Antibiotika actinomadura-l-31 a, b

Info

Publication number: DE3104886A1
Application number: DE19813104886
Authority: DE
Inventors: Yukio Miyazaki; Akio Tokyo Seino; Hideo Sugawara
Original assignee: Kaken Chemical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1981-02-11
Publication date: 1982-04-15
Also published as: GB2069500B; JPS56113791A; US4328211A; FR2476127B1; GB2069500A; JPS6254320B2; DE3104886C2; FR2476127A1

Description

1A-3490
Kc-34

KAKEN CHEMICAL CO., LTD. Tokyo, Japan

Antibiotika Actinomadura-L-31 A, B

Die vorliegende Erfindung betrifft die Antibiotika Actinomadura-L-31 A, B und ihre Herstellung. Bei den Antibiotika Actinomadura-L-31 A, B handelt es sich um neue, schwefelhaltige Peptid-Antibiotika.

Es sind bereits bestimmte, schwefelhaltige Peptid-Antibiotika bekannt. Typische, bekannte, schwefelhaltige Peptid-Antibiotika umfassen Thiopeptin [j.Antibiot,23_, 113 (1970)], Thiostrepton [Antibiotics Annual, S. 554 (1955/56)], Taitomycin [J.Antibiot, A 12, 1 (1959)], Siomycin [J. Antibiot, 22, 364 (1969)], Pepthiomycin [J. Antibiot, 21., 429 (1968)], Gardimycin [J.Antibiot,22, 501 (1976)], Kobenomycin [J.Antibiot, 21, 320 k(i968)], Leucinamycin [J. Antibiot, A 20, 194 (1967)], Macromomycin [J.Antibiot, 21., 44 (1968)] und Neocarzinostatin [J. Antibiot, A 18, 68 (1965)].

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung neuer Actinomadura-L-31 A, B, wobei es sich um neue Antibiotika handelt.

Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 A hat als Chlorwasserstoff salz folgende Eigenschaften:

Aussehen:
Schmelzpunkt:
spezifische Drehung: Elementaranalyse:

konstituierende Aminosäuren:

UV-Absorptionsspektrum: weißes oder blaßgelbes Pulver kein klarer Schmelzpunkt [a]p⁵ -34° (C:0,5; pH: 7,5 Wasser) (gefunden)

C 51,71%; H 6,23%; O 21,03%; N 13,94%; S 5,82%; Cl 1,17% Asparaginsäure; Glutaminsäure; Glycin; Valin; Phenylalanin; Histidin; Luecin; Tryptophan Fig. 1
Absorptionsmaximum:

280 nm: E^^% _cm = 45,2

IR-Spektrum:

290 nm: Schulter E^_cm Fig. 2
Absorptionen (cm~ ) 3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700.

Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 B hat als Chlorwasserstoffsalz die folgenden Eigenschaften:

Aussehen:
Schmelzpunkt:
spezifische Drehung: Elementaranalyse:

konstituierende Aminosäuren:

UV-Absorptionsspektrum: weißes bis blaßgelbes Pulver kein klarer Schmelzpunkt [cc]jp -26°(C:0,5; pH: 7,5 Wasser) (gefunden)

C 51,10%; H 6,34%; 0 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08% Asparaginsäure; Threonin, Glutaminsäure; Prolin; Glycin; Valin; Phenylalanin; Tryptophan Fig. 3
Absorptionsmaximum:

280 nm: ^

^Ei^/Ucm = ⁴⁴'⁸

290 nm: Schulter E

1% 1 cm

= 37,3

1 OAoüb

IR-Spektrum: Fig. 4 *

Absorptionen (cm~ )

3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700.

Es ist den Erfindern gelungen, bei der Kultivierung eines zur Gattung Actinomadura gehörenden Mikroorganismus, der von den Erfindern isoliert wurde, antibiotische Substanzen herzustellen und anzureichern sowie die antibiotischen Substanzen abzutrennen. Im Hinblick auf die physiochemischen Eigenschaften werden die Antibiotika der vorliegenden Erfindung als schwefelhaltige Peptid-Antibiotika angesehen. Die Antibiotika unterscheiden sich jedoch von Thiopeptin, Thiostrepton, Taitomycin, Siomycin, Pepthiomycin, Gardimycin, Kobenomycin, Leucinamycin, Macromomycin und Neocarzinostatin. Die Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind neue Antibiotika, die als Actinomadura-L-31 bezeichnet werden und die bei der Herstellung als Gemisch von L-31 A und L-31 B anfallen.

Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 kann durch Kultivieren von L-31 produzierenden Mikroorganismen der Gattung Actinomadura und Abtrennen des L-31 aus dem Kulturmedium hergestellt werden. Bei den für die Herstellung von Actinomadura-L-31 verwendeten Mikroorganismen kann es sich um alle Mikroorganismen der Gattung Actinomadura handeln, die eine L-31-Bildungsfunktion aufweisen. Besonders bevorzugt wird die Verwendung des Stamms Actinomadura sp. L-31» der im Fermentation Research Institute of Japan als FERM-5324 hinterlegt und bei American Type Culture Collection als ATCC Nr. 31793 hinterlegt worden ist und von den Erfindern erstmals isoliert wurde.

Der Mikroorganismenstamm Actinomadura sp. L-31, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat echtes Substratmycel und Luftmycel. Der Stamm bildet eine Kette von Sporen, jedoch weder Sporangium noch Pianosporen in seinem Sporophor. Der Stamm hat aerobe und mesophile Eigenschaften. Die diagnostischen Komponenten des Gesamtzellhydrolysats von Actinomadura sp. L-31-Stamm enthalten meso-Diaminopimelinsäure, 3-o-Methylgalactose und Galactose. Es ist jedoch keine L,L-Diaminopimelinsäure, Arabinose und Xylose enthalten. Es wird angenommen, daß es sich bei Actinomadura Sp. L-31 um einen Stamm der Gattung Actinomadura in der Ordnung Actinomycetales handelt. Der Actinomadura sp. L-31-Stamm weist folgende charakteristische Eigenschaften auf.

(i) Morphologische Charakteristik^

Das Substramycel ist gut entwickelt und verzweigt und bildet keine echten Sporen. Das Substratmycel hat einen Durchmesser von etwa 0,5 /um und bildet keine zickzack-verzweigte Form. Das Mycel verursacht keine Fragmentierung und umfaßt somit keine bazillären oder coccoiden Elemente, die bei der statischen Kultur in einem flüssigen Medium, wie Trypton-Hefe-Extrakt-Brühemedium, bei 28⁰C während 2 Wochen zu einer Trübung des flüssigen Mediums führen würden. Das Luftmycel verursacht ein mäßiges oder stärkeres Anhaften in Stärkeagar-Medium, Glycerin-Calciummalatagar und Glucoseasparaginagar plus Hefeextrakt. Das führt zu einem pulvrigen, hellgräulich-blauen Aussehen des Luftmycels. Bei der Untersuchung unter dem Mikroskop zeigen sich gutentwickelte, gerade oder zickzackförmige lange Achsen und kurze Sporophoren, die gegenüberliegend oder alternierend verzweigt sind. Es finden sich jedoch keine echten Verticile. Das Sporophor bildet eine kurze Kette von.Sporen mit 15 oder weniger in einer Haken-, Schleifen- oder Wellenform. Es bildet jedoch keine echte Spiralform in den oben erwähnten

Agarmedien oder in Tyrosinagarmedium, Hefeextrakt-Malzextrat-Agarmedium und Weizenmehlagarmedium. Die Spore hat eine längliche (rechteckige) Form mit den Abmessungen von etwa 0,8 /um χ 1,2/um. Sie hat eine warzige Oberfläche und klare Grenzlinien, jedoch kein Sporangium, Pseudosporangium, Sclerotium, Coremium und Planospor.

(II) Kultivierungscharakteristika

Die Tests werden durchgeführt gemäß dem Test, der von E.B. Shirling et al., Int. J. Syst. Bateriol, Band 16, Seiten 313-3^0 (1966), beschrieben wurde, und zwar zusammen mit zusätzlichen, bekannten Tests unter Verwendung bekannter Medien.

Die Farbe wird unter der Standardlichtquelle einer Xenonlampe bestimmt. Dabei werden als Farbstandards diejenigen des Color Harmony Manual Fourth edition (Container Corporation of America, Chicago, 1958), verwendet. Bei Auffinden der korrespondierenden Farbtafeln werden jeweils die dort angegebenen allgemeinen Namen wiedergegeben; diese allgemeinen Namen werden jedoch im Verlauf der Beschreibung nicht wiederholt. Der Farbtafel-Code des Color Harmony Manual ist jeweils in Klammern angegeben.

Die nachfolgende Zusammenstellung der Daten zeigt die Wachstumsbedingungen bei der Kultivierung in dem jeweiligen Medium bei 28⁰C während eines Monats, falls nichts anderes angegeben ist.

(1) Saccharose-Nitratagar(Difco-Bacto)-Medium Wachstum dünn, teilweise einigermaßen gut

Farbe der Oberfläche: farblos bis Lt. Apricot (4 ea). Keine Farbänderung in 0,05N wäßr. HCl oder 0,05N wäßr. NaOH

Luftmycel keines

lösliches Pigment keines

(2) Glucose-Asparaginagarmedium

Wachstum mäßig; Farbe: bamboo, buff, straw,

wheat (2fb)

Luftmycel keines (mit bloßem Auge betrach

tet)

lösliches Pigment keines

(3) Glycerin-Asparaginagarmedium (ISP-5, Difco-Bacto) Wachstum im wesentlichen keines

Luftmycel keines (mit bloßem Auge betrach

tet)

lösliches Pigment keines

(4) Stärke-Agarmedium (ISP-4 Difco-Bacto)

Wachstum mäßig; im wesentlichen farblos

Luftmycel pulvrig, gut, Haze Blue (13 ec)

lösliches Pigment keines Sonstiges bemerkenswert schwache Hydrolyse

der Stärke: keine Auflösung von

Calciumcarbonat

(5) Tyrosinagarmedium (ISP-7 Difco-Bacto)

Wachstum gut: geringfügig spreitend,(4 ea)

(keine Farbänderung in einer Säure oder einer Base)

Luftmycel mäßig, pulverförmig, Farbe: flesh

pink, pale pink, petal pink, shell pink (6 ca)

lösliches Pigment keines

Sonstiges keine Bildung von melanoiden

Pigmenten

(6) Nähragarmedium (Difco-Bacto)

Wachstum mäßig; cremefarben

Luftmycel gering, punktförmig; weiß

lösliches Pigment keines

(7) Hefeextrakt-Malzextrakt.-Agarmedium (lSP-2 Difco-Bacto) Wachstum mäßig bis gut; Farbe: Lt.Tan(3 gc) Luftmycel gut, pulvrig, Farbe: dusty white lösliches Pigment keines

(8) Hafermehlagarmedium (lSP-3)

Wachstum gut, flach spreitend, perlen-

förmig; Farbe: shell tint (3 ba)

Luftmycel gut, pulvrig; Farbe: alabaster

tint like (13 ba)

lösliches Pigment keines

(9) Glycerin-Calciummalat-Agarmedium

Wachstum mäßig, flach; Farbe: ivory like

(3 db) Luftmycel mäßig, pulvrig; Farbe: dusty blue,

Lt. gray blue, mist blue (16 ge) lösliches Pigment keines Sonstiges keine Auflösung des Calciummalats

(10) Glucose-Asparagin-Agarmedium mit 0,2% Hefeextraktzusatz Wachstum mäßig; Farbe: camel, maple sugar

tan (3 ie) oder bluish gray Luftmycel mäßig oder gut, pulvrig, farbe:

claud blue (15 cb) lösliches Pigment leuchtendbraun (bright brown)

(III) Physiologische und biochemische Charakteristika

(1) Temperaturbereich (Glucose-Asparagin-Agarmedium mit 0,2% Hefeextraktzusatz; 2 Wochen) optimale Temperatur 28 bis 35°C Nicht-Wachstums-Temperatur:obere Grenze 40⁰C, untere Grenze

16°C

(2) Versuch der Verflüssigung von Glucose-Pepton-Gelatine (26⁰C); 1 Monat) positiv

3 Ί 04886 j. - 40*

(3) Hydrolyse von Stärke (Stärkeagarmedium, ISP-4 I-IK-

Reaktion)ί negativ bis schwach positiv

(slight)

(4) Koagulation und Peptonisation von Magermilch (37⁰C):

keine Koagulation, im wesentlichen Peptonisation

(5) Bildung von Melanin: negativ in Trypton-Hefeextraktbrühe, Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agarmedium oder Tyrosin-Agarmedium:

in Melaninbildungs-Agarmedium bei 28⁰C negativ nach einer Woche, geringfügig positiv nach 2 Wochen (rötlichbraun); positiv nach 3 Wochen (braun)

(6) Löslichkeit von xanthin, Hypoxanthin, Adenin, Tyrosin:

positiv: Tyrosin, Hypoxanthin; negativ: Adenin, Xanthin

(7) NaCl-Toleranz (Bennet's Agarmedium + O, 4, 7, 10, 13%

^NaC1)^: Wachstum bis zu h-%

kein Wachstum bei 7%.

(IV) Kohlen.«;· ifquellenausnutzung (Pridham and Gottlieb's basal ageτ medium, ISP-9, Difco-Bacto; C-2 Agarmedium): positiv D-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose,

L-Rhamnose negativ D-Fructose, Saccharose, i-Inosit,

Raffinose, D-Mannit, Salicin.

Die gleichen Ergebnisse erhält man unabhängig von der Art der Basismedien und der Zugabe oder Nicht-Zugabe von Vitaminen B (0,5 mg Thiamin-HCl, 0,5 mg Riboflavin, 0,5 mg Niacin, 0,5 mg Pyridoxin-HCl, 0,5 mg i-Inosit,- 0,5 mg Ca-Pantothenat, 0,5 mg PABA und 0,25 mg Biotin in 1 1).

- γ- Λ*

(V) Diagnostische Komponenten des Gesamtzellhydrolysats

Die diagnostischen Komponenten enthalten meso-Diaminopimelinsäure, 3-O-Methyl-D-galactose und Galactose, jedoch enthalten sie nicht ^!.-Diaminopimelinsäure, 3-Hydroxydiaminopimelinsäure, Arabinose und Xylose.

Gemäß dem Stand der Technik umfassen die bekannten Stämme der Gattung Actinomadura mit taxonomen Charakteristika:

Actinomadura verrucosospora: Nonomura und Ohara 1971 (Hakko Kogaku 42, 11, Seite 904, 1971); Actinomadura eitrea:Lavrova et al., 1972 (Antibiotiki V7, 11,

Actinomadura coerulea: Preobrazhenskaya et al., 1975 (Antibiotiki 20, 5, Seite 404, 1975); Actinomadura luteofluorescens: (Shinobu) Preobrazhenskaya et al. (Microbiologa 44, S. 524, 1975).

In Actinomycetes and Related Microorganisms 1j2, 1, Seite 30, 1977» wurde von Preobrazhenskaya et al. beschrieben, daß die Farbe des Luftmycels auf synthetischen Medien zunächst rosa ist und sich nach Blau ändert. Andererseits ist in International J. Systematic Bacteriology I₁S» Seiten 391 bis 512, 1969, beschrieben worden, daß die Farbe des Luftmycels auf ISP-Medien gelb ist oder der roten Serie angehört und die Farbe des Substratmycels auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium gelb oder grünlich-gelb und auf Stärkeagarmedium oder dem GIycerin-Asparagin-Agarmedium rötlich-orange oder gelblich-rosa ist. Hingegen tritt beim Wachstum des Actinomadura sp. L-31-Stamm auf den ersteren Medien eine beige Farbe auf und auf den letzteren beiden Medien ist die Kultur im wesentlichen farblos. Der neue Stamm verhält sich somit ganz anders als die vorstehenden.

Der neue Stamm unterscheidet sich von den bekannten auch hinsichtlich der Kohlenstoffquellennutzung. Die bekannten

Stämme nutzen D-Fructose, Saccharose und D-Mannit, wohingegen der Actinomadura sp. L-31-Stamm diese Quellen nicht nutzt. Hierin ist einer der Unterschiede zu sehen.

Die Farbe des Luftmycels von Actinomadura citrea ist zunächst gelb und ändert sich nach Blau. Das lösliche Pigment auf synthetischen Medien ist gelb. Darin unterscheidet sich dieser Stamm von Actinomadura sp. L-31.

Bei Actinomadura verrucosospora ist die Farbe des Substratmycels auf Stärkeagarmedium und Glycerin-Asparagin-Agarmedium rosa oder orange und es bildet sich ein hellgraues Luftmycel auf dem Stärkeagarmedium. D-Fructose und D-Mannit werden genutzt. Darin besteht ein Unterschied zu dem Actinomadura sp. L-31-Stamm.

Actinomadura coerulea kann nicht identifiziert werden, da dieser Mikroorganismus nicht hinterlegt wurde.

Es ist möglich, Varianten des Stamms, die durch gewisse künstliche Variationen des Actinomadura sp. L-31-Stamms mittels Anwendung von ultravioletten Strahlen, Röntgenstrahlen, radioaktiven Strahlen und chemischen Reagentien erhalten wurden, einzusetzen.

Die Kultur kann unter Verwendung herkömmliche Kultivierungsverfahren für Actinomycetes oder unter Modifizierung derselben durchgeführt werden. Bei der industriell durchgeführten Kultivierung wird es bevorzugt, die aerobe Fermentation in einem Fermentationstank durchzuführen. Die Temperatur für die Kultivierung kann in einem Bereich liegen, der für das Wachstum des Mikroorganismus unter Bildung von Actinomadura L-31 geeignet ist. Die Temperatur liegt gewöhnlich in einem Bereich von 25 bis 35⁰C.

f- 43

Die Kulturmedien können unter Verwendung von Substanzen hergestellt werden, die für die Kultivierung von Actinomycetes eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquellen können Glucose, Dextrin, Stärke und dergl. sein. Als Stickstoffquellen kommen Weizenkeime, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Fleischextrakt und Ammoniumsulfat in Frage. Es können anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium oder Calciumsalze, einverleibt werden. Vorzugsweise wird der pH-Wert für die Kultivierung eingestellt, und zwar beispielsweise auf 5 bis 9. Das Kulturmedium umfaßt vorzugsweise 0,5 bis 20% (Gew./Vol.) der Kohlenstoffquelle und 0,5 bis 10% (Gew./Vol.) der Stickstoffquelle. Die Kultivierungszeit hängt von den Bedingungen ab und beträgt gewöhnlich 3 bis 8 Tage. Das Actinomadura L-31 ist in dem Mycel und in dem Filtrat enthalten. Abhängig von den Bedingungen der Kultivierung und der Art des Stammes, können Actinomadura-L-31 A und L-31 B in unterschiedlichen Mengen gebildet werden.

Um Actinomadura-L-31 aus dem Kultivierungsprodukt abzutrennen und zu reinigen, können herkömmliche Verfahren gewählt werden und im Hinblick auf die physikochemischen Eigenschaften des Produktes entsprechend kombiniert werden. Beispielsweise können Extraktionsverfahren mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln, das Phasentransfer-Verfahren oder die Absorptions- oder Trennchromatographie in zweckentsprechender Weise kombiniert werden.

Das Antibiotikum Actinomadura-L-31, das in dem kultivierten Produkt gebildet wurde, kann vorzugsweise folgendermaßen abgetrennt werden. Ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol und Aceton, wird dem Kultivierungsprodukt zugesetzt, um das Actinomadura-L-31 zu extrahieren. Die Mycele werden durch Filtration abgetrennt und der pH des Filtrats wird auf 2 bis 3 eingestellt. Anschließend

wird das Actinomadura-L-31 mit dem genannten organischen Lösungsmittel extrahiert. Nach dem gleichen Verfahren kann das Actinomadura-L-31 aus den Mycelen extrahiert werden. Die extrahierte Lösung wird anschließend weiterbehandelt, und zwar wird z.B. eine Lösungsmitteldestillation, eine Phasenübertragung, eine nochmalige Extraktion, eine Präzipitation oder eine Konzentrierung bis zur Trockene oder dergl. durchgeführt, um ein Gemisch von Actinomadura-L-31 A und L-31 B abzutrennen. Das Gemisch wird unter Verwendung eines zweckentsprechenden Lösungsmittels, wie Bufcanol-Essigsäure-Wasser, chromatographiert. Dabei wird die Fraktion aufgefangen, die antibiotische Aktivität gegenüber Bacillus stearothermophilus aufweist. Die Fraktion wird unter vermindertem Druck konzentriert und gegebenenfalls einer weiteren Behandlung unterworfen, um reines Actinomadura-L-31 A und L-31 B zu erhalten. Bei Actinomadura-L-31 A und L-31 B handelt es sich um schwach saure Verbindungen, die in einer freien Form getrennt werden können. Sie können auch in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes oder in der Hydrochlorid- oder Sulfat-Form getrennt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen Actinomadura-L-31 A und L-31 B haben antibiotische Wirkungen. Sie sind als Antibiotika wirksam oder können in effektiver Weise als Ausgangsmaterialien für Antibiotika verwendet werden. Obwohl die antibiotische Wirksamkeit in einem Plattentest festgestellt wurde, so hat sich doch bei einem Test zur Infektion von Mäusen mit Escherichia coli und dergl. ein ausgezeichneter Schutzeffekt herausgestellt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

70 ml eines flüssigen Mediums mit einem Gehalt an 1% Glycerin, 1% Glucose, 1% Stärke, 1% Weizenkeimen, 0,5% NZ-Amin, 0,2% Bierhefe, 0,5% Maisquellwasser und 0,2% Calciumcarbonat wird mit dem Actinomadura sp. L-31-Stamm (FERM-5324; ATCC Nr. 31793) okuliert. Durch ein Schüttelkultivierungsverfahren bei 28°C während 5 Tagen wird der Mikroorganismus kultiviert, um eine Präkulturlösung herzustellen. In einen 200 1 Fermentationstank werden 100 1 eines flüssigen Mediums mit einem Gehalt an 2% Glycerin, 2% Glucose, 2% Stärke, 1% Weizenkeimen, 0,5% NZ-Amin, 0,2% Bierhefe, 0,5% Maisquellwasser und 0,2% Calciumcarbonat gegeben und mit 1 1 der Präkulturlösung okuliert. Während 6 Tagen wird bei 28⁰C eine Kultivierung durchgeführt, und zwar unter den Bedingungen einer Lufteinsprudelrate von 100 l/min und einer Umdrehungszahl pro Minute von 250 U/min.

Nach der Kultivierung wird das Kultivierungsprodukt mit HCl auf einen pH von 2 eingestellt. Dem Kultivierungsprodukt werden 2% Diatomeenerde zugesetzt, und es wird filtriert. Anschließend wird eine Extraktion des Produkts durchgeführt, wobei man 80 1 des Filtrats ein gleiches Volumen an Butanol zusetzt. Andererseits werden die Mycele mit 80 1 eines 80% Aceton-Wasser-Lösungsmittels extrahiert. Nach dem Abdestillieren des Acetons wird die Wasserphase mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird mit der Lösungsmittelphase kombiniert, die aus dem KuIturfiltrat erhalten wurde, und das Gemisch wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird mit 10 Äthylacetat vermischt, um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 50 g eines rohen Pulvers der Mischung von Actinomadura-L-31 A und L-31 B.

2 g des rohen Pulvers werden in einer geringen Menge eines gemischten Lösungsmittels aus Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:1) aufgelöst. Mit dem genannten, gemischten Lösungsmittel wird eine Chromatographie an einer Cellulosesäule durchgeführt, wobei zunächst Actinomadura-L-31 B und daraufhin L-J51 A eluiert wird. Die Fraktionen werden aufgefangen und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird in 300 ml Butanol aufgelöst und anschließend werden 300 ml einer 1%igen Natriumbicarbonatlösung zugesetzt, um die Phasentrennung durchzuführen. Die wäßrige Phase wird mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 1,5 bis 2,0 angesäuert. Das Produkt wird mit dem gleichen Volumen Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält reines Actinomadura-L-31 A (15 mg) und L-31 B (18 mg) als Chlorwasserstoffsalze in Form eines Pulvers.

Beispiel 2

Gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 wird die Kultivierung durchgeführt und das Kultivierungsprodukt in die Mycelien und das Filtrat aufgetrennt. Die Mycelien werden nach dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt, wobei man eine konzentrierte Butanolextrakt-Lösung erhält. Andererseits wird das Filtrat auf etwa 3 1 Diaion HP-20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Ind. Ltd.) adsorbiert und der beladene Träger wird mit Wasser und anschließend mit 3 1 50%igem Methanol-Wasser gewaschen. Das Produkt wird mit 5 1 70%igem Aceton-Wasser, das einen pH von 2 bis 3 aufweist, extrahiert, wobei die aktive Fraktion aufgefangen wird. Die Fraktion wird unter vermindertem Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird mit 10 1 Butanol vermischt, um das Produkt zu extrahieren, und die Butanollösung wird mit 5 1 der Butanolextrakt-Lösung vermischt.

Die Butanollös^ng wird mit 5 1 einer 1%igen Natriumbicarbonatlösung vermischt, um die Phasentrennung durchzuführen. Die Wasserphase wird mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 2 Us 3 angesäuert und das Produkt wird mit 5 1 Butanol extrahiert. Die Butanolextrakt-LÖsung wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck bis zur Trockene konzentriert. Man erhält etwa 30 g eines rohen Gemisches von Actinomadura-L-31 A und L-31 B in Form eines Pulvers.

Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden 2 g des rohen Gemisches durch Chromatographie an Cellulose gereinigt. Man erhält reines Actinomadura-L-31 A (18 mg) und L-31 B (20 mg) als Chlorwasserstoffsalze in Form eines Pulvers.

Die Antibiotika Actinomadura-L-31 A und L-31 B haben die folgenden physikochemischen Eigenschaften.

Actinomadura-L-31 A (HydrochlorId)

(1) Aussehen weißes oder blaßgelbes Pulver

(2) Schmelzpunkt kein klarer Schmelzpunkt

(3) spezifische Drehung [⁰Oq⁵ -34^o(C: 0,5; pH; 7,5 Wasser)

(4) Löslichkeit löslich in Methanol, Äthanol,

Propanol, Butanol, Essigsäure und Dimethylformamid; unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Äther, Hexan und Wasser

(5) Stabilität relativ stabil bei pH 2 bis 8

(6) Farbreaktion positiv bei der Kaliumpermanganat-,

Ninhydrin- und Ehrlich's-Reaktion; negativ bei der Eisen( IH)-ChIorid-Reaktion

(7) Elementaranalyse C 51,71% H 6,23% 0 21,03%

N 13,94% S 5,82% Cl 1,17%

1 OA886

(8) UV-Absorptionsspektrum Fig. 1, gemessen in Methanol

Absorptionsraaximum: 280 nm (E₁^ = 45,2)

290 nm (Schulter, E^ = 38)

(9) IR-Spektrum Fig. 2, gemessen nach der KBr-

Methode; Absorptionen (cm" ): 3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700

(10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie, Rf-Wert)

Lösungsmittel Rf-Wert

mit Wasser gesättigtes Butanol 0,0

ButanolEssigsäure:Wasser (2:1:1) 0,6

ButanolEssigsäure:Wasser (4:1:1) 0,2

(11) Konstitutive Aminosäuren

(a) Das Produkt wird vor der Analyse mit 6N HCl bei 110⁰C während 17 h hydrolysiert.

Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Histidin, zwei weitere unbekannte Aminosäuren;

(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan

(12) Antimikrobielles Spektrum

In Tabelle 1 sind die Wachstumsinhibierungsdurchmesser angegeben, die nach der Plattenmethode bestimmt wurden.

Actinomadura-L-31 B (Hydrochlorid)

(1) Aussehen weiß oder blaßgelb

(2) Schmelzpunkt kein klarer Schmelzpunkt

(3) spezifische Drehung [⁰Oq⁵ -26^o(C: 0,5; pH: 7,5,Wasser)

(4) Löslichkeit löslich in Methanol, Äthanol,

Propanol, Butanol, Essigsäure und Dimethylformamid;

unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Äther, Hexan und Wasser

(5) Stabilität relativ stabil bei pH 2 bis 8

(6) Farbreaktion positiv bei der Kaliumpermanganat-,

Ninhydrin- und Ehrlich's-Reaktion; Negativ bei der Eisen(III)-chlorid-Reaktion

(7) Elementaranalyse C 51,1096 H 6,34% 0 20,75%

N 14,81% S 5,91% Cl 1,08%

(8) UV-Absorptionsspektrum Fig. 3, gemessen in Methanol

Absorptionsmaximum:

280 nm (e]^% = 44,8) ι cm ^n/

290 nm (Schulter Ei* = 37,3)

ι cm

(9) IR-Spektrum Fig. 2, gemessen nach der KBr-

—1 Methode; Absorptionen (cm ):

3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700

(10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie

Lösungsmittel Rf-Wert mit Wasser gesättigtes Butanol 0,0 Butanol:Essigsäure:Wasser (2:1:1) 0,7 Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:1) 0,5

(11) !Constitutive Aminosäuren

(a) Das Produkt wird vor der Analyse 17 h mit 6N HCl bei 110⁰C hydrolysiert.

Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Valin, Phenylalanin und zwei weitere unbekannte Aminosäuren

(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan

(12) Antimikrobielles Spektrum

Tabelle 1 Antimikrobielles Spektrum

Mikrobenstaram Wachtumsinhibitionsdurchmesserdnm)

L-51 A L-31 B 500 γ/ml 125 γ/ml 5OOy/ml 125 γ/ml

Bacillus stearothermo- philus subsp.calido- lactis C-953	21	15	23	17
Bacillus subtilis PCI 219	0	0	0	0
Escherichia coil NIHJ JC₂	0	0	0	0

(13) Obwohl mittels der Plattenmethode kein Wachsturnsinnibitionseffekt festgestellt wurde, findet man einen Schutzeffekt bei Lebewesen. Beispielsweise wird die Infektion von Mäusen mit Escherichia coil mit einer Rate von 40 bis 80% und 50 bis 100% verhindert, indem man Mäusen Actinomadura-L-31 A und L-31 B mit einer Dosis von 50 bis 100 mg intraperitoneal injiziert.

Untersuchungen von bakterieller Infektion

Zehn weibliche ICR/JCL-Mäuse (5 Wochen alt) werden als eine Gruppe verwendet. Das jeweilige Mittel wird im Falle von Actinomadura-L-31 A auf dem Wege der intraperitonealen Injektion (i.p.) mit einer Dosis von 50 mg/kg/Maus und im Falle von Actinomadura-L-31 B mit einer Dosis von 25 mg/ kg/Maus verabreicht, und zwar 3 Tage vor der Infektion mit den Bakterien. 7 Tage nach der Infektion wird die Zahl der überlebenden Mäuse bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Organismus Dosis (Zellen/Maus)	5	X	10⁸	Verbindung	(mg/kg)	Überlebens- zahl
Staphylo co ecus aureus EQP 5	2	X	10⁷	L-31 A L-31 B keine	50 25	4/10 6/10 0/10
Escherichia coli ML-4707	5	X	10?	L-31 A L-31 B keine	50 25	5/10 7/10 0/10
Pseudomonas aeruginosa IFO-2901	X	10⁷	L-31 A L-31 B keine	50 25	7/10 8/10 0/10
Proteus mirabilia CCM-680	L-31 A L-31 B keine	50 25	6/10 7/10 0/10

(14) Untersuchung der akuten Toxizität Zur Bestimmung der LDcQ-Werte werden weibliche ICR/JCL-Mäuse (5 Wochen alt) (Gewicht 22,0 +1,Og) verwendet. Der Wirkstoff wird auf dem Wege der intraperitonealen Injektion appliziert und die Ergebnisse werden nach einer Woche festgestellt. Bei Actinomadura-L-31 A ist der LDcQ-Wert größer als 300 mg/kg und bei Actinomadura-L-31 B liegt der Wert in einem'Bereich von 150 bis 250 mg/kg.

Im folgenden werden die Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Actinomadura-L-31 A;

Fig. 2 das Infrarot-Spektrum von Actinomadura-L-31 A, gemessen nach der KBr-Tablettenmethode;

Fig. 3 das Ultraviolett- Absorptionsspektrum von Actinomadura-L-31 B; und

Fig. 4 das Infrarot-Spektrum von Actinomadura-L-31 B, gemessen nach der KBr-Tablettenmethode.

Claims

Patentansprüche

1, Antibiotikum Actinomadura-L-31 A, das in Form des Hydrochloridsalzes die folgenden Eigenschaften aufweist:

Aussehen: weißes oder schwachgelbes Pulver

Schmelzpunkt: kein klarer Schmelzpunkt

spezifische Drehung: t^a^D ~34⁰(C:0,5; pH:7,5, Wasser) Elementaranalyse: (gefunden)

C 51,71% H 6,23% 0 21,03% N 13,94% S 5,82% Cl 1,17% Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Valin, Phenylalanin, Histidin, Leucin, Tryptophan Fig. 1

Absorptionsmaximum: 280 nm:E^_cra = 45_: 290 mn:
Fig. 2

Absorptionen (cm~') 3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700.

konstitutive Aminosäuren:

UV-Absorptionsspektrum:

IR-Spektrum:

Ί cm
Schulter

-1

=
2. Antibiotikum Actinomadura-L-31 B, das in Form des Hydrochloridsalzes die folgenden Eigenschaften aufweist:

Aussehen:
Schmelzpunkt:
spezifische Drehung Elementaranalyse:

konstitutive Aminosäuren: weißes bis schwachgelbes Pulver kein klarer Schmelzpunkt [oc]jp -26°(C: 0,5; pH:7,5, Wasser) (gefunden)

C 51,10% H 6,34% 0 20,75% N 14,81% S 5,91% Cl 1,08% Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan

UV-Absorptionsspektrum:

IR-Spektrum:

Fig. 3

Absorptionsmaximum: 280 nm: E^_0n = 44 8

290 nm: Schulter EJ* = 37,3

■ cm

Fig. 4

■-"1

Absorptionen (cm )

3350, 3050, 2950, 1660, 1520,

1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700.
3. Antibiotikum Actinomadura-L-31, dadurch gekennzeichnet, daß es Actinomadura-L-31 A und L-31 B gemäß den Ansprüchen 1 und 2 umfaßt.
4. Antibiotika Actinomadura-L-31 A und L-31 B gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kultivierung eines Actinomadura-Stamms mit L-31-Bildungsfunktion erhalten wurden.
5. Antibiotika Actinomadura-L-31 A und L-31 B gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kultivierung des als FERM 5324 bei Fermentation Research Institute of Japan und als ATCC Nr.31793 bei American Type Culture Collection hinterlegten Actinomadurasp. L-31 erhalten wurden.
6. Antibiotika Actinomadura-L-31 A und L-31 B gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Kultivierung eines Actinomadura-Stamms mit L-31-Bildungsfunktion und gesonderter Abtrennung von Actinomadura-L-31 A und L-31 B erhalten wurden.