KR0184752B1 - 신규한 마크롤라이드계 항생물질과 그를 생산하는 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 특히 그람 양성균과 기존의 항생물질 내성균주에 대해 강력한 항균활성을 갖는 다음의 구조식으로 표시되는 마크롤라이드계 항생물질 GERI-155와 그의 유도체를 제공하는 것이며, 이 GERI-155를 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155를 제공한다. 또한 본 발명은, 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155를 영양배지에서 배양하여서 GERI-155를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

Description

신규한 마크롤라이드계 항생물질과 그를 생산하는 미생물

제1도는 본 발명에 따른 마크롤라이드계 항생물질의 자외선 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,

제2도는 본 발명에 따른 마크롤라이드계 항생물질의 적외선 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 본 발명에 따른 마크롤라이드계 항생물질의 탄소 핵자기 공명 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이고,

제4도는 본 발명에 따른 마크롤라이드계 항생물질의 수소 핵자기 공명 흡수 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 신규한 마크롤라이드계 항생물질과 그를 생산하는 새로운 토양 미생물분리균에 관한 것이다.

1929년 플레밍에 의해 최초로 페니실린이 발견된 이래 많은 항생물질이 개발되어 왔으며, 현재 그 수가 13,500 여종에 달하는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 이러한 많은 항생물질이 개발되어 있음에도 불구하고, 항생물질을 자주 사용함에 따라 세균들이 그 항생물질에 대해 내성을 갖게 되어, 새로운 항생물질의 개발은 계속 요구되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 토양방선균류로 부터 새로운 생리활성물질을 탐색하던 중 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 방선균의 한 균주로부터 신규한 마크롤라이드계(Macrolide) 항생물질을 발견하게 되었다. 이 항생물질은 지금까지 알려진 마크롤라이드계 항생물질, 예컨데 찰코마이신(Chalcomycin : Woo, P.W.K. et al., J. Am. Chem. Sco. 86, 2726(1964)), 뉴트라마이신(Neutramycin : Kunstmann, M. P. et al., Experientia 21, 372(1965)), 알드가마이신 씨(Aldgamycin C : Ellestad, G. A. et al., Tetrahedron 23, 3893(1967)), 알드가마이신이(Aldgamycin E : Ellestad, G. A. et al., Tetrahedron 23, 3893(1967)), 알드가마이신 에프(Aldgamycin F : Achenbach, H. et al., Chem. Ber. 108, 780(1975)), 알드가마이신 지(Aldgamycin G : Mizobuchi, S. et al., J. Antibiotics 39, 1776(1986)), 스왈파마이신(Swalpamycin : Christopher, M. M. et al., J. Antibiotics 40, 1361(1987); 유럽특허공개 제257615호) 및 기타 오오무라 등에 의해 정리된 16 원환 마크롤라이드계 항생물질의 총설(Omura, S. et al., Am. Chem. Soc. 97, 4001(1975))에 기재된 화합물 등과는 구조식, 분자량, 분자식 및 기타의 이화학적 특성 등에서 명료하게 구별되었으며, 그람양성균(Gram-positive bacteria) 등에 강한 항균활성을 나타내었고, 특히 기존의 항생물질에 내성을 나타내는 균주에 강한 항균활성을 나타냄을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 신규한 마크롤라이드계 항생물질과 그를 생산하는 신규한 미생물을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

본 발명자들이 발견한 항생물질 생성 균주는 강원도 홍천지역에서 채취한 토양으로부터 새롭게 분리한 균주로서 미생물학적인 특성은 다음과 같다.

1) 형태적 특성

ISP(International Streptomyces Project) 규정에 따라 28℃에서 14일간 배양한 후 광학현미경 및 전자현미경하에서 형태적 특성을 조사한 결과, 포자의 연쇄형태는 나선상의 형태를 나타내었으며 포자의 표면은 매끈하고 기생균사는 비교적 잘 성장 분기하며 통상의 조건하에서는 분단하지 않는 특성이 있었다. 전분 한천, 오트밀한천배지 등에서는 기균사를 양호하게 착생하며 포자의 형성 정도도 매우 풍부하였다.

본 포자는 원통형으로 크기는 0.6∼0.7×0.8∼1.1μm으로 보통 10-50개 정도의 연쇄상으로 되어있다.

2) 각종 배지조건에 따른 배양학적 특성

각종 ISP 배지조건에서 28℃, 14일간 배양한 후 본 균주의 배양학적 특성을 조사하였으며, 그 결과는 다음의 표 1과 같았다.

본 균주의 생육정도는 효모·맥아한천배지, 전분한천배지, 오트밀한천배지, 글리세롤·아스타라진한천배지 등에서 비교적 양호한 생육정도를 나타났으며 타이로신한천배지에서는 보통이었고 글루코스·아스파라진한천배지, 글루코스·나이트레이트한천배지, 글루코스·펩톤한천배지, 슈크로스·나이트레이트한천배지, 영양한천배지 등에서는 불량한 생육정도를 나타냈다. 한편 기생균사의 색상은 대부분의 배지에서 회색을 나타냈으며 배지 뒷면의 색상은 갈색을 나타내었고 수용성 색소는 무색 내지는 흑색을 나타내었다.

3) 생리적 특성

본 균주의 생리적 특성을 조사하기 위하여 쉴링·거트리브 한천배지를 사용하여 28℃에서 14일간 배양한 후 전분가수분해능, 젤라틴 액화능, 밀크의 펩톤화 및 응집화, 멜라닌 색소의 형성능, 카제인 가수분해능, 식염내성 정도 및 생육온도 등을 조사하였으며, 그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다.

4) 탄소이용성

본 균주의 탄소이용성을 조사하기 위하여 쉴링·거트리브 한천배지를 사용하여 28℃에서 14일간 배양한 후 탄소원의 이용능력을 조사하였으며, 그 결과를 다음의 표 3에 나타내었다.

본 균주는 공시한 13 종류의 탄소원 중 글루코스, 아라비노스, 후락토스, 말토스 등은 잘 이용하였으나 람노스, 라피노스 등은 그다지 잘 이용하지 못하였고, 셀룰로스, 자이로스, 락토스, 이노시톨 등의 탄소원은 전혀 이용하지 못하였다.

++ : 생육아주양호, + : 생육양호, ± : 생육불량, - : 생육치 못함

5) 균체성분

본 균주의 균체세포벽 성분을 조사하기 위하여 벡커의 방법(B. Becker et al., Applied Microbilogy 12, 421-423(1964))에 의해 검토한 결과 본 균주의 균체 가수분해 성분인 디아미노피멜린산(diaminopimellic acid)은 LL형이었다.

이상으로 본 균주의 형태학적, 배양학적, 생리학적 특성 또는 달이용성, 균체성분 등을 조사한 결과 본 균주는 방선균 중에서도 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주로 본 발명자들은 본 균주를 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155(Streptomyces sp. GEGI-155)로 명명하였다. 본 균주를 부다페스트 조약하의 기탁기관인 유전공학연구소 유전자은행에 1992년 4월 14일자로 기탁되었으며 KCTC-0041BP의 기탁번호를 부여받았다.

본 균주의 동정에서 ISP(International Streptomyces Project)기준, 버지스매뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, 제4판, 1989), 액티노마이세테스(The Actinomycetes) 제2권 및 방선균에 관한 최근의 문헌에 의해 실시하였다.

방선균의 제반성질은 일정한 것이 아니라 자연적으로 혹은 인공적으로 용이하게 변화되는 것이 알반적인 성질이며, 본 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155 균주도 일반 방선균주의 경우와 마찬가지로 그 성상이 변화하기 쉽다. 따라서, 본 발명 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155는 물론, 이 균주에 유래하는 돌연변이주(자연돌연변이 또는 인공돌연변이), 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어진 균주라 하여도 GERI-155 물질을 생산하는 것은 모두 본 발명에 포함한다.

본 발명에 있어서 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로서는 종래 방선균의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산암모니움, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서는, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 또한 균의 생육을 촉진하며 마크롤라이드계 항생물질의 생산을 촉진시키기 위하여 유기물 및 무기물을 적당히 첨가하면 효과가 있다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 통기교반 배양하는 것이 좋다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 15℃∼37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 대부분의 경우에는 26℃∼30℃에서 배양한다. 또한 배양기간은 진탕배양, 탱크배양의 경우 모두 통상 2일 내지 7일간 배양할 때 항생 물질의 생산이 최고에 달하였다.

상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 배양하면 마크롤라이드계 항생물질을 얻을 수 있는데, 본 물질은 배양액 뿐만 아니라 균체부분에도 존재하므로 배양액을 원심분리하여 배양상등액과 균체를 분리한 후 다음의 방법에 따라 효율적으로 추출, 정제를 실시할 수 있다. 즉, 마크롤라이드계 항생 물질은 지용성(lipophilic compound)이기 때문에 배양액에 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 유기용매를 가하여 추출한다. 한편, 균체부분은 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 다시 에틸아세테이트, 클로로포름 등을 추출한 후 배양액 추출물과 합친다. 이와 같이 하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트, 클로로포름 용매를 증발건조시킨 후 클로로포름 : 메탄올을 100 : 1∼1 : 1인 용매를 사용한 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피이 실시하고, 클로로포름 : 아세톤이 10 : 1∼1 : 1인 용매를 사용하여 로바컬럼 크로마토그래피를 실시한다. 이와 같이하여 얻어진 활성분획들을 재차 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 한 후 HPLC 하여서 순수한 본 발명의 항생물질을 얻을 수 있었다.

본 발명의 항생물질의 활성검정은 공지의 박테리아인 바실러스 써틸리스(Bacillus subtilis)를 검정균으로 이용하였다. 상기의 정제 방법은 단독 또는 복합적으로 반복하면 더욱 손쉽게 순수한 정제품을 얻을 수 있다. 이상과 같이 하여 정제된 본 발명의 항생물질의 이화학적 특성은 다음과 같다.

1) 물질의 성상 : 백색분말

2) 분자량 : 702

3) 분자식 : C₃₅H₅₈O₁₄

4) 질량분석(M + H)⁺

계산치 : 703.3905

실측치 : 703.3921

5) 비선광도 : [α]_D: -75.5°(C. 0.37 메탄올 용액에서)

6) 융점 : 98.5℃

7) 자외선 흡수 스펙트럼(UV λ^MeOH _MaXnm(ε))

메탄올에서 측정한 자외선 흡수 스펙트럼은 제1도에 나타낸 바와 같이 217(19,400), 290(S)에서 흡수피크를 나타났다(제1도).

8) 적외선 흡수 스펙트럼(IRλ^CHCl3 _MaXnm)

CHCl₃를 용매로 하여 측정한 스펙트럼은 제2도에 나타낸 바와 같이 3580, 2950, 1919, 1805cm_-1에서 흡수피크를 나타냈다.

9) 핵자기 공명(NMR) 흡수 스펙트럼

듀트로클로로폼(CDCl₃)을 용매로 하고 테트라메틸실란을 포준물질로 하여 탄소 핵자기 공명(¹³C-NMR) 스펙트럼과 수소 핵자기 공명(¹H-NMR) 스펙트럼을 조사한 결과 제3도 및 제4도와 같이 탄소 35, 수소 58, 산소 14개의 특징적인 피크가 나타났다.

10) 용해성

용해 : 아세톤, 벤젠, 크로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올에 용해

불용 : 물, n-핵산에 난용 또는 불용

11) 박층 크로마토그래피의 Rf치 = 0.25

흡착제 : 머크사 실리카젤 60F 254

전개용매 : CHCl₃: 아세톤 = 1 : 1

12) 발색반응

닌히드린(Ninhydrin) : 음성

브롬크레졸그린(Bromcresol green) : 음성

바닐린(Vaniline) : 음성

13) 화학구조식

본 발명자들은 상기와 같이 정의된 화합물을 GERI-155라 명명하였다. 본 발명은 상기 GERI-155는 물론 이들의 무기 또는 유기염, 에스테르 수화물 및 용매화물과 이성질체를 포함한 모든 유도체까지도 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나, 이 실시예에 본 발명이 국한되는 것은 아니며, 배지의 종류, 배양조건, 추출정제 방법 등을 대폭적으로 바꾸어도 본 물질을 얻을 수 있으며 또한 기존의 항생 물질에 내성을 나타내는 군주에 대한 항생제 등 다양한 용도로도 이용될 수 있을 것이다.

[실시예 1 : 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155 균주의 배양]

스트렙토마이세스 에스피. GERI-155 균주(KCTC OO41BP)를 배양하기 위하여 종배지로는 글루코스 2%, 대두박 2.5%, 육즙 0.1%, 효모추출액 0.4%를 넣은 배지를 사용하였다. 또 생산배지로는 가용성 전분 1%, 글루코스 2%, 대두박 2.5%, 육즙 0.1%, 효모추출액 0.4%, 소금 0.2%, 인산 제2칼리 극소량을 함유한 배지를 사용하였다. 종배지, 생산배지 모두 멸균전에 pH를 7.3으로 조정한 후 사용하였다.

상기의 종배지 20ml가 담긴 100ml 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 스트렙토마이세스 에스피. GERI-155(KCTC 0041)의 사면배양 시험관에서 1백금이를 접종하여 28℃에서 3일간 진탕배양하여서 1차 종배양액으로 하였다. 그런 다음에 종배지 100ml가 들어 있는 500ml용량의 삼갈플라스크를 121℃에서 에서 20분간 멸균하고 상기 1차 종배양액 5ml를 접종하여 28℃에서 3일간 배양하여서 2차 종배양액으로 하였다. 이어서, 18ℓ의 생산배지가 들어있는 30ℓ 용량의 발효조를 미리 멸균시킨 후 제2차 종배양액 800ml를 접종하여 28℃에서 4일간 배양하였다. 이때 배양조건으로는 통기 18ℓ/분, 각반은 초기 200rpm, 후기 300rpm으로 하였다.

[실시예 2 : GERI-155의 분리 및 정제]

상기의 실시예 1에서 배양한 배양액을 12,000 × g에서 15분간 원심분리하여 배양 상등액과 균체를 분리하고 균체는 다시 80% 아세톤 10ℓ로 2회 반복 추출한 후 감압농축하여 아세톤을 제거하고 배양 상등액 15ℓ와 합하여 동량의 에틸아세테이트로 3회 반복 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 감압농축하여 약 9g의 조유효성분을 얻었다. 이를 클로로포름에 용해한 후 실리카젤(70∼230mesh, Merck) 500ml의 컬럼크로마토그래피(5×40cm)에 걸어 클로로포름 : 메탄올이 100 : 1 내지 1 : 1의 비율로 조성된 유기용매로 전개시켜 활성분획만을 모아 약 2.5g의 조유효성분을 얻었다. 이를 다시 로바컬럼(순상, 40∼63㎛)에 걸어 클로로포름 : 아세톤이 10 : 1에서 1 :1의 비율로 조성된 유기용매로 전개하여 약 97.2mg의 활성분획을 모았다. 이 활성분획을 아세톤을 전개 용매로 하여 세파덱스 LH-20(Pharmacia) 컬럼 크로마토그래피(1.75×100cm)에 걸어 활성분획 약 39.5mg을 모으고, 다시 HPLC(역상, UV : 210, 60% 메탄올, 40% 물)를 실시하여 15.9mg의 순수한 GERI-155 물질을 얻었다.

[실시예 3 : GERI-155 물질의 항균활성시험]

상기의 실시예 2에서 정제한 GERI-155 물질의 각종 미생물에 대한 항균활성을 1mg/ml 농도에서 페이퍼 디스크법(Hewitt, W., et al., Theory and application of Microbiological assay, AP, 1989)으로 조사하였다. 그 결과 표 4에 나타낸 바와 같이 그람양성세균 등에 강한 활성을 나타냈다. 특히 본 피검 균주 중 스타필로코커스 아우레우스 KCTC 1928 균주는 페니실린(penicillin), 카나마이신(Kanamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 크로람페니콜(Chlorampherirol), 테트라싸이클린(Tetracycline) 및 마크롤라이드(Macrolide) 계항생물질에 내성을 갖도록 만들어진 변이주이기 때문에 본 GERI-155 항생물질은 상기의 항생물질에 내성을 나타내는 균주에 특히 강한 활성을 갖는 항생물질이다.

[실시예 4 : GERI-155 물질의 독성시험]

GERI-155 물질을 6주령된 6마리의 ICR 계 숫놈 마우스에 각 100mg/kg 농도로 경구 투여하고 14일간 관찰한 결과 5마리 모두 아무런 이상을 발견하지 못하였다. 또한 부검 후 장기의 이상 유무를 관찰한 결과 장기내의 아무런 이상도 발견하지 못하였다.

Claims (4)

1. 다음의 구조식으로 표시되는 마크롤라이드계 항생물질 GERI-155, 그의 유도체 및 약학적으로 허용가능한 이들의 염 :
2. 제1항의 마크롤라이드계 항생물질 GERI-155를 생산하는 스트렙토마이세스 속 GERI-155(Streptomyces sp. GERI-155, KCTC 0041BP)
3. 스트렙토마이세스 속 GERI-155(Streptomyces sp. GERI-155, KCTC 0041BP) 균주를 영양배지에서 배양하여서 다음의 구조식으로 표시되는 마크롤라이드계 항생물질 GERI-155를 제조하는 방법 :
4. 제1항의 마크롤라이드계 항생물질 GERI-155, 그의 유도체 또는 약학적으로 허용 가능한 이들의 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.