NO166538B - Mikrobiell hydroksyleringsmetode for kinin, kinidin, dihydrokinin og dihydrokinidin. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og stereospesifikk hydrolysering av kinin, kinidin, dihydrokinin og dihydrokinidin i 3S-stilling.

Hepatisk mikrosomal hydroksylering utgjør ofte et av de første metabolismetrinn av en fremmed kjemisk forbindelse som innføres i et pattedyrs hjelpe- eller blodsirkuleringssystemer. En slik hydroksylering etterfulgt av andre reaksjoner såsom 0-metylering eller konjugering foretas for å gjøre slike substanser mer vannløselige og derfor påskynde utskillelsen av dem. I visse tilfeller er imidlertid de hydroksylerte forbindelser mer aktive eller mer giftig enn det opprinnelige molekyl; dette berettiger interesse for identifisering av dem, og derfor fremstilling av dem med tanke på undersøkelse av deres aktivitet.

Organiske syntesemetoder er åpenbart greie for metabolitter av enkle forbindelser, men den kjemiske fremstilling av mer kompliserte (og optisk aktive) molekyler kan kreve betydelig anstrengelse og tid.

Hydroksyleringer ved mikrobiologiske midler har allerede blitt utviklet betydelig for mange år siden på området steroider, hvor de har gjort det mulig å oppnå i industriell skala regio-og stereoselektivt hydroksylerte produkter som stammer fra spesifikk oksydering av ikke funksjonaliserte karbonatomer. Slike molekyler ville ha krevet betydelige syntetiske anstreng-elser hvis det hadde vært nødvendig å anvende kjemiske metoder. Denne metoden er senere blitt anvendt på andre molekylgrupper

og den utgjør i visse tilfeller en foretrukket måte å fremstille nye forbindelser på, som kan overføres til produksjon i stor skala ved å bruke klassiske fermenteringsteknikker og utstyr. Videre viser det seg at mikrobielle hydroksyleringer for hver type fører til et ofte snevrere område av metaboliter enn det som finnes i pattedyrets systemer, og fjerner således noen separasjonsproblemer; det er da tilstrekkelig å utnytte multiplisiteten av stammer for å rekonstituere de forskjellige muligheter for levrede metaboliter.

På alkaloideområdet er imidlertid temmelig få reaksjoner av denne type beskrevet, og de vedrører i de fleste tilfeller den ikke-nitrogenerte del av det aromatiske eller ikke-steroide molekyl. Det er derfor både ønskelig og interressant å kunne utføre under fordelaktige betingelser hydroksylering av nitrogen-holdig alkaloidekjerne hvis. produkter allerede er gjenkjent som aktive metaboliter. Spesielt beskriver fransk patent nr. 2.506.312 hydroksylerte forbindelser av kinidin såsom 3-hydroksy-10,11-dihydro-kinidin og dens 3R og 3S epimere som kan anvendes terapeutisk for behandling av kardiale arrytmier. På den annen side er man klar over at kinin hvis farmakologiske egenskaper er kjente og kinidin er to isomerer, som adskiller seg i sine konfigurasjoner med hensyn: til karbonene i stillingene 8 og 9.

Fremstillingen av slike aktive, optisk rene forbindelser ved en mikrobiologisk metode, som kan overføres til industriell skala „ er derfor et mål av åpenbar interresse med' hensyn til kjemiske hydroksyleringer,. hvilke fører til lave utbytter og diastereoisomere blandinger.

Målet for denne oppfinnelse er derfor å frembringe en ny fremgangsmåte for mikrobiologisk hydroksylering av kinin, kinidin og deres derivater, spesielt deres hydrogenerte derivater på en regio- og stereospesifikk måte slik at man får optisk rene forbindelser.

Et annet mål for denne oppfinnelse er å frembringe en fremgangsmåte for mikrobiologisk hydroksylering av kinin, kinidin og deres derivater, anvendelige for industrielle formål, og frembringe optisk rene forbindelser i et tilfredsstillende utbytte ved hjelp av apparatur av vanlig type. Den regio-spesifikke og stereospesifikke mikrobiologiske hydroksylerings-metode ifølge denne oppfinnelse muliggjør hydroksylering i 3S-stillingen av kinin, kinidin og deres dihydroderivater med formelen (I): hvor R betyr en etyl- eller vinylgruppe under dannelse av det tilsvarende 3S-hydroksylerte derivat med formel (II):

hvor R har samme betydning som ovenfor, ved at en mikroorganisme av typen lavere sopp valgt fra gruppen bestående av Cunninghamella echinulata, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, eller typen bakterie så som Streptomyces rimosus, dyrkes i et dyrkningsmedium inneholdende kilder for assimilerbart karbon, nitrogen og mineralsalter under betingelser for aerob fermentering i dypkultur, og forbindelsen som skal hydroksyleres settes direkte til dyrkningsmediet når veksten av mikroorganismen er tilstrekkelig, med det forbehold at C. echinulata ikke anvendes for hydroksyleringen av kinidin.

I formel (I) ovenfor, representerer R en vinylrest i tilfellet kinin og kinidin som adskilles ved karbonenes konfigurasjoner i stillingene 8 og 9, og R representerer en etylrest i tilfellet hydrogenerte derivater, dvs. dihydrokinin og dihydrokinidin. Den samme anmerkning gjelder de hydroksylerte derivater med formel (II).

De heretter identifiserte stammer brukes fortrinnsvis: Cunninghamella echinulata (NRRL 3655, MMP 2203), Mucor circinelloides (CBS 108-16), Mucor plumbeus (MMP 430, CBS 111-07) og Streptomyces rimosus (NRRL 2234).

De ovennevnte henvisninger har sine vanlige betydninger, dvs. NRRL = Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center, Peoria, 111.; CBS = Centraal Bureau voor Shimmelcultures, Baarn Netherlands; MMP: Mycothéque du Muséum d'histoire Naturelle, Paris, France.

Dyrkningen forløper fortrinnsvis under aerobe fermenterings-betingelser og i dypkultur. Forbindelsen som skal hydroksyleres tilsettes - fortrinnsvis under sterile betingelser - til mediet, man inkuberer inntil man har fått en tilstrekkelig mengde av de hydroksylerte produkt, og ekstraksjon utføres ved vanlige teknikker. Inkuberingen kan utføres i en vanlig type fermenteringstank i et temperaturområde mellom ca. 20 og 30°C, idet mediet har pH nær 7. Om nødvendig kan man bruke et medium med en pH på mellom ca. 6 og 8 uten å nevneverdig endre resultatene.

Fremgangsmåten som benyttes består i å dyrke mikroorganis-mene i et egnet dyrkningsmedium slik at man får en godt utviklet biomasse; i tillegg til en kilde for assimilerbart karbon (dextrose, saccharose, stivelse, mannitol) i en 1 til 10% konsen-trasjon kan mediet inneholde en kilde for nitrogen, enten organisk (peptoner, asparagin, protein hydrolysat) eller mine-ralsk (ammoniumsalter, nitrater) og de nødvendige mineralsalter, samt som vitaminsubstanser (slike som foreligger i "maisstøp", gjærekstrakt, ...); temperaturen kan variere fra ca. 20 til 30°C avhengig av stammene, og dyrkningen utføres med røring. Når veksten anses tilfredsstillende og i alminnelighet når hydrokar-bonsubstratet er uttømt, dvs. etter ca. 2 til 5 dager, tilsettes forbindelsen som skal hydroksyleres - som et fast stoff eller oppløst i et lite volum av et vannblandbart organisk løsnings-middel (f.eks. etanol), under sterile betingelser ved en sluttkonsentrasjon som kan variere fra 0,2 til flere gram/liter, avhengig av molekylet eller stammen. Inkubering som kan følges av en svak restvekst fortsetter under kraftig røring for å belufte blandingen ved den samme temperatur i et 2 til 40 dagers tidsrom.

Ifølge en variant av den oppfunnede fremgangsmåte utføres inkuberingen av forbindelsen som skal hydroksyleres med celler som er forut vasket og gjenoppslemmet i et bufret vandig medium som ikke inneholder noe karbon eller nitrogen. Hydroksyleringen utføres så etter at mikroorganismen har vokst og etter at mycelet er samlet uten vekst.

Ekstraksjon av inkuberingsproduktene samt for resten av substratet utføres ved hjelp av et organisk løsningsmiddel som ikke er blandbart med vann (metylenklorid, kloroform, etylacetat osv.) etterat mycelet er fjernet ved filtrering og løsningsmidlet mettet med salter (NaCl, Na2S04).

Påvisningen og identifisering av hydroksyleringsproduktene kan utføres ved tynnsjikt kromatografi på kiselgel eller ved revers-fase-høytrykksvæske-kromatografi. Separasjon av de hydroksylerte produkt fra det gjenværende opprinnelige substrat, om sådant foreligger - og dets rensning utføres ved klassiske teknikker for krystallisering eller kromatografi på mineralske adsorbenter.

De rensede hydroksyleringsprodukter er blitt identifisert ved sammenligning med de autentiske (3S)-hydroksy produkter

(fremstilt ved kjemiske metoder eller beskrevet i litteraturen)

i forskjellige kromatografiske systemer, samt ved vanlig spektro-skopiske (UV, ^-H- eller <13>C-NMR) og polarometriske teknikker.

De oppnådde resultater er gjengitt i de følgende eksempler, hvori flere stammer av mikroorganismer som er i stand til å utføre disse hydroksyleringer regio- og stereoselektivt ut fra flere av de aktuelle substrater med en variabel omdannelses-hastighet er blitt karakterisert. I tillegg til den vesentlige fordelen med hydroksyleringsselektivitet, er en annen fordel at det ikke dannes andre metaboliter i nevneverdige mengder, hvilket forenkler rensningen og muliggjør resirkulering av substratet som eventuelt ikke er blitt metabolisert.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen uten å begrense dens omfang.

EKSEMPEL 1

Hydroksylering av kinidin med M. plumbeus

Noen få dråper av en suspensjon av M.plumbeus MMP-430 sporer settes til 100 ml medium A beskrevet nedenunder justert til pH

7 i en 250 ml Erlenmeyerkolbe. Inkuberingen fortsetter i 72 timer ved 37°C på en roterende rister (327 OPM). En løsning av 50 mg kinidin i 1 ml etanol tilsettes så under sterile betingelser til kulturen, og ristingen fortsetter i 14 dager under de samme betingelser. Kulturen filtreres på celit, filtratet mettes med NaCl, bringes til pH 10-12 med 2N NaOH, ekstraheres så seks ganger med metylenklorid. De tørkede og deretter inndampede organiske fraksjoner kromatograferes på et preparativt sjikt av

kiselgel ved bruk av løsningsmidlet CHCl2-MeOH-NH4OH (85:14:1). (3S)-3-hydroksy-kinidinbåndet som identifiseres ved sin fluores-cens ved 254 nm og sin vandring som er mindre enn kinedinets, skrapes av og elueres med metanol. Man får 1 mg (3S)-3-hydroksy-kinidin, identisk med en autentisk prøve. Ikke-omsatt kinidin gjenvinnes på samme måte og nesten kvantitativt (42 mg).

EKSEMPEL 2

Hydroksylering av dihydrokinidin ved M. plumbeus

Den samme inkubering utføres på en lignende kultur av

M. plumbeus CBS 111-07 med 1 g/liter sluttkonsentrasjon dihydrokinidin, utbytter etter 20 dager 5 mg (3S)-3-hydroksy dihydrokinidin, identisk med en autentisk prøve og 80 mg gjenvunnet dihydrokinidin.

EKSEMPEL 3

Hydroksylering av dihydrokinidin med S. rimosus

Noen få ml av en forkultur av S. rimosus NRRL 2334 forkultur settes til 100 ml medium B (beskrevet nedenunder), justert til pH 7. Dyrking utføres ved 72 timer ved 27°C; 100 mg dihydrokinidin oppløst i 1 ml etanol tilsettes og risting fortsettes i 25 dager under de samme betingelser. Man får på samme måten 4 mg (3S)-3-hydroksy dihydrokinidin og 85 mg gjenvunnet dihydrokinidin.

EKSEMPEL 4

Hydroksylering av kinidin med C. echinulata

Den samme inkubering utført på lignende kultur (medium A)

av C. echinulata NRRL 3655 med kinin i en 1 g/liter sluttkonsentrasjon gir etter 30 dager 9,5 mg (3S)-3-hydroksy kinin identisk med en autentisk prøve og 75 mg gjenvunnet kinin. Også dannelsen av små mengder av to andre produkter (som fluorescerer ved 2 54 nm) påvises.

EKSEMPEL 5

Hydroksylering av dihydrokinin med M. circinelloides

Den samme inkubering utført på en lignende kultur (medium

A) av M. circinelloides CBS 108-16, med dihydrokinin i en sluttkonsentrasjon på 1 gram/liter, gir etter 36 dager 17 mg (3S)-3-hydroksy dihydroksykinin identisk med en autentisk prøve og 70 mg gjenvunnet dihydrokinin.

EKSEMPEL 6

Hydroksylering av dihydrokinidin med M. plumbeus

To hundre ml kultur av M. plumbeus MMP 430 i det samme medium A som i eksempel 1 blandes, sentrifugeres og mycelet, vasket under sterile betingelser med en fosfatbuffer inneholdende 2 gram K2HP04 og 1 gram KH2P04 pr. liter destillert vann, plasseres i 100 ml av den samme buffer og inkuberes med dihydrokinidin i en sluttkonsentrasjon på 0,5 gram/liter.

Etter 5 dagers inkubering ved 27°C oppnås 6,5 mg (3S)-3-hydroksy dihydrokinidin og 40 mg gjenvunnet dihydrokinidin ved vanlige teknikker.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved regiospesifikk og stereospesifikk hydroksylering av kinin, kinidin, dihydrokinin og dihydrokinidin i 3S-stilling, karakterisert ved at en mikroorganisme av typen lavere sopp valgt fra gruppen bestående av Cunninghamella echinulata, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, eller typen bakterie så som Streptomyces rimosus, dyrkes i et dyrkningsmedium inneholdende kilder for assimilerbart karbon, nitrogen og mineralsalter under betingelser for aerob fermentering i dypkultur, og forbindelsen som skal hydroksyleres settes direkte til dyrkningsmediet når veksten av mikroorganismen er tilstrekkelig, med det forbehold at C. echinulata ikke anvendes for hydroksyleringen av kinidin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at inkuberingen av forbindelsen som skal hydroksyleres utføres direkte med forutvaskede celler, som er gjenoppslemmet i et medium som ikke inneholder noen kilde for karbon eller nitrogen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at inkuberingen utføres i temperaturområdet 20 til 3 0°C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at dyrkningsmediets pH er i området mellom 6 og 8.