NO763474L - - Google Patents

Description

FrGEigacgaTivltes for fremctilligg av klavulansyre

cg d- ens salter*

Oppfinnelsen vedrører fremstilling av Iclavalansyre og ciens salter via fementoring av Streptojayccs jueonjinonsis*

ZUavulanayre, aoia or den nyttige antibakteriellc forbineeIse av forsael (I):

o-v -ic-jui; jalfcar og estere, er beskrevet i belgisk patentskrift 827925. Patsiitokrif tot heakrivor også fremstill ing av klavulan-

oyre eg dens derivater via feroentering ev StreptoæycQS

elavuligerus.

Streptæyceo junonjinonsis er beskrevet i belgick patentckr1ft nr. 604341 a©« produsent av et annet antibakteriolt niddel enn klavulanayre. Det er nå oppdaget at klavulansyre egsu produseres under virkning av Streotoiaycos ju&on jinensic.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen en frem-gangsm&te for fremstilling av klavulansyre og dens nal ter, og fremgangsmåten onfattor dyrkning nv en starane av Streptcmyces juiuonjiaenoia og utvinning av fclavulansyre eller ot aalt derav f ret kulturejj.

Elavulanayresi iitvinn.es gjerne30a sine fasts

litium-, natrium-, kalium-, kalaiuw-, tiagnesiu/a-, barium-, aluainiurfi-, amaonitsu- eller substituerte ainøoniuorsalter. Egnede substituerte ajcnoniussal ter inkluderer prin-sre, aafcuaci/yro, tertiære og iivatcmarc" assnioniitrisalter.

Klavulansyro utvinnes gjerne aora aitt faste al-

fcaliiaetallsalt» for eksempel natrium- eller kalivcusaltet.

I5cd betegnelsen faste salter av kl avalar* sy re

åenes krystallinske salter og amorfe calter av Rlavulansyre. Saltene av klavulansyren oppnås bekvemt sosa krystallinske salter, for eksempel son natriur^lavulanat-tetrahy&rat-krystallinsk salt eller elet krystallinske kalium- eller litiunnalter.

Fortrinnsvis anvendes Streptoinycss jmionjinensic iJRIU, 1574X eller c-n h*.*y ty tende nutant derav ved f romgaagsiaaten i henhold til oppfinnelsen.

Streptorayces juæanjinensis fflSKL 5741 or også depo-nert ved Eaarn i Nederland ser, CBS 1.77.76 og 1 den tyske saraling avKilkroorganisaer DSri.

Slik det bor brukes, betyr uttrykket dyrkning over-lagt aorovekat av en klavuiansyre-produserende organiske i nar-var av assixsilerbare kilder av karbon, nitrogen eg ciineralsalter. En slik aerob vakst kan finne stod i et fast eller halvfast n;'.»ringsubstrat, oller i e.t flytende substrat som næringssaltene er oppløst eller suspendert i. Dyrkningen kan finne sted pa on aerob overflate eller ved naddyppingskultur. ifør ing sssoa let kan besta av komplekse næringssalter oller kan vare kjeoisk definert.

Delgisk patentskrift nr. 804.341 beskriver gene-relle betingelser for dyrkiiing av Streptoiayces jumonjinensis.

Vi har funnet at Media soia inneholder kompleksa næringsstoffer, for eksempel gjærekstrakt, soyab^nnemol og liknende, er spesielt godt egnet.

De neringistoffmedia cow kan anvendes for dyrkning av Streptosaycaa juncnjinansia kan inneholde, i oæradet 0,1 -

1G3, en kompleks organisk nitrogenkilde, for eksempel gjærak-strakt, raaisstøpv«3ke, vegetabilsk protein, frøprotein, hydrolysater av slike proteiner, melkeprotcinhydrolysater, fisk- og kjøttskstrakter og hydrolysater, for eksempel peptoner. Alternativt kan kjeraick definerte kilder for nitrogen anvendes, for eksempel urinstoff, asnnoniuitisalter, aciider, enkle ellar blandinger av vanlige aminosyrar, for eksempel valin, asparagin, glutamin-syre, prolin og fenylalanin. Karbohydrat (0,1 - 5S) kan inkluderes i naring-3stoffnedia. Stivelse eller stivelsehydrolysator, for ekaenpol dskstrin,3ukrose, laktose eller andre sukkerarter eller glyesrol eller glycerolostere kan også anvendes. Earboa-kildene kan også stame fra vegetabilske oljer eller animalske fett. Karboksylsyrer og deres salter kan inkluderes sora karbon-

kilde for vekst og produksjon av li-låkts*.a-je-inhibi.torcr.

Tilsetning av anti nkuiarasjaidler (for eksempel aPluronicc L@l) kan være nødvendig for A regulere ofcusiaing av visselaedia i fermentatorer.

Slike sineralsaltor sen ;-IaCl, KC1, «gCl. , 2nCl0, FeCl^, Ha2S04, FoS04, JigS04og Sia -eller K -salter av fooforsyre kan tilsettes til delasdia so:u er beskrevet ovenfor, spesielt hvis de er kjemisk definert? CaCQ~kan tilsettes sosa en kilde for Ca -ioner eller for pu£ringsvirkning.

Salter av sporeler-cnter, for oksesipsl nikkel, kobolt eller nang^r:y kan også inkluderes. Vitaminer kan tilsettes oia så ønskes.

Sli!', det lier brukes, betyr betegnelsen mutant enhver taufcantstassce son oppstår spontant eller ved effekten av et eksternt middel hva enten midlet anvendes iaed overlegg oller på annen ntåte. Sga-3d« netoder for produksjon av su tants tainaier inkluderer dem son er beskrevet 1 belgisk patentskrift nr. 827.926.

Dyrkning av Streptcsayces juraonjinanais finner normalt sted i teiaperaturoriradct lfe-35°C, vanligvis 20-32°C og fortrinnsvis 25-30°C, for «ks&SBpel ved ca. 27°C, og ved en pH-verdi mellom 5 og 3,5, og gjerne cellor; G og 7,5.

Streptorayces juKonjinensis kan dyrke:., i de oven-nevnte media i konveasjonollo kar, for ekoesapol koniske glacs-kolber soø: luftes ved ag i tering, for ekseapal ved rysting på en roterende rysternaskin, eller i luftede forr.ientatorer, for ekses-pal i fermenta tore r i rustfritt stål£*>r ar utstyrt raad ieder-plater og aora oarøros ned skovlskiverotorer cg luftes -ved en spreder. Perraonteringsn kan også utføres på kontinuerlig tsåto.

Utgangs-pH for fermenteringen er typisk 7,0 og maksimum utbytte av klavulansyre oppnås i løpet av 1 - 10 dager ved 2C-32°C, for eksempel i ltfpet av 2 - 5 dager.

Klavulanoyre og dens salter kan ekstraheres £ra kulturfiltrat ved hjelp av en lang rekke netodor, for eksempel slike som er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 827.926.'tøs-ningsmiddolekstraksjon fra koldt kulturfiltrat son er justert til sure pa-verdier, og metoder basert på den anioniske natur av meta-bolitten3&SQE!anvendelse av ionebytteharpikssr, har vist seg a vsre spesialt nyttige.

Sellene av Gtroptouiycos junonjinoaais fjernes aor~raalt ftfrst fra fermenteringen ved filtrering oller se&trifagering før slike ekstraksjonsprosesser påbegynnes.

X løsningsniddelekstraksjonsprosessen avkjøles kulturfiltratet og pli-verdien senkes tii området 2-3 vad tilsetning av ayre undor grundig blanding seed et organisk løsnings-Kiidcol som ikke or blandbart med vann, for oksenpol n-butylacotat, aetylisobutylketori, u*-buta£ol eller etylaeetat. Den syre sod anvendes for & senke pS-vcrdien i nedist, er norcjalt en mineralsyre, for eksempel saltsyre, svovelsyre, «altpetersyre, foaforsyro aller- liknende, n-butanol er et spesielt godt egnet løsnings-raiddei for anvendelse i ekstraksjon av det surgjorte kulturfiltrat. l'.tter separering av fasene ved sentrifuger ing tllbakeekstrakercs klavwlansyre-EiQ-tafcolittei* fra løsningsniddeifasan inn i vandig aatriutøbikarbonat eller kaliæahydrogenfosfat-puffer, CaCO^-suspensjon eller vann nens pK-vordien boldes tilnærmat npytral, for eksempel ved pH 7,0. Denne vandige ekstrakt kas etter separering av fasene konsentreres under redusert trykk og fryast^rfces slik at nas far et riltt preparat av et salt av klavulansyre.

Satte preparat or stabilt nar det lagres soia et tørt, fast stoff ved -20°C.

I anionebyttebarpiksprosessen bringes kultur f i1tratet ved tilnarrtot nøytral eller lott sur pH-vordi, for ekseirpel p£j-6-7, i kontakt r-ied et sjukt taed svak eller sterk base-anionebytte-harpiks, for eksempel "Aaberlltc<*>IR43 eller "Zorolit" STIP, respektive, vanligvis inntil harpiksen er stettet og hlavulansyre-materialet3fcr#Eæter ut fra sjiktet. Sjiktet vaskes så med vann og elueres ned en vandig saltløsning, for eksempel et alkali-metaliklorid, for okser.pal natriumklorld. De klavulansyreholdige fraksjoner oppsamles, gjøres voluminøse, avsaltes cg frysetørkes slik at san ffir et fast r&salt av klavulansyrc. "Anberiite"

IMB er et ekæenpal på.en svakt basisk anlomebyttenarpiks ssed polyariin-aktive grupper og tvorrbuiidet polyatyrsn-divinylbenssea-grumsjaasae. Andre egnede svakt basiske anior.ebytteharplkser inkluderer "Azaberlita" I2A6i; og XHA93.- °3arolit<B>FFIP er en sterkt basisk anionebyt te harpiks roed kvarternsre aiamoniuia-ak ti ve grupper og en tverrbundet polyvinyl-divinylbonsengrunriKiaose. Harpikser soai er ekvivalente med "«orollt" FFIP, inkluderer "Isopor" PP UP

og "DsAcidite" FFIP SPA 64, 61 og 62.

Ea alternativ fora av oks-traksjons<p>roEessei! er å bringe kulturfiltratat (vanligvis ved tilnærmet nøytral pu-vordi) ao:3 inneholder et salt av klavulancyrs, 1 kontakt n& å en organisk fase i hvilkeji dot er oppløst et vann-ultfsolig ara in. Egnede organiske løaniztgsoldler inkluderer ulike konvensjonelle vann» ublandbare polare Xøsningcsrddier sen r.etylisobutylketen, tri- . kloretylen og liknende. "?'gne2e auiner inkluderer ocfoincter© oller torticre aminer hvor 6xi av aubatituontgruppeae er en langkjedet ulifatisk gruppe» for okset-pel nad 12-16 karbonatoner, og dasi annan er en tart.-clkylgruppo slik at nolekylet er lipofilt. Søkoron har hatt hell »e& det antn sos har handelobccfegnclsen "Asborlito0 somalt anvendes aaiaofc i fors av sitt syre-addisjonosalt. Etter doiuva ekstråkajonsprosoas er klavulanoyran tilsteda i don organiske fase i fora av aninaalfcot.

Den orgasiako fase separeres så fra kulturfiltrafcet* Klavulancyren kan ekstraheres irm 1 en vandig løssiiag av et alkaliaatallcalt, for eksempel natritrafclorid, natriur?.nitrat oller liknende. Råcaltet av klavulansyre kan deretter oppnås ved frysetørking eller liknende.

Andre pxlrssre nateder for isolerir.g son kan anvendes, inkluderer konvensjonelle metoder oåsrøsa adsorpsjon på karboa, utfelling, utaalting og uolekylfil txarisig. Disse saatoåcr vil «onaalt bli anvendt i tilknytning til andre isolasjonsnetoder,

Adsorpsjcn på karbon kan mod fordel utføres vad at ea vandig l^sulng av kulturfiltrat føres gjennom et trekullejlkt, for eksempel nedover en coylo oova inneholder trekull. Trekull-sjiktet vaskes deretter gjerne ac«3 vann og sjiktet elueros ned ot vandig va«'ablai~dbart l^srdi^sraiddei, for eksempel ot keton, for eksercpel aceton, og de klavulancyre-hoMige fraksjoner heldes tilbaka. Det er ofte bekvemt først d eluero ned aceton og deretter iaed vandig aceton.

Det kan ofte være bekvemt å fræas tille klavulenoyre i fonn av et relativt vann-ul-i-cdig salt, for ekseiupol litiua-saltet. I dette tilfelle er utfelling og utsal ting nyttige cva-toder ved fresastillinga». Ctfelling kan bekvcr.t utføres ved til-» setning av ot vaasv-TilvBcl ig orgrtnio!: løsningsmiddel til on vaadig løsning av det relativt vatæ-uløselige salt av klovulansyro, for okseiapel litiaaklavulanat. Denne prosess kan bekvent utføres ved at et salt av klavulansyrc. bringes 1 kontakt nied et Xitiurasalfc, ontaa ved eluoring fra en ac-ylo ellar ved oppløsning av soltene i den saKSio løsning og tilsetning av det vann-blandbare løsnings-middel til løsningen son inneholder litiuEkiavuXanat, hvorved litiumklavulanat utfalles.

Litiunklnvulanat kan utsaltes av es vandig løsning som inneholder XitiurckXavuXanat i nærvær av en ionisk litiua-forbindelso, son gjerne er dot litiunsalt sos anvendes for dannelse av Xitluffiklavulanatot, ved hevning av konsentrasjonen av litium-icner i løsning elik at løseligheten av litiumklavulanat ved den angjeldende tøraperatur i stor grad overskrides. Siden litiura-klavulan&t er mindre løselig ved lavere temperaturer, utføres denne fremgangsmåte gjerne ved nedsatt temperatur , for eksempel o-s°c.

Ytterligere rensning av de urennede faste stoffer soia oppnås ved de ovenfor beskrevne froaganganåter, kan oppnås ved en lang rekkeKictodor, nen ionebyttesøylekrosiatografi er spesielt godt egnet, spesielt under anvendelse av *'Isopor? "tfeAcidite" FFIP SHAG4 eller "DSAI:"-cellulose.<a>DeAcidite°-

søylen kan elusroa gracksrt racci on vandig løsning av ot salt, for okseopol natriuitiklorid (0 - 0,5»). Søylen av "øsas<rt->e©lluXooe i 0,0Xm fosfatpuffer ved pli 7 kan. eluorcs mod en saltløsning sois normalt er on alkaliiaotaiXkXoridiøsaing, for eksempel en r-JcCl-løsning (0-0,2ojSfaCl i Q, Glm fosfatpuffer ph7). Aktive fraksjoner kan påvises ved fatjelp av sin {i-laktårase inhiberende aktivitet og sin aktivitet på KAG-systemet, som begge er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 327926.

Ds fraksjoner non inneholder mesteparten av denne aktivitet, kombineres deretter og konsentreres tii lito volun under vakuun og avsaltas*

Separasjon av klavularjoyre og/eller dens salter

fra uorganiske salter spesielt,/sen også fra andre forurensende substanser, kan oppnås ved adsorbering av det antibakterielle stoff på en lipofil harpiks sow uorganiske salter ikke adsorberoc pa. Søkeren har funnat at on slik polystyren-divinylbensen-ko-polyner som "iYiTibarlite" KAD-4 er spesielt godt egnet, «tet ønskede antibiotikum, kan fjernes fra søy lun vad eluering (elueringHied vann eller vandig alkanol) cg den resulterende løsning konsentreres vsd inndai2pntng og frysctørke3 slik at man far at materiale u.ed forbedret renhet. Separasjon av klavulansyra cg/ol lor dens salter fra uorganiske salter kan også gjerne utføres ved

kroaatografi på en søyle son består av et golfiitrariivgsraiddoi, for eksempel tverrbundne dekstrandolar, for eksempel "SepbadaK" G15 og polyaJirylaarid-aolor, for efcscanpal "Qiogel" V2.

("Bio<g->el" P2, "Scphadsx" Cif* og "ftobcrlito'<1>markedsføres av henholdsvis Bio ."lad, Hlchnond, G.S«i\.,

Phariiiacia Great Britain btd.j 75 UKbridge ftoad, 'London I;.5., O.K.

and Rohm and Eaas, Philadelphia U.S.A.)

Aktivt avsaltet materiale kan renses ytterligere ved kror.atografi, for eksorapul pil on cellulosesøyle ander anvendelse av et vandig alkohol-løsningsffiiddelsystcm, for eksempel butanol/etanol/vann, 4/1/5 i volum, toppfase.

En variasjon av frcn^angsinåton for fristilling av en ren fora av klavulansyre eller dom salter osfatter oppnåelse av en uren fort:, av klavulansyre eller et salt derav, dannelse av eneastfer av klavulansyre på konvensjonell saåte, rensing av esteren og deretter regenerering av klavalansyre eller et salt derav fra esteren. I<?>or anvendelse i dette aspekt av oppfinnelsen ar esteren gjerne benzylesteren ollar en liknende hydrogenolyøor-bar ester.

ben urene fora av klavsilansyre eller et salt derav som skal renses vad danne fren5gangsriåt»2, kan. vare i form av et fast stoff eller en løsning sam vanligvis også vil inneholde betydelige aengder av organiske eller uorganiske forurensninger.

Klavularasyron eller saltet derav kan omdannes til on ester ved f oras tringsreaks joner ocn; det skal henvises til i det følgende. Den foretrukne netede for dannelse av don ønskede ester av klavulansyre er ved omsetning av et salt av klavulansyre svad et forestringsniddel, for eksenpel et reaktivt halcgcnid,

an sulfonatester eller ved ekvivalente reagens. Slike reaksjoner utføres ofte i et organisk løsningsmiddel wed høy dielektrisi-tetskonstant, for eksunpel ciaetylfoKwaraid, Siaetylforøaiaid/ aceton, dine tyl sul f oksyd, y<->cietylacetamid, heksaiaotylfosforaiaid og 1 Ulnende.

Evis dat er ønskelig, kan saltet av klavulansyre oppløses 1 løsningsmidlet på konvensjonell måte eller kan bindes til en polyjuer bærer. r.gnede beinare for anvendelse ved denne fremgangsaiåte inkluderer sterke base-anicnebyttoharpikser, spesielt slike som er i besittelse av en faakrorctikular natur son tillater anvendelse av ikke-vandige løsningsniddelsys tester, Søkeren har funnet at "Asjberlyst0 h 26 er egsiot for dette formål. Klavulansyresaltet kan adsorberes pa harpiksen fra kulturfiltratet09harpiksen deretter suspenderes i dinietylforrsanid sos inneholder natriumjodid og benzylbroriid. li 1 avu 1ancyren kan alternativt olusre3søyle-vie aed en løsning av natriuiajodid i dine ty 1 f orniamid «Iler i en blanding av diiietylforraasiid og aceton. Klavulansyren i elaatet forestres deretter Véfl tilsetning av benayibronid.

Sar den så er dannet, renses den urene03ter av klavulansyrc normalt kronatograf is?<. Ved slike prosesser opp-løses esteren normalt i et organisk løsningaoiddol, for eksempel etylacetat, aetylenklorid, kloroform eller liknende løsnings-midler. Den faste fase son anvendes ved den krana to<g>rafi ske prosess, erfiomalt et saateriååe sil son silikagel eller et g"el-filtreringsaiddel, for eksempel<M>f'ephaco3t"LH20 eller kron:ato-grafisk like naterialer.

Do fraksjoner som strøjamer ut fra søylen, kan

testes pu nærvsr av klavulansyreesteren ved at man gjør bruk av dens synergistiske egenskaper oller ved slike kjoniokc tester soirt omsetning med trifenyltetrazoliuinklorid i tilknytning til tynns jiktskroiaatografi.

Aktive fraksjoner kombineres normalt cg det organiske løsningsmiddel fordonpas under redusert trykk.

Den ester som resulterer fra denne fremgangsmåte,

er generelt av akseptabel renhet, non materialet kan rekromato-graferes 01 i så ønskes.

Denne rensede ester av klavulansyre kan omdannes

til klavulansyrc eller et salt derav ved de metoder sora er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 827926.

En spesielt godt egnet fremgangsmåte for for-

nyet oppnåelse av klavulansyre eller dens salter er a hydro-gensre dens banzyleistor. Slike reaksjoner finner normalt sted i nervær av en overgangstnetallkatalysator under anvendelse av lavt eller middels trykk av hydrogen. Reaksjonen kan utføres ved høy, omgivelses- eller nedsatt temperatur, for eksempel ved 0 - 100°C. Spesielt egnede reaksjonsbetingelser for en slik bydrogenering vil vare a anvende et lett overat&osfisriok hydrc-gantrykk ved tilnærmet omgivelsestemperatur (12 - 20°C). Reaksjonen kan utføres i konvensjonelle løsningsmidler, for

ekse<y>upol lavere alkanolcr, for eksenpalotaaol. S$>kerc& har funnafc at on spesielt egnet katalysator er palladiun på trekull.

Hvis hydrogeneringen utføres i nærvær av en foaee, aci blix'det fremstilt ot salt av klavulansyre, for eksempel resulterer litiuia-, natrium- eller kalitrasaltct hvis reaksjonen utføres i ncarvaa: av natricua- eller kaliurohydro^eiikarbonat eller litium-, aatriura- eller kaliurakarbonat.

Klavulansyren eller saltet derav son resulterer fra en slik reaksjon, or generelt av god renhet, for eksonpeiEiinct<g>o^i ront, og kan vanligvis produseres praktisk talt helt rent.

Følgende ekaertpler er illustrerende for oppfinnelsen.

♦JksOj..*^el 1

Stroptoinyees Juiaonjlncneis MHRL 5741 blo dyrket i 7 dager ved 2<3°C på skråkulturer nsod fast agar av følgende soBizaonootning i

Vekst son ble skrapet av fra denne skråkultur, ble anvendt direkte for inokulering av 100 ni av kinstadiisa-Gubatrat som befant seg i 500 ol koniske kolber lukket med skura-plactpropper. Sasjesensetningen av kirasutaetratct var son følgers

Substratet ble sterilisert før inokulering ved autoklavering ved 1,03 kg/ca<**>ved 121°C i 15 minutter. Kini-atadiet ble Inkubert vod 2G°C i f/ 5 tivaer pa en roterende rist©--maskin ved 240 osidr. p.m. ned 2,54 era kast.

Porsjoner på S ml av kinstdtøaetratet ble anvendt for inokulering av porsjoner pti 100 al av fennentsringesubstrat aoxa befant eeg 1 S00 r,il koniske kolber lukket nod okui^propper.

■fre forskjellige fenaeaterlngsuubstrater blo anvendt, og sarssien-se.tningon av substratene var son følger:

(Soyabønnenelet er "ibrkaaoy* 50 fra British Arfcday Co.,

Old Trafford, Manchester} "Scotasol<*>or tørket, løoelig iaatorialo fra raaltdiatillatør, levert av Thonas 2orthvfick Ltd., C9 uo11ington Street, Glasgow, Storbritania. Dekstrin leveres av C.P.C. (U.a\.) Ltd., Traff ord Park, Manchester, Storbritania.

Alle feraenteringssubotrater ble sterilisert før inokulering ved autoklavering ved 1,05 kg/cn ved 12i~C i IS sinutter.

Fermentering skolbene ble inkubert ved 2»j°Cpå

en roterende ryateaaskln ved 240 oadr. p.as. aed 2,54 cej kast. Prvver på 5 al ble fjernet fra farmersteringskolberie under «terile betingelser på dag .2 under forraenÉeringen og behandlet p« ff*l g g nd a måta s

Prøvene ble sentrifugert ved 2.200 G i 10 minutter og den overstående vaske boldt tilbake. Den overstående vaske vinte eeg å ba inhiberende aktivitet overfor efc preparat av 'J.coli J£4~$-laktemas© under anvendelse av en standard @~laktaraasa inhiherin<g>sbestaraselse. Sn egnet G-laktaæaco-ia.hi-bcrijjgobostiesantelrjo er beskrevet i belgisk patentskrift nr. G2792S.

Shoeawel 2

Streptonyces jusaanjinensic 8RHL 5741 bla dyrkiat.

i cubstrat A som beskrevet i «kacnipoi 1. Prøver på 5 al ble tatt ut siod jevne melloiaroxi under bele fermenteringen, mider anvendelse av storil taknikk. -Jen overstående v<s8ko aorø ble opp-nådd ved sentrifuge ring av disuo prøvar ved .2.200 <S i 10 rainotfcer, ble analysert undar .anvendelse av on rokke j^rooeoaer son er faoakrevst i detalj aedenundor.

(a) Den antibakterielle aktivitet overfor Xlobsiella aerogenoa A under anvendelse av cn dlffusjonobectessaelco ved hjelp av kuM-i-pIate*agar. (b) aktivitet p£ imG-agarplacfccysteajGt, beskrevet i belgisk patentskrift nr. 827926, ble a&lt.

Prøver fra dag 4 av denne femontering ble avsatt so;a flekker på I os brede atrifilor av kronatogra feringspapir ivbatnan i>.r. 1. Dlase strimler ble kroiriatografert skatten over ved 4°C ifølgende løsningsmiddelayotsnar: tt-butanol/etanol/vasm 4 :1s 5 vol./vol.

(topp-fase)

n-butanol/oddiksyre/vann 12 i 3:5 vol./vol.

Båndene ble tørket og lagt oå agarplatcx coss var kinsatt med Klobsiella aoregenas UC<:>j?C 4IS og inneheldt penicillin G (FÅG-plater). Etter inkubering av platens i 16 tieor ved 20°C ble det iakttatt soner med inhibariug av veksten. J begge løs-ningsmiddolGyste*aer blo det observert en enkelt inhibitorsone ved IL., 0,72 i butanol/GddiKsyra/vannsystenot og ved Ti^ 0,25 i butanol/Gtanol/vaan. Sp-verdlene var de sarame son for oa autentisk prøve av klavwlansyr© vei- kjæring i det saiaue oysten,

StrajrstOEiycos jæaonjinonsio USKL 5741 bis dyr&fet i

7 dagar vod 26°C på skråkulturer av fa at agar soia befant seg 1 nous-flakker. «Rgarsubatratet var:

Daktogjær »altekstrakt agar (ISP-substrat 2)

(Di f co Laboratories, Detroit, ":2icbigan, O.S.A..)

100 ral sterilt avioniaert vants sea inneheldt 0,051 "Triton™ sr (ovcrflateaktivt rsidcfcal) bl« tilsatt i en Kon»» f laske, overflates av kulturen nie skrapet for tillaging av oa suspensjon av anoror og rayeel. Saanonajones (100 usl) ble anvendt for inokulering av ki^istadiussubstratet (50 liter) son b«£u«t seg i en 90 liters xomoutator av rustfritt stal, fullstendig utstyrt iaed ledeplater.

(Antl skuræsaraidlefe besto av 10% "Fluronic;" L61 (uginc Buhloaim Chcnicals Ltd) uis<p>er<g>erfc i soyobønnaolje (British Oil a CaSte Mills).

Substratet ble damps torill sort i forrenta-toren før inokuleringen.

Etfcer inokuleringen hlo ktastadiet agitert under anvende lee av en akovlplaterotorlaed «Siane ter 12,7 era, kjørt ved 240 ©n&r.p.ns., steril luft bla tilført i en. hastighet av 50 l/ tnin. og temperaturen holdt vetf 2Q°C«Voks ten av Stissctadiet fortsatte 1 415 titaer.

7,5 liter av kiL.ctadiet bla anvenfit for inokulering av 150 liter av fementerlngasubstratet sota bofanfc sog i en 300 liters foraentator av rustfritt stål, fullstendig utotyrt rnzå ledeplate.

Feræanteringsstadiurcsubstratot hadde følgonUa sasruenootning s

{Soyabønneaolet ar "Arkasoy" 50 fra Drltiab Arkady Co. Ltd. ,

Old Traff ord« SSancheator).

Ånti ckuzrasaiaidlct var det sasss son blo brukt

i kiHstadlarssubstratet.

Substratet ble da&patarilisert i fornoutevtoec^i

før inokul&r£r.gon.

Etter inoknloriivjen blo farinen: ter ingen agitert tinder anvendelse av©r* 21,6 era ekcvlckivsrotor sosa bl®kjørt ved 340 ondr*p.o.«, steril luft bla tilført i ca hastighet av 150 l/min.og' tcKiporaturcn holdt ved 26 ounder feriaentoringan aoa varto i 72 timer.

Hele brygget bia klargjort ved sentrifugerirrø$og det klargjort© brygg (140 liter) ble justert til pH 6,2.

Det klarnede brygg bla kj^rt på on sterkt basisk anionebytte-harpiks av K2erolit° PF (ip) f?-<A61 (15 s 130 ca) ("Serolit"

I*td U.K.) ved an hastighet av 500 esl/min. Kjolen blo vacket aad avkjølt avreinoraliaort vann (15 liter) i en atesiningshaatighet av 500 ni/Ein. og derettor eluort aiod en avkjølt IM vandig £JaCl-løsning ved s*arirae stofimingshastighet, og 4 li tor fraksjonar bla oppsacilet. Fraksjonen blo kontrollert u.vior anvendelse av standardhullst i den bioanalytiske platetoknikk ph KAG-piato-systoiaot. Fraksjonene (2-19) «ora har god aktivitet på K&G-sytsteaet, ble koiabinert. £»e kombinerte fraksjoner ble justert til pli 6, 2 cg avkjølt cg kj?rt pA en søyle av "ÅEiberlite"

(30 :c 125 on) (ItohMa Haas, Philadelphia, t;.S.£>.) i en haatig-het av 500 nl/:aia. Skylen ble vasket i;od avkjølt li! MaCl (5 1)

og dsretter eluert aaed avniinsralifiert vaoa, ved 5 oC cg ved 500 nl/rain. 5 liters frakajonar ble oppsadlet ved at man startet akkurat før fullstendig aluering av KaCl fra søy lau, ^raksjonono (3-9) soe inneholdt klavulansyro ble konbinert.

Da kombinerte fraksjoner (33 i) blo konsentrert

10 ganger ved omvendt osmose (Do Danske SufckorfabrSJ-.Iier Lafooratory Kodule,Das&raa typo 995). ^ron^angsfaåton var å resirkulere retentatot fra en tan!: av rustfritt stil, utstyrt iaed et kjøle-system utløpsventilen i ultrafiltrerlngsenhctasattct slik at det ga et differensial trykk over de 40 nsnbraaer på <?5 atoos-ferer. Teapsraturon ble holdt ved 2 - 5°C og p&-verdien ved 6,8- 0,1 ved tilsetning av 2aiiCl. Det resulterende konsentrat (3,5 1) blo tørket slik at Ban fikk et brunt, ariorft fast stoff (34 g). 2 g av dette arriorfe faste stoff blo renset ved fremgangsmåten i aeaholu til ekserrpel 17 i belgisk patentskrift nr* 627926 slik at ra an fikk i alt vesentlig rent, krystallinsk vtatriænklavulanat-totrahydrat. 32 g av det ar-sorfe faste stoff ble behandlet med 10 ai benzylbreaid og 35 al diiaetylf oræaiaid t og blandingen ble onrørt ved- ronter.neratur i 4 tiwer. Løsnings-midlene ble fjernet i vakuum slik at Ean fikk en halvfast rest. 50Kil etylacotat kle tilsatt, og eventuelt fastEiateriale ble fjernet ved filtrering. Filtratet bla irnidarcpet i vakuura slik at man fikk en olje.

En *'£©phadex" Ln 20 søyle (3,3 x 35 crt\) (Phar-aacia Ltd.) ble fremstilt i cyfcloheksan/klojroforsa 1:1. Produktet fra bensyleringen ble oppløst i et srdjjiiausi av cykloheksan/kloroforni 1:1 C( j kjørt på søylen soa ble eluert red den saru ie løsningc-aiddelblanding. "Oe første ISO al av olueringsoiddel blo vraket,

og derettor ble 25 ral fraksjoner oppsanlot. R-ervsret av benzylklavulanat ble kontrollert ved avsetning av flekker av 5yl prøver fra hver fraksjon på silikagel-tynnsjiktplater og ut-vikling av platene i cyfcloheksan/otylaeetat 1:1. Benzylklavulanatet ble synliggjort vea dusjing nod trifonyltetrasoliuirjclorid-reagens, a^-verdiea ble sa^nienliknet ned verdien for en autentisk prøve av bens yl k iavulanat sou» ble k roina tog ra for t. under de saræie betingelser. (Trlfenyltetrazoliæ&loridreagensct frccastilles ved blanding av 1 del av en itKetaneiisk trifonyltetrasoliunklorid-løsning ned 1 del ln kaustiksoda.

Fraksjonene (30-«lb) son inneholdt benzylkIavulanat ble kombinert og inndarapet under redusert trykk slik at man fikk en olje.

'Produktet fra "Saphatlex<*>?4H20-søylen blo oppløst i stLiiainun av cyklohcfcson/etylacetat 1/1 og kjørt på en oilikagel--søyle (2,5 x 23 c?s) (Morek silikagel U, tynn3jiktkror-atografi-

kvalitet), fremstilt i det aatama løsnlngsniddol. Spylen ble eluert iaed cykloheksan/etylacetat 1/1 og 28 fraksjoner ned volur.i 7 ssl ble oppsamlet, fulgt av fraksjoner p& IS ni. Fraksjonene (3.1-33)30Ki ga en rød farge når de ble avsatt son flekker på øilikagel-tynnsjiktkroraatografiplater og dusjet med fcrlfenyltetrazoliiEn-klorldroagesia, ble kombinert og inndanpot under redusert trykk.

Don resulterende olje ble utsatt for lli- iR- cg lii-spektroskop!, og spek trane var identiske raed den iser. gis av en autentisk prøve av benzylklavulanat.

Eksenpel 4 Freaaatilling av r.atrlunl? lavulanatcr.

Senssylklavulanat (0,5 g fra eksempel 3) i 20 tsl etanol og S ral vann ble hydrogonert over 10% Pd/C (0,13 g) og 0,15 g natriisrabikarbonat i 25 minutter ved reratortperatur og atfioaf^retrykk. Katalysatoren ble filtrert, va3ket isad vann og otanol, og de konhinerte filtrater ble inadanpet i vakuusa. Produktet krystalliserte ut fra en vanrs/acetonblaiiaing soro natriuciklavulanatte trahydråt.

Claims (20)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av klavulan&yre og dens salter, karakterisert ved dyrkning av en st amras av Streptomyces jumonjinensis cg utvinning av klavulansyre eller salter derav fra kulturen.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av klavulansyre og dens salter, karakterisert ved dyrkning av Streptomyces jumonjinonsls NRRL 5741 eller en høytytende mutant derav.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, tilpasset for fremstilling av et fast litium-, natrium-, kalium-, kalcium-, magnesium? barium-, aluminium-, ammonium- eller substituert ammoniumsalt.

4. Fremgang sina te son angitt i krav 3, tilpasset for fremstilling av det krystallinske natriumklavulanat-tetrahydrat-salt eller det krystallinske kalium- eller det krystallinske litiumsalt.

5. Fremgangsmåte som angitt i hvilke som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at en stamme av Streptomyces jumonjinensis dyrkes og at deretter cellene av streptomyces jumonjlnensis som er fjernet fra fermenteringen og det resulterende kulturfiltrat ekstraheres slik at man får klavulansyre eller et salt derav.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at klavulansyre eller et salt derav løsnlngsmiddelekstraheres fra kulturfiltratet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at kulturfiltratet avkjøles og pH~ verdien til kulturfiltratet justeres til en pn-verdi i området 2-3 hvoretter klavulansyren i dette først ekstraheres inn i et vann-ublandbart organisk løsningsmiddel og deretter tilbake-ekstraheres inn i vandig natriusibikarbonat, kaliumhydrogenfosfat-puffer, kalciumkarbonatsuspensjon med vann mens pH-verdien holdes tilnærmet nøytral, og utvinning av klavulansyre eller et salt derav fra den resulterende vandige ekstrakt.

3. Framgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at kulturfiltratet bringes i kontakt med en organisk fase i hvilken er oppløst et vann-uløselig amin, hvorved klavulansyre ekstraheres inn i den organiske fase ifforrn av aminsaltet, og deretter tilbakeekstrahering av klavulansyre inn i en vandig løsning av et alkalimetallsalt og utvinning av klavulansyre eller et salt derav fra de vandige ekstrakter.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at klavulansyre eller et salt derav ekstraheres fra kulturfiltratet ved metoder som er basert på en anionisk natur av klavulansyren.

10. = Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at kulturfiltratet pH 6-7 bringes i kontakt med en svak eller sterk base-anlonebytteharplks inntil harpiksen blir mettet med klavulansyre, og deretter eluering med en vandig saltløsning og utvinning av et salt av klavulansyre fra eluanten.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at en vandig løsning av kulturfiltratet føres gjennom et trekullsjikt, åeretter vaskes med vann og elueres med et vandig vann-blandbart løsningsmiddel.

12. Fremgangsmåte som angitt i hvilke som helst av kravene 5- 11, karakterisert ved det ytterligere trinn som går ut på utsalting eller utfelling av et vann-uløselig salt av klavulansyre.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at det som vann-uløselig salt av klavulansyre anvendes litiumklavulana t.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 12 eller 13, karakterisert ved at utfellingen utføres ved tilsetning av et vann-uløselig lø sningsmiddel til en vandig løsning av det relativt vann-uløselige salt av klavulansyre.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved eit utsaltingen av litiumklavulanat finner sted i en vandig lø sning av litiumklavulanat i nærvær av en ionisk 1 itiumforbindelse ved hevning av konsentrasjonen av litium-ioner i løsning slik at løseligheten av litiumklavulanat ved den angjeldende temperatur i høy grad overskrides.

16. - Fremgangsmåte som angitt i hvilke som helst av kravene 5 til 15, k a r a k t c r i s e r t ve d det ytterligere trinn som går ut på å danne en ester av klavulansyre på konvensjonell måte, rensning av esteren og deretter regenerering av klavulansyre eller et salt derav fra esteren.

17. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at esteren av klavulansyren dannes ved reaksjonen mellom et salt av klavulansyre og et reaktivt halogenid eller en sul fonatester.

18. Fremgangsmåte som angitt i krav 17, karakterisert ved at det som reaktivt halogenid anvendes benzylbromid.

19. Fremgangsmåte som angitt i hvilke som helst av karvene 16 til 18, karakterisert ved at klavulansyre eller et salt derav regenereres fra esteren ved hydrogenolyse.

20. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 5 til 19, karakterisert ved det ytterligere trinn som går ut på y tterligere rensning av klavulansyreeller et salt derav ved ionebyttesøylekromatografi.