JPH04262791A - モラノリン誘導体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、次の一般式〔Ｉ〕で表される、医薬品として
有用な、Ｎ−置換モラノリン誘導体の効率的かつ低廉な
取得方法に関する。 ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す。 一般式〔Ｉ〕においてＲが水素の物質は、モラノリンと
して最初、生薬桑白皮より抽出され医薬品としての有用
性が確認されたものである（八木ら「日本農芸化学会誌
」〔５０、５７１、（１９７６）〕。 一般式〔Ｉ〕においてＲが低級アルキルのものは、例え
ば特公昭５９−４３４５９号（特許第１２６８０３０号
）等により血糖上昇抑制等の薬理作用とともに公知にさ
れている化合物である。 本発明に係る化合物はその後、抗ウィルス作用のあるこ
とが確認されており（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２２９Ｐ　１９８８）、医薬品とし
ての重要性は非常に高いものである。

【従来の技術】

モラノリンは、モラノリン産生菌を培養することにより
取得する方法が確立されている（特公昭５６−０９９１
９５号等）。 一般式〔Ｉ〕においてＲが低級アルキルであるものは、
モラノリンを通常の方法により、例えば、適当なアルキ
ル化剤（例えば、アルキルハライド等）を反応させる方
法、Ｎ−アシル化した後に還元してＮ−アルキル体とす
る方法、アルキルアルデヒドと還元剤を作用させる方法
等により、随時取得することができた。 ところで、上記したこれまでの方法を適用させるために
は、モラノリンをいったん純粋な形で取得することが必
須であった。 本発明者らは、モラノリンの高産生能を有する菌株を取
得するべく研究を重ね、多数の成果を挙げたが、これら
によるモラノリン産生培養液中には、目的物たるモラノ
リンの他、１、５−ジデオキシ−１、５−イミノ−Ｄ−
マンニトールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニ
トール等の複数の低分子の塩基性水溶性物質が含まれて
いることが判った。 これまでは、培養液中からモラノリンを取得するために
、例えば、イオン交換法、活性炭素吸着法、セファデッ
クス、セルロース、シリカゲル等のカラムクロマト分画
等を適用して精製してきた。 これらの方法はなるほどモラノリンを単離する方法とし
ては順当なものではあったが、今日のように、モラノリ
ンが医薬品として又は医薬品の原料として極めて重要な
物質であることが判明してくると、更に効率よい方法が
望まれるようになり、高産生能を有する菌株の発見によ
り、培養液中からの目的物たるモラノリンの単離方法が
極めて重要な技術的課題として注目されるに到った。

【発明が解決しようとする課題】

従って、本発明の目的は、一般式〔Ｉ〕で表される化合
物を効率よい方法により取得することにあった。

【課題を解決するための手段】

本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を重ねた結
果、■サイクロデキストリングリコシルトランスフェラ
ーゼ（ＣＧＴａｓｅ）による糖転移反応は、モラノリン
及びＮ−低級アルキルモラノリンには反応するが、混在
する塩基性物質には反応しないこと、■上記反応により
取得されるモラノリン及びＮ−置換モラノリン誘導体の
グルコースオリゴマーは、本発明者らの開示した方法に
より（特公昭６０−２０３８号公報）、容易にグルコシ
ルモラノリン及びグルコシル−Ｎ−低級アルキルモラノ
リンに変換しうること、■グルコシルモラノリン及びグ
ルコシル−Ｎ−低級アルキルモラノリンは本発明者らの
開示した方法により（特開昭６２−２４２６９１号公報
）、容易に単離しうること、■グルコシルモラノリン及
びグルコシル−Ｎ−低級アルキルモラノリンは、酸又は
グルコアミラーゼ（ＧＡ）によりモラノリン及びＮ−低
級アルキルモラノリンに誘導しうること、等に着目し、
これらの過程を経てゆけば、培養液から高収率で目的物
を取得することができることに想到した。 更に、実に意外なことではあったが、上記した過程を研
究するうち本発明者らは、モラノリン等をＣＧＴａｓｅ
により糖転移反応にかける際、及びその後モラノリン等
のグルコースオリゴマーをＧＡによってグルコシルモラ
ノリン等に誘導する際の酵素反応において、基質である
モラノリン等の存在により、酵素活性が非常に安定化さ
れる事実に遭遇した。このことは、後に更に詳しく説明
する。 本発明は上記新知見を見出したことにより、初めて完成
をみた発明である。 以下に、本発明の構成を更に詳しく説明する。 本発明においては、まずモラノリンを産生する菌を培養
する。このような菌としては放線菌を挙げることができ
、例えば本発明者らが特公昭５６−９９１９号公報で開
示した菌等を用いることができる。 培養液中には、目的物たるモラノリンのほか、前述した
ように、１、５−ジデオキシ−１、５−イミノ−Ｄ−マ
ンニトールや２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニト
ール等の複数の低分子の塩基性水溶性物質が混在するこ
ととなる。 最終目的物としてＮ−低級アルキルモラノリンを取得し
たい場合には、この培養液をアルキル化反応に掛ける。 本発明において低級アルキルとは、例えば、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、１５０−プロピル、ｎ−ブチル、
ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等を挙げることがで
きる。 アルキル化は、例えば、適当なアルキル化剤（例えば、
アルキルハライド等）を反応させる方法を適用すること
ができる。 培養液中には、この状態ではＮ−低級アルキルモラノリ
ンのほか、Ｎ−低級アルキル−１、５−ジデオキシ−１
、５−イミノ−Ｄ−マンニトールやＮ−低級アルキル−
２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−マンニトール等が混在
するところとなる。 本発明においては、その後、澱粉、デキストリン、サイ
クロデキストリン等のグルコースの供与体を培養液中に
加える。その後、サイクロデキストリングルコシルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）によって一般式〔ＩＩ
〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から２４までの整数
を表す）で表されるグルコースオリゴマーに変換し、そ
の後必要に応じてグルコアミラーゼ（ＧＡ）によって、
一般式〔ＩＩ〕においてｎが０である化合物（グルコシ
ル体）に変換する。 一般式〔ＩＩ〕においてＲが水素の化合物については、
ＧＡを作用させるのが最も良い。後述するように一般式
〔ＩＩ〕においてＲが水素でｎが０である化合物（グル
コシルモラノリン）はメタノールとの分子化合物を形成
して分別結晶することができるという特異的性質がある
からである。 ＧＡを作用させる必要のない場合には、収量を上げたり
操作の利便の目的のためにＧＡ反応を省略することがで
きる。 この過程において、混在する１、５−ジデオキシ−１、
５−イミノ−Ｄ−マンニトールや２−アミノ−２−デオ
キシ−Ｄ−マンニトール、及びこれらのＮ−低級アルキ
ル化物は、ＣＧＴａｓｅ等の作用を受けることがない。 上記したＣＧＴａｓｅ及びＧＡに基づく反応は酵素反応
であり、本発明の重要な要旨のひとつは、後述するよう
にこの酵素反応を有利に実行することができる手法を確
立したところに存在する。 上記によって取得した〔ＩＩ〕で表される化合物は、本
発明の目的化合物についてのみ生成する。 〔ＩＩ〕は、一般式〔Ｉ〕で表される化合物に比して、
例えば、分別結晶という経済的な操作で非常に効率的に
単離することができる。これは〔ＩＩ〕が〔Ｉ〕のグル
コースオリゴマーであることによる物理化学的性質を利
用しようとするものである。 例えば、グルコシルモラノリンについては、含水メタノ
ール中で攪拌することにより、メタノールとの分子化合
物を形成するから、非常に効率的に結晶化することがで
きるし、またＮ−低級アルキルモラノリンについては、
アリールスルホン酸を用いて、同様に非常に効率的に結
晶化することができる。 また、この反応においては、母液から〔ＩＩ〕化合物を
回収した後にも、再度その残渣を原料として同じ操作を
繰り返すことにより、未回収の化合物〔ＩＩ〕を容易に
回収することができるから、最終的な回収率を高めるこ
とができる。 このように、本発明の目的は混在物からの効率的な単離
にあり、〔ＩＩ〕に誘導するのもその単離を高収率化す
るためであって、本発明の効果はこの時点で発揮される
ところとなる。 上記の単離方法としては、例えば、本発明者らの発明に
係る特開昭６１−１１５０９３号公報記載の方法等を適
用することができる。 上記により取得された〔ＩＩ〕は、更に、例えば塩酸水
溶液等の酸性水溶液中で加熱して加水分解することによ
り、又は過剰のＧＡを作用させて、モラノリン又はＮ−
低級アルキルモラノリンとグルコースとに分解すること
ができる。 グルコースは中性物質であり、目的物は塩基性であるか
ら、例えば、強酸性イオン交換樹脂にかけて常法により
処理することにより、目的物のみを取得することができ
る。これらの実施にあたっては、本発明者らの発明に係
る特開昭６２−２４２６９１号公報、特開昭６２−２４
２６９２号公報に開示された方法を適用することができ
る。 この場合において、もし最終目的物を他の化合物に誘導
する反応に供するときには、必ずしも結晶化する必要は
ない。〔ＩＩ〕化合物を加水分解した後においては、目
的物は、事実上合成反応に供することができるほどの純
度を有しているから、そのまま合成反応に適用すること
ができる。 さて、以下に本発明の重要な要旨である、本発明に係る
酵素反応について述べる。 酵素反応の技術についての近年の技術的進歩は目覚まし
く、まさに隔世の感があり、ことにキトサンビーズを応
用した固定化酵素法は、例えば溶液中での酵素反応等の
これまでの従来方法に比べ使用酵素量が少なくて済む点
や効率的な反応を行うことができる点で格段の効果があ
った。 キトサンビーズ応用の固定化酵素法については複数の特
許出願がなされており、例えば、特開昭６３−１９６２
９０号公報には、多孔質のキトサンビーズに、サイクロ
デキストリングルカノトランスフェラーゼを固定化させ
た後、さらに架橋剤で架橋処理する技術が開示されてい
る。 本発明においても、固定化酵素法を適用することができ
る。 本発明において適用する固定化酵素の製造法について例
示すると、架橋剤をまずキトサンビーズと反応させて、
キトサンビーズ表面のアミノ基に架橋を形成させる。そ
の後、本発明に係るＣＧＴａｓｅ又はＧＡを架橋剤の末
端に固定する。 本発明に係る架橋剤として、例えば、グルタールアルデ
ヒド等を用いることができる。 本発明に係るキトサンビーズとしては、例えば、キトパ
ール（冨士紡績（株）製）ＢＣＷ−１０００シリーズ等
を使用することができる。本発明に係る固定化酵素を生
成させるためには、例えば適当な温度（例、室温）で適
当な緩衝液（例、ｐＨ６．０の０．１Ｍ酢酸バッファ）
中に上記キトサンビーズを加え、緩やかに振盪し、適当
な濃度（例、２５Ｗ／Ｖ％）のグルタールアルデヒドを
加え、適当な時間（例、１〜４８時間）、緩やかに振盪
した後、濾過し、水洗した後、適当な緩衝液（例、ｐＨ
６．０の０．０２５Ｍ酢酸バッファ）中で、適当な濃度
（例１〜５００ｍｇ／ｍｌ）のＣＧＴａｓｅ溶液を加え
、適当な時間（例１〜４８時間）緩やかに振盪した後、
濾過し水洗して得ることができる。 上記の方法は、本発明者らによって初めて確立された手
法であって、これにより上記特開昭６３−１９６２９０
号公報に開示された技術を使用しなくても固定化酵素法
を実施することができる。 以下に、本発明の実施に関する重要な新知見について詳
述する。 本発明者らは、本発明を完成させる過程で、上記した本
発明に係る酵素反応において、本発明に係るモラノリン
又はＮ−置換モラノリン誘導体、又はこれらのグルコー
スオリゴマーが存在すると、当該酵素反応が安定化し、
一定時間を経過してもその酵素活性が減衰しない、とい
う驚くべき新知見を見出した。 例えば、固定化ＣＧＴａｓｅにおいては、５５℃で３６
６日経過しても初期活性の９０％以上を保持することが
でき、固定化ＧＡでは、５５℃で４３日経過しても初期
活性の８０％以上、５０℃、１７５日では８０％以上、
４０℃、１３３日では９０％以上を保持することができ
る。 この事実がいかなる理由により生じるかについては必ず
しも定かではないが、酵素反応の基質は酵素反応に対し
ては阻害剤として働くことから、この阻害作用との関係
において何らかの機能が発揮されているものと推測する
ことができる。 上記の知見は、この明細書において初めて開示する事実
である。 このことにより、固定化酵素は極めて安定化され、本発
明に適用するに際して、有利な条件を提供するところと
なる。

【実施例】

以下に、本発明に係る参考例及び実施例を掲げて、本発
明を更に詳しく説明する。 参考例１ ＣＧＴａｓｅの固定化（１） １０ｌの富士紡績社製キトパールＢＣＷ−３０１０を２
．５ｗ／ｖ％グルタールアルデヒドを含む０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ６．０）４０ｌに、室温で２４時間浸漬処
理した後、充分にイオン交換水で洗浄した。ついでキト
パール１ｍｌ当たり蛋白質２０ｍｇ相当のＣＧＴａｓｅ
〔林原生物化学研究所社製。バチルス・ステロサーモフ
ィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）由来〕を加えて、さらに酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．０）を最終濃度が０．０２５Ｍになるように加え
て、全液量が３０ｌになるようにした。このまま室温で
２４時間浸漬してその後イオン交換水で充分洗浄して、
固定化ＣＧＴａｓｅを得た。得られたビーズの蛋白吸着
量は、１９．５ｍｇ／ｍｌ（ビーズ）であった。 参考例２ ＣＧＴａｓｅの固定化（２） 参考例１と同様にして、蛋白質吸着量５ｍｇ／ｍｌ（ビ
ーズ）となるように、バチルス・ステロサーモフィリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）由来のＣＧＴａｓｅを固定化した。 参考例３ ＧＡの固定化 天野製薬社製グルコザイムＮＬ−３を透析した後、６０
〜６５ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度にしたものをＧＡ水溶液
として用いた。 富士紡績社製キトパールＢＣＷ−３０１０の１ｌを２．
５ｗ／ｖ％グルタールアルデドを含む５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）３ｌに室温で２４時間浸漬処理した後
、充分イオン交換水で洗浄した。ついで、キトパール１
ｍｌ当たり蛋白質１００ｍｇ相当のＧＡ水溶液を加え、
さらに水を加えて、全液量が３ｌになるようにした。 このまま室温で２４時間浸漬して、その後イオン交換水
で充分洗浄して固定化ＧＡを得た。得られたビーズの蛋
白質吸着量は、１２．８ｍｇ／ｍｌ（ビーズ）であった
。 参考例４ 固定化ＣＧＴａｓｅの安定化（モラノリンの糖転移反応
） モラノリン２．５ｗ／ｖ％、アミコールＮｏ．６Ｌ〔日
澱化学社製〕２５ｗ／ｖ％、ｐＨ未調整の水溶液１００
ｍｌに、参考例１で得た固定化ＣＧＴａｓｅを１０ｍｌ
加え、５５℃で回転振盪を続けた。一定時間経過後にグ
ラスフィルターでビーズ（固定化ＣＧＴａｓｅ）を瀘過
し充分水洗した後、次のようにして固定化ＣＧＴｄｓｅ
の酵素活性を測定した。 （固定化ＣＧＴａｓｅの酵素活性測定法）モラノリン２
．５ｗ／ｖ％、アミコールＮｏ．６Ｌ２５ｗ／ｖ％、ｐ
Ｈ未調整の水溶液１０ｍｌにビーズ（５５℃で一定時間
経過後の洗浄固定化ＣＧＴａｓｅ）１ｍｌを加え、５５
℃で２４時間反応させた。反応液３ｍｌを強酸性イオン
交換樹脂ダウエックス　５０Ｗ×２（Ｈ＋）７ｍｌに通
過させ、充分水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶出し、
溶出液を減圧下に濃縮乾固して、３ｍｌの水に溶かし、
その１０μｌを高速液体クロマトグラフィーに注入して
分析し、未反応のモラノリンの濃度を求めた。高速液体
クロマトグラフィーの分析条件は、カラム（Ｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｌ　５ＮＨ２、５μｍ、４ｍｍ　ｉ．ｄ．×２５
ｃｍ）、展開溶媒（アセトニトリル−水＝７０：３０）
、検出器（日立６５５Ａ−３０、ＲＩ検出器）、データ
プロセッサー（日立Ｄ−２０００）。 ５５℃で回転振盪を開始した時点の反応進行率を１００
とした場合の一定時間経過後の相対的な反応進行率を上
記式により算出し、この値をもって酵素活性保持率とし
た。結果を表１に示す。固定化ＣＧＴａｓｅが本発明に
係るモラノリンによって酵素活性が安定化された事実が
明白である。 （以下次頁） 参考例５ 固定化ＣＧＴａｓｅの安定化（Ｎ−メチルモラノリンの
糖転移連続反応） 直径１ｃｍのジャケット付きカラムに参考例１で得た固
定化ＣＧＴａｓｅの２０ｍｌを充填し、Ｎ−メチルモラ
ノリン１．５ｗ／ｖ％、可溶性澱粉９ｗ／ｖ％、ｐＨ未
調整の溶液を１６０ｍｌ／日の通過速度で５５℃で連続
的に通過反応させ、経時的に通過液の反応進行率を求め
た。反応進行率、活性保持率は参考例４と同様にして求
めた。その結果、１４０日を経過しても、ほぼ１００％
の活性を保持していることが判った。 参考例６ 固定化ＣＧＴａｓｅの安定化（モラノリン、モラノリン
のグルコースオリゴマー） 参考例２で得た固定化ＣＧＴａｓｅの１ｍｌにモラノリ
ン（２．５ｗ／ｖ％）、モラノリンのグルコースオリゴ
マー（混合物）（５．０ｗ／ｖ％）を加え、全容１０ｍ
ｌで５５℃で振盪した。モラノリンのグルコースオリゴ
マーは、実施例７で得た糖転移反応液を強酸性イオン交
換樹脂ダウエックス５０Ｗ×２（Ｈ＋）で処理し、充分
水洗した後、０．５Ｎアンモニア水で溶出後、溶出液を
濃縮乾固した塩基性フラクションである。 調整時の酵素活性を１００としたときの残存酵素活性保
持率（％）を表２に示した。酵素活性の測定方法等はす
べて参考例４と同様にした。 モラノリン、モラノリンのグルコースオリゴマーにＣＧ
Ｔａｓｅの活性を保持する作用があることが明白である
。 参考例７ 固定化酵素ＣＧＴａｓｅの安定化（Ｎ−置換モラノリン
、Ｎ−置換グルコシルモラノリン） 参考例１で得た固定化ＣＧＴａｓｅ　１ｍｌに、Ｎ−置
換モラノリン（０．５ｗ／ｖ％）、Ｎ−置換グルコシル
モラノリン（０．５ｗ／ｖ％）を加え、全容１０ｍｌで
５５℃で１４日間振盪した後、残存酵素活性を測定した
。最初の酵素活性を１００としたときの残存酵素活性率
を表３に示した。酵素活性の測定方法は参考例４と同じ
である。 本発明化合物が、良好なる安定化作用を示していること
は明白である。 参考例８ 固定化ＧＡの安定化（モラノリンの糖転移反応液）実施
例７の方法によって製造した未反応のモラノリン、未反
応のアミコールＮｏ．６Ｌ、オリゴグルコシルモラノリ
ンを含む反応液を、硫酸を用いてｐＨ５．２に調整した
水溶液を、参考例３で得た固定ＧＡ２０ｍｌを充填した
直径１ｃｍのジャケット付カラムに４８０ｍｌ／日の通
過速度で、５０℃で連続的に通過反応させた。一定時間
反応させた後、カラム内の固定化ＧＡをとり、次の方法
で酵素活性を測定し、反応開始時の酵素活性を１００％
としたときの活性保持率（安定性）を求めた。結果を表
４に示した。 （固定化ＧＡの活性測定法） 固定化ＧＡの一定量（湿重量３０〜８０ｍｇ）を、Ｇ−
２のグラスフィルター上にとり、軽く吸引して水分を濾
過した後、グラスフィルター上の固定化ＧＡをレンズペ
ーパー上に乗せて過剰の水分を除去した後、栓つきサン
プル瓶に入れ、固定化ＧＡの湿重量を求めた。次に、固
定化ＧＡを１０ｍｌの５％マルトース溶液（０．０５Ｍ
酢酸緩衝液、ｐＨ４．６）に加え、３７℃で２０分間イ
ンキュベートした。反応液の１００μｌを０．０５Ｎの
水酸化ナトリウム中に加え、反応を停止させた。 この反応停止液の１０μｌを用いてグルコースを定量し
た。グルコースの定量は、ダイヤカラーＧＣ（小野薬品
社製）を用いて行った。 活性は次のように定義した。１分間に１μＭのグルコー
スを生成させる酵素活性を１ユニットとした。ブランク
には反応液のかわりに基質と等容に混合した０．０５Ｎ
水酸化ナトリウムを用いた。 このとき、固定化ＧＡの活性は、５．５６×ＯＤＳＡ／
ＯＤＳＴＤ／固定化ＧＡの湿重量。ここでＯＤＳＡは、
サンプル（固定化ＧＡ）の５００ｎｍの吸光度、ＯＤＳ
ＴＤは、１ｍｇ／ｍｌのグルコース水溶液の５００ｎｍ
の吸光度を意味する。表４で活性保持率の値が変動して
いるが、これは測定誤差である。本発明化合物の固定化
ＧＡに対する安定化作用が明白である。 参考例９ 固定化ＧＡの安定化（モラノリンの糖転移反応液）参考
例８と同様にして４０℃で実験した。結果を表５に示し
た。 （以下次頁） 参考例１０ ＧＡ（水溶液）での安定化（モラノリン、Ｎ−メチルモ
ラノリン） モラノリン、Ｎ−メチルモラノリンは、グルコアミラー
ゼの酵素活性を阻害するので溶液状グルコアミラーゼに
対する安定化効果は次のようにして検討した。酵素は生
化学工業社製のリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ
　ｎｉｖｅｕｓ）由来の試薬グルコアミラーゼを用いた
。 酵素５ｍｇを１ｍｌの０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０
）に溶解したものに、モラノリン、Ｎ−メチルモラノリ
ンを６０００μｇ／ｍｌとなるように溶解させ、ネジ口
試験管に入れて５０℃にてインキュベートした。 それぞれの酵素液は、測定時に０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５．０）で１００倍に希釈してその１００μｌをとり
、５％マルトース液（０．０５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．
６）４００μｌを加えて４０℃で２０分間反応させる。 その反応液の１００μｌをとり、０．０５Ｎの水酸化ナ
トリウム１００μｌを加えて反応を停止させる。この中
から更に１００μｌをとり、３．０ｍｌのグルコース測
定試薬ダイヤカラーＧＣを加えて、３７℃で３０分間静
置し発色させ、その後氷冷し、５００ｎｍで吸光度を測
定しグルコース量を測定した。このグルコース産生量を
阻害剤共存下での酵素活性とした。初めの酵素活性（グ
ルコース産生量）を１００としたときの相対的な酵素活
性を求めた。結果を図１に示した。本発明化合物の酵素
安定化作用が明白である。 実施例１ モラノリン産生菌の培養 澱粉２％、大豆粉１％、塩化カリウム０．０５％、硫酸
マグネシウム０．０５％、食塩０．２％、炭酸カルシウ
ム０．３５％（ｐＨ７．２）の組成の培地２００ｍｌを
、５００ｍｌ容三角フラスコに取り、常法通り滅菌後、
これにストレプトミセス・ラベンデュレ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）ＳＥＮ−１５８
株の斜面培養から数白金耳胞子を接種し、２７℃で３日
間２００回転で振盪培養し、これを種培養液とした。 澱粉８％、大豆粉３％、酵母エキス１．５％、塩化カリ
ウム０．０５％、硫酸マグネシウム七含水塩０．０５％
、食塩０．１％、炭酸カルシウム０．１５％（ｐＨ７．
２）の組成の培地２５０ｌを４２０ｌ容ジャーファーメ
ンターに入れ、常法通り滅菌した後、種培養液２．４ｌ
を接種した。これを１００回転／分、通気量１２５ｌ／
分、２７℃で１０日間培養した。参考例４に記載した方
法と同様にして、培養液中のモラノリンを高速液体クロ
マトグラフィーによって定量した結果、約３５００μｇ
／ｍｌのモラノリンが含まれていた。 実施例２ モラノリン含有培養液の部分精製（１）実施例１の方法
で得た培養液を、限外瀘過膜（ＵＦ　Ｍｏｄｕｌｅ；Ｍ
Ｕ−６３０３−ＨＧ；クラレ社製）にかけ、通過液を更
に逆浸透膜（ＨＲ−５１５５　ＦＩ；ホローファイバー
型；東洋紡社製）にかけ、濃縮した非通過液を部分精製
品とした。 実施例３ モラノリン含有培養液の部分精製（２）実施例１の方法
で得た培養液をプレスフィルターで濾過した培養濾液を
強酸性イオン交換樹脂ダンヤイオンＳＫ−１０４（Ｈ＋
）７０ｌのカラムにかけ、充分水洗後、１Ｎアンモニア
水で溶出した。 溶出液を減圧下に濃縮した後、強塩基性イオン交換樹脂
ダイヤイオンＳＡ−１１Ａ（ＯＨ−）３５ｌのカラムに
かけ、水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮し、部分精
製品とした。 実施例４ モラノリン含有培養液のＮ−メチル化 実施例１で得た培養液１０００ｍｌに、ハイフロースー
パーセル１００ｇを加えて濾過し、培養濾液８５０ｍｌ
を得た。これにホルマリン３０ｍｌ、市販工業用ラネー
ニッケル触媒約１５ｍｌを加えて、常温常圧で接触還元
した。 反応終了後、触媒を濾別し、濾液を強酸性イオン交換樹
脂ダウエックス５０Ｗ×２（Ｈ＋）５００ｍｌのカラム
にかけ、充分水洗後、１Ｎアンモニア水で溶出した。溶
出液を減圧下に濃縮しアンモニアを除去した。このよう
にして次反応に用いることができるＮ−メチルモラノリ
ンを含む培養液の部分精製品を得た。 実施例５ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（１）実
施例１で得た培養液２００ｍｌにハイフロースーパーセ
ル１００ｇを加えて瀘過し、培養濾液１８００ｍｌを得
た。これを減圧下に濃縮乾固した後、Ｎ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド２００ｍｌを加え、攪拌後、瀘過した。更
に１００ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄し
た。濾液と洗液を合わせ、これに臭化ｎ−ブチル１６．
１ｇＮ炭酸カリウム２１．８ｇを加えて１１０℃で７時
間反応させた。 反応後、濾過して減圧下に溶媒を除去して、次反応に用
いることができるＮ−（ｎ−ブチル）化された培養液の
部分精製品を得た。 実施例６ モラノリン含有培養液のＮ−（ｎ−ブチル）化（２）実
施例１で得た培養濾液１０００ｍｌを実施例３の方法で
処理した部分精製品を減圧下に濃縮乾固した。 これにメタノール５０ｍｌを加え氷冷下で攪拌した。 ｎ−ブチルアルデヒド２０．５ｍｌ、５％塩酸メタノー
ル溶液１２．０ｍｌ、水素化シアノホウ素ナトリウム２
．５ｇを加え、３０分攪拌後、室温で１６時間反応させ
た。 減圧下に溶媒を留去し、水２５ｍｌに溶解し、１５ｍｌ
のクロロホルムで３回分配した。水層を強酸性イオン交
換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１０４（Ｈ＋）１００ｍｌの
カラムにかけ、充分水洗後、０．５Ｎアンモニア水で溶
出した。溶出液を減圧下に濃縮して次反応に用いること
ができるＮ−（ｎ−ブチル）化された培養液の部分精製
品を得た。 実施例７ モラノリン含有培養液の部分精製品（１）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（２０００ｌ）
を、実施例２と同様の方法で処理した部分精製品（１５
０ｌ；モラノリン約７ｋｇ含有）を４２０ｌ容ジャーフ
ァーメンターと５０ｌ容カラムを連結した反応装置のジ
ャーファーメンターに加えた。 更にアミコールＮｏ．６Ｌ　７０ｋｇを加え加熱溶解し
た。６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整した後
、水を加えて全容を２８０ｌとした。参考例１の方法で
製造した固定化ＣＧＴａｓｅ　３０ｌをカラムに充填し
、３ｌ／分の流速で循環させながら５５℃で４８時間反
応させてモラノリンの糖転移反応液を得た。 実施例８ モラノリン含有培養液の部分精製品（２）の糖転移反応 実施例１と同様の方法で培養した培養液（２０００ｌ）
を実施例３と同様の方法で処理した部分精製品（１００
ｌ；モラノリン約７ｋｇ含有）を４２０ｌ容ジャーファ
ーメンターと５０ｌ容カラムを連結した反応装置のジャ
ーファーメンターに加えた。 更にアミコールＮｏ．６Ｌ　７０ｋｇを加え加熱溶解し
た。ｐＨ未調整のまま水を加えて全容を３００ｌにした
。参考例１の方法で製造した固定化ＣＧＴａｓｅ　３０
ｌをカラムに充填し、３ｌ／分の流速で循環させながら
５５℃で７２時間反応させてモラノリンの糖転移反応液
を得た。 実施例９ Ｎ−メチルモラノリン含有培養液の糖転移反応実施例４
の方法で製造したＮ−メチルモラノリン含有培養液（５
０ｍｌ；Ｎ−メチルモラノリン約３ｇ含有）に、可溶性
澱粉１２ｇを加温溶解した後、水を加えて全容を１００
ｍｌとした。参考例１の方法で製造した固定化ＣＧＴａ
ｓｅ　１０ｍｌを加え、５５℃で４８時間反応後、グラ
スフィルターで瀘過してＮ−メチルモラノリンの糖転移
反応液を得た。 実施例１０ Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（１） 実施例５の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔１８．３ｇ；この
うち約４．０ｇがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである
〕を、水１００ｍｌに溶解し、アミコールＮｏ．６Ｌ３
０ｇを加温溶解し、水を加えて全容を２００ｍｌとした
。 参考例２の方法で製造した固定化ＣＧＴａｓｅ　１０ｍ
ｌを加え、５５℃で４８時間反応後、グラスフィルター
で濾過してＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応
液を得た。 実施例１１ Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン含有培養液の糖転移反応
（２） 実施例６の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノリ
ンを含む培養液の部分精製品の一部〔１０．０ｇ；この
うち約８．０ｇがＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンである
〕を水８０ｍｌに溶解し、アミコールＮｏ．６Ｌ　８０
ｇを加温溶解し、水を加えて全容を１６０ｍｌとした。 参考例１の方法で製造した固定化ＣＧＴａｓｅ　２０ｍ
ｌを加え、５５℃で４８時間反応後、グラスフィルター
で濾過してＮ−（ｎ−ブチル）モラノリンの糖転移反応
液を得た。 実施例１２ 実施例７に係るＧＡ反応（モラノリン）４２０ｌ容ジャ
ーファーメンターと５０ｌ容カラムを連結した反応装置
において、５０ｌ容カラムには参考例３の方法で製造し
た固定化ＧＡ　１５ｌを充填し、ジャーファーメンター
には実施例７の方法で製造したモラノリンの糖転移反応
液２８０ｌ（モラノリン約７ｋｇを反応した糖転移反応
液）を入れ、濃硫酸でｐＨを５．２に調整した後、３ｌ
／分の流速で循環させながら５０℃で１９時間反応させ
た。 実施例１３ 実施例８に係るＧＡ反応（モラノリン）４２０ｌ容ジャ
ーファーメンターと５０ｌ容カラムを連結した反応装置
において、５０ｌ容カラムには参考例３の方法で製造し
た固定化ＧＡ　１５ｌを充填し、ジャーファーメンター
には実施例８の方法で製造したモラノリンの糖転移反応
液３００ｌ（モラノリン約７ｋｇを反応した糖転移反応
液）を入れ、濃硫酸でｐＨを５．２に調整した後、３ｌ
／分の流速で循環させながら４０℃で１８時間反応させ
た。 実施例１４ 実施例９に係るＧＡ反応（Ｎ−メチルモラノリン）実施
例９の方法で製造したＮ−メチルモラノリンの糖転移反
応液１００ｍｌ（糖転移反応の前にてＮ−メチルモラノ
リンを約３ｇ含有）を、濃硫酸でｐＨを５．２に調整し
た後、参考例３の方法で製造した固定化ＧＡ　１０ｍｌ
を加えて５０℃で２０時間反応させた。 グラスフィルターで濾過して固定化ＧＡを除き、ＧＡ反
応液を得た。 実施例１５ 実施例１０に係るＧＡ反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノ
リン） 実施例１０の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノ
リンの糖転移反応液２００ｍｌ〔糖転移反応の前にてＮ
−（ｎ−ブチル）モラノリンを約３ｇ含有〕を、濃硫酸
でｐＨを５．２に調整した後、参考例３の方法で製造し
た固定化ＧＡ　２０ｍｌを加えて５０℃で２０時間反応
させた。グラスフィルターで瀘過して固定化ＧＡを除き
、ＧＡ反応液を得た。 実施例１６ 実施例１１に係るＧＡ反応（Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノ
リン） 実施例１１の方法で製造したＮ−（ｎ−ブチル）モラノ
リンの糖転移反応液１６０ｍｌ〔糖転移反応の前にてＮ
−（ｎ−ブチル）モラノリンを約８ｇ含有〕を、濃硫酸
でｐＨを５．２に調整した後、参考例３の方法で製造し
た固定化ＧＡ　２０ｍｌを加えて５０℃で２０時間反応
させた。グラスフィルターで濾過して固定化ＧＡを除き
、ＧＡ反応液を得た。 実施例１７ グルコシルモラノリンの精製（１） 実施例１２の方法で製造したＧＡ反応液２８０ｌを、脱
色用樹脂ＨＳ（北越炭素社製）のカラム（１２０ｌ）に
通過させて水洗した。通過液と洗液を合わせ強酸性イオ
ン交換樹脂ダンヤイオンＳＫ−１０４（Ｈ＋）１８０ｌ
のカラムに通過させた。充分水洗後、１Ｎアンモニア水
で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニア
を除去した。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂ＳＡ−１
１Ａ（ＯＨ−）のカラム１８０ｌに通過させて水で溶出
した。溶出液を約１８ｌまで濃縮し、攪拌しながらメタ
ノール３２０ｌを加え、終夜攪拌した。生じた結晶を濾
過して集め、乾燥して、グルコシルモラノリンのメタノ
ール付加物７．９ｋｇを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約３％のモラ
ノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認めな
かった。 実施例１８ グルコシルモラノリンの精製（２） 実施例１３の方法で製造したＧＡ反応液３００ｌを強酸
性イオン交換樹脂ダンヤイオンＳＫ−１０４（Ｈ＋）１
８０ｌのカラムに通過させた。充分水洗後、１Ｎアンモ
ニア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しながらアン
モニアを除去した。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂Ｓ
Ａ−１１Ａ（ＯＨ−）のカラム５０ｌに通過させて水で
溶出した。溶出液を約２０ｌまで濃縮し、攪拌しながら
メタノール３５０ｌを加え、終夜攪拌した。生じた結晶
を濾過して集め、乾燥してグルコシルモラノリンのメタ
ノール付加物７．３ｋｇを得た。 このものは、参考例４に記載したものと同じ条件で高速
液体クロマトグラフィーで分析した結果、約０．５％の
モラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上認
めなかった。 実施例１９ グルコシル−Ｎ−メチルモラノリンの精製実施例１４の
方法で製造したＧＡ反応液１００ｍｌを強酸性イオン交
換樹脂ダウエックス５０×２（Ｈ＋）のカラム１００ｍ
ｌに通過させた。充分水洗後、０．５Ｎアンモニア水で
溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しながらアンモニアを
除去した。濃縮液を強塩基性イオン交換樹脂ＳＡ−１１
Ａ（ＯＨ−）のカラム１００ｍｌに通過させて水で溶出
した。通過液と溶出液とを合わせ減圧下に濃縮乾固し、
メタノール５０ｍｌに溶解した後、ｐ−トルエンスルホ
ン酸（一水和物）４．８ｇを加え、室温で終夜放置した
。生じた結晶を瀘過して集め、乾燥してグルコシル−Ｎ
−メチルモラノリンのｐ−トルニンスルホネート４．４
ｇを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約０．５％のＮ−メチ
ルモラノリンを含んでいたが、その他の不純物は事実上
認めなかった。 実施例２０ グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（１
） 実施例１５の方法で製造したＧＡ反応液２００ｍｌを強
酸性イオン交換樹脂ダウエックス５０×２（Ｈ＋）のカ
ラム２００ｍｌに通過させた。充分水洗後、０．５Ｎア
ンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しながら
アンモニアを除去した。濃縮液を強塩基性イオン交換樹
脂ＳＡ−１１Ａ（ＯＨ−）のカラム１００ｍｌに通過さ
せて水で溶出した。通過液と溶出液とを合わせ減圧下に
濃縮乾固し、メタノール５０ｍｌに溶解した後、ｐ−ト
ルエンスルホン酸（一水和物）５．２ｇを加え、室温で
終夜放置した。生じた結晶を濾過して集め、乾燥してグ
ルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンのｐ−トルニ
ンスルホネート５．５ｇを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約１．５％のＮ−（ｎ
−ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物
は事実上認めなかった。 実施例２１ グルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（２
） 実施例１６の方法で製造したＧＡ反応液１６０ｍｌを強
酸性イオン交換樹脂ダウエックス５０×２（Ｈ＋）のカ
ラム２００ｍｌに通過させた。充分水洗後、０．５Ｎア
ンモニア水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮しながら
アンモニアを除去した。濃縮液を強塩基性イオン交換樹
脂ＳＡ−１１Ａ（ＯＨ−）のカラム１００ｍｌに通過さ
せて水で溶出した。通過液と溶出液とを合わせ減圧下に
濃縮乾固し、メタノール５０ｍｌに溶解した後、ｐ−ト
ルエンスルホン酸（一水和物）５．２ｇを加え、室温で
終夜放置した。生じた結晶を濾過して集め、乾燥してグ
ルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンのｐ−トルエ
ンスルホネート１０．０ｇを得た。 このものは、その一部をとり塩基性フラクションとした
後、参考例４に記載したものと同じ条件で高速液体クロ
マトグラフィーで分析した結果、約０．５％のＮ−（ｎ
−ブチル）モラノリンを含んでいたが、その他の不純物
は事実上認めなかった。 実施例２２ グルコシルモラノリン精製時の回収母液残渣を用いた糖
転移反応、ＧＡ反応及びモラノリンの精製 実施例１７において、メタノールによる分別結晶をした
母液の溶媒（メタノール）を回収除去したときに得られ
た残渣（実施例７及び実施例１２と同様の反応をして実
施例１７と同様の処理をした３ロット分の回収残渣）を
原料として、実施例７、実施例１２、及び実施例１７と
同様の操作を実施した結果、９．０ｋｇのグルコシルモ
ラノリンのメタノール付加物を得た。 実施例２３ モラノリンの精製 実施例１７の方法で精製したグルコシルモラノリンのメ
タノール付加物１ｋｇを、１Ｎの塩酸（５ｌ）に溶解し
、９０℃で３時間反応させた。反応液を弱塩基性イオン
交換樹脂ダイヤイオンＷＡ−２０（ＯＨ−）１０ｌのカ
ラムにかけ、充分水洗した。通過液と洗液を合わせ、強
酸性イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ−１０４（Ｈ＋）
５ｌのカラムにかけ、充分水洗した後、１Ｎアンモニア
水で溶出した。溶出液を減圧下に濃縮乾固して、モラノ
リン４６８ｇを得た。 本品は、結晶化しなくとも高純度であり、このままで充
分に合成原料として使用することができるものである。 実施例２４ Ｎ−メチルモラノリンの精製 実施例１９の方法で製造したグルコシル−Ｎ−メチルモ
ラノリンのｐ−トルエンスルホネート２ｇを、１Ｎ塩酸
（１０ｍｌ）に溶解し、９０℃で３時間反応させた。反
応液を弱塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ−２０
（ＯＨ−）１００ｍｌのカラムにかけ、充分水洗した。 通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂ダイヤイ
オンＳＫ−１０４（Ｈ＋）５０ｍｌのカラムにかけ、充
分水洗した後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した。溶出
液を減圧下に濃縮乾固した後、エタノールから再結晶し
て、Ｎ−メチルモラノリン５９０ｍｇを得た。 実施例２５ Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（１）実施例２０
の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラ
ノリンのｐ−トルエンスルホネート３ｇを、１Ｎ塩酸（
３０ｍｌ）に溶解し、９０℃で３時間反応させた。反応
液を弱塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ−２０（
ＯＨ−）２００ｍｌのカラムにかけ、充分水洗した。通
過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂ダウエック
ス５０×２（Ｈ＋）１００ｍｌのカラムにかけ、充分水
洗した後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した。溶出液を
減圧下に濃縮乾固した後、エタノールから再結晶して、
Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン８５０ｍｇを得た。 実施例２６ Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリンの精製（２）実施例２１
の方法で製造したグルコシル−Ｎ−（ｎ−ブチル）モラ
ノリンのｐ−トルエンスルホネート５ｇを水に溶かし、
１Ｎ塩酸でｐＨを５．２に調整した。 全容を１０００ｍｌとした後、参考例３の方法で製造し
た固定化ＧＡ　５０ｍｌを加えて５０℃で２４時間反応
させた。グラスフィルターで濾過して固定化ＧＡを除き
、濾液を、弱塩基性イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ−
２０（ＯＨ−）１００ｍｌのカラムにかけ、充分水洗し
た。 通過液と洗液を合わせ、強酸性イオン交換樹脂ダウエッ
クス５０×２（Ｈ＋）１００ｍｌのカラムにかけ、充分
水洗した後、０．５Ｎアンモニア水で溶出した。 溶出液を減圧下に濃縮乾固した後、エタノールから再結
晶して、Ｎ−（ｎ−ブチル）モラノリン１．６ｇを得た
。

【図面の簡単な説明】

図１は、参考例１０における、ＧＡでの安定化作用を図
示したものである。横軸は時間（日）を、縦軸は相対的
酵素活性を示す。 ○は、コントロールを、●は６ｍｇ／ｍｌのモラノリン
を、△は６ｍｇ／ｍｌのＮ−メチルモラノリンを、それ
ぞれ表す。 出願人　日本新薬株式会社 代理人　弁理士　片岡　宏

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す）で表され
   るＮ−置換モラノリン誘導体を取得するにあたり、 （１）モラノリン産生菌を培養した培養液をそのまま、
   又はこれにアルキル化反応を施し、 （２）グルコース供与体を加えた後、サイクロデキスト
   リングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を
   作用させて次の一般式〔ＩＩ〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から２４までの整数
   を表す）で表されるオリゴグリコシル−Ｎ−置換モラノ
   リン誘導体を生成させ、必要に応じてグルコアミラーゼ
   （ＧＡ）を作用せしめて一般式〔ＩＩ〕においてｎが０
   である化合物を生成させ、（３）分別操作を施して一般
   式〔ＩＩ〕で表される化合物を単離し、 （４）単離した式〔ＩＩ〕で表される化合物を加水分解
   して一般式〔Ｉ〕で表されるＮ−置換モラノリン誘導体
   を取得し、 上記（１）〜（４）までの一連の操作を順次行うことを
   特徴とする、一般式〔Ｉ〕で表されるＮ−置換モラノリ
   ン誘導体の製造方法。
2. 【請求項２】次の一般式〔Ｉ〕 （ここにＲは、水素又は低級アルキルを表す）で表され
   るＮ−置換モラノリン誘導体を取得するにあたり、 （１）モラノリン産生菌を培養した培養液をそのまま、
   又はこれにアルキル化反応を施し、 （２）グルコース供与体を加えた後、サイクロデキスト
   リングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を
   作用させて次の一般式〔ＩＩ〕 （ここにＲは、前記と同じ。ｎは０から２４までの整数
   を表す）で表されるオリゴグリコシル−Ｎ−置換モラノ
   リン誘導体を生成させ、 （３）グルコアミラーゼ（ＧＡ）を作用せしめて、一般
   式〔ＩＩ〕においてｎが０であるグルコシル　Ｎ−置換
   モラノリン誘導体を生成させ、 （４）分別操作を施してグルコシル　Ｎ−置換モラノリ
   ン誘導体を単離し、 （５）単離したグルコシル　Ｎ−置換モラノリン誘導体
   を加水分解して一般式〔Ｉ〕で表されるＮ−置換モラノ
   リン誘導体を取得し、 上記（１）〜（５）までの一連の操作を順次行うことを
   特徴とする、一般式〔Ｉ〕で表されるＮ−置換モラノリ
   ン誘導体の製造方法。