DE2646001A1 - Verfahren zur herstellung von clavulansaeure und deren salze aus streptomyces jumonjinensis - Google Patents

Verfahren zur herstellung von clavulansaeure und deren salze aus streptomyces jumonjinensis

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DE2646001A1
DE2646001A1 DE19762646001 DE2646001A DE2646001A1 DE 2646001 A1 DE2646001 A1 DE 2646001A1 DE 19762646001 DE19762646001 DE 19762646001 DE 2646001 A DE2646001 A DE 2646001A DE 2646001 A1 DE2646001 A1 DE 2646001A1
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    • Y10S435/886—Streptomyces

Description

DiPL-CHEM. DR. ELISABETH JUNG DIPL-PHYS. DR. JÜRGEN SCHIRDEWAHN D R.-IN G. GERHARD SCHMITT-NILSON PATENTANWÄLTE
MÖNCHEN- 43. OLEME.M3ST3AS3E30 TELEFON 34 SO 67 TELEQRAMM-ADRE!
TELEX 5-29 688
u.Z.: L 213 C (J/MK/or) Case B.208
Oktober 1976
BEECHAM GROUP LIMITED
Brentford, Middlesex, Grossbritannien
"Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und deren Salze aus Streptomyces jumonjinensis"
Beanspruchte Priorität:
13. Oktober 1975, Grossbritannien, Nr. 41898/75
Clavulansäure der Formel I, deren Salze und Ester sind wichtige antibakterielle Mittel
Ά _ CH2OH (D
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die gemäss der BE-PS 827 926 durch Bebrütung von Streptomyces clavuligerus hergestellt werden können.
Gemäss der BE-PS 804 32Jl produziert der Stamm Streptomyces jumonjinensis ein anderes bakterielles Mittel als Clavulansäure.
Es wurde nun jedoch festgestellt, dass bei der Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis auch Clavulansäure produziert wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und deren Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet und die Clavulansäure und deren Salze aus dem Kulturmedium isoliert.
Die Clavulansäure wird im erfindungsgemässen Verfahren am besten als festes Lithium-, Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Barium-, Aluminium-, Ammonium oder substiuiertes Ammoniumsalz isoliert. Geeignete Ammoniumsalze sind primäre, sekundäre, tertiäre und quartäre Ammoniumsalze.
Vorzugsweise wird die Clavulansäure als festes Alkalimetallsalz, z.B. als Natrium- oder Kaliumsalz, isoliert.
Unter "festes Salz der Clavulansäure" werden kristalline und amorphe Salze der Clavulansäure bezeichnet. Besonders geeignet sind kristalline Salze, z.B. das Clavulansäure-Natriumsalz-tetrahydrat oder das kristalline Kalium-oder Lithiumsalz.
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Im erfindungsgemässen Verfahren wird vorzugsweise der Stamm Streptomyces jumonjinensis NRRL 57^1 oder dessen besonders ergiebige Mutante bebrütet.
Streptomyces jumonjinensis NRRL 57*11 ist bei Baarn, Niederlande,
als CBS 177.76 und bei der deutschen Sammlung für Mikroorganismen DSM unter Nummer 7^7 hinterlegt.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird der die Clavulansäure produzierende Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen aerob wachsen ge-.lassen. Dieses aerobe Wachstum kann in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind, erfolgen. Die Kultur kann . auf einer aeroben Fläche oder als Submerskultur stattfinden, wobei das Nährmedium aus komplexen Nährstoffen bestehen kann oder chemisch definiert ist.
In der BE-PS 804 3*11 sind die allgemeinen Bedingungen für die Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis beschrieben.
Im erfindungsgemässen Verfahren sind komplexe Nährstoffe, wie Hefeextrakt oder Sojabohnenmehl; besonders geeignet.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann das Kulturmedium 0,1 bis 10 % einer komplexen organischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt,Maisquellwasser, Pflanzenproteine, Samenproteine und Hydrolysate dieser Proteine, Milchprotein-Hydrolysate, Fisch- und Fleisch-
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extrakte und deren Hydrolysate, wie Peptone, enthalten. Andererseits kann das Kulturmedium chemisch definierte Stickstoffquellen enthalten, wie Harnstoff, Ammoniumsalze, Amide, gewöhnliche
Aminosäuren und deren Gemische, wie Valin, Asparagin, Glutaminsäure, Prolin und Phenylalanin. Kehlehydrate werden dem Kulturmedium in einer Menge von 0,1 bis 5 % als Kohlenstofflieferant zugesetzt, z.B. Stärke oder Stärke-Hydrolysate,
wie Dextrin, Saccharose, Lactose und andere
Zucker, Glycerin und Glycerinester, oder Pflanzenöle oder Tierfette Auch Carbonsäuren und deren Salze können als Kohlenstoffquelle für das Wachstum und die Produktion von ß-Lactamase-Hemmstoffen eingesetzt werden.
Gelegentlich ist es notwendig dem Kulturmedium ein Antischaummittel, wie Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxyäthylen-Polymerisat, zuzusetzen.
Als Mineralsalze geeignet sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Zinkchlorid, Eisen(III)-chlorid, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat und Magnesiumsulfat sowie Natrium- und Kaliumsalze der Phosphorsäure, insbesondere wenn sie chemisch definiert sind. Calciumcarbonat kann als Calciumionenquelle oder zur Pufferung zugesetzt werden. Man kann dem Kulturmedium aber auch Salze von Spurenelementen, wie Nickel, Kobalt oder Mangan, und gegebenenfalls Vitamine zusetzen.
Unter "Mutante" wird hier jede Mutante des Stammes bezeichnet, gleichgültig ob sie spontan oder durch Einwirkung eines äusseren Mittels entstanden ist. Geeignete Verfahren zur Herstellung von
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Mutanten sind in der BE-PS 827 926 beschrieben.
Die Bebrütung von Streptomyces jumonjinensis erfolgt im allgemeinen in einem Temperaturbereich von 16 bis 35°C, im allgemeinen 20 bis 32°C, vorzugsweise 25 bis 300C, z.B. bei etwa 27°CjUnd einem pH-Wert von 5 bis δ, 5, insbesondere 6 bis 7»5.
Streptomyces jumonjinensis wird in dem oben angegebenen Nährmedium in herkömmlichen Gefässen, wie konischen Glasflaschen, die durch Bewegung belüftet werden, bebrütet, z.B. in einem sich drehenden Schüttelapparat oder in belüfteten Fermentatoren, z.B. in einem Permentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen, einem Leitschaufelrührer und einer Luftsprüheinrichtung ausgerüstet ist. Die Bebrütung kann aber auch kontinuierlich erfolgen.
/allgemeinen
Im erfindungsgemässen Verfahren beträgt der Ausgangs-pH-Wert *m 7,0. Die maximale Ausbeute an Clavulansäure erhält man in 1 bis 10 Tagen bei 20 bis 320C, z.B. in 2 bis 5 Tagen.
Clavulansäure und deren Salze können aus dem Filtrat der Kulturbrühe nach verschiedenen Verfahren, wie in der BE-PS 827 926 beschrieben, extrahiert werden. Besonders geeignet sind die Lösungsmittelextraktion aus dem kalten, auf einen sauren pH-Wert eingestellten Kulturfiltrat und Verfahren, die auf der anionischen Natur der Clavulansäure beruhen, wie die. Verwendung von Anionenaustauscherharzen.
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Vor der Extraktion werden aus der Kulturbrühe die Zellen von Streptomyces Jumonjinensis abgetrennt, entweder durch Filtrieren oder Zentrifugieren.
Bei der Lösungsrnittelextraktion wird das Kulturfiltrat gekühlt und der pH-Wert auf 2 bis 3 durch Zugabe von Säure gesenkt, wobei das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen
wie
Lösungsmittel,/n-Butylacetat, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Äthylacetat, vermischt wird. Die zur Verminderung des pH-Werts des Mediums verwendete Säure ist im allgemeinen eine Mineralsäure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Phosphorsäure. n-Butanol ist für die Extraktion des angesäuerten Kulturfiltrats besonders geeignet.
Nach der Trennung der Phasen durch Zentrifugieren wird die Clavulansäure oder deren Derivat aus der Lösungsmittelphase in eine wässrige Natriumbicarbonatlösung, einen Kaliumhydrogenphosphatpuffer, einer Calciumcarbonatsuspension oder in Wasser extrahiert, wobei der pH-Wert etwa neutral ist, z.B. 7,0. Der wässrige Extrakt nach der Trennung der Phasen kann unter vermindertem Druck eingeengt und zu einem Rohprodukt gefriergetrocknet werden. Dieses rohe Clavulansäuresalz ist als trockener Peststoff bei -20°C genügend stabilem gelagert werden zu können.
Bei Verwendung von Anbnemustauscherharz wird das Kulturfiltrat bei etwa neutralem oder schwach saurem pH-Wert, z.B. 6 bis 7, mit einem Bett eines schwach oder stark basischen Anionenaustauscherharzes in Berührung gebracht, bis das Harz gesättigt ist
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und die Clavulansäure aus dem Bett abläuft. Das Bett wird dann mit Wasser gewaschen und mit einer wässrigen Salzlösung, wie eines Alkalimetallchlorids, z.B. Natriumchlorid, eluiert. Die die Clavulansäure enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, eingeengt, entsalzen und gefriergetrocknet. Man erhält das Rohprodukt eines festen Clavulansäuresalzes.
Als schwach basisches Anionenaustauscherharz im erfindungsgemässen Verfahren ist ein vernetztes Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisat mit aktiven Polyamingruppen, als stark basisches Änionenaustauscherharz ist ein vernetztes Polyvinyl-Divinylbenzol-Polymerisat mit aktiven quartären Ammoniumgruppen geeignet.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann man aber auch das Kulturfiltrat bei einem etwa neutralen pH-Wert mit einer organischen Phase, in der ein wasserunlösliches Amin gelöst ist, extrahieren. Geeignete organische Lösungsmittel sind herkömmliche; mit Wasser nicht mischbare polare Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon und Trichloräthylen. Als Amine geeignet sind sekundäre oder tertiäre Amine, in denen ein Substituent ein langkettiger aliphatischer Rest, z.B. mit 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, und der andere ein tertiärer Alkylrest ist, so dass das Molekül lipophil ist. Im erfindungsgemässen Verfahren ist ein flüssiges Anionen-
als Amin
austauscherharz (Amberlite LA2)/besonders geeignet. Im allgemeinen wird das Amin in Form des Säureadditionsalzes eingesetzt. Nach der Extraktion befindet sich die Clavulansäure in der organischen Phase als Aminsalz. Die organische Phase wird dann vom Kulturfiltrat abgetrennt, die Clavulansäure kann in eine wässrige
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Lösung eines Alkalimetallsalzes, wie Natriumchlorid oder Natriumnitrat, extrahiert werden. Durch Gefriertrocknen erhält man dann das rohe Clavulansäuresalz.
Man kann die Clavulansäure aus dem Kulturfiltrat aber auch nach anderen herkömmlichen Verfahren, wie Adsorbtion auf Kohle, Ausfällen > Aussalzen und Molekularfiltration, isolieren. Diese Verfahren werden im allgemeinen in Kombination mit anderen Isolierverfahren verwendet.
Die Adsorption auf Kohle erfolgt im allgemeinen durch Leiten einer wässrigen Lösung des Kulturfiltrats über ein Kohlebett, z.B. durch eine Kohle enthaltende Kolonne. Das Kohlebett wird dann mit Wasser gewaschen und mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel eluiert, z.B. mit einem Keton, wie Aceton. Oft ist es günstig,die Säule zuerst mit Aceton und dann mit wässrigem Aceton zu eluieren.
Gelegentlich ist es günstig, die Clavulansäure als relativ wasserunlösliches Salz, z.B. als Lithiumsalz, herzustellen, wobei das Ausfällen und Aussalzen dann geeignete Methoden sind. Die Ausfällung erfolgt am besten durch Zugatse eines mit Wasser
nicht' mischbare η /
/ " organischen Lösungsmittels zur wässrigen Lösung des relativ wasserunlöslichen Clavulansäuresalzes, z.B. Clavulansäure-Lithiumsalz.So kann man ein Salz der Clavulansäure mit einem Lithiumsalz behandeln, entweder d«rch Eluieren aus
einer Kolonne oder durch Lösen der Salze in der gleichen Lösung , und zu dieser Lösung ein mit Wasser nicht mischbares Lösungs-
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zugeben
mittel/ t wobei das Clavulansäure-Lithiumsalz ausfällt.
Clavulansäure-Lithiumsalz kann man aber auch aus einer wässrigen, das Lithiumclavulansäure-Lithiumsalz enthaltenden Lösung in Gegenwart einer ionischen Lithiumverbindung aussalzen, wobei die Lithiumverbindung am besten das zur Herstellung des Clavulansäure-Lithiumsalzes verwendete Lithiumsalz ist und die Konzentration an Lithiumionen in der Lösung so erhöht wird, dass die Löslichkeit des Clavulansäure-Lithiumsalzes bei dieser Temperatur stark überschritten wird. Da Clavulansäure-Lithiumsalz bei niedrigen Temperaturen weniger löslich ist, erfolgt das Aussalzen am besten bei niedriger Temperatur, z.B. bei O bis 5°C
Die weitere' Reinigung der Clavulansäure-Rohprodukte kann nach verschiedenen Verfahren erfolgen, die Ionenaustauscher-Kolonnenchromatographie ist unter Verwendung von Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisaten mit quartären Ammoniumgruppen oder Diäthylaminocellulose besonders geeignet.
Eine mit Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisat beschickte Kolonne kann durch Gradientenelution mit einer wässrigen Lösung eines Salzes, wie Natriumchlorid,mit einem Gradienten von O bis 0,5 m,eluiert werden. Die mit Diäthylaminoäthylcellulose in 0,01 m Phosphatpuffer bei pH 7 beschickte Kolonne wird mit einer Salzlösung, im allgemeinen mit einer Lösung eines Alkalimetallchlorids, z.B. 0 bis 0,2 m Natriumchlorid in 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7, eluiert. Die aktiven Fraktionen können durch ihre Hemmwirkung auf
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ß-Lactamase und ihre Aktivität im KAG-System erkannt werden
mit (vgl. BE-PS 827 926; das KAG-System besteht aus/Klebsiella aerogenes NCTC *Jl8 beimpften und Penicillin G enthaltenden Agarplatten).Die die Hauptmenge dieser Aktivität enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und entsalzt.
Die Trennung von Clavulansäure und/oder deren Salze von insbesondere anorganischen Salzen, aber auch von anderen Verunreinigungen, erfolgt durch Adsorbieren der antibakteriellen Verbindungen auf ein lipophiles Harz, an dem anorganische Salze nicht adsorbiert werden. Im erfindungsgemässen Verfahren hat sich ein Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymerisat besonders bewährt; das gewünschte Antibiotikum wird von der Kolonne mit Wasser oder, wässrigem Alkanol eluiert, die erhaltene Lösung wird eingedampft und gefriergetrocknet. Das Produkt ist wesentlich reiner. Man kann die Clavulansäure und/oder deren Salze von den anorganischen Salzen aber auch durch Säulenchromatographie mit einem Gelfiltrationsmittel, wie vernetztes Dextrangel oder Polyacrylamidgel, trennen.
Das aktive entsalzene Material kann durch Chromatographie, z.B. auf einer Cellulosesäule^mit einem wässrigen alkoholischen Lösungsmittelsystem, z.B. Butanol/Xthanol/Wasser im Volumverhältnis 11:1:5 (obere Phase) weiter gereinigt werden.
Im erfindungsgemässen Verfahren kann man die Clavulansäure und/ oder deren Salze auch dadurch reinigen, dass man aus der rohen
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Clavulansäure oder deren Salz in herkömmlicher Weise den Ester bildet, diesen Ester reinigt und anschliessend die Clavulansäure oder deren Salz wieder zurückgewinnt. Für diesen Zweck geeignete Ester sind der Benzylester oder andere leicht hydrolysierbare Ester. Die rohe Clavulansäure oder deren Salz kann für dieses Reinigungsverfahren entweder als Peststoff oder als Lösung, die im allgemeinen beträchtliche Mengen an organischen oder anorganischen Verunreinigungen enthält,eingesetzt werden.
Zur Herstellung des Clavulansäureesters wird vorzugsweise ein Salz der Clavulansäure mit einem veresternden Mittel, wie einem reaktiven Halogenid oder einem Sulfonsäureester, umgesetzt. Diese Reaktion erfolgt im allgemeinen in einem organischen Lösungs-
mittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstante, wie Dimethylformamid, Dimethylformamid/Aceton, Dimethylsulfoxid, N-Methylacettamid oder Hexamethylphosphoramid.
Das Clavulansäuresalz kann aber auch in herkömmlicher Weise in dem Lösungsmittel gelöst oder an ein polymeres Trägermittel gebunden werden. Geeignete Trägermittel sind stark basische Anionenaustauscherharze, insbesondere solche mit makroretikularer Struktur, die die Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmittelsystemen erlauben. Das Clavulansäuresalz wird aus dem Kulturfiltrat an das Harz adsorbiert, das Harz wird dann in Dimethylformamid, das Natriumjodid und Benzylbromid enthält, suspendiert. Man kann die Clavulansäure aber auch wie bei einer Kolonne mit einer Lösung von Natriumjodid in Dimethylformamid oder einem Gemisch von Dimethylformamid und Aceton eluieren. Die Clavulansäure in dem
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Eluat wird dann durch Zugabe von Benzylbromid verestert.
Der gebildete unreine Clavulansäureester wird normalerweise chromatographisch gereinigt, d.h. der Ester wird in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat,Methylenchlorid oder Chloroform; gelöst und über eine Säule von Kieselgel oder einem Gelfiltrationsmittel, wie vernetztem Dextran, chromatographiert. Die aus der Säule ablaufenden Fraktionen werden auf die Anwesenheit von Clavulansäureester entweder anhand der synergistischen Eigenschaften oder chemisch durch Umsetzen mit Triphenyltetrasoliumchlorid in Kombination mit Dünnschichtchromatographie untersucht. Aktive Fraktionen werden vereinigt, das organische Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der nach diesem Verfahren hergestellte Ester ist im allgemeinen von ausreichender Reinheit, man kann das Material jedoch noch einmal Chromatographieren.
Der gereinigte Clavulansäureester wird gemäss der BE-PS 827 926 in die Clavulansäure oder deren Salz zurückverwandelt.
Besonders geeignet ist die Hydrierung des Benzylesters. Diese Reaktion erfolgt im allgemeinen in Gegenwart eines Übergangsmetallkatalysators bei niedrigem oder mittlerem Wasserstoffdruck und bei hoher, Raum- oder erniedrigter Temperatur, z.B. 0 bis 10O0C. Besonders geeignet ist ein schwach überatmosphärischer Wasserstoffdruck bei annähernd Raumtemperatur (12 bis 200C). Die Reaktion wird im allgemeinen in einem herkömmlichen Lösungsmittel, wie einem niederen Alkanol, z.B. Äthanol, in Gegenwart von
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Palladium auf Kohle durchgeführt.
Erfolgt die Hydrierung in Gegenwart einer Base, so bildet sich ein Salz der Clavulansäure, z.B. das Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalz bei Verwendung von Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat, Lithium-, Natrium- oder Kaliumcarbonat.
Die im erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Clavulansäure oder deren Salz ist im allgemeinen von guter Reinheit, z.B. mindestens 90 %. Sie kann aber auch praktisch vollkommen rein hergestellt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Streptomyces jumonjinensis NRRL 57^1 werden 7 Tage bei 28°C auf einem festen Schrägagar gezüchtet. Der Agar hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile
Bacto-Hefe-Extrakt (Difco) Bacto-Malz-Extrakt (Difco) Bacto-Dextrose (Difco) gelöst in destilliertem Wasser, das auf pH 7,3 eingestellt wurde, dann mit
Bacto-Agar 20,0
versetzt.
709Ö16/116Ö
Menge H (g/Liter)
10 ,0
k ,0
,0
At
Die Zellen werden von diesem Schrägagar abgekratzt und direkt zum Inokulieren von 100 ml Nährmedium in 500 ml fassendensmit Schaumstoffstöpseln verschlossenen konischen Glasflaschen verwendet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Trypton (Oxoid) 5,0
Hefe-Extrakt 3,0
Das Medium wird vor dem Inokulieren in einem Autoklaven bei bei
1,05 kg/cm UHd^l0C 15 Minuten sterilisiert. Das Nährmedium wird 65 Stunden bei 26°C in einem Drehschüttelapparat mit einem Hub von 2,5*1 cm und 21IO UpM bebrütet.
Je 5 ml dieses Nährmediums werden zum Inokulieren von je 100 ml eines Gärmediums der folgenden Zusammensetzung in 500 ml fassenden, mit Schaumstoffstöpseln verschlossenen konischen Glasflaschen verwendet. Das Gärmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Medium A Glukose
Sojabohnenmehl
CaCO
Na2SO4
20 ,2
10 ,5
0 ,001
0
0
in destilliertem Wasser
709816/1 1 6 β
Bestandteile
Medium B Dextrin
Sojabohnenmehl Melasse
Menge (g/Liter)
KCl
in destilliertem Wasser
Medium C Hefe-Extrakt (Oxoid)
getrocknetes lösliches Malzdestillat in destilliertem Wasser, das vor der Sterilisation auf pH 7 eingestellt wurde.
55 ,3
20 ,0
20
1
1
10
20
(Das Sojabohnenmehl wird von der Firma British Arkady Co., Old Trafford, Manchester, das Malzdestillat von der Firma Thomas Borthwick Ltd., 69 Wellington Street, Glasgow und das Dextrin von der Firma C.P.C. Ltd., Trafford Park, Manchester bezogen.)
Jedes Gärmedium wird vor dem Inokulieren in einem Autoklaven
und
bei 1,05 kg/cm2/bei 121°C 15 Minuten sterilisiert.
Die Medien werden bei 26 C in einem Dreh-Schüttelapparat mit einem
und
Hub von 2,5** cm/bei 2*10 UpM bebrütet. Am zweiten Tag werden aus dem Gärmedium 5-ml-Proben unter sterilen Bedingungen entnommen und bei 2200 g 10 Minuten zentrifugiert. Der überstand wird auf seine Hemmwirkung gegen ein Präparat von E.coli JTiJ-ß-Lactamase in einem· Standard-ß-Lactamase-Hemmtest untersucht (vgl. BE-PS 827 926)
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Beispiel 2
Streptomyces jumonjinensis NRRL 571Jl wird gemäss Beispiel 1 in Medium A gezüchtet. Dem Gärmedium werden unter sterilen Bedingungen 5-ml-Proben in regelmässigen Abständen entnommen und bei 2200 g 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird nach folgenden Verfahren untersucht:
(a) Die antibakterielle Aktivität gegen Klebsieila aerogenes A wird im Lochtest.in einem Platten-Agardiffusionsversuch bestimmt.
(b) Die Aktivität im KAG-Agarplattensystem gemäss BE-PS 827 926 wird gemessen.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefasst.
Tabelle: Aktivität des Überstands
Dauer der Gärung (Tage) 2 — 3 H 7 —
Zonendurchmesser (mm) bei
Klebsieila aerogenes
Zonendurchmesser (mm) im
KAG-System		 20,5
37,1		 17,4
26,8
Am vierten Tag nach Beginn der Gärung werden Proben aus dem Medium auf 1 cm breite Streifen von Whatman-No.!-Chromatographie· papier aufgebracht und über Nacht bei 40C mit folgenden Lösungsmittelsystemen chromatographiert:
n-Butanol/Äthanol/Wasser im Volumverhältnis 4:1:5 (obere Phase) n-Butanol/Essigsäure/Wasser im Volumverhältnis 12:3:5
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Die Streifen werden getrocknet und auf Agarplatten, die mit Klebsieila aerogenes NCTC 4l8 beimpft sind und Penicillin G enthalten (KAG-Plasten) gelegt. Die Platten werden 16 Stunden bei 280C bebrütet, dann werden die Wachstumshemmzonen in beiden Lösungsmittelsystemen untersucht. Man erhält in beiden Systemen nur eine einzige Hemmzone und zwar bei Rf 0,72 mit Butanol/Essigsäure/Wasser und bei Rf 0,25 mit Butanol/Äthanol/Wasser. Diese FL.-Werte sind mit denen einer authentischen Probe von Clavulansäure in den gleichen Systemen identisch.
Beispiel 3
Streptomyces jumonjinensis NRRL 57^1 wird 7 Tage bei 26°C auf festem Schrägagar in Roux-Plaschen gezüchtet. Das Medium besteht aus Bacto-Hefe-Malz-Extrakt-Agar (ISP-Medium 2 der Firma Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.) und wird mit 100 ml sterilem entionisiertem Wasser, das 0,05 % eines Netzmittels
enthält
(Arylalkylpolyätheralkohol)/versetzt. Die Oberfläche der Kultur wird abgekratzt, man erhält eine Suspension von Sporen und Mycelium. 100 ml dieser Suspension werden zum Inokulieren von 50 Liter Nährmediuin in einem 90-Liter fassenden Fermentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen ausgerüstet ist, verwendet.
Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
709816/116β
Bestandteile Menge (g/Liter)
Trypton (Oxoid) 5,0
Hefe-Extrakt (Oxoid) 3,0
Antischaummittel 0,5
in Leitungswasser
(Das Antischaummittel besteht aus einer lOprozentigen Dispersion von Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxyäthylen-Polymerisat der Firma ügine Kuhlmann Chemicals Ltd. in Sojabohnenöl der Firma British Oil & Cake Mills).
Das Medium wird vor dem Inokulieren in dem Fermentator durch Dampf sterilisiert.
Nach dem Inokulieren wird das Nährmedium bei 26°C während Stunden mit einem Leitschaufelrührer mit einem Durchmesser von 12,7 cm und 2*10 UpM gerührt und mit 50 Liter/Minute steriler Luft versorgt.
7,5 Liter dieses Nährmediums werden als Inokulum für 150 Liter Gärmedium in einem 300 Liter fassenden Fermentator aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen ausgerüstet ist, verwendet. Das Gärmedium hat folgende Zusammensetzung:
Bestandteile Menge (g/Liter)
Glukose-monohydrat 20,0
Sojabohnenmehl 10,0
CaCO, 0,2
oH2O 0,001
211 0,5
Antischaummittel 0,5 in Leitungswasser
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(Das Sojabohnenmehl stammt von der Firma British Arkady Co. Ltd., Old Trafford, Manchester,)
Als Antischaummittel wird wie im Nährmedium Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Polyoxyäthylen-Polymerisat verwendet.
Das Medium wird im Fermentator vor dem Inokulieren durch Dampf sterilisiert.
Nach dem Inokulieren wird das Gärmedium mit einem Leitschaufelrührer mit einem Durchmesser von 21,6 cm und 32JO UpM gerührt, mit 150 Liter/Minute steriler Luft versorgtund bei 260C 72 Stunden bebrütet.
Das Medium wird zentrifugiert, die klare Brühe (140 Liter) wird auf pH 6,2 eingestellt und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute auf eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 15 cm und ist auf eine Höhe von 13O cm mit einem vernetzten Polyvinyl-Dibenzol-Polymerisat mit aktiven quartären Ammoniumgruppen (der Firma Zerolit Ltd. U.K.) gefüllt. Die Säule wird bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit 15 Liter gekühltem entionisiertem Wasser gewaschen, dann bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit gekühlter 1 m wässriger Natri'umchloridlösung eluiert. Es werden H-Liter-Fraktionen gesammelt, wobei die Fraktionen mit dem Standardlochtest im KAG-Plattensystern untersucht werden. Die Fraktionen 2 bis 19 mit guter Aktivität im KAG-System werden vereinigt, auf pH 6,2 eingestellt, abgekühlt" und bei einer Fliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute
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auf eine Anionenaustauschersäule aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 30 cm und ist auf eine Höhe von 125 cm mit einem Polystyrol-Divinylbenzol-Polymerisat (der Firma Rohm & Haas, Philadelphia, V.St.A.) gefüllt. Die Kolonne wird mit 5 Liter gekühlter 1 nvNatriumchloridlosung gewaschen und bei 5°C und einer Pliessgeschwindigkeit von 500 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 5-Liter-Fraktionen gesammelt, wobei gerado nach der Eluierung des Natriumchlorids aus der Kolonne begonnen wird. Die die Clavulansäure enthaltenden Fraktionen 3 bis 9 werden vereinigt.
Diese vereinigten Fraktionen (35 Liter) werden durch Umkehrosmose auf das lOfache eingeengt (De Danske Sukkerfabrikker Laboratory Modell, Membrantyp 995)· Dabei wird der Rückstand durch einen Tank aus rostfreiem Stahl geleitet, der mit einem Kühlsystem und einem Austrittsventil einer Ultrafiltrationseinheit ausgerüstet ist, das so eingestellt ist, dass ein
Differienzialdruck von 115 Atmosphären durch die ^O Membranen herrscht. Die Temperatur beträgt 2 bis 5°C, die Lösung wird
durch Zugabe von 2 η Salzsäure auf pH 6,8-0,1 eingestellt.
Das entstandene Konzentrat (3,5 Liter) wird zu einem braunen amorphen Feststoff getrocknet. Ausbeute: 31J g.
2 g dieses amorphen Feststoffs werden gemäss der BE-PS 827 926, Beispiel 17, gereinigt. Man erhält praktisch reines kristallines Clavulansäure-Natriumsalz-Tetrahydrat.
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ar
32 g des amorphen Peststoffs werden mit 10 ml Benzylbromid und 35 ml Dimethylformamid versetzt und ^J Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck entfernt, man erhält einen halbfesten Rückstand, der mit 50 ml Äthylacetat versetzt wird. Eventuell vorhandene Peststoffe werden .abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt, man erhält ein öl, das in einem Minimum von Cyclohexan/ Chloroform im Verhältnis 1:1 gelöst wird und auf eine Ionenaustauscherkolonne aufgegeben wird. Die Kolonne hat einen Durchmesser von 3,8 cm und ist auf eine Höhe von ~$k cm mit vernetztem Dextran (Sephadex LH20 der Firma Pharmacia Ltd.) in Cyclohexan/
Chloroform im Verhältnis 1:1 gefüllt. Die Kolonne wird mit Cyclohexan/Chloroform im Verhältnis 1:1 eluiert. Die ersten 150 ml des Eluats werden verworfen, dann werden 25-ml-Praktionen gesammelt. Durch Aufbringen von 5-Mikroliter-Proben jeder Fraktion auf Kieselgel-Dünnschichtplatten, Entwickeln der Platten mit Cyclohexan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 und Besprühen mit Triphenyltetrazoliumchlorid-Reagens wird der Clavulansäure-benzylester nachgewiesen. Der R_-Wert wird mit dem R„-Wert authentischer Proben von Clavulansäure-benzylester, die auf gleiche Weise chromatographiert wurden, verglichen. ( Das Triphenyltetrazoliumchlorid-Reagens wird durch Vermischen von 1 Teil einer Prozentigen methanolischen Triphenyltetrazoliumchloridlösung mit 1 Teil 1 η Natronlauge hergestellt.)
Die Fraktionen 30 bis 45,die den Clavulansäure-benzylester enthalten »werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt. Dieses öl wird in einem Minimum von Cyclohexan/
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Äthylacetat im Verhältnis 1:1 gelöst und auf eine Kieselgelsäule aufgegeben. Die Säule hat einen Durchmesser von 2,5 cm und eine Höhe von 28 cm und ist mit Cyclohexan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 equilibriert (Kieselgel H für die Dünnschichtchromatographie der Firma Merck). Die Säule wird mit Cyclohexan/Äthylacetat im Verhältnis 1:1 eluiertj es werden 28 Fraktionen zu 7 ml, dann 15-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 31 bis 33.zeigen auf den Kieselgel-Dünnschichtchromatographie-Platten beim Besprühen mit Diphenyltetrazoliumchlorid-Reagens eine rote Farbe. Sie werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft.
Die NMR- und IR-Spektren dieses Öls sind mit den Spektren einer authentischen Probe von Clavulansäure-benzylester identisch.
Beispiel 4
0,5 g des nach Beispiel 3 hergestellten Clavulansäure-benzylesters in 20 ml Äthanol und 5 ml Wasser werden mit 0,13 g lOprozentigem Palladium auf Kohle und 0,15 g Natriumbicarbonat 25 Minuten bei Raumtemperatur und atmosphärischem Wasserstoffdruck hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, mit Wasser und Äthanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden unter vermindertem Druck eingedampft. Das Produkt, Clavulansäure-Natriumsalz-tetrahydrat, wird aus Wasser/Aceton umkristallisiert.
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    il/Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und deren Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet und die Clavulansäure oder deren Salze aus dem Kulturmedium isoliert.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces jumonjinensis NRRL 57^1 oder dessen Mutante bebrütet. -
    3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass
    Calcium-, man das feste Lithium-, Natrium-, Kalium-s/Magnesium-, Barium-, Aluminium-, Ammonium- oder substituierte Ammoniumsalz der Clavulansäure herstellt.
    k. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass man das kristalline Clavulansäure-natriumsalz-tetrahydrat oder das kristalline Kalium- oder Lithiumsalz der Clavulansäure herstellt.
    5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces jumonjinensis bebrütet, die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt und aus dem Kulturfiltrat die Clavulansäure oder deren Salz extrahiert.
    6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz mit einem Lösungsmittel aus
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    2648001
    dem Kulturfiltrat extrahiert.
    7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturfiltrat abkühlt, den pH-Wert auf etwa 2 bis 3 einstellt, die Clavulansäure zuerst in ein mit Wasser nicht mischbares organisches Lösungsmittel extrahiert, daraus dann in eine wässrige Natriumbicarbonatlösung, einen Kaliumhydrogenphosphatpuffer, in eine Calciumcarbonatsuspension oder in Wasser bei etwa neutralem pH-Wert zurückextrahiert und die Clavulansäure oder deren Salz aus diesem wässrigen Extrakt isoliert.
    8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturfiltrat mit einer ein wasserunlösliches Amin enthaltenden organischen Phase in Berührung bringt, die Clavulansäure als Aminsalz in die organische Phase extrahiert, aus dieser Phase die Clavulansäure in eine wässrige Lösung eines Alkalimetallsalzes zurückextrahiert und aus dieser Lösung die Clavulansäure oder deren Salz isoliert.
    9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz aus dem Kulturfiltrat nach Verfahren^die auf der anionischen Natur der Clavulansäure beruhen, extrahiert.
    10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturfiltrat bei einem pH-Wert von 6 bis 7 so lange mit einem schwach oder stark basischen Anionenaustauscherharz kontaktiert, bis das Harz mit Clavulansäure gesättigt ist, das Harz
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    mit einer wässrigen Salzlösung eluiert und aus dem Eluat das Salz der Clavulansäure isoliert.
    11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, dass man das wässrige Kulturfiltrat durch ein Kohlebett filtriert, dieses mit Wasser wäscht und mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel eluiert.
    12. Verfahren nach. Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wasserunlösliches Salz der Clavulansäure aussalzt oder ausfällt.
    13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass man als wasserunlösliches Salz Clavulansäure-Lithiumsalz ausfällt. ' .
    lU. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Ausfällung des Salzes die wässrige Lösung eines relativ wasserunlöslichen Salzes der Clavulansäure mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel versetzt.
    15» Verfahren nach Anspruch 1 bis lh, dadurch gekennzeichnet, dass man das Lithiumsalz der Clavulansäure aus einer wässrigen, .dieses Salz enthaltenden Lösung in Gegenwart einer ionischen Lithiumverbindung aussalzt, wobei die Lithiumverbindung das zur Herstellung des Clavulansäure-Lithiumsalzes verwendete Lithiumsalz ist,
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    16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15» dadurch gekennzeichnet, dass man in herkömmlicher Weise einen Ester der Clavulansäure herstellt, den Ester reinigt und daraus die Clavulansäure oder deren Salz
    zurückgewinnt.
    17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass man den Ester der Clavulansäure durch Umsetzen eines Salzes der
    Clavulansäure mit einem reakt5.ven Halogenid oder Sulfonsäureester herstellt.
    18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet, dass man als reaktives Halogenid Benzylbromid verwendet.
    19» Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz durch Hydrieren des Esters
    gewinnt.
    20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass man die Clavulansäure oder deren Salz durch Ionenaustauscherchromatographie weiter reinigt.
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