Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia soli kwasu klawulanowego na drodze fermen¬ tacji Streptomyces jumonjinensis. Kwas klawulanowy o wzorze 1, który jest uzy¬ tecznym zwiazkiem o dzialaniu przeciwbakteryj- nym, oiraz jego sole i estry opisane sa w belgij¬ skim opisie patentowym nr 827926. W opisie tym przedstawiony jest równiez spo¬ sób wytwarzania kwasiu klaw'Ulanowego i jego po¬ chodnych na drodze fermentacji Streptomyces clavuligerus. Streptomyces jumonjinensis opisany jest w bel¬ gijskim opisie patentowym nr 804341 jako szczep bakteryjny wytwarzajacy czynnik przeciwbakte- ryjny inny niz kwas klawulanowy. Obecnie stwier¬ dzono, ze w trakcie hodowania Streptomyces ju¬ monjinensis powstaje równiez kwas klawulanowy. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia soli kwasu klawulanowego o wzorze 1, który polega na tym, ze hoduje sie szczep Streptomyces jumonjinensis a nastepnie usuwa sie komórki ze srodowiska fermentacyjnego, kontaktuje sie skla¬ rowana brzeczke przy pH=6—7 ze slabo lub silnie zasadowa zywica jonowymienna do momen¬ tu az zywica zostanie nasycona kwasem klawula- nowym, wymywa sie zywice wodnym roztworem soli, rozdziela sie frakcje wykazujace aktywnosc inhibitorów ^-laktamazy, wysala sie te frakcje i wyodrebnia sól kwasu klawulanowego. Kwas klawulanowy odzyskuje sie w postaci sta- lych soli litu, sodu, potasu wapnia, magnezu, ba¬ ru, glinu, amonu lub podstawionych soli amonu, takich jak pierwszo, drugo, trzecio- i czwartorze¬ dowe sole amonowe. Korzystnie kwas klawulanowy odzyskiwany jest w postaci stalej soli metalu alkalicznego, takiej jak sól sodowa lub potasowa. Termin „stale sole kwasu klawulanowego" ozna¬ cza w opisie krystaliczne i bezpostaciowe sole kwasu klawulanowego. Sole kwasu klawulanowe¬ go korzystnie jest uzyskiwac w postaci krystalicz¬ nej, na przyklad jako krystaliczna, czterowodna sól sodowa kwasu klawulanowego lub jako krystalicz¬ na sól potasowa lub sodowa. W sposobie wedlug wynalazku korzystnie jest stosowac Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 lub jego wysoko wydajny mutant. Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 zdepono¬ wany jest w Baarn w Holandii jako CBS 177.76 i w German Collection of Microorganisms DSN. Uzywany w opisie termin „hodowanie" oznacza umyslny rozwój w warunkach aerobowych orga¬ nizmu wytwarzajacego kwas klawulanowy w obec¬ nosci przyswajalnych zródel wegla, azotu i soli mineralnych. Rozwój taki moze miec miejsce w stalym lub pólplynnym srodowisku odzywczym, lub w 'srodowisku cieklym, w którym odzywki sa rozpuszczone lub zdyspergowane. Hodowanie moze byc prowadzone w warunkach aerobowego lub calkowitego zalania. Srodowisko odzywcze moze 105 4943 105 494 4 byc utworzone ze zlozonych odzywek, lub moze byc zdefiniowane chemicznie. W belgijskini opisie patentowym nr 804,341 przedstawione sa ogólne warunki hodowania Streptomyces jumonjinensis. Jak stwierdzono, szczególnie przydatne sa sro¬ dowiska zawierajace takie zolozone odzywki jak ekstrakt drozdzowy, maczka sojowa itp. Srodowisko odzywcze^ które moza byc stosowa¬ ne do hodowania Streptomyces jumonjinensis mo¬ ze zawierac w granicach 0,1—10% zlozone, orga¬ niczne zródlo azotu, takie jak ekstrakt drozdzowy, wodny roztwór merceryzowanej kukurydzy, bialko roslinne, bialko nasienne, produkty hydrolizy ta¬ kich bialek, hydrolizaty] bialka pochodzacego z mleka, ekstrakty ryb i miesa, i hydrolizaty takie jak peptony. Jako chemicznie zdefiniowane zródla azotu mozna stosowac mocznik, sole amonowe, amidy, zwykle' aminokwasy takie jak walina, as- paragina, kwas glutaminowy, prolina i fenyloala- nina, lub ich mieszaniny. Do srodowiska odzywcze¬ go moga byc wlaczone weglowodowany w ilosci 0,1—5%- Mozna stosowac równiez skrobie lub pro¬ dukty jej hydrolizy takie jak dekstryna, sacharo¬ za, laktoza lub inne cukry, lub gliceryne lub estry gliceryny. Zródlami wegla moga byc oleje roslinne lub tluszcze zwierzece. Do srodowiska odzywczego moga byc równiez wlaczone kwasy karboksylowe i ich sole, jako zródlo wegla dla wzrostu i wytwa¬ rzania inhibitorów {J-laktamazy. Niezbedne moze byc dodanie srodków przeciw- pieniacych takich jak Pluronic L81, w celu regu¬ lowania pienienia niektórych srodowisk w ka¬ dziach fermentacyjnych. Do opisanego wyzej srodowiska, zwlaszcza jesli jest zdefiniowane chemicznie, mozna dodac soli mineralnych takich jak NaCl, KC1, MgCl2, ZNC12, FeCl3, Na*S04, FES04, MgS04 isoli Na+ i K+kwa¬ su fosforowego. CaCOt mozna dodac jako zródlo jonów Ca++ luib dla jego dzialania buforujacego. Mozna wlaczyc równiez sladowe ilosci soli takich pierwiastków jak nikiel, kobalt lub mangan. W razie potrzeby mozna dodac witamin. Stosowany w opisie termin „mutant" oznacza dowolny mutant szczepu pojawiajacy sie samo¬ rzutnie lub w wyniku dzialania czynnika zew¬ netrznego, bezj wzgledu na to, czy czynnik taki stosowany jest umyslnie czy przypadkowo. Odpo¬ wiednie sposoby tworzenia mutantów obejmuja równiez sposoby opisane w belgijskim opisie pa¬ tentowym nr 827,926. Hodowania Streptomyces jumonjinensis prowa¬ dzi sie normalnie w temperaturze w granicach 16—35°C, zwykle w granicach 20—32°C, a korzyst¬ nie w" granicach 25—30°C, na przyklad w tempe¬ raturze okolo 27°C, i przy pH w granicach 5—8,5, a korzystniej w granicach 6—7,5. Streptomyces jumonjinensis moze byc hodowa¬ ny w takim srodowisku umieszczonym w zwyk¬ lych naczyniach, na przyklad w szklanych kolbach stozkowych napowietrzanych przez wstrzasanie, na przyklad na wstrzasarce obrotowej, lub w napo¬ wietrzanych kadziach fermentacyjnych, na przy¬ klad w zaopatrzonych w przegrody kadziach fer¬ mentacyjnych wykonanych z nierdzewnej stali i mieszanych przy pomocy wirnika zaopatrzonego w tarcze z lopatkami, a napowietrzanych przez urzadzenie rozpryskujace. Fermentacje mozna rów¬ niez prowadzic w sposób ciagly. Wyjsciowe pH srodowiska poddawanego fermen¬ tacji wynosi zwykle 7,0, a maksymalna wydajnosc kwasu klawulanowego uzyskuje sie w okresie 1—10 dni hodowli w temperaturze 20—32°C, na przyklad w okresie 2—5 dni. Kwas klawulanowy* jak i jego sole moga byc ekstrahowane z przesaczu hodowli róznymi sposo¬ bami opisanymi w belgijskim opisie patentowym nr 827,926. Jak stwierdzono, szczególnie uzyteczne sa sposoby polegajace na ekstrahowaniu rozpusz¬ czalnikiem zimnego przesaczu hodowli o kwaso¬ wych wartosciach pH, oraz metody oparte na anio¬ nowym charakterze tego produktu przemiany ma¬ terii, takie jak zastosowanie anionitów organicz¬ nych. Zwykle przed ekstrakcja usuwa sie ze srodowi¬ ska hodowli na drodze filtracji lub odwirowania komórki Streptomyces jumonjinensis. W procesie ekstrakcji rozpuszczalnikiem przesacz hodowli schladza sie, obniza jego pH do zakresu pH=2—3 przez dodanie kwasu, po czym do¬ kladnie miesza z nie mieszajacym sie z woda roz¬ puszczalnikiem organicznym takim jak ootan n-butylu, metyloizobutyloketon, n-butanol lub oc¬ tan etylu. Do obnizenia pH srodowiska stosuje sie zwykle kwas nieorganiczny taki jak kwas chloro¬ wodorowy, siarkowy, azotowy, fosforowy itp., na¬ tomiast do ekstrakcji zakwaszonego przesaczu ho¬ dowli szczególnie przydatny jest n-butanol. Po roz¬ dzieleniu faz na drodze odwirowania, kwas klawu- lanowy bedacy produktem przemiany materii wspomnianego szczepu ekstrahuje sie z warstwy rozpuszczalnika wodnym roztworem kwasnego' we¬ glanu sodowego lub buforem wodorofosforanu po¬ tasowego, zawiesina CaC03 lub woda, utrzymujac pH mieszaniny! w granicach odczynu obojetnego, na przyklad przy pH = 7,0. Wyciag wodny, po rozdzieleniu faz, mozna zatezyc pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizowac w celu uzyskania surowe¬ go osadu soli kwasu klawulanowego. Uzyskany produkt jest trwaly w przypadku przechowywania go w temepraturze —20 °C, w' postaci wysuszonej substancji stalej. W procesie z uzyciem; anionitu organicznego, obojetny lub lekko kwasny przesacz hodowli, na przyklad o pH = 6—7, wprowadza sie w kontakt ze zlozem anionitui organicznego o charakterze slabej lub mocnej zasady, odpowiednio takiego jak Amiberlite IR4B lub Zerolit FFIP, az do calkowi¬ tego nasycenia zywicy, co objawia sie obecnoscia kwasu klawulanowego w wycieku ze zloza. Wów¬ czas zloze przemywa sie woda i eluuje wodnym roztworem soli takiej jak chlorek metalu alkalicz¬ nego, na przyklad chlorek sodowy. Frakcje zawie¬ rajace kwas klawulanowy laczy sie, wysala i liofi¬ lizuje, uzyskujac surowy osad soli kwasu klawula¬ nowego. Amberlite IR4B jest przykladem anionitu organicznego o charakterze slabej zasady, z aktyw¬ nymi grupami poliaminowymi i uisieciowanym pod¬ lozem polistyrenowo-dwuwinylowo-benzenowym. Innymi, nadajacymi sie do tego celu amonitami 55 40 45 50 555 105 494 6 organicznymi sa Amberlite IRA68 i IRA93. Ze- rolit FFIP jest anionitem 'organicznym o charakte¬ rze mocnej zasady, posiadajacym aktywne, czwar¬ torzedowe grupy amonowe i usieciowane podloze poliwinylowo-dwuwinylobenzeniOwe. Zywice rów¬ nowazne Zerolitowi FFIP to Isopor FFIP oraz DeAcidite FFIP SRA 64, 61 i 62 . Alternatywna postacia procesu ekstrakcji jest sposób polegajacy na zetknieciu przesaczu hodowli (zwykle o odczynie zblizonym do obojetnego) za¬ wierajacej sól kwasu klawulanowego z warstwa organiczna, w której rozpuszczona jest nierozpusz¬ czalna w wodzie amina. Odpowiednimi do tego celu rozpuszczalnikami organicznymi sa takie ty¬ powe, nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki polarne jak metyloizobuty — loketon, trójchloro¬ etylen ,itp. a odpowiednimi aminami sa aminy dru¬ gorzedowe lub trzeciorzedowe, w których jednym z podlstawriików jest grupa bedaca dlugim lancu¬ chem alifatycznym o 12—16 atomach wegla, a dru¬ gim Ill-rz. grupa alkilowa, dzieki czemu czastecz¬ ka jest lipofilowa. W naszym przypadku korzyst¬ na amina okazal sie Amberlite LA2. Zwykle ami¬ ne stosuje sie w postaci soli addycyjnej z kwa¬ sem. Po ekstrakcji, kwas klawulanowy znajduje sie w warstwie organicznej w postaci soli amino¬ wej. Nastepnie warstwe organiczna oddziela sie od przesaczu hodowli. Z warstwy organicznej kwas klawulanowy mozna ekstrahowac wodnym roztwo¬ rem soli metalu alkalicznego, takiej jak chlorek sodowy, azotan sodowy itp. Surowy osad soli kwa¬ su klawulanowego mozna uzyskac na drodze liofi¬ lizowania lub w podobny sposób. Do innych sposobów wydzielania kwasu klawu¬ lanowego mozna zaliczyc adsorpcje na weglu, stra¬ canie, wysalanie i filtracje na sitach molekular¬ nych. Sposoby te stosuje sie zwykle w polaczeniu z innymi metodami wydzielania. Adsorpcje na weglu mozna korzystnie prowadzic przepuszczajac wodny roztwór hodowli przez zloze wegla drzewnego, na przyklad przez kolumne wy¬ pelniona weglem drzewnym. Nastepnie warstwe wegla przemywa sie korzystnie woda i eluuje wodnym roztworem mieszajacego sie z woda roz¬ puszczalnika, takiego keton, na przyklad aceton, zbierajac frakcje zawierajace kwas klawulanowy. Czesto; wygodnie jest eluowac wegiel najpierw acetonem, a potem roztworem wodnym acetonu. Czesto korzystnie jest wytwarzac kwas klawula¬ nowy w postaci soli stosunkowo slabo rozpuszczal¬ nej w wodzie, na przyklad w postaci soli litowej. W tym przypadku mozna stosowac metody pole¬ gajace na wytracaniu lub wysalaniu. Wytracanie mozna prowadzic dodajac do wodnego roztworu stosunkowo slaborozpuszczalnej w wodzie soli kwasu klawulanowego, na przyklad klawulanianu litowego, czy nierozpuszczalnego w wodzie roz¬ puszczalnika organicznego. Proces taki mozna ko¬ rzystnie prowadzic kontaktujac sól kwasu klawu¬ lanowego z sola litowa, lub eluujac sola litowa z kolumny, lub rozpuszczajac sole w tym samym roztworze i dodajac mieszajacego sie z woda roz¬ puszczalnika do roztworu zawierajacego klawula- nian litowy. Klawulanian litowy mozna uzyskac z jego wod¬ nego roztworu w obecnosci jonowego zwiazku li¬ tu, korzystnie soli litowej uzywanej do utworze¬ nia klawulanianu litowego, zwiekszajac stezenie jonów litu w roztworze tak, by spowodowac znacz¬ ne przekroczenie wspólczynnika rozpuszczalnosci klawulanianu litowego w danej temperaturze. Po¬ niewaz klawulanian litowy w nizszych temperatu¬ rach jest slabiej rozpuszczalny, proces korzystnie jest prowadzic w obnizonej temperaturze, na przyklad w temperaturze w granicach 0—5°C. Dalsze uzyskanie surowych osadów uzyskanych opisanymi wyzej metodami mozna prowadzic w rózny sposób, lecz szczególnie korzystne jest sto¬ sowanie oczyszczania chromatograficznego w ko¬ lumnie jonitowej, zwlaszcza, gdy jako jonit stosuje sie Isopor, DeAcidite FFIP SRA64 lub celuloze DEAE. Kolumne wypelniona DeAcidite mozna stopniowo eluowac wodnym roztworem soli, takiej jak chlorek sodowy, o stezeniu zmieniajacym sie od 0 do 0,5 m. Kolumne wypelniona celuloza DEAE w 0,01 m buforze fosforanowym o pH = 7 mozna eluowac roztworem soli, zwykle roztworem chlorku metalu alkalicznego, takim jak roztwór NaCl o stezeniu 0—0,2 m NaCl w 0,01 m buforze fosforanowym o pH = 7. Frakcje zawierajace sub¬ stancje aktywne mozna wykrywac badajac aktyw¬ nosc inhiibitofwania p-laktamazy i ich oddzia¬ lywania na uklad KAG — obie te metody opisane sa w belgijskim opisie patentowym nr 827926. Frakcje zawierajace zwiazki aktywne laczy sie, zateza pod próznia do niewielkiej objetosci i od¬ sala. Oddzielanie kwasu klawulanowego i/lub jego soli od substancji zanieczyszczajacych, zwlaszcza od soli nieorganicznych, prowadzi sie adsorbujac zwiazek o dzialaniu przeciwbakteryjnym na zywi¬ cy lipofilowej, na której nie adsorbuja sie sole nieorganiczne. Szczególnie uzyteczny do tego celu jest kopolimer polistyrenowó-dwuwinylobenzeno- wy taki jak Amberlite XAD-4 Pozadany antybio¬ tyk mozna wymywac z kolumny woda lub wod¬ nym roztworem alkanolu, a uzyskany roztwór za- tezac przez odparowanie i liofilizowac. W wyniku uzyskuje sie produkt o wiekszej czystosci. Oddzie¬ lanie kwasu klawulanowego i/lub jego soli od so¬ li nieorganicznych mozna równiez korzystnie pro¬ wadzic na drodze chromatograficznej w kolumnie wypelnionej zelem stosowanym do filtracji, na przyklad usieciowanym zelem dekstranowym ta¬ kim jak Sephadex G 15 lub zelem poliamidoakry- lowym takim jak Biogel P2. (Biogel P2, Sephadex G15 i Amberlite XAD-4 dostarczony byl przez odpowiednie firmy: Bio Rad, Richmond, USA, Pharmacia Great Britain Ltd, 75 Uxbri)clge Road, London W. 5., U. K. i Rohm and Haas, Philadelphia, USA). Odsolona substancje aktywna mozna oczyszczac dalej na drodze chromatograficznej, na przyklad w kolumnie wypelnionej celuloza, przy uzyciu ukladu rozpuszczalników typu woda — alkohol, na przyklad ukladu butanol:etanol:woda w stosunku 4:1:5 (w % objetosciowych). Odmiany procesie wytwarzania czystego kwasu klawulanowego lub jego soli obejmuja uzyskiwa¬ nie zanieczyszczonego kwasu klawulanowego lub a 40 45 50 55 607 105 494 8 jego soli, utworzenie w zwykly sposób estru, oczyszczanie estru, i nasitepnie regenerowanie z niego kwasu klawulanowego lub jego soli. Odpo- wiednirn estfem do wykorzystania w tej odmia¬ nie sposobu wedlug wynalazku jest ester benzylo¬ wy lub podobny, ulegajacy wodorolizie ester. Zanieczyszczony kwas klawulanowy lub jego sól, która poddaje sie oczyszczaniu sposobem wedlug wynalazku, moze miec postac osadu lub roztworu zawierajacego równiez znaczne ilosci zanieczysz¬ czen organicznych lub nieorganicznych. Kwas klawulanowy lub jego sól mozna przepro¬ wadzic w ester na drodze opisanych wyzej reakcji estryfikacji. Preferowanym sposobem tworzenia pozadanego estru kwasu klawulanowego jest pod¬ danie soli kwasu klawulanowego reakcji z czynni¬ kiem estryfikujacym takim jak reaktywny haloge¬ nek, ester siarczanowy itp. Reakcje takie prowadzi sie czesto w rozpuszczalniku organicznym o wyso¬ kiej stalejt dielektrycznej, takim jak dwumetylo- formamid, mieszanina dwumetyloformamidu i ace¬ tonu, dwumetylosulfotlenek, N-metyloacetamid, szesciometylofosforamid itp. W razie potrzeby, sól kwasu kalwulanowego mozna rozpuscic w zwykly sposób w rozpuszczal¬ niku lub zwiazac z nosnikiem. Odpowiednimi nos¬ nikami do zastosowania w tym procesie sa amo¬ nity organiczne o charakterze mocnej zasady, zwlaszcza te, które posiadaja budowe makrosiatko- wa, pozwalajaca na uzycie ukladów rozpuszczalni¬ ków nie zawierajacych wody. Jak stwierdzono, do tego celu nadaje sie Amberlyst A26. Sól { kwasu klawulanowego mozna adsorbowac na zywicy bez¬ posrednio z przesaczu hodowli, po czym zywice dyspergowac w dwumetyloformamidzie zawieraja¬ cym jodek sodowy i bromek benzylu. Alternatyw¬ nie, kwas klawulanowy mozna eluowac metoda kolumnowa przy uzyciu roztworu jodku sodowego w dwumetyloformamidzie lub mieszaninie dwu¬ metyloformamidu i acetonu. Kwas klawulanowy zawarty w wycieku estryfikuje sie przez dodanie bromku benzylu. Zanieczyszczony ester kwasu klawulanowego oczyszcza sie zwykle na drodze chromatograficznej. W tym przypadku ester rozpuszcza sie w rozpusz¬ czalniku organicznym takim jak octan etylu, chlo¬ rek metylenu, chloroform itp. Faze stala w proce¬ sie oczyszczania chromatograficznego stanowi zwykle zel krzemionkowy lub zel stosowany do fil¬ tracji, taki jak Sephadex LH 30 lub podobne pod wzgledem przydatnosci w chromatografii substan¬ cje. Frakcje wyplywajace z kolumny mozna badac na obecnosc estru kwasu klawulanowego wykorzy¬ stujac jego wlasnosci synergiczne, lub poddajac próbom chemicznym, takim jak reakcja z chlor¬ kiem trójfenylotetrazolowym w polaczeniu z chro¬ matografia cienkowarstwowa. Frakcje aktywne laczy sie i pod zmniejszonym cisnieniem odpedza z nich rozpuszczalnik. Ester uzyskany tym sposobem posiada zwykle dostateczna czystosc, lecz w razie potrzeby moze byc poddany ponownemu oczyszczeniu na drodze chromatograficznej. Oczyszczony ester kwasu klawulanowego mozna przeprowadzic w kwas klawulanowy lub jego sól na drodze sposobów opisanych w belgijskim opisie patentowym nr 827926. Szczególnie uzytecznym sposobem odzyskiwania kwasu klawulanowego lub jego soli z estru. jest wodoroliza estru benzylowego. Reakcje takie pro¬ wadzi sie zwykle w obecnosci metalu grupy przej¬ sciowej jako katalizatora, przy zastosowaniu ni¬ skiego lub sredniego cisnienia wodoru. Reakcje mozna prowadzic w temperaturze podwyzszonej, obnizonej lub równej temperaturze otoczenia, na przyklad w temperaturze w granicach 0—100°C. Szczególnie korzystnymi warunkami prowadzenia takiego uwodornienia jest( zastosowanie lekkiego nadcisnienia wodoru i temperatury zblizonej do temperatury otoczenia (12—20°C). Reakcje mozna prowadzic w typowych rozpuszczalnikach takich jak nizsze alkanole, na przyklad etanol. Jak stwierdzono, szczególnie korzystnym katalizatorem jest pallad na weglu drzewnym. W przypadku, gdy uwodornienie prowadzi sie w obecnosci zasady, jako produkt uzyskuje sie sól kwasu klawulanowego. I tak, sól litowa, sodowa lub potasowa uzyskuje sie w przypadku, gdy reak¬ cje prowadzi sie w obecnosci kwasnego weglanu sodowego lub potasowego, lub weglanu litowego, sodowego lub potasowego. W wyniku takich reakcji uzyskuje sie dostatecz¬ nie czysty kwas klawulanowy lub jego sól (na przyklad o czystosci co najmniej 90%, a zwykle mozna uzyskiwac kwas calkowicie czysty). Przyklad I. Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 hoduje sie w ciagu 7 dni w tempe¬ raturze 28°C na stalych; pochylonych powierzch¬ niach agarowych o nastepujacym skladzie: Bacto — ekstrakt drozdzowy (Difco) 4,0 g/l Bacto — ekstrakt slodowy (Difco) 10,0 g/l Bacto — desktroza (Difco) 4,0 g/l Powyzsze skladniki rozpuszcza sie w wodzie de¬ stylowanej, pH roztworu doprowadza sie do war¬ tosci 7,3 i dodaje Bacto —agar 20,0 g/l Narosl zeskrobana z powierzchni uzywa sie bez¬ posrednio do zaszczepienia 100 ml srodowiska na¬ siennego umieszczonego w 500 ml kolbach stozko¬ wych zamknietych korkami piankowymi z tworzy¬ wa sztucznego. Sklad srodowiska jest nastepujacy: Tryptone (Oxoid) 5,0 g/l Ekstrakt drozdzowy 3,0 g/l Srodowisko przed zaszczepieniem wyjalawia sie w ciagu 15 minut w autoklawie pod cisnieniem 1,05 at, w temperaturze 121°C. Zaszczepione, in- kubuje sie w ciagu 65 godzin w temperaturze 26°C umieszczajac je na wstrzasarce obrotowej o 240 obrotach na minute i skoku ok. 2,54 cm. ml porcje srodowiska nasiennego uzywane sa do zaszczepiania 100 ml porcji srodowiska fermen¬ tacyjnego umieszczonego w 500 ml kolbach stozko¬ wych zaopatrzonych w korki piankowe. Stosuje sie trzy rózne srodowiska fermentacyj¬ ne o nastepujacych skladach: 40 45 50 55 609 195 494 lt Srodowisko A Glikoza Maczka sojowa CaC03 NsjSOa COCl2. 6H2Q g/l g/l 0,2 g/l 0,5 g/l 0,001 g/l Rozdrobione w wodzie destylowanej Srodowisko B Dekstryna Maczka sojowa Melasa NaHzP04 KC1 55 g/l g/l g/l 1,3 g/l 1,0 g/l Rozdrobione w wodzie destylowanej Srodowisko C Ekstrakt drozdzowy Scotasol (Oxoid) 10 g/l g/l Rozdrobione w wodzie destylowanej, przed ste¬ rylizacja pH srodowiska doprowadza sie do war¬ tosci 7. Jako maczke sojowa stosuje sie Arkasoy 50 z firmy British Arkday Co., Old Trafford, Manchester; Scotasol jest suszonym, rozpuszczal¬ nym slodem gorzelnianym z firmy Thomas Borth- wick Ltd., 69 Wellington Street, Glasgow, U. K.; dekstyrna pochodzi z firmy C.P.G. (U.K.) Ltd., Trafford Park, Manchester U.K.). Wszystkie srodowiska fermentacyjne przed zasz¬ czepieniem wyjalawia sie w ciagu 15 minut w au¬ toklawie pod cisnieniem 1,05 at, w temperaturze 121°C. Kolby z medium fermentacyjnym inkubuje sie w tempraturze 26QC, umieszczajac je na wstrza- sarce obrotowej o predkosci 240 obrotów na minu¬ te jf o skoku okolo 2,54 cm. Drugiego dnia fer¬ mentacji z kolb pobiera sie w warunkach jalo¬ wych 5 ml próbki medium i poddaje je nastepuja¬ cemu postepowaniu: Próbki odwirowuje sie z predkoscia 2200 obr/min w ciagu 10 minut, po czym oddziela warstwe wierzchnia. Oddzielona warstwa wykazuje dzia¬ lanie inhibitujace wytwarzanie p-laktamazy przez E.coli J.T4 w standardowej próbie inhibito- wania ^-laktamazy. Odpowiednia próbka inhibito- wania fl-laktamazy opisana jest w belgijskim opi¬ sie patentowym nr 827926. Przyklad II. Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 hoduje sie na srodowisku A w sposób opisany w przykladzie I. W równych odstepach czasu pobiera sie ze srodowiska fermentacyjnego w warunkach jalowych 5 ml próbki. Warstwe gór¬ na uzyskana w wyniku odwirowania tych próbek w ciagu 10 minut z predkoscia 2200 obr/min pod¬ daje sie licznym, opisanym nizej testom: (a) badaniu dzialania przeciwbakteryjnego na przykladzie Klebsiella aerogenes A, przy zastoso¬ waniu próby dyfuzji przez otwór w plytce aga¬ rowej, (b) badaniu aktywnosci w próbie plytki agaro¬ wej KAG opisanej w belgijskim opisie patento¬ wym nr 827926. 40 45 50 55 60 65 Rodzaj próby Srednica obszaru Klebsiella aerogenes (mm) | Srednica obszaru w próbie KAG (mm) Czas fermentacji (dni) 1 2 4 ,5 37sl 3 17,4 26,8 7 | Próbki z 4 dnia fermentacji umieszcza sie na paskach bibuly chromatograficznej Whatmana nr 1 o szerokosci 1 cm i podaje w ciagu nocy w temperaturze 4°C rozwijaniu przy pomocy na¬ stepujacych ukladów rozpuszczalników: n-butanol:etanol:woda 4:1:5 (w % objetosciowych) n-butanol:kwas octowy:woda 12:3:5 (w % objetosciowych) Nastepnie paski suszy sie i umieszcza na plyt¬ kach agarowych zakazonych Klebsiella aerogenes NCTC 418 i zawierajacych penicyline C (plytki KAG), po czym calosc inkubuje w ciagfu 16 go¬ dzin w temperaturze 28°C. Porównujac wyniki uzyskane dla obu ukladów rozpuszczalników moz¬ na stwierdzic, ze w przypadku ukladu butanol/ /kwas octowy/ woda pojedyncza strefa inhibitowa- nia wystepuje przy RF = 0,72, a, w przypadku ukladu butanol/ etanol/ woda — przy Rr = 0,25. W tym samym ukladzie rozpuszczalników wartosci RF, dla zwyklych próbek sal takie same jak dla autentycznych próbek kwasu klawulanowego. Przyklad III. Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 hoduje sie w ciagu 7 dni w tempera¬ turze 26°C na stalych, nachylonych powierzchniach agarowych umieszczonych w kolbach Roux. Sro¬ dowisko agarowe tworzy: Bacto — Yesast Malt Ekstract Agar (ISP — srodowisko 2). (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A). Do kolby Roux'a dodaje sie 100 ml jalowej, zde- mineralizowanej wody zawierajacej 0,05% Trito- nu X (srodek powierzchniowo czynny), pol czym zeskrobuje hodowle z powierzchni w celu utwo¬ rzenia zawiesiny komórek i zarodków. 100 ml uzyskanej zawiesiny uzywa sie do zaszczepienia 50 litrów srodowiska nasiennego umieszczonego w za¬ opatrzonej w przegrody 90-litrowej kadzi fermen¬ tacyjnej z nierdzewnej stali. Srodowisko nasienne tworzy sie z nastepujacych skladników: g/l Tryptone (Oxoid) 5,0 Ekstrakt drozdzowy (Oxoid) 3,0 Srodek przeciwpieniacy 0,5 Calosc rozrobiona w wodzie (Srodek przecwipieniacy sklada sie z 10% Pluronic L81 (Ugine Kuhlmann Chemicals Ltd.) zdyspergo- wanego w oleju sojowym (British Oil and Cake Mills). Przed zaszczepieniem isrodowisko wyjalawia sie w kadzi fermentacyjnej para wodna. Po zaszczepieniu, srodowisko nasienne wytrzasa11 105 494 12 sie przy uzyciu plytki rozpryskujacej o srednicy ok. 12,7 cm obracajacej sie z predkoscia 240 obr/min. Do kadzi dostarcza sie jalowe powietrze w ilosci 50 litrów/minute, utrzymujac temperature srodowiska w poblizu 26°C. Hodowanie prowadzi sie w ciagu 48 godzin. 7,5 litra srodowiska nasiennego uzywa sie do zaszczepiania 150 1 srodowiska fermentacyjnego umieszczonego w zaopatrzonej w przegrody 300 1 kadzi fermentacyjnej ze stali nierdzewnej. Srodowisko fermentacyjne utworzone jest z na¬ stepujacych skladników: g/l Jednowodzian glikozy 20,0 Maczka sojowa 10,0 CaC03 0,2 COClf.6HiO 0,001 Na2S04 0,5 Srodek przeciwpieniacy 0,5 Calosc rozrobiona w wodzie (Maczke sojowa stanowi Arkasoy 50 z firmy Britisn Arkady CO., Ltd., Old Trafford, Manche¬ ster). Stosuje sie taki sam srodek przeciwpieniacy jak w srodowisku nasiennym. Przed zaszczepieniem, srodowisko wyjalawia sie w kadzi fermentacyjnej przy pomocy pary wodnej. Po zaszczepieniu, srodowisko wstrzasa sie przy pomocy plytki rozpryskujacej o srednicy ok. 15,5 cm, obracajacej sie z predkoscia 340 obr/min. Do kadzi dostarcza sie jalowe powietrze w ilosci 150 l/min, utrzymujac temperature srodowiska w poblizu 26°C. Cala fermentacje prowadzi sie w ciagu 72 godzin. Uzyskana mieszanine odwirowuje sie i oddziela 140 1 sklarowanego roztworu, doprowadzajac jego pH do wartosci 6,2. Nastepnie uzyskany roztwór przepuszcza sie z predkoscia 500 ml/min przez wy¬ pelnienie o wymiarach 15X130 cm, które stanowi anionit organiczny o charakterze mocnej zasady, taki jak, Zerolit FF(ip) SRA61 (Zerolit Ltd U.K.). Nastepnie kolumne przemywa sie 15 1 schlodzonej, zdemineralizowanej wody z predkoscia 500 ml/min, po czym eluuje z ta sama predkoscia schlodzonym, 1 m roztworem wodnym NaCl, zbierajac frakcje 4-litrowe. Frakcje sprawdza sie przy pomocy standardowe¬ go testu biologicznego na plytke KAG. Frakcje wykazujace odpowiednia aktywnosc (sa to frak¬ cje 2—19) laczy sie, doprowadza ich pH do wartosci 6,2, schladza i przepuszcza z predkoscia 500 ml/min przez kolumne wypelniona warstwa Amberlite XAD-4 o wymiarach 30X125 cm (Rohm and Haas, Philadelphia, USA). Kolumne przemy¬ wa sie 5 1 schlodzonego 1 m roztworu NaCl, po czym eluuje z predkoscia 500 ml/min woda zde- mineralizowana o temperaturze 5°C. Zbiera sie frakcje 5 litrowe rozpoczynajac od frakcji wymy¬ wajacych NaCl z kolumny. Frakcje 3—9 zawieraja¬ ce kwas klawulanowy laczy sie ze soba. 1 polaczonych frakcji zateza sie 10-krotnie na drodze odwrotnej osmozy (De Danske Sukkerfa- brikker Laboratory Module; membrana typu 995). Prowadzenie procesu polega na recyrkulowaniu frakcji ze zbiornika wykonanego ze stali nierdzew¬ nej, zaopatrzonego W uklad chlodzacy i tak usta¬ wiony zawór wylotowy z ukladu ultrafiltracji, by uzyskac róznice cisnien na 40 membranach równa 45 atmosfer. Temperature frakcji utrzymuje sie w . granicach 2—5°C, a pH w granicach 6,8 + 0,1 przez dodawanie 2n roztworu HC1. 3,5 1 uzyskanego koncentratu suszy sie uzyskujac 34 g brazowego, bezpostaciowego osadu. 2 g tego osadu oczyszcza sie sposobem podanym io w przykladzie 17 belgijskiego opisu patentowego nr 827926, uzyskujac praktycznie czysta, krystalicz¬ na, czterowpdha sól sodowa kwasu klawulanowe- go. 32 g uzyskanego wyzej, bezpostaciowego osa¬ du poddaje sie dzialaniu 10 mm bromku benzylu i 35 ml dwumetyloformamidu, mieszajac mieszani¬ ne w ciagu 4 godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie odpedza sie pod próznia rozpuszczalni¬ ki, uzyskujac w wyniku pólplynna pozostalosc. Do pozostalosci dodaje sie 50 ml octanu etylu, po czym calosc przesacza usuwajac caly osad. Przesacz od¬ parowuje sie pod próznia uzyskujac7 w wyniku oleista pozostalosc. W kolumnie umieszcza sie przygotowana w mie¬ szaninie cykloheksanu i chloroformu w stosunku 1:1 warstwe Sephade^u LH4O (Pharmacia Lto.) o wymiarach 3,8X34 cm. Produkt reakcji estryfiko¬ wania rozpuszcza sie w minimalnej ilosci miesza¬ niny cykloheksanu i chloroformu w stosunku 1:1, i przepuszcza przez kolumne, która nastepnie elu- Si uje sie ta sama mieszanina rozpuszczalników. Pierwsze 150 ml eluatu odrzuca sie, po czym zbie¬ ra frakcje po 25 ml. Obecnosc klawulanianu ben¬ zylu wykrywa sie umieszczajac 5 mikrolitrowe próbki kazdej frakcji na cienkich plytkach zelu krzemionkowego, po czym chromatogramy rozwija mieszanina cykloheksanu i octanu etylu w stosun¬ ku 1:1. Klawulanian benzylu staje sie widoczny po spryskaniu chromatogramu chlorkiem trójfenylote¬ trazolu. Uzyskana wartosc Rr porównuje sie z au- 40 tentyczna próJba klawulaniianiu benzylu analizowa¬ na chromatograficznie w tych samych warunkach (chlorek trójfenylotetrazolu przygotowuje sie przez zmieszanie 1 czesci 4% roztworu chlorku trójfeny¬ lotetrazolu w metanolu, z 1 czescia In roztworu 45 sody kaustycznej). Frakcje 30—45 zawierajace klawulanian benzylu laczy sie i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem uzyskujac w wyniku olej. w Produkt uzyskany z kolumny wypelnionej Sepha- dex'em LH20 rozpuszcza sie w minimalnej ilosci mieszaniny cykloheksanu i octanu etylu w sto¬ sunku 1:1, i przepuszcza przez kolumne zawieraja¬ ca warstwe zelu krzemionkowego (zel krzemionko- B5 wy typu H do chromatografi cienkowarstwowej z firmy Merck) o wymiarach 2,5X28 cm, przygoto¬ wana w tym samym rozpuszczalniku. Kolumne eluuje sie mieszanina cykloheksanu i octanu ety¬ lu w stosunku 1:1, zbierajac 28 frakcji po 7 ml, w a nastepnie odbierajac frakcje po 15 ml. Frakcje 31—33 umieszczone na cienkiej plytce chromato¬ graficznej zelu krzemionkowego i spryskane chlor¬ kiem trójfenylotetrazolu zabarwiaja ,sie na czerwo¬ no. Frakcje te laczy sie i odparowuje pod zmniej- 65 szonym cisnieniem.105 494 13 14 Uzyskany olej poddaje sie analizie widmowej NMR i w podczerwieni, otrzymujac wyniki iden¬ tyczne jak w przypadku autentycznych próbek klawulanianu benzylu. Przyklad IV. Wytwarzanie klawulanianu so¬ dowego. 0,5 g klawulanianu benzylu z przykladu III umieszczonego w 20 ml etanolu i 5 ml wody uwo- darnia sie w ciagu 25 minut w temperaturze po¬ kojowej i pod cisnieniem atmosferycznym w obec¬ nosci 0,13 g katalizatora: 10% Pd/C, oraz w obec¬ nosci 0,15 g kwasnego weglanu sodowego. Nastep¬ nie katalizator odsacza sie, przemywa woda i eta¬ nolem, a polaczone przesacze odparowuje pod próznia. Produkt przekrystalizowuje sie z miesza¬ niny wody i acetonu uzyskujac czterowodny kla- wulanian sodowy. PL