DE3013246C2

DE3013246C2 -

Info

Publication number: DE3013246C2
Application number: DE3013246A
Authority: DE
Inventors: Bruno Cavalleri; Hermes Pagani; Giancarlo Mailand/Milano It Volpe
Original assignee: GRUPPO LEPETIT SpA MAILAND/MILANO IT
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1979-04-07
Filing date: 1980-04-03
Publication date: 1987-11-19
Also published as: JPS6320514B2; AU5903680A; CA1142866A; JPS6251274B2; NL192989B; NL8001982A; MX5958E; FR2452931A1; IL59704A; CH655515B; SE441188B; SE8002601L; GR67279B; IT8021162A0; US4328316A; IE49327B1; LU82327A1; PT71064A; PH17230A; AU533951B2

Description

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum A/16 686, seine Salze, ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Züchtung eines neuen Stammes der Gattung Actinoplanes, sowie Arzneimittel mit einem Gehalt an dieser Verbindung (vgl. die Patentansprüche, besonders die Ansprüche 1, 3 und 5).

Das Antibiotikum A/16 686 ist ein Glycopeptid-Antibiotikum von basischem Charakter, das mit Säuren Salze bildet. Gegenstand der Erfindung sind somit auch die Salze dieses Antibiotikums und insbesondere die physiologisch bzw. pharmakologisch verträglichen Salze davon.

Der Einfachheit halber wird der Ausdruck "Antibiotikum A/16 686" für die Antibiotikum in Form der freien Base sowie für dessen Salze mit Säuren verwendet.

Das Antibiotikum A/16 686 bewirkt eine in vitro-Hemmung von bestimmten pathogenen Bakterien, insbesondere von gram-positiven Bakterien. Außerdem bewirkt eine parenterale Verabfolgung des Antibiotikums A/16 686 einen starken Schutz gegenüber experimentell hervorgerufenen Infektionen bei Mäusen.

Wie vorstehend erwähnt, wird das Antibiotikum A/16 686 durch Züchtung eines neuen Stammes der Gattung Actinoplanes gebildet. Eine Kultur dieses aus einer in Vaghalbod (Indien) gewonnenen Bodenprobe isolierten Stammes wurde am 30. Januar 1979 bei der ATCC (American Type Culture Collection), 12 301 Parklawn Drive, Rückville, Maryland 20 852, V. St. A. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 33 076 hinterlegt.

Nachstehend sind die Eigenschaften von Actinoplanes sp. ATCC 33 076 näher erläutert.

Morphologie

Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Medien unter Bildung eines orangefarbenen Substratmyzels. Er bildet kein Pigment. Luftmyzel wird nie gebildet. Bei mikroskopischer Prüfung des vegetativen Myzels erkennt man verzweigte Hyphen mit einem Durchmeser von etwa 1 µm. Sporangien werden spärlich nur auf Kartoffel-Agar gebildet und sind gewölbt mit einer sehr unregelmäßigen Oberfläche und einem Durchmesser von 5,0 bis 9,0 µm. Eine Sporangienfreisetzung wird nach einem Bruch der Sporangiumwand beobachtet. Die subsphärischen Sporen sind beweglich (1,0 bis 1,5 µm Durchmesser). Bei der Analyse der Zellwandbestandteile ergibt sich meso-Diaminopimelinsäure und ein Zuckermuster vom Typ D (vgl. Lechevalier und Mitarb., Chemical composition as a criterium in the classification of Actinomycetes, Adv. Applied Microbiology, Bd. 14 (1971), Academic Press N. Y.).

Kultureigenschaften

In Tabelle I sind die Kultureigenschaften von Actinoplanes ATCC 33 076 nach Züchtung auf verschiedenen Standardmedien gemäß Shirling und Gottlieb, (Intern. J. System. Bact., Bd. 16 (1966), S. 313 bis 340) und auf andere Medien gemäß Waksman, (The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and Wilkins Co., 1961), zusammengestellt. Die Kultureigenschaften werden nach 6- bis 14tägiger Inkubation bei 30°C bestimmt.
KulturmedienZüchtungseigenschaften

Medium Nr. 2 (Hefeextrakt-Malz-Agar)reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
hellbraun 12 H 12 Medium Nr. 3 (Hafermehl-Agar)spärliches Wachstum, dünn,
hell orangefarben 9 B 6 Medium Nr. 4 (anorganische Salze-Stärke-Agar)mäßiges Wachstum, krustige Oberfläche,
orangefarben 11 L 12 Medium Nr. 5 (Glycerin-Asparagin-Agar)spärliches Wachstum, glasklar Medium Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar)spärliches Wachstum, glasklar bis hellbraun Medium Nr. 7 (Tyrosin-Agar)spärliches Wachstum, glatte Oberfläche,
braun 5 D 11 Hafermehl-Agar (gemäß Waksman)reichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
orangefarben bis braun 12 C 10 Hickey und Tresner-Agarreichliches Wachstum, krustige Oberfläche,
orangefarben 11 G 8 Czapek-Glucose-Agarmäßiges Wachstum, krustige Oberfläche,
orangefarben 11 G 8 Glucose-Asparagin-Agarspärliches Wachstum, krustige Oberfläche,
hell-orangefarben 11 F 6 Nähragarmäßiges Wachstum, glatte Oberfläche,
orangefarben 11 G 8 Kartoffel-Agarreichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
bernsteinfarben-braun 12 E 10 Bennett-Agarreichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
orangefarben 11 C 8 Calciummalat-Agarmäßiges Wachstum, glatte Oberfläche,
hell-orangefarben 10 C 6 Magermilch-Agarreichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
orangefarben 9 C 2 Czapek-Agarmäßiges Wachstum, krustige Oberfläche,
orangefarben 10 D 7 Hühnerei-Agarmäßiges Wachstum, glatte Oberfläche,
glasklar bis hell-orangefarben Pepton-Glucose-Agarreichliches Wachstum, gerunzelte Oberfläche,
orangefarben 11 G 11 Agarsehr spärliches Wachstum,
glatte Oberfläche, glasklar Loeffler-Serumsehr spärliches Wachstum,
glatte Oberfläche, orangefarben Kartoffelnspärliches Wachstum, krustig, hellbraun Gelatinespärliches Wachstum, hellorangefarben Cellulosesehr spärliches Wachstum, dünn, glasklar

Kohlenstoffverwertung

In Tabelle II ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen gemäß dem Verfahren von Pridham und Gottlieb, J. Bact., Bd. 56 (1948), S. 107, angegeben.
KohlenstoffquellenVerwertung

Inosit- Fructose+ Rahmnose+ Mannit- Xylose+ Raffinose- Arabinose+ Cellulose- Saccharose+ Glucose+ Mannose+ Lactose- Salicin+

+ = die Kohlenstoffquelle wird verwertet
- = kein Wachstum

Physiologische Eigenschaften

In Tabelle III sind die physiologischen Eigenschaften des erfindungsgemäß verwendeten Stammes angegeben.

Zur Bildung des Antibiotikums A/16 686 wird der Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33 076 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das verwertbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, gezüchtet. Zur Züchtung können eine Reihe von in der Fermentationstechnik üblichen Nährmedien verwendet werden, jedoch werden bestimmte Medien besonders bevorzugt. Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Glucose, Fructose, Mannose, Saccharose und dergleichen. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Sojabohnenmehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trypton, Aminosäuren und dergleichen. Als anorganische Salze werden den Züchtungsmedien üblicherweise verwendete lösliche Salze einverleibt, die Ionen liefern, wie Natrium-, Kalium-, Eisen-, Zink-, Kobalt-, Magnesium-, Calcium-, Ammonium-, Chlorid-, Carbonat-, Sulfat- und Nitrationen. Im allgemeinen wird der das Antibiotikum bildende Stamm in einem Schüttelkolben vorgezüchtet. Die erhaltene Kultur wird sodann zur Beimpfung von Glasfermentern zur Bildung von wesentlichen Mengen des Antibiotikums A/16 686 verwendet. Als Anzuchtmedien können die gleichen Medien verwendet werden, die für größere Fermentationsansätze eingesetzt werden. Möglich ist aber auch die Verwendung von anderen Medien.

Der A/16 686 bildende Stamm kann bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 37°C und vorzugsweise von etwa 28 bis etwa 30°C gezüchtet werden.

Während der Züchtung kann die Bildung des Antibiotikums durch Überprüfung von Proben der Gärbrühe oder von Extrakten der Myzelfeststoffe auf ihre antibiotische Aktivität verfolgt werden. Für diesen Zweck eignen sich Mikroorganismen, deren Empfindlichkeit gegenüber dem Antibiotikum A/16 686 bekannt ist. Ein besonderes geeigneter Testorganismus ist Sarcina lutea. Der entsprechende biologische Test wird zweckmäßigerweise gemäß der Agar-Diffusionsmethode auf Agarplatten durchgeführt. Die maximale antibiotische Aktivität tritt im allgemeinen zwischen dem dritten und fünften Tag auf. Das während der Züchtung des Stamms Actinoplanes sp. ATCC 33 076 gebildete Antibiotikum findet sich sowohl in der Gärbrühe als auch in der Myzelmasse. Die Gewinnung dieses Antibiotikums kann daher durch getrennte Extraktion von Gärbrühe und Myzel durchgeführt werden.

Die Extraktion der Myzelmasse wird am zweckmäßigsten mit Methanol durchgeführt. Es eignen sich aber auch andere niedere Alkohole und Chloroform. Das Antibiotikum A/16 686 wird nach einem üblichen Verfahren als Rohprodukt aus dem Extraktionslösungsmittel gewonnen. In analoger Weise wird die Gärbrühe, vorzugsweise mit n-Butanol, extrahiert. Durch Fällung dieser Extraktionslösung erhält man eine weitere Menge an rohem Antibiotikum A/16 686. Die Reinigung des rohen Antibiotikums wird sodann vorgenommen, indem das aus den Extraktionslösungsmitteln gewonnene Produkt mit einem Gemisch aus Chloroform : Äthanol : Wasser = 4 : 7 : 2 behandelt, das gebildete ölige Produkt abtrennt und in Wasser gießt. Durch diese Behandlung erstarrt das Produkt. Dieses Produkt wird abfiltriert und weiter durch Säulenchromatographie an Kieselgel gereinigt, wobei mit einem Gemisch aus Acetonitril : 0,01 n HCl = 1 : 1 eluiert wird. Gemäß diesem Verfahren erhält man das Antibiotikum A/16 686 in Form des Hydrochlorids, das sodann durch Chromatographie an einer mit vernetztem Dextrangel gepackten Säule entsalzt wird.

Die einzelnen Stufen des vorgenannten Reinigungsverfahrens werden dünnschichtchromatographisch überwacht, wobei ein entsprechendes Lösungsmittelsystem verwendet wird, beispielsweise ein basisches Lösungsmittelsystem, wie n-Propanol : n- Butanol : 1 n Ammoniak = 2 : 3 : 4 (obere Phase) oder Methanol : 10 prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung : 10prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 1. In diesen Lösungsmittelsystemen lassen sich beliebige Salze des Antibiotikums A/16 686 in die freie Base überführen. Sämtliche vorgenannten Schritte dienen zur Isolierung des reinen Antibiotikums A/16 686, das in dem speziellen verwendeten Lösungsmittelsystem einen bestimmten R_f-Wert aufweist.

Es können auch andere Reinigungsverfahren angewendet werden, beispielsweise an sich übliche Extraktions- und Adsorptionsverfahren. Diese anderen Reinigungsverfahren lassen sich leicht stufenweise zusammenstellen, indem man den Reinigungsfortschritt, wie vorstehend erläutert, dünnschichtchromatographisch überwacht. Durch Verfolgung des bei der Dünnschichtchromatographie gebildeten Flecken des Antibiotikums A/16 686 mit einem speziellen R_f-Wert ist es dem Fachmann möglich, die zur Isolierung des reinen Antibiotikums A/16 686 geeigneten Verfahrensmaßnahmen zu ergreifen.

Gegebenenfalls kann das gemäß dem vorstehend erläuterten Verfahren erhaltene Hydrochlorid des reinen Antibiotikums A/16 686 nach an sich üblichen Verfahren in die entsprechende freie Base oder in ein anderes physiologisch bzw. pharmakologisch verträgliches Salz mit einer Säure übergeführt werden.

Das Antibiotikum A/16 686 ist insbesondere gegen gram-positive Mikroorganismen aktiv. In Tabelle IV ist das in vitro-Wirkungsspektrum des Antibiotikums A/16 686 zusammengestellt.
OrganismenMinimale Hemmkonzentration
des Antibiotikums A/16 686 (µg/ml)

S. aureus ATCC 65380,16 S. aureus ATCC 91440,16 S. aureus Tour0,31 Staphylococcus 10B Ciba0,08 S. epidermidis ATCC 12 2280,08 S. saprophyticus NCTC 72920,16 M. flavus ATCC 10 2400,016 S. lutea ATCC 93410,02 S. pyogenes C 203 SKF 13 4000,01 S. pneumoniae Felton UC 410,05 S. faecalis ATCC 70800,31 S. foecium ATCC 10 5410,08 S. agalactiae ATCC 70770,02 S. mutans ATCC 27 6070,08 C. diphtheriae var. mitis ATCC 11 0510,31 C. xerosis NCTC 97550,02 B. subtilis ATCC 66330,062 B. cereus var.mycoides ATCC 11 7780,08 C. perfringens ISS 30 5430,16 P. acnes ATCC 69190,4 P. acnes ATCC 69220,8 P. acnes ATCC 25 7460,4

In Tabelle V sind die Werte für die minimale Hemmkonzentration des Antibiotikums A/16 686 gegenüber einer Reihe von klinisch isolierten Stämmen von Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae und Streptococcus faecalis zusammengestellt.
OrganismenMinimale Hemmkonzentration
des Antibiotikums
A/16 686 (µg/ml)

S. aureus 54 310 L 10960,62 S. aureus 54 560/I L 10970,31 S. aureus 54 635 L 10980,31 S. pyogenes L 330,04 S. pyogenes L 7940,08 S. pyogenes L 8000,04 S. pyogenes L 8010,16 S. pyogenes L 8020,08 S. pyogenes L 8030,08 S. pyogenes L 8040,62 S. pyogenes L 8050,08 S. pneumoniae L 10550,04 S. pneumoniae L 11020,04 S. pneumoniae L 11740,08 S. faecalis L 7680,31 S. faecalis L 8760,31 S. faecalis L 9220,31 S. faecalis L 9490,31 S. faecalis L 9650,31 S. faecalis L 11390,62 S. foecium L 7630,16

Das Antibiotikum A/16 686 besitzt auch eine starke in vivo- Aktivität gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen. Die Wirksamkeit ergibt sich aus Tabelle VI, in der die ED₅₀-Werte gegen 3 verschiedene Mikroorganismen bei Mäusen angegeben sind.

Tabelle VI

Das Antibiotikum A/16 686 weist eine relativ geringe Toxizität auf. Beispielsweise beträgt der LD₅₀-Wert bei intraperitonealer Verabfolgung an Mäuse etwa 500 bis 750 mg/kg.

Diese Arzneimittel für die orale, lokale oder parenterale Verabreichung werden nach üblicher pharmakologischer Praxis hergestellt. Beispiele für entsprechende Präparate sind in Remington's Pharmaceutical Sciences 15. Aufl., 1975, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, beschrieben. Entsprechende Beispiele sind Tabletten, Kapseln, Pulver, Salben, Lösungen und Injektionsflüssigkeiten. Der Wirkstoffanteil der Präparate kann 0,5 bis 99 Prozent und vorzugsweise 5 bis 80 Prozent betragen. Die Tagesdosis wird unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, wie Körpergewicht, infizierender Mikroorganismus, Schwere der Infektion und Dauer und Art der Verabreichung, festgelegt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Züchtung des Stamms Actinoplanes sp. ATCC 33 076

Actinoplanes sp. ATCC 33 076 wird in einem Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in einem Schüttelkolben angezüchtet:

Fleischextrakt3 g/Liter Hefeextrakt5 g/Liter Trypton5 g/Liter lösliche Stärke24 g/Liter Glucose1 g/Liter CaCO₃4 g/Liter Leitungswasser1 Liter

Die Kolben werden etwa 96 Stunden bei 28 bis 30°C geschüttelt. Die erhaltenen Anzuchtkulturen (1 Liter) werden zur Beimpfung von jeweils 10 Liter eines Nährmediums, der nachstehend angegebenen Zusammensetzung, das sich in einem Glasfermenter befindet, verwendet:

Fleischextrakt40 g Pepton40 g Hefeextrakt10 g Natriumchlorid25 g Sojabohnenmehl100 g Glucose250 g CaCO₃50 g Leitungswasser10 Liter

Die Fermentationsansätze werden bei 28 bis 30°C unter aeroben Bedingungen und unter Rühren inkubiert. In bestimmten Abständen wird die antibiotische Aktivität auf mikrobiologischem Wege gemäß der Agar-Diffusionsmethode unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus bestimmt. Die maximale Aktivität wird nach 72- bis 120stündiger Züchtung erreicht.

Beispiel 2 Gewinnung des Antibiotikums A/16 686

170 Liter gemäß Beispiel 1 hergestellte Gesamtfermentationsbrühe werden auf 10°C gekühlt und durch Zusatz von 18prozentiger Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Die erhaltene saure Brühe wird unter Verwendung eines Filterhilfsmittels (Clarcel Flow-Ma) filtriert. Der Myzelkuchen wird mit Wasser gewaschen. Anschließend werden die filtrierte Brühe und das Myzel getrennt voneiannder weiter verarbeitet.

a) Zur Extraktion der Myzelmasse werden 30 Liter Methanol verwendet. Nach Filtration wird nochmals mit einem Gemisch aus 30 Liter Methanol und 5 Liter Wasser extrahiert. Das verbrauchte Myzel wird verworfen. Die beiden Methanolextrakte werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 40°C zu 6 Liter eines wäßrigen Konzentrats eingeengt. Dieses wäßrige Konzentrat wird 3mal mit jeweils 10 Liter n-Butanol extrahiert. Die Extraktionsflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingeengt.

Das erhaltene Konzentrat wird zu Petroläther gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dekantieren abgetrennt und mit einer weiteren Menge an Petroläther versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 80 g Antibiotikum A/16 686 in Form eines Rohmaterials mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pneumoniae US 41 von 0,1 µg/ml.

b) Das vereinigte Gemisch aus filtrierter Brühe und Waschflüssigkeit (165 Liter) wird auf 10°C gekühlt und durch Zusatz von 2,5 Liter konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 3,5 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird mit 80 Liter n-Butanol extrahiert. Der organische Extrakt wird sodann bei Temperaturen unter 35°C zu 6 Liter Butanolkonzentrat eingeengt. Dieses Konzentrat wird zu Petroläther gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird durch Dekantieren abgetrennt und mit einer weiteren Menge an Petroläther versetzt. Der Feststoff wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 26,3 g Antibiotikum A/16 686 in Form eines Rohprodukts mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pneumoniae UC 41 von 0,8 µg/ml.

Beispiel 3 Reinigung des Antibiotikums A/16 686

47 g des gemäß Beispiel 2a) erhaltenen rohen Antibiotikums A/16 686 werden mit 1,4 Liter eines Gemisches aus Chloroform : Äthanol : Wasser im Volumenverhältnis 4 : 7 : 2 behandelt. Das gebildete ölige Produkt wird von der Lösung dekantiert. Sodann wird das ölige Produkt mit weiteren 70 ml des vorgenannten Gemisches versetzt und der Trennvorgang wiederholt. Das ölige Produkt erstarrt bei Behandlung mit 440 ml Wasser. Es wird abzentrifugiert und filtriert.

a) Der abgetrennte Feststoff wird in 170 ml Wasser suspendiert, durch Zusatz von 400 ml Methanol in Lösung gebracht und filtriert. Anschließend werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck durch Zusatz von n-Butanol bei einer Temperatur, die nie über 35°C ansteigt, abgestreift. Man erhält etwa 50 ml eines Butanolkonzentrats. Bei Zusatz von 500 ml Diäthyläther bildet sich ein Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 1,012 g eines relativ reinen Produkts des Antibiotikums A/16 686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pyogenes von 0,025 µg/ml. Dieses Produkt wird den nachstehend angegebenen Reinigungsverfahren unterzogen:

1,58 g des vorstehend erhaltenen Antibiotikums A/16 686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegen S. pyogenes von 0,025 µ/ml werden in einem Gemisch aus Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis 1 : 1 gelöst. Die Lösung wird auf eine mit 430 g Kieselgel 60 (Merck 0,06 bis 0,2 ml) gepackte Säure, die in dem gleichen Gemisch hergestellt worden ist, aufgesetzt. Als Laufmittel wird zunächst das vorgenannte Gemisch aus Acetonitril und Wasser verwendet, wobei 70 Fraktionen von jeweils 20 ml abgenommen werden. Anschließend werden weitere 290 Fraktionen mit jeweils 20 ml unter Verwendung eines Gemisches aus Acetonitril und 0,01 n Salzsäure im Volumenverhältnis 1 : 1 abgenommen. Die Elution der Säule wird dünnschichtchromatographisch an 60 F₂₅₄-Kieselgelplatten und durch Bestimmung der Aktivität der Fraktionen gegenüber Sarcina lutea überwacht. Die Fraktionen 130 bis 265 werden vereinigt und durch Abstreifen der Lösungsmittel mit n-Butanol zu einer n-Butanolkonzentration mit einem Volumen von 20 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird in eine große Menge Diäthyläther gegossen. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über P₂O₅ getrocknet. Man erhält 1,015 g des Antibiotikums A/16 686.

0,67 g des vorstehenden Produkts werden in 24 ml Wasser und 76 ml Methanol gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 220 g Sephadex LH-20 gepackte Säule der Abmessungen 3,0×62,0 cm aufgesetzt, die mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser im Volumenverhältnis von 7 : 3 geschüttet worden ist. Als Laufmittel wird das vorstehend erwähnte Gemisch verwendet, wobei Fraktionen von 10 ml abgenommen werden. Die Fraktionen 24 bis 32 werden vereinigt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 35°C mit n-Butanol auf ein Restvolumen von etwa 10 ml abgestreift. Die erhaltene Lösung wird zu Diäthyläther gegeben. Es fällt das gewünschte reine Antibiotikum A/16 686 aus. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck über P₂O₅ bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 0,26 g reines Antibiotikum A/16 686.

b) Das Filtrat wird unter Zugabe von n-Butanol bei Temperaturen unter 35°C unter vermindertem Druck abgestreift. Man erhält ein n-Butanolkonzentrat mit einem Volumen von 50 ml. Der durch Zusatz von Petroläther gebildete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 42,9 g partiell gereinigtes Antibiotikum A/16 686 mit einer minimalen Hemmkonzentration gegenüber S. pyogenes von 0,2 µg/ml. Dieses Produkt wird in 2,5 Liter Wasser suspendiert und durch Zugabe von 1 n NaOH bis zum pH-Wert 7 in Lösung gebracht. Anschließend wird die erhaltene wäßrige Lösung 3mal mit jeweils 5 Liter n-Butanol extrahiert. Die erhaltene organische Phase wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck bei Temperaturen unter 35°C auf ein Volumen von 200 ml eingeengt.

Der bei Zugabe von Diäthyläther zum Konzentrat gebildete Niederschlag wird abfiltriert und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Das getrocknete Produkt wird in 160 ml der oberen Phase eines Gemisches aus n-Propanol : n-Butanol : 1 n Ammoniak im Volumenverhältnis 2 : 3 : 4 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit 1,7 g Kieselgel 60 (Merck 0,06 bis 0,2 mm) gepackte, 100 cm hohe Säule vom Durchmesser 7,5 cm, die in dem vorstehend genannten Lösungsmittelgemisch geschüttet worden ist, aufgesetzt. Als Laufmittel wird das gleiche Lösungsmittelgemisch verwendet. Fraktionen mit einem Volumen von 300 ml werden aufgefangen. Die Elution der Säule wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Die Fraktionen 21 bis 26 werden vereinigt und bei Temperaturen unter 35°C mit n-Butanol unter vermindertem Druck abgestreift. Man erhält ein n-Butanolkonzentrat von 50 ml. Nach Zusatz von Diäthyläther bildet sich ein Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über P₂O₅ getrocknet. Man erhält 1,875 g relativ reines Antibiotikum A/16 686, das sodann gemäß den vorstehend unter a) erläuterten Verfahren weiter gereinigt wird.

Beim Hydrochlorid des Antibiotikums A/16 686 handelt es sich um ein weißes, kristallines, leicht hygroskopisches Material vom F. 224 bis 226°C. Es ist sehr gut löslich in Wasser und Dimethylformamid, löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und Benzol. Das unter inerter Atmosphäre bei 140°C vorgetrocknete Antibiotikum A/16 686-hydrochlorid ergibt bei der Elementaranalyse folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung (Mittelwert von mehreren Analysen): Kohlenstoff 51,73 Prozent, Wasserstoff 6,34 Prozent, Stickstoff 9,96 Prozent, Chlor (Gesamtgehalt) 5,84 Prozent, Chlorionen 4,74 Prozent und Rückstand 1 Prozent.

Das IR-Spektrum in Nujol ist in Fig. 1 dargestellt. Folgende Absorptionsmaxima lassen sich beobachten (in cm^-1):
3290-3070, 2930 und 2860 (Nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (Nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 und 820.

Das UV-Absorptionsspektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben. Es ergeben sich folgende Absorptionsmaxima:

a) in Methanol: b) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 n HCl: c) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 n NaOH: 295 nm (Schulter)
d) in Methanol mit einem Gehalt an einem Puffer vom pH-Wert 7,38:

Die UV-Absorptionsspektren sind mit einem Beckmann DK-2- Spektrometer aufgenommen.

Das Antibiotikum A/16 686-hydrochlorid weist eine spezifische Drehung

Das Antibiotikum A/16 686 zeigt folgende charakteristischen Reaktionen:

Ninhydrin (3prozentige Äthanollösung)negativ Ninhydrin (3prozentige Äthanollösung + Natriumacetat)positiv 1% FeCl₃-1% K₃Fe(CN)₆ (wäßrige Lösung)positiv (grün) Molischpositiv Fehlingnegativ Biuretpositiv Anthronpositiv Millonnegativ H₂SO₄ konz.negativ KMnO₄ wäßrigpositiv

Die R_f-Werte des Antibiotikums A/16 686 bei de Papierchromatographie unter Verwendung von verschiedenen Lösungsmittelsystemen und von S. aureus ATCC 6538 als Nachweisorganismus sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt.
ElutionssystemeR_f-Werte

1) n-Butanol, gesättigt mit Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,00,00 2) n-Butanol, gesättigt mit Wasser
mit einem Gehalt an 2 Prozent p-Toluolsulfonsäure0,00 3) n-Butanol, gesättigt mit Wasser
mit einem Gehalt an 2 Prozent Ammoniak0,00 4) Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,0, gesättigt mit n-Butanol0,05 5) n-Butanol : Methanol : Wasser = 4 : 1 : 20,43 6) Essigsäureäthylester, gesättigt mit Wasser0,00 7) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 2 : 1 : 10,52 8) n-Butanol : Pyridin : Wasser = 4 : 3 : 70,87

*) absteigende Chromatographie

Rm: 40 cm
Mengen: 20 µg der Verbindung gelöst in wäßrigem Methanol (2 mg/ml)

Die R_f-Werte des Antibiotikums A/16 686 in verschiedenen dünnschichtchromatographischen Systemen sind in nachstehender Tabelle zusammengestellt.
Elutionssysteme (Volumenteile)R_f-Werte

1) n-Propanol : n-Butanol : 1 n Ammoniak = 2 : 3 : 4 (obere Phase)0,15 2) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 2 : 50,61 3) n-Butanol : Äthanol : 0,1 n Salzsäure0,61 4) Chloroform : Äthanol : 10prozentige Essigsäure = 4 : 7 : 20,00 5) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 50,17 6) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung:
10prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 10,52 7) n-Butanol : Pyridin : Wasser : Essigsäure = 6 : 4 : 3 : 10,45 8) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung:
10prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 10,11 9) 0,25 m wäßriges NaH₂PO₄-Lösung : Acetonitril = 1 : 10,68 10) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung = 1 : 10,65 11) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 2 : 50,77

Rm: etwa 140 mm
Menge: 2 bis 5 µl einer Lösung (1 mg/ml) der Verbindung in Acetonitril/Wasser (1 : 1).

Nachweis:

a) Bioautographie auf mit B. subtilis ATCC 6633 beimpften Agarplatten;
b) Verkohlen durch Erhitzen mit α-Naphtholschwefelsäure;
c) Joddampf;
d) Chlor-Toluidin-Reagens;
e) UV-Licht von 254 nm

1 bis 7: Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten (Merck); Nachweis a, e, b, c, d, e,
8,9: Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten silanisiert (Merck); Nachweis e,
10, 11: Cellulose F-Platten (Merck); Nachweis a.

Durch hochleistungsfähige chromatographische Verfahren läßt sich nachweisen, daß das Antibiotikum A/16 686, das gemäß Beispiel 3 isoliert und gereinigt worden ist, zu 70 bis 80 Prozent aus einer Hauptkomponente besteht, während der Rest von 30 bis 20 Prozent mindestens 2 untergeordneten Komponenten zuzuordnen ist.

Das gemäß den vorstehenden Beispielen isolierte Antibiotikum A/16 686-hydrochlorid ist ein Hydrochlorid mit einem chlorhaltigen basischen Glycopeptid, das sich von Antibiotika der klassischen Glycopeptidgruppe durch seinen Chlorgehalt und in der Art seiner Aminosäurebestandteile unterscheidet. Nach 6stündiger Hydrolyse in 6 n Salzsäure bei 110°C lassen sich mit Hilfe eines Aminosäure-Autoanalysators folgende Aminosäuren nachweisen: Ornithin (118 µg/mg = 0,58 µMol/mg), Asparaginsäure (29,2 µg/mg = 0,22 µMol/mg), Threonin (68 µg/mg = 0,57 µMol/mg), Glycin (25 µg/mg = 0,33 µMol/mg), Alanin (29 µg/mg = 0,32 µMol/mg), Leucin (41 µg/mg = 0,31 µMol/mg) und Phenylalanin (42 µg/mg = 0,25 µMol/mg).

Unter Verwendung der Säule für neutrale und saure Aminosäuren lassen sich weitere 4 Peaks nachweisen. 2 dieser 4 Aminosäuren wurden durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie nach Umwandlung in die entsprechenden Methylester-Trifluoracetyl- Derivate als Aminosäuren der Formeln I und II identifiziert:

Beispiel 4 Isolierung der freien Base

Durch Behandlung einer Lösung von 0,05 g des Hydrochlorids des Antibiotikums A/16 686 in 3 ml Wasser und 8 ml Äthanol mit 2 ml 1,2-Epoxybutan erhält man einen Niederschlag, der nach 1tägigem Stehenlassen bei niedriger Temperatur abzentrifugiert, sodann mit Äthanol gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck über P₂O₅ getrocknet wird. Man erhält 0,016 g der entsprechenden freien Base.

Durch Behandlung des Antibiotikums A/16 686 in Form der freien Base mit einer anorganischen oder organischen Säure erhält man die entsprechenden Salze mit Säuren. Bevorzugt werden die pharmakologisch verträglichen Salze. Entsprechende pharmakologische Säuren sind nicht-toxische Säuren, die sich zur Bildung von therapeutisch wertvollen Salzen eignen. Beispiele dafür sind Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Weinsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Glutaminsäure und Methansulfonsäure.

Claims

1. Glycopeptid-Antibiotikum A/16 686 und seine Salze, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften des Hydrochlorids:

A) weißes kristallines Material vom F. 224 bis 226°C;
B) sehr gut löslich in Wasser und Dimethylformamid, löslich in Methanol, Äthanol, Propanol und Butanol und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und Benzol;
C) ungefähre Zusammensetzung: 51,73 Prozent Kohlenstoff, 6,34 Prozent Wasserstoff, 9,96 Prozent Stickstoff, 5,84 Prozent Chlor (Gesamtgehalt), 4,74 Prozent Chloridionen und 1 Prozent Rückstand;
D) IR-Spektrum in Nujol mit folgenden Absorptionsmaxima: 3290-3070, 2930 und 2860 (Nujol), 1765, 1630, 1510, 1455, 1375 (Nujol), 1230, 1175, 1130, 1065, 1030, 1015, 980, 840 und 820 cm^-1;
E) UV-Absorptionsspektrum mit den folgenden Absorptionsmaxima:
- a) in Methanol: b) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 n HCl: c) in Methanol mit einem Gehalt an 0,1 n NaOH: 295 nm (Schulter)
  d) in Methanol mit einem Gehalt an einem Puffer vom pH-Wert 7,38:
F) spezifische Drehung G) charakteristische Eigenschaften:Ninhydrin (3prozentige Äthanollösung)negativ Ninhydrin (3prozentige Äthanollösung + Natriumacetat)positiv 1 Prozent FeCl₃-1 Prozent K₃Fe(CN)₆positiv (grün) Molischpositiv Fehlingpositiv Biuretpositiv Anthronpositiv Millonnegativ H₂SO₄ konz.negativ KMnO₄positivH) R_f-Werte bei der Papierchromatographie an Whatman Nr. 1-Papier unter Verwendung von S. aureus ATCC 6538 als Nachweisorganismus:ElutionssystemeR_f-Werte1) n-Butanol, gesättigt mit Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,00,00 2) n-Butanol, gesättigt mit Wasser
mit einem Gehalt an 2 Prozent p-Toluolsulfonsäure0,00 3) n-Butanol, gesättigt mit Wasser
mit einem Gehalt an 2 Prozent Ammoniak0,00 4) Sörensen-Puffer vom pH-Wert 6,0, gesättigt mit n-Butanol0,05 5) n-Butanol : Methanol : Wasser = 4 : 1 : 20,43 6) Essigsäureäthylester, gesättigt mit Wasser0,00 7) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 2 : 1 : 10,52 8) n-Butanol : Pyridin : Wasser = 4 : 3 : 70,87I) R_f-Werte in verschiedenen dünnschichtchromatographischen Systemen:Elutionssysteme (Vol./Vol./Vol.)R_f-Werte1) n-Propanol : n-Butanol : 1 n Ammoniak = 2 : 3 : 4 (obere Phase)0,15 2) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 2 : 50,61 3) n-Butanol : Äthanol : 0,1 n Salzsäure0,61 4) Chloroform : Äthanol : 10prozentige Essigsäure = 4 : 7 : 20,00 5) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 50,17 6) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung:
10prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 10,52 7) n-Butanol : Pyridin : Wasser : Essigsäure = 6 : 4 : 3 : 10,45 8) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung:
10prozentiges Ammoniak = 10 : 9 : 10,11 9) 0,25 m wäßriges NaH₂PO₄-Lösung : Acetonitril = 1 : 10,68 10) Methanol : 10prozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung = 1 : 10,65 11) n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 2 : 50,77 1 bis 7 auf Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten;
8 und 9 auf silanisierten Kieselgel 60 F₂₅₄-Platten;
und 10 und 11 auf Cellulose F-Platten;
J) Aminosäureanalyse nach 6stündiger Hydrolyse in 6 n Salzsäure bei 110°C: mindestens folgende Aminosäuren lassen sich nachweisen: Ornithin, Asparaginsäure, Threonin, Glycin, Alanin, Leucin, Phenylalanin, p-Hydroxyphenylglycerin und durch Hydroxylgruppen und/oder Chloratome substituiertes Phenylglycin.

2. Antibiotikum A/16 686-hydrochlorid.

3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33 076 in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen so lange züchtet, bis sich eine wesentliche Menge des Antibiotikums A/16 686 gebildet hat, und das Antibiotikum nach üblichen Verfahren gewinnt.

4. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Actinoplanes sp. ATCC 33 076 in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthält, unter aeroben Submersbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet worden ist, das Antibiotikum durch getrennte Extraktion von Kulturbrühe und Myzel mit einem organischen Lösungsmittel aus der Gruppe niedere Alkanole und Chloroform gewinnt, die aus den Extraktionslösungsmitteln gewonnene antibiotische Substanz mit einem Gemisch aus Chloroform : Äthanol : Wasser = 4 : 7 : 2 behandelt, das abgeschiedene ölige Produkt in Wasser gießt, das erstarrte Produkt abtrennt und es durch Chromatographie an einer mit Kieselgel gepackten Säule weiter reinigt, wobei mit einem Gemisch aus Acetonitril : 0,01 n HCl = 1 : 1 eluiert wird, wodurch man das Hydrochlorid des Antibiotikums A/16 686 erhält, das durch Chromatographie an einer mit vernetztem Dextrangel gepackten Säule entsalzt wird, und daß man gegebenenfalls das Antibiotikum A/16 686-hydrochlorid nach an sich üblichen Verfahren in die entsprechende freie Base oder in andere Salze mit Säuren überführt.

5. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an der Verbindung nach Anspruch 1 in Form der freien Base oder in Form eines Salzes mit einer physiologisch verträglichen Säure.