DE3104886C2 - - Google Patents
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- DE3104886C2 DE3104886C2 DE3104886A DE3104886A DE3104886C2 DE 3104886 C2 DE3104886 C2 DE 3104886C2 DE 3104886 A DE3104886 A DE 3104886A DE 3104886 A DE3104886 A DE 3104886A DE 3104886 C2 DE3104886 C2 DE 3104886C2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/06—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/03—Actinomadura
Description
Die vorliegende Anmeldung betrifft die in den Patentansprüchen
1 bis 3 angegebenen Antibiotika
Actinomadura-L-31 A und Actinomadura-L-31 B.
Es sind bereits bestimmte, schwefelhaltige Peptid-Antibiotika
bekannt. Typische, bekannte, schwefelhaltige Peptid-
Antibiotika umfassen Thiopeptin [J. Antibiot, 23, 113 (1970)],
Thiostrepton [Antibiotics Annual, S. 554 (1955/56)], Taitomycin
[J. Antibiot, A 12, 1 (1959)], Siomycin [J. Antibiot,
22, 364 (1969)], Pepthiomycin [J. Antibiot, 21, 429 (1968)],
Gardimycin [J. Antibiot, 29, 501 (1976)], Kobenomycin [J. Antibiot,
21, 320 k(1968)], Leucinamycin [J. Antibiot, A 20,
194 (1967)], Macromomycin [J. Antibiot, 21, 44 (1968)] und
Neocarzinostatin [J. Antibiot, A 18, 68 (1965)].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung neuer
Actinomadura-L-31 A, B, wobei es sich um neue Antibiotika
handelt.
Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 A hat als Chlorwasserstoffsalz
folgende Eigenschaften:
Aussehen:weißes oder blaßgelbes Pulver
Schmelzpunkt:kein klarer Schmelzpunkt
spezifische Drehung:[α] -34° (C: 0,5; pH: 7,5, Wasser)
Elementaranalyse: (gefunden)
C 51,71%; H 6,23%; O 21,03%; N 13,94%; S 5,82%; Cl 1,17%
konstituierende Aminosäuren:Asparaginsäure; Glutaminsäure; Glycerin; Valin; Phenylalanin; Histidin; Leucin; Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 1
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 45,2290 nm: Schulter E = 38 IR-Spektrum:Fig. 2
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700.
C 51,71%; H 6,23%; O 21,03%; N 13,94%; S 5,82%; Cl 1,17%
konstituierende Aminosäuren:Asparaginsäure; Glutaminsäure; Glycerin; Valin; Phenylalanin; Histidin; Leucin; Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 1
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 45,2290 nm: Schulter E = 38 IR-Spektrum:Fig. 2
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700.
Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 B hat als Chlorwasserstoffsalz
die folgenden Eigenschaften:
Aussehen:weißes bis blaßgelbes Pulver
Schmelzpunkt:kein klarer Schmelzpunkt
spezifische Drehung:[α] -26° (C: 0,5; pH: 7,5 Wasser)
Elementaranalyse: (gefunden)
C 51,10%; H 6,34%; O 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08%
konstituierende Aminosäuren:Asparaginsäure; Threonin, Glutaminsäure; Prolin; Glycin; Valin; Phenylalanin; Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 3
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 44,8290 nm: Schulter E = 37,3 IR-Spektrum:Fig. 4
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700.
C 51,10%; H 6,34%; O 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08%
konstituierende Aminosäuren:Asparaginsäure; Threonin, Glutaminsäure; Prolin; Glycin; Valin; Phenylalanin; Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 3
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 44,8290 nm: Schulter E = 37,3 IR-Spektrum:Fig. 4
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700.
Es ist den Erfindern gelungen, bei der Kultivierung eines
zur Gattung Actinomadura gehörenden Mikroorganismus, der
von den Erfindern isoliert wurde, antibiotische Substanzen
herzustellen und anzureichern sowie die antibiotischen
Substanzen abzutrennen. Im Hinblick auf die physikochemischen
Eigenschaften werden die Antibiotika der vorliegenden
Erfindung als schwefelhaltige Peptid-Antibiotika angesehen.
Die Antibiotika unterscheiden sich jedoch von Thiopeptin,
Thiostrepton, Taitomycin, Siomycin, Pepthiomycin, Gardimycin,
Kobenomycin, Leucinamycin, Macromomycin und Neocarzinostatin.
Die Antibiotika der vorliegenden Erfindung
sind neue Antibiotika, die als Actinomadura-L-31 bezeichnet
werden und die bei der Herstellung als Gemisch von
L-31 A und L-31 B anfallen.
Das Antibiotikum Actinomadura-L-31 kann durch Kultivieren
eines bestimmten Mikroorganismus der Gattung Actinomadura
und Abtrennen des L-31 aus dem Kulturmedium hergestellt
werden.
Eingesetzt wird
den Stamms Actinomadura sp. L-31, der
bei American Type Culture Collection als
ATCC Nr. 31793 hinterlegt worden ist und von den Erfindern
erstmals isoliert wurde.
Der Mikroorganismenstamm Actinomadura sp. L-31, der bei
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat echtes
Substratmycel und Luftmycel. Der Stamm bildet eine Kette
von Sporen, jedoch weder Sporangium noch Planosporen in
seinem Sporophor. Der Stamm hat aerobe und mesophile Eigenschaften.
Die diagnostischen Komponenten des Gesamtzellhydrolysats
von Actinomadura sp. L-31-Stamm enthalten
meso-Diaminopimelinsäure, 3-o-Methylgalactose und Galactose.
Es ist jedoch keine L,L-Diaminopimelinsäure, Arabinose
und Xylose enthalten. Es wird angenommen, daß es sich bei
Actinomadura sp. L-31 um einen Stamm der Gattung Actinomadura
in der Ordnung Actinomycetales handelt. Der Actinomadura
sp. L-31-Stamm weist folgende charakteristische
Eigenschaften auf.
Das Substratmycel ist gut entwickelt und verzweigt und bildet
keine echten Sporen. Das Substratmycel hat einen Durchmesser
von etwa 0,5 µm und bildet keine zickzack-verzweigte
Form. Das Mycel verursacht keine Fragmentierung und umfaßt
somit keine bazillären oder coccoiden Elemente, die bei
der statischen Kultur in einem flüssigen Medium, wie
Trypton-Hefe-Extrakt-Brühemedium, bei 28°C während 2 Wochen
zu einer Trübung des flüssigen Mediums führen würden. Das
Luftmycel verursacht ein mäßiges oder stärkeres Anhaften
in Stärkeagar-Medium, Glycerin-Calciummalatagar und Glucoseasparaginagar
plus Hefeextrakt. Das führt zu einem pulvrigen,
hellgräulich-blauen Aussehen des Luftmycels. Bei der
Untersuchung unter dem Mikroskop zeigen sich gutentwickelte,
gerade oder zickzackförmige lange Achsen und kurze Sporophoren,
die gegenüberliegend oder alternierend verzweigt
sind. Es finden sich jedoch keine echten Verticile. Das
Sporophor bildet eine kurze Kette von Sporen mit 15 oder
weniger in einer Haken-, Schleifen- oder Wellenform. Es
bildet jedoch keine echte Spiralform in den oben erwähnten
Agarmedien oder in Tyrosinagarmedium, Hefeextrakt-Malzextrakt-
Agarmedium und Weizenmehlagarmedium. Die Spore
hat eine längliche (rechteckige) Form mit den Abmessungen
von etwa 0,8 µm×1,2 µm. Sie hat eine warzige Oberfläche
und klare Grenzlinien, jedoch kein Sporangium, Pseudosporangium,
Sclerotium, Coremium und Planospor.
Die Tests werden durchgeführt gemäß dem Test, der von
E. B. Shirling et al., Int. J. Syst. Bacteriol, Band 16,
Seiten 313-340 (1966), beschrieben wurde, und zwar zusammen
mit zusätzlichen, bekannten Tests unter Verwendung bekannter
Medien.
Die Farbe wird unter der Standardlichtquelle einer Xenonlampe
bestimmt. Dabei werden als Farbstandards diejenigen
des Color Harmony Manual Fourth edition (Container
Corporation of America, Chicago, 1958), verwendet. Bei
Auffinden der korrespondierenden Farbtafeln werden jeweils
die dort angegebenen allgemeinen Namen wiedergegeben;
diese allgemeinen Namen werden jedoch im Verlauf der Beschreibung
nicht wiederholt. Der Farbtafel-Code des Color
Harmony Manual ist jeweils in Klammern angegeben.
Die nachfolgende Zusammenstellung der Daten zeigt die Wachstumsbedingungen
bei der Kultivierung in dem jeweiligen
Medium bei 28°C während eines Monats, falls nichts anderes
angegeben ist.
(1) Saccharose-Nitratagar(Difco-Bacto)-Medium
Wachstumdünn, teilweise einigermaßen gut
Farbe der Oberfläche: farblos
bis Lt. Apricot (4 ea). Keine
Farbänderung in 0,05 N wäßr. HCl
oder 0,05 N wäßr. NaOH
Luftmycelkeines
lösliches Pigmentkeines
(2) Glucose-Asparaginagarmedium
Wachstummäßig; Farbe: bamboo, buff, straw,
wheat (2fb)
Luftmycelkeines (mit bloßem Auge betrachtet)
lösliches Pigmentkeines
(3) Glycerin-Asparaginagarmedium (ISP-5, Difco-Bacto)
Wachstumim wesentlichen keines
Luftmycelkeines (mit bloßem Auge betrachtet)
lösliches Pigmentkeines
(4) Stärke-Agarmedium (ISP-4 Difco-Bacto)
Wachstummäßig; im wesentlichen farblos
Luftmycelpulvrig, gut, Haze Blue (13 ec)
lösliches Pigmentkeines
Sonstigesbemerkenswert schwache Hydrolyse
der Stärke: keine Auflösung von
Calciumcarbonat
(5) Tyrosinagarmedium (ISP-7 Difco-Bacto)
Wachstumgut: geringfügig spreitend, (4 ea)
(keine Farbänderung in einer
Säure oder einer Base)
Luftmycelmäßig, pulverförmig, Farbe: flesh
pink, pale pink, petal pink, shell
pink (6 ca)
lösliches Pigmentkeines
Sonstigeskeine Bildung von melanoiden
Pigmenten
(6) Nähragarmedium (Difco-Bacto)
Wachstummäßig; cremefarben
Luftmycelgering, punktförmig; weiß
lösliches Pigmentkeines
(7) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agarmedium (ISP-2 Difco-Bacto)
Wachstummäßig bis gut; Farbe: Lt.Tan(3 gc)
Luftmycelgut, pulvrig, Farbe: dusty white
lösliches Pigmentkeines
(8) Hafermehlagarmedium (ISP-3)
Wachstumgut, flach spreitend, perlenförmig;
Farbe: shell tint (3 ba)
Luftmycelgut, pulvrig; Farbe: alabaster
tint like (13 ba)
lösliches Pigmentkeines
(9) Glycerin-Calciummalat-Agarmedium
Wachstummäßig, flach; Farbe: ivory like
(3 db)
Luftmycelmäßig, pulvrig; Farbe: dusty blue,
Lt. gray blue, mist blue (16 ge)
lösliches Pigmentkeines
Sonstigeskeine Auflösung des Calciummalats
(10) Glucose-Asparagin-Agarmedium mit 0,2% Hefeextraktzusatz
Wachstummäßig; Farbe: camel, maple sugar
tan (3 ie) oder bluish gray
Luftmycelmäßig oder gut, pulvrig, Farbe:
claud blue (15 cb)
lösliches Pigmentleuchtendbraun (bright brown)
(1) Temperaturbereich (Glucose-Asparagin-Agarmedium mit
0,2% Hefeextraktzusatz; 2 Wochen)
optimale Temperatur 28 bis 35°C
Nicht-Wachstums-Temperatur: obere Grenze 40°C, untere Grenze 16°C
optimale Temperatur 28 bis 35°C
Nicht-Wachstums-Temperatur: obere Grenze 40°C, untere Grenze 16°C
(2) Versuch der Verflüssigung von Glucose-Pepton-Gelatine
(26°C); 1 Monat)
positiv
positiv
(3) Hydrolyse von Stärke (Stärkeagarmedium, ISP-4 I-IK-
Reaktion):
negativ bis schwach positiv
negativ bis schwach positiv
(4) Koagulation und Peptonisation von Magermilch (37°C):
keine Koagulation, im wesentlichen Peptonisation
keine Koagulation, im wesentlichen Peptonisation
(5) Bildung von Melanin: negativ in Trypton-Hefeextraktbrühe,
Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agarmedium oder Tyrosin-
Agarmedium:
in Melaninbildungs-Agarmedium bei 28°C negativ nach einer Woche, geringfügig positiv nach 2 Wochen (rötlichbraun); positiv nach 3 Wochen (braun)
in Melaninbildungs-Agarmedium bei 28°C negativ nach einer Woche, geringfügig positiv nach 2 Wochen (rötlichbraun); positiv nach 3 Wochen (braun)
(6) Löslichkeit von Xanthin, Hypoxanthin, Adenin, Tyrosin:
positiv: Tyrosin, Hypoxanthin,
negativ: Adenin, Xanthin
positiv: Tyrosin, Hypoxanthin,
negativ: Adenin, Xanthin
(7) NaCl-Toleranz (Bennet's Agarmedium + 0, 4, 7, 10, 13% NaCl):
Wachstum bis zu 4%
kein Wachstum bei 7%.
Wachstum bis zu 4%
kein Wachstum bei 7%.
positivD-Glucose, L-Arabinose, D-Xylose,
L-Rhamnose
negativD-Fructose, Saccharose, i-Inosit,
Raffinose, D-Mannit, Salicin.
Die gleichen Ergebnisse erhält man unabhängig von der Art
der Basismedien und der Zugabe oder Nicht-Zugabe von Vitaminen
B (0,5 mg Thiamin-HCl, 0,5 mg Riboflavin, 0,5 mg
Niacin, 0,5 mg Pyridoxin-HCl, 0,5 mg i-Inosit, 0,5 mg Ca-
Pantothenat,
0,5 mg PABA und 0,25 mg Biotin in 1 l).
Die diagnostischen Komponenten enthalten meso-Diaminopimelinsäure,
3-O-Methyl-D-galactose und Galactose, jedoch enthalten
sie nicht L,L-Diaminopimelinsäure, 3-Hydroxydiaminopimelinsäure,
Arabinose und Xylose.
Gemäß dem Stand der Technik umfassen die bekannten Stämme
der Gattung Actinomadura mit taxonomen Charakteristika:
Actinomadura verrucosospora: Nonomura und Ohare 1971 (Hakko Kogaku 49, 11, Seite 904, 1971);
Actinomadura citrea: Lavrova et al., 1972 (Antibiotiki 17, 11, Seiten 965, 1972);
Actinomadura coerulea: Preobrazhenskaya et al., 1975 (Antibiotiki 20, 5, Seite 404, 1975);
Actinomadura luteofluorescens: (Shinobu) Preobrazhenskaya et al. (Microbiologa 44, S. 524, 1975).
Actinomadura verrucosospora: Nonomura und Ohare 1971 (Hakko Kogaku 49, 11, Seite 904, 1971);
Actinomadura citrea: Lavrova et al., 1972 (Antibiotiki 17, 11, Seiten 965, 1972);
Actinomadura coerulea: Preobrazhenskaya et al., 1975 (Antibiotiki 20, 5, Seite 404, 1975);
Actinomadura luteofluorescens: (Shinobu) Preobrazhenskaya et al. (Microbiologa 44, S. 524, 1975).
In Actinomycetes and Related Microorganisms 12, 1, Seite 30,
1977, wurde von Preobrazhenskaya et. al. beschrieben,
daß die Farbe des Luftmycels auf synthetischen Medien zunächst
rosa ist und sich nach Blau ändert. Andererseits
ist in International J. Systematic Bacteriology 19, Seiten
391 bis 512, 1969, beschrieben worden, daß die Farbe des
Luftmycels auf ISP-Medien gelb ist oder der rote Serie
angehört und die Farbe des Substratmycels auf Hefeextrakt-
Malzextrakt-Agarmedium gelb oder grünlich-gelb und auf
Stärkeagarmedium oder dem Glycerin-Asparagin-Agarmedium
rötlich-orange oder gelblich-rose ist. Hingegen tritt beim
Wachstum des Actinomadura sp. L-31-Stamm auf den ersteren
Medien eine beige Farbe auf und auf den letzteren beiden
Medien ist die Kultur im wesentlichen farblos. Der neue
Stamm verhält sich somit ganz anders als die vorstehenden.
Der neue Stamm unterscheidet sich von den bekannten auch
hinsichtlich der Kohlenstoffquellennutzung. Die bekannten
Stämme nutzen D-Fructose, Saccharose und D-Mannit, wohingegen
der Actinomadura sp. L-31-Stamm diese Quellen nicht
nutzt. Hierin ist einer der Unterschiede zu sehen.
Die Farbe des Luftmycels von Actinomadura citrea ist zunächst
gelb und ändert sich nach blau. Das lösliche Pigment
auf synthetischen Medien ist gelb. Darin unterscheidet
sich dieser Stamm von Actinomadura sp. L-31.
Bei Actinomadura verrucosospora ist die Farbe des Substratmycels
auf Stärkeagarmedium und Glycerin-Asparagin-Agarmedium
rosa oder orange und es bildet sich ein hellgraues
Luftmycel auf dem Stärkeagarmedium. D-Fructose und D-Mannit
werden genutzt. Darin besteht ein Unterschied zu dem
Actinomadura sp. L-31-Stamm.
Actinomadura coerulea kann nicht identifiziert werden, da
dieser Mikroorganismus nicht hinterlegt wurde.
Die Kultur kann unter Verwendung herkömmlicher Kultivierungsverfahren
für Actinomycetes oder unter Modifizierung derselben
durchgeführt werden. Bei der industriell durchgeführten
Kultivierung wird es bevorzugt, die aerobe Fermentation
in einem Fermentationstank durchzuführen. Die
Temperatur für die Kultivierung kann in einem Bereich liegen,
der für das Wachstum des Mikroorganismus unter Bildung
von Actinomadura L-31 geeignet ist. Die Temperatur
liegt gewöhnlich in einem Bereich von 25 bis 35°C.
Die Kulturmedien können unter Verwendung von Substanzen
hergestellt werden, die für die Kultivierung von Actinomycetes
eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquellen können
Glucose, Dextrin, Stärke und dgl. sein. Als Stickstoffquellen
kommen Weizenkeime, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser,
Fleischextrakt und Ammoniumsulfat in Frage. Es
können anorganische Salze, wie Natrium-, Kalium- oder
Calciumsalze, einverleibt werden. Vorzugsweise wird der pH-
Wert für für Kultivierung eingestellt, und zwar beispielsweise
auf 5 bis 9. Das Kulturmedium umfaßt vorzugsweise
0,5 bis 20% (Gew./Vol.) der Kohlenstoffquelle und 0,5
bis 10% (Gew./Vol.) der Stickstoffquelle. Die Kultivierungszeit
hängt von den Bedingungen ab und beträgt gewöhnlich
3 bis 8 Tage. Das Actinomadura L-31 ist in dem Mycel
und in dem Filtrat enthalten. Abhängig von den Bedingungen
der Kultivierung und der Art des Stammes, können
Actinomadura-L-31 A und L-31 B in unterschiedlichen Mengen
gebildet werden.
Um Actinomadura-L-31 aus dem Kultivierungsprodukt abzutrennen
und zu reinigen, können herkömmliche Verfahren gewählt
werden und im Hinblick auf die physikochemischen
Eigenschaften des Produktes entsprechend kombiniert werden.
Beispielsweise können Extraktionsverfahren mit verschiedenen
organischen Lösungsmitteln, das Phasentransfer-Verfahren
oder die Absorptions- oder Trennchromatographie in
zweckentsprechender Weise kombiniert werden.
Das Antibiotikum Actinomadura-L-31, das in dem kultivierten
Produkt gebildet wurde, kann vorzugsweise folgendermaßen
abgetrennt werden. Ein organisches Lösungsmittel, wie
Methanol, Äthanol und Aceton, wird dem Kultivierungsprodukt
zugesetzt, um das Actinomadura-L-31 zu extrahieren.
Die Mycele werden durch Filtration abgetrennt und der pH
des Filtrats wird auf 2 bis 3 eingestellt. Anschließend
wird das Actinomadura-L-31 mit dem genannten organischen
Lösungsmittel extrahiert. Nach dem gleichen Verfahren kann
das Actinomadura-L-31 aus den Mycelen extrahiert werden.
Die extrahierte Lösung wird anschließend weiterbehandelt,
und zwar wird z. B. eine Lösungsmitteldestillation, eine
Phasenübertragung, eine nochmalige Extraktion, eine Präzipitation
oder eine Konzentrierung bis zur Trockene oder
dgl. durchgeführt, um ein Gemisch von Actinomadura-L-31 A
und L-31 B abzutrennen. Das Gemisch wird unter Verwendung
eines zweckentsprechenden Lösungsmittels, wie Butanol-
Essigsäure-Wasser, chromatographiert. Dabei wird die Fraktion
aufgefangen, die antibiotische Aktivität gegenüber
Bacillus stearothermophilus aufweist. Die Fraktion wird
unter vermindertem Druck konzentriert und gegebenenfalls
einer weiteren Behandlung unterworfen, um reines Actinomadura-
L-31 A und L-31 B zu erhalten. Bei Actinomadura-
L-31 A und L-31 B handelt es sich um schwach saure Verbindungen,
die in einer freien Form getrennt werden können.
Sie können auch in Form des Natrium- oder Kaliumsalzes
oder in der Hydrochlorid- oder Sulfat-Form getrennt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen Actinomadura-L-31 A und
L-31 B haben antibiotische Wirkungen. Sie sind als Antibiotika
wirksam oder können in effektiver Weise als Ausgangsmaterialien
für Antibiotika verwendet werden. Obwohl
die antibiotische Wirksamkeit in einem Plattentest festgestellt
wurde, so hat sich doch bei einem Test zur Infektion
von Mäusen mit Escherichia coli und dgl. ein
ausgezeichneter Schutzeffekt herausgestellt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen
näher erläutert.
70 ml eines flüssigen Mediums mit einem Gehalt an 1%
Glycerin, 1% Glucose, 1% Stärke, 1% Weizenkeimen, 0,5%
NZ-Amin, 0,2% Bierhefe, 0,5% Maisquellwasser und 0,2%
Calciumcarbonat wird mit dem Actinomadura sp. L-31-Stamm
(ATCC Nr. 31793) okuliert. Durch ein Schüttelkultivierungsverfahren
bei 28°C während 5 Tagen wird
der Mikroorganismus kultiviert, um eine Präkulturlösung
herzustellen. In einen 200 l Fermentationstank werden
100 l eines flüssigen Mediums mit einem Gehalt an 2%
Glycerin, 2% Glucose, 2% Stärke, 1% Weizenkeimen, 0,5%
NZ-Amin, 0,2% Bierhefe, 0,5% Maisquellwasser und
0,2% Calciumcarbonat gegeben und mit 1 l der Präkulturlösung
okuliert. Während 6 Tagen wird bei 28°C eine Kultivierung
durchgeführt, und zwar unter den Bedingungen
einer Lufteinsprudelrate von 100 l/min und einer Umdrehungszahl
pro Minute von 250 U/min.
Nach der Kultivierung wird das Kultivierungsprodukt mit
HCl auf einen pH von 2 eingestellt. Dem Kultivierungsprodukt
werden 2% Diatomeenerde zugesetzt, und es wird
filtriert. Anschließend wird eine Extraktion des Produkts
durchgeführt, wobei man 80 l des Filtrats ein gleiches
Volumen an Butanol zusetzt. Andererseits werden die Mycele
mit 80 l eines 80% Aceton-Wasser-Lösungsmittels extrahiert.
Nach dem Abdestillieren des Acetons wird die Wasserphase
mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird mit der
Lösungsmittelphase kombiniert, die aus dem Kulturfiltrat
erhalten wurde, und das Gemisch wurde unter vermindertem
Druck konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird mit 10 l
Äthylacetat vermischt, um ein Präzipitat zu bilden. Das
Präzipitat wird abfiltriert und unter vermindertem Druck
getrocknet. Man erhält 50 g eines rohen Pulvers der Mischung
von Actinomadura-L-31 A und L-31 B.
2 g des rohen Pulvers werden in einer geringen Menge eines
gemischten Lösungsmittels aus Butanol-Essigsäure-
Wasser (4 : 1 : 1) aufgelöst. Mit dem genannten, gemischten
Lösungsmittel wird eine Chromatographie an einer Cellulosesäule
durchgeführt, wobei zunächst Actinomadura-L-31 B
und daraufhin L-31 A eluiert wird. Die Fraktionen werden
aufgefangen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Der Rückstand wird in 300 ml Butanol aufgelöst und anschließend
werden 300 ml einer 1%igen Natriumbicarbonatlösung
zugesetzt, um die Phasentrennung durchzuführen. Die wäßrige
Phase wird mit Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 1,5
bis 2,0 angesäuert. Das Produkt wird mit dem gleichen Volumen
Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird mit Wasser
gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält
reines Actinomadura-L-31 A (15 mg) und L-31 B (18 mg)
als Chlorwasserstoffsalze in Form eines Pulvers.
Gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 wird die Kultivierung
durchgeführt und das Kultivierungsprodukt in die Mycelien
und das Filtrat aufgetrennt. Die Mycelien werden nach
dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt, wobei man eine
konzentrierte Butanolextrakt-Lösung erhält. Andererseits
wird das Filtrat auf etwa 3 l Diaion HP-20
adsorbiert und der beladene
Träger wird mit Wasser und anschließend mit 3 l
50%igem Methanol-Wasser gewaschen. Das Produkt wird mit
5 l 70%igem Aceton-Wasser, das einen pH von 2 bis 3 aufweist,
extrahiert, wobei die aktive Fraktion aufgefangen
wird. Die Fraktion wird unter vermindertem Druck konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wird mit 10 l Butanol
vermischt, um das Produkt zu extrahieren, und die Butanollösung
wird mit 5 l der Butanolextrakt-Lösung vermischt.
Die Butanollösung wird mit 5 l einer 1%igen Natriumbicarbonatlösung
vermischt, um die Phasentrennung durchzuführen.
Die Wasserphase wird mit Chlorwasserstoffsäure auf einen
pH von 2 bis 3 angesäuert und das Produkt wird mit 5 l
Butanol extrahiert. Die Butanolextrakt-Lösung wird mit
Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck bis zur
Trockene konzentriert. Man erhält etwa 30 g eines rohen
Gemisches von Actinomadura-L-31 A und L-31 in Form eines
Pulvers.
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 werden 2 g des rohen
Gemisches durch Chromatographie an Cellulose gereinigt.
Man erhält reines Actinomadura-L-31 A (18 mg) und L-31 B
(20 mg) als Chlorwasserstoffsalze in Form eines Pulvers.
Die Antibiotika Actinomadura-L-31 A und L-31 B haben die
folgenden physikochemischen Eigenschaften.
Actinomadura-L-31 A (Hydrochlorid)
(1) Aussehenweißes oder blaßgelbes Pulver
(2) Schmelzpunktkein klarer Schmelzpunkt
(3) spezifische Drehung[α] -34° (C: 0,5; pH: 7,5 Wasser)
(4) Löslichkeitlöslich in Methanol, Äthanol,
Propanol, Butanol, Essigsäure und
Dimethylformamid; unlöslich in
Äthylacetat, Chloroform, Äther,
Hexan und Wasser
(5) Stabilitätrelativ stabil bei pH 2 bis 8
(6) Farbreaktionpositiv bei der Kaliumpermanganat-,
Ninhydrin- und Ehrlich's-Reaktion;
negativ bei der Eisen(III)-chlorid-
Reaktion
(7) ElementaranalyseC 51,71%; H 6,23%; O 21,03%;
N 13,94%; S 5,82%; Cl 1,17%
(8) UV-AbsorptionsspektrumFig. 1, gemessen in Methanol
Absorptionsmaximum:280 nm: (E = 45,2)290 nm: (Schulter, E = 38) (9) IR-SpektrumFig. 2, gemessen nach der KBr- Methode; Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700 (10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie, Rf-Wert)
Absorptionsmaximum:280 nm: (E = 45,2)290 nm: (Schulter, E = 38) (9) IR-SpektrumFig. 2, gemessen nach der KBr- Methode; Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700 (10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie, Rf-Wert)
LösungsmittelRf-Wert
mit Wasser gesättigtes Butanol0,0
Butanol : Essigsäure : Wasser (2 : 1 : 1)0,6
Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 1)0,2
(11) Konstitutive Aminosäuren
(a) Das Produkt wird vor der Analyse mit 6N HCl bei 110°C während 17 h hydrolysiert.
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Histidin, zwei weitere unbekannte Aminosäuren;
(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan
(a) Das Produkt wird vor der Analyse mit 6N HCl bei 110°C während 17 h hydrolysiert.
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Valin, Leucin, Phenylalanin, Histidin, zwei weitere unbekannte Aminosäuren;
(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan
(12) Antimikrobielles Spektrum
In Tabelle 1 sind die Wachstumsinhibierungsdurchmesser angegeben, die nach der Plattenmethode bestimmt wurden.
In Tabelle 1 sind die Wachstumsinhibierungsdurchmesser angegeben, die nach der Plattenmethode bestimmt wurden.
Actinomadura-L-31 B (Hydrochlorid)
(1) Aussehenweiß oder blaßgelb
(2) Schmelzpunktkein klarer Schmelzpunkt
(3) spezifische Drehung[α] -26° (C: 0,5; pH: 7,5, Wasser)
(4) Löslichkeitlöslich in Methanol, Äthanol,
Propanol, Butanol, Essigsäure
und Dimethylformamid;
unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Äther, Hexan und Wasser (5) Stabilitätrelativ stabil bei pH 2 bis 8 (6) Farbreaktionpositiv bei der Kaliumpermanganat-, Ninhydrin- und Ehrlich's-Reaktion;
negativ bei der Eisen(III)- chlorid-Reaktion (7) ElementaranalyseC 51,10%; H 6,34%; O 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08% (8) UV-AbsorptionsspektrumFig. 3, gemessen in Methanol
Absorptionsmaximum:280 nm: (E = 44,8)290 nm: (Schulter E = 37,3) (9) IR-SpektrumFig. 4, gemessen nach der KBr- Methode; Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700 (10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie
unlöslich in Äthylacetat, Chloroform, Äther, Hexan und Wasser (5) Stabilitätrelativ stabil bei pH 2 bis 8 (6) Farbreaktionpositiv bei der Kaliumpermanganat-, Ninhydrin- und Ehrlich's-Reaktion;
negativ bei der Eisen(III)- chlorid-Reaktion (7) ElementaranalyseC 51,10%; H 6,34%; O 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08% (8) UV-AbsorptionsspektrumFig. 3, gemessen in Methanol
Absorptionsmaximum:280 nm: (E = 44,8)290 nm: (Schulter E = 37,3) (9) IR-SpektrumFig. 4, gemessen nach der KBr- Methode; Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1440, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700 (10) Silikagel-Dünnschichtchromatographie
LösungsmittelRf-Wert
mit Wasser gesättigtes Butanol0,0
Butanol : Essigsäure : Wasser (2 : 1 : 1)0,7
Butanol : Essigsäure : Wasser (4 : 1 : 1)0,5
(11) Konstitutive Aminosäuren
(a) Das Produkt wird vor der Analyse 17 h mit 6N HCl bei 110°C hydrolysiert.
Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Proplin, Glycin, Valin, Phenylalanin und zwei weitere unbekannte Aminosäuren
(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan
(a) Das Produkt wird vor der Analyse 17 h mit 6N HCl bei 110°C hydrolysiert.
Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Proplin, Glycin, Valin, Phenylalanin und zwei weitere unbekannte Aminosäuren
(b) Analyse des UV-Spektrums: Tryptophan
(12) Antimikrobielles Spektrum
In Tabelle 1 sind die Wachstumsinhibierungsdurchmesser angegeben, die nach der Plattenmethode bestimmt wurden.
In Tabelle 1 sind die Wachstumsinhibierungsdurchmesser angegeben, die nach der Plattenmethode bestimmt wurden.
(13) Obwohl mittels der Plattenmethode kein Wachstumsinhibitionseffekt
festgestellt wurde, findet man einen Schutzeffekt
bei Lebewesen. Beispielsweise wird die Infektion
von Mäusen mit Escherichia coli mit einer Rate von 40 bis
80% und 50 bis 100% verhindert, indem man Mäusen Actinomadura-
L-31 A und L-31 B mit einer Dosis von 50 bis 100 mg
intraperitoneal injiziert.
Zehn weibliche ICR/JCL-Mäuse (5 Wochen alt) werden als eine
Gruppe verwendet. Das jeweilige Mittel wird im Falle von
Actinomadura-L-31 A auf dem Wege der intraperitonealen Injektion
(i. p.) mit einer Dosis von 50 mg/kg/Maus und im
Falle von Actinomadura-L-31 B mit einer Dosis von 25 mg/
kg/Maus verabreicht, und zwar 3 Tage vor der Infektion
mit den Bakterien. 7 Tage nach der Infektion wird die Zahl
der überlebenden Mäuse bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 aufgeführt.
(14) Untersuchung der akuten Toxizität
Zur Bestimmung der LD₅₀-Werte werden weibliche ICR/JCL- Mäuse (5 Wochen alt) (Gewicht 22,0±1,0 g) verwendet. Der Wirkstoff wird auf dem Wege der intraperitonealen Injektion appliziert und die Ergebnisse werden nach einer Woche festgestellt. Bei Actinomadura-L-31 A ist der LD₅₀-Wert größer als 300 mg/kg und bei Actinomadura-L-31 B liegt der Wert in einem Bereich von 150 bis 250 mg/kg.
Zur Bestimmung der LD₅₀-Werte werden weibliche ICR/JCL- Mäuse (5 Wochen alt) (Gewicht 22,0±1,0 g) verwendet. Der Wirkstoff wird auf dem Wege der intraperitonealen Injektion appliziert und die Ergebnisse werden nach einer Woche festgestellt. Bei Actinomadura-L-31 A ist der LD₅₀-Wert größer als 300 mg/kg und bei Actinomadura-L-31 B liegt der Wert in einem Bereich von 150 bis 250 mg/kg.
Im folgenden werden die Zeichnungen näher erläutert; es
zeigt
Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von
Actinomadura-L-31 A;
Fig. 2 das Infrarot-Spektrum von Actinomadura-L-
31 A, gemessen nach der KBr-Tablettenmethode;
Fig. 3 das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von
Actinomadura-L-31 B; und
Fig. 4 das Infrarot-Spektrum von Actinomadura-L-
31 B, gemessen nach der KBr-Tablettenmethode.
Claims (4)
1. Antibiotikum Actinomadura-L-31,
dadurch gekennzeichnet, daß es
Actinomadura-L-31 A und Actinomadura-L-31 B umfaßt, wobei
- (a) Actinomadura-L-31 A in Form des Hydrochloridsalzes
die folgenden Eigenschaften
Aussehen:weißes oder schwachgelbes Pulver
Schmelzpunktkein klarer Schmelzpunkt
spezifische Dehnung:[α] -34° (C: 0,5; pH: 7,5, Wasser)
Elementaranalyse: (gefunden)
C 51,71%; H 6,23%; O 21,03%; N 13,94%; S 5,82%; Cl 1,17%
konstitutive Aminosäuren:Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycerin, Valin, Phenylalanin, Histidin, Leucin, Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 1
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 45,2290 nm: Schulter E = 38 IR-Spektrum:Fig. 2
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1530, 1430, 1395, 1340, 1255, 1235, 1100, 745, 700,
und
- (b) Actinomadura-L-31 B in Form des Hydrochloridsalzes
die folgenden Eigenschaften aufweist:
Aussehen:weißes bis schwachgelbes Pulver
Schmelzpunktkein klarer Schmelzpunkt
spezifische Dehnung:[α] -26° (C: 0,5; pH: 7,5, Wasser)
Elementaranalyse: (gefunden)
C 51,10%; H 6,34%; O 20,75%; N 14,81%; S 5,91%; Cl 1,08%
konstitutive Aminosäuren:Asparaginsäure, Threonin, Glutaminsäure, Prolin, Glycerin, Valin, Phenylalanin, Tryptophan UV-Absorptionsspektrum:Fig. 3
Absorptionsmaximum:280 nm: E = 44,8290 nm: Schulter E = 37,3 IR-Spektrum:Fig. 4
Absorptionen (cm-1)
3350, 3050, 2950, 1660, 1520, 1430, 1390, 1340, 1260, 1230, 1100, 745, 700,und die Fig. 1 bis 4 Bestandteil dieses Anspruchs sind.
2. Actinomadura-L-31 A gemäß Anspruch 1.
3. Actinomadura-L-31 B gemäß Anspruch 1.
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