JPH0377857A - 新規生理活性物質ジオクタチン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規生理活性物質ジオクタチン（Ｄｉｏｃｔａ
ｔｉｎ）及びその製造方法に関する。

［従来の技術〕 ジベプチジルアミノベブチターゼ■の酵素活性は、全身
性エリテマトーデスや慢性関節リュウマチ等の膠原病に
おいて著しく上昇し、その病因と深く関わることが示唆
されている〔関、ハギハラ（Ｍ、　Ｈａｇｉｈａｒａ）
ら、クリニカル・ゲミストリー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第３３巻、第１４６３〜１４６
５頁、１９８７年］。微生物の生産するジペプチジルＴ
ミノペブチターゼＩＩ阻害物質としては、これまでにビ
ューロマイシイ　（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）が、Ｊ、に、
マクドナルド（Ｊ、　Ｋ、　Ｍｃ口ｏｎａ　ｌｄ）らに
よって報告されている［　Ａ、　Ｊ、パレット（Ａ、　
Ｊ、　Ｂａｒｒｅｔ）　編、プロテアーゼズ・イン・マ
ンマリアン・セルズ・アンド・ティシューズ　（Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅｓ　　ｉｎ　　ａ＋ａｍｍａｌｉａｎ　　ｃ
ｅｌｌｓ　　ａｎｄ　　ｔｉｓｓｕｅｓ）、第３１１〜
３９１頁、ノース・ホランド・パブリッシング・カンパ
ニー　アムステルダム（Ｎｏｆｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、＾ｍｓｔｅｒ
ｒｉａｍ）、１９７７年〕。

［発明が解決しようとする課題］ ビューロマイシイはジペプチジルアミノペプチダーゼ■
を阻害すると共に、他のアミノペプチダーゼを阻害する
ことが知られている。、したがって、アミノペプチダー
ゼ■の特異的な阻害物質が望まれている。

本発明の目的は、そのような特異性の高い生理活性物質
及びその製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は新規生理活
性物質ジオクタチンに関する発明であって、下記−前人
■： 〔式中、Ｒは水素（Ｂ）あるいはメチル基（Ａ）を示す
〕 で表される化合物であることを特徴とする生理活性物質
ジｊ°クタチンあるいはそれらの塩であることを特徴と
する。

また本発明の第２の発明は、新規生理活性物質ジオクタ
チンの製造方法に関する発明であって、ストレプトミセ
ス属に属するジオクタチン生産菌を培養し、その培養物
から上記−前人■で表される生理活性物質ジオクタチン
のΔ、Ｂの少なくとも１種を分離採取することを特徴と
する。

ストレプトミセス属に属するジオクタチン生産菌の一例
としては、本発明者らによって分離すｆＬり放１ｍｆＭ
ス）　Ｉ／７’　）　ｉ　＋　、７．＊　ｓｐ、ＳＡ−
２５８１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　５Ａ−
２５８１）がある。本菌株の菌学的性状は次のとおりで
ある。

本菌株は菌糸幅１μｍ内外の放線菌であり、光学顕微鏡
下では放線菌の気菌糸」二の胞子鎖はオーブン・スパイ
ラル（ｏｐｅ口５ｐｉｒａｌ）である。

電子顕微鏡下では桿状の胞子が観察され、胞子表面は平
滑である。細胞壁の構成成分としては、１４．１、−ジ
アミノピメリン酸が検出され、電子顕微鏡でも胞子のう
やその他の特徴的な構造は認められない。以上より本菌
はストレプトミセス属に属する。本閑の培養性状、生理
学的性状ａびに糖の資化性能の有無を第１〜３表に示す
。

なお各種培地における色の記載について括弧内に示す標
準はコンテイナー・コーポレーション１オブφアメリカ
（Ｃｏ口ｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏ［ａｔｉｏｎＯ［Ａ
ｍｅｒｉｃａ）　（７）　力５−−　バーーＥニー・マ
ニュアル（Ｃｏｌｏｒ　ｈａｒｍｏｎｙ　ｏｖａｎｕａ
ｌ）を用いた。すべての性状試験は２７℃において２週
間培養後判定した。

第１表　培養性状 第３表　糖の資化性 第２表　生理学的性状 ゼラチンの液化性 デンプンの氷解 カゼインの氷解 尿素の氷解 エスクリンの氷解 カタラーゼテスト セルラーゼ活性 チロシナーゼ活性 硝酸塩の還元 脱脂牛乳のペプトン化 脱脂牛乳の凝固 硫化水素の産生 食塩耐性濃度 生育温度 陽性 陽性 陽性 陽性 陰性 陽性 陰性 陽性 陽性 陽性 陰性 陰性 ６％ １５〜 ３４℃ 糖 １）−−グルコース Ｉ〕−フルクトース Ｌ−アラビノース Ｄ−キシロース Ｌ−ラムノース シュークロース ラフィノース Ｄ−マンニトール イノシトール 利用性 陽性 陽性 陰性 陰性 陽性 擬陽性 陽性 陽性 擬陽性 以−Ｌσ性状は本菌が放線菌ストシブ）ｆｉ＋ス属に属
することを示す。

なお、Ｓ＾−２５８１株を工業技術院微生偽工業技術研
究所に寄託申請し、平成元年６月７日、微工研菌寄第１
０７７８号（ＦＯＲＭ　Ｐ−１０７７８）として受託さ
れた。本発明において用いることのできる菌株は、上記
菌株、その変異株をはじめ、ストレプトミセス属に属す
るジオクタチン生産菌ずべてを使用できる。

ジオクタチンの培養工程並びに精製工程中での追跡は、
次の方法による抗ジベブチジルアミノベプチターゼ■活
性の測定に基づいて行った。

その測定には、Ｊ、に、マクドナルド（Ｊ、に、Ｍｃ口
０ｎａｉｄ）らの測定法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、
第２４３巻、第４１４３〜４１５０頁、１９６８年〕の
変法を用いた。

すなわち、３．２ｍＭのりジル−アラニン−β−ナフチ
ルアミドの水溶液０．０２５ｉｄに０．１　Ｍの３゜３
−ジメチルグルタル酸緩衝液０゜１＃ｆｆ、試料を含む
溶液Ｏ，０５ｄを加えた混合液にラット胛脳のホモジェ
ネートより硫安分画法により部分精製したジベプチジル
アミノベプチターゼ■溶液０．０２５ａｆ加えて、３７
℃、１時間反応させ！こ。

反応後、ボリオキシエチ１／ン（２０）ソルビタン干ノ
ラウレート（和光純薬工業製）を１０％、ファーストガ
ーネットＧＢＣ塩［シグマ・ケミカルやカンパニー（Ｓ
ｉｇｍａ　Ｃｈｅａｉｃａｌ　Ｃｏａ＋ｐａｎｙ）米国
〕を０．２％含む０．５　Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ３，７８）を０゜ｉｓ加えて反応を停止（７，５
２５ｎｍにおける吸光度（ａ）を測定ｊ。

た。同時に試料だけを除いて同様に反応した時の対照の
吸光度（ｂ）を測定した。なお、この時、それぞれに対
する盲検の吸光度（ａ′）（ｂ’　）をも測定した。盲
検は先に緩衝液（ｐｌ（３、７８＞を加えてから酵素を
加え酵素反応を行わずに発色したものを用いた。そして
ジペプチジルアミノペプチダーゼ■阻害活性（％）は式
％式％］ により計算した。この定量法（０８２−系）で５０％阻
害をボず阻害物質の量を１ユニットとする。この定量法
で純粋なジオクタチンΔ反びジオクタチンＢはそれぞれ
、０．１９μｇｏｄ。

０．８９μｇ／ｄの濃度でジペプチジルアミノペプチダ
ーゼ■を５０％阻害した。

ストレプトミセス属に属するジオクタチン生Ｎ１を栄養
源含有培地に接種して好気的に発育させることによって
ジオクタチンを含む培養物が得られる。栄養源としては
放線菌の栄養源として使用しつるものが使用される。例
えば市販されているペプトン、肉エキス、コーン・ステ
イープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキ
ス、ＮＺ−アミン、カゼインの氷解物、硝酸ソーダ、硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの窒ｓ源１、及
び市販されているグリセリン、シュークロース、デンプ
ン、グルコース、ガラクトース、マンノース、糖みつな
との炭水化物、あるいは脂肪などの炭素源、及び食塩、
リン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどの無
機塩を使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩、
消泡剤としての肋、植、鉱物油などを添加することもで
きる。これらのものは生産菌が利用し、ジオクタチンの
生産に役立つものであればよく、公知の放線菌の培養材
料はすべて用いることができる。ジオクタチンの大量生
産には液体培養が好ましく、培養温度は生産菌が発育し
、ジオクタチンを生産する範囲で適用でき、通常１５〜
３４℃好まｌ〜くは２５＝＝　３０　ｔである。培養は
以上に述べた条件を、使用するジオクタチン生産閑の性
質に応じて適宜選択して行うことができる。ジオクタチ
ンは培養ろ液及び菌体の両方に存在する。培養ろ液より
は、ｐＨ２以下でブタノールなどの水不混和性の有機溶
剤で抽出することができるほか、ダイヤイオンＩ　Ｐ　
−２０などの有機吸着剤に吸着後、酸性含水メタノール
、酸性含水アセトンなどで溶出できる。菌体よりは、酸
性含水メタノール、酸性含水アセトン等の有機溶剤で抽
出後、抽出液を減圧濃縮し培養ろ液と同様の方法で更に
溶媒抽出することができる。上述の方法に加え、脂溶性
物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマ
トグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、薄層クロ
マトグラフィーよりのかき取り、高速液体クロマトグラ
フィー等を適宜組合せ、あるいは繰返すことによって純
粋に採取することができる。

ジオクタチンＡＳＢの形状、質量分析、分子式、比旋光
度、紫外部吸収極大、赤外部吸収極大、溶解性、シリカ
ゲル薄層クロマトグラフィーのＲｆ値を、第４表に示す
。また、第１図及び第２図にそれぞれジオクタチンΔ、
ジオクタチンＢの臭化カリウム錠による赤外部吸収スペ
クトルを示す。各図において横軸には波数（ｃｍ−’）
を、縦軸には透過率（％）を示す。そして、第３図にジ
オクタチンＡ塩酸塩の、第４図にジオクタチンＢ塩酸塩
のそれぞれ重水素化ジメチルスルホキシド中の４００　
ＭＨｚプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す。各図にお
いて横軸は化学シフト（ｐｐ＠）を表す。なお内部基準
はテトラメチルシランである。更にまた、ジオクタチン
Ａ塩酸塩、及びジオクタチンＢ塩酸塩の重水素化ジメチ
ルスルホキシド中の１００　Ｍｔｌｚ”Ｃ核磁気共鳴ス
ペクトルデーダを第５表に示す。

第５表 １６Ｂ、　８ １６５．５ １３１゜３ １２８、６ ５２．５ ４６．１ ４０゜９ ４０゜５ ３６ ３１．１ ：ｎ、ｉ ０８ ２５．０ ２３．７ ２２．０ ２１．８ １４、０ １３．９ １３．８ １６Ｂ、　５ １６５、５ １３１、４ １２８、６ ８２ ４６．２ ０６ ７５ ３３．６ １１ １１ ３１゜０ ２５．０ ２４．０ ２２．０ ２１．８ １３．９ １３．８ １３．５ ｑは四重線 内部基準はテトラメチルシラン 上記理化学的性状によりジオクタチンＡ、　Ｂはそれぞ
れ下記式■及び■の構造を有する。

ジオクタチンＡ ジオクタチンＢ ジオクタチンの塩の例としては、ジオクタチンのカルボ
キシル基における薬学的に許容できる陽イオン、例えば
ナトリウム、カリウムのごときアルカリ金属、カルシウ
ム、マグネシウムのごときアルカリ土類金属の陽イオン
との塩がある。

更にジオクタチンのアミノ基における薬学的に許容でき
る陰イオン、例えば塩酸、硫酸、リン酸などの鉱酸との
塩がある。

ジオクタチンは毒性の低い物質であり、マウスに対する
急性毒性試験では、マウス腹腔内にジオクタチンＡの２
５０■／　ｋｇを投与しても、ジオクタチンＢの２５０
ｄｇ／ｋｇを投与しても死亡例は認められなかった。

〔実施例〕

次に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら
に限定されるものではない。なお、各鋼中％は特に断ら
ない限り重量％である。

実施例１ 寒天斜面培地で培養した放線菌ス）・レプトミセス属ｓ
ｐ、５Ａ−２５８１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｐ
、５Ａ−２５８１）株〔微工研菌寄第１０７７８号（Ｆ
口ＲＭ　Ｐ−１０７７８）　］よりグリセロールＩ５％
、フマルマメディア［株］（トｌ／イダーズ・オイル・
ミル社！ＩＩ）　１゜５％からなる液体＠地（ｐＨ７，
４）を１００ｄずつ分注したワツフル付き三角フラスコ
に１白金耳ずつ接種し、２７℃、３日間振とう培養した
。これを種培養として、滅菌した前述の培地１．５１を
入れたジャー培養器４基に４００ｒＩｄ！ずつ接種して
、２７℃１通気毎分１０１１かくはん毎分１００回転の
条件で６日間培養した〔消泡剤は必要に応じてプロナー
ル５０１　　（信越化学工業製）を適宜加えた〕。こう
（７て得られた培養液をセライトをろ過助剤としてろ過
しろ液と菌体を分別した。ろ液４１１（３，２ｘＪ、０
’ユニツトの阻害物質を含む）を４ｐのダイヤイオンＨ
Ｐ−２０［三菱化成■］のカラムにかけ、水１６１を流
した後Ｏ７１規定の塩酸水を５０（容１）％含むアセト
ン溶液１６１で溶出した。得られた溶出液！６．８ｊ？
　（２，１５Ｘｌ　Ｏ’ユニット）を減圧＃ｉ縮してア
セトンを留去し、水を加左て３１とした。これをブタノ
ール３Ｒで抽出し、水洗後のブタノール層３β（１，８
７ＸｌＯ’ユニツト）に１規定アンモニア水を加えて中
和して減圧濃縮した。菌体などの固形物は０゜２５規定
の塩酸水を２０（容量）％含むメタノール溶液ＩＯ！で
抽出した。この抽出液ｌＯβ（３゜２８ｘｌＯ’ユニツ
ト）を減圧濃縮してメタノールを留去した後、ろ液の場
合と同様にブタノールで抽出し、ブタノール層を水洗後
アンモニア水を加えて中和し減圧′ａ縮してシロップ状
の濃縮液とした。これを培養ろ液に由来するシロップ状
濃縮液と合せ塩酸酸性メタノールに溶かして６ＱＯ１１
ｉとし、これに１規定アンモニア水を加えて中和して沈
殿物を析出させた。沈殿物をろ過により集め水洗後、減
圧下に乾燥し１、３６　ｇの粗粉末を得た。これにメタ
ノール１００ｒＩＪ１．を加え２０％塩酸を滴下して溶
解し、シリカゲル１３．６　ｇを加えて減圧下に濃縮乾
固した。次にこれをシリカゲル１２２ｇを充てんした内
径３．２　ｃｍのカラムにかけて混合溶媒（クロロホル
ム：メタノール：酢酸−１００：３０：１）で溶出した
。２成分の活性分画が得られた。後から溶出される活性
物質をジオクタチンＡや先に溶出される活性物質をジオ
クタチンＢと命名した。それぞれの活性分画を集めて減
圧下に濃縮乾固した。それぞれを塩酸酸性メタノールに
溶解し１規定アンモニア水を滴下することにより活性物
質を析出させた。これをろ過により集め水洗後、減圧１
１２、ジオクタチンΔの６６２■の白色粉末とジオクタ
チンＢの１８０■の白色粉末を得た。ジオクタチンＡと
ジオクタチンＢはそれぞれ０．１９μｇ　／ａｌｅと０
．８９μｇ／−の濃度でラット膵臓由来のジペプチジル
アミノペプチダーゼ■を５０％阻害した。

〔発明の効果〕

以」二詳細に説明したとおり、本発明により自己免疫疾
患と深い関わりのあるジペプチジルアミノペプチダーゼ
■を特異的に阻害する新規生理活性物質ジオクタチンが
提供された。またジオクタチンは、２種類の系統の異な
るラット陣細胞を用いた混合リンパ球反応において広い
濃度範囲でこれを有意に抑制することより、免疫抑制剤
としての有用性を有する。一方、ジオクタチンはコンカ
ナバリンＡで前処理したラット牌細胞（ナイロンウール
通過細胞）の培養における増殖細胞のトリチウム化チミ
ジンの取込みを有意に促進１２、免疫調整剤としての作
用が期待される。

【図面の簡単な説明】 第１図及び第２図はそれぞれジオクタチンΔ、Ｈの臭化
カリウム錠による赤外部吸収スペクトル図、第３図及び
第４図はそれぞれジオクタチン八、Ｂの重水素化ジメチ
ルスルホキシド中の４００　ＭＨｚプロトン核磁気共鳴
スペクトル図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ｒは水素あるいはメチル基を示す）で表される
   化合物であることを特徴とする生理活性物質ジオクタチ
   ンあるいはそれらの塩。 ２、ストレプトミセス属に属するジオクタチン生産菌を
   培養し、その培養物から請求項１記載の生理活性物質ジ
   オクタチンの少なくとも１種を分離採取することを特徴
   とする生理活性物質ジオクタチンの製造方法。