JP4012176B2 - バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換する新規微生物 - Google Patents

Description

本発明は、バリエナミンおよび（または）バリダミンの製造法に関する。

バリエナミンおよびバリダミンから誘導されるバリオールアミンは、それぞれα−グルコシダーゼ阻害活性を有しており、肥満、脂肪過多、糖尿病などの予防、治療薬として有用である。これらのＮ−置換体にはさらに強力なα−グルコシダーゼ阻害活性を有するものが知られている（特許文献１、特許文献２および特許文献３）。バリエナミンやバリダミンは、バリオールアミンおよびそのＮ−置換体の原料化合物として重要なものである。

非特許文献１には、バリダマイシンＡまたはバリドキシルアミンＡにシュードモナス・デニトリフィカンス（Pseudomonas denitrificans）の菌体を作用させることにより、バリエナミン［valienamine;1L-(1,3,4/2)-4-アミノ-6-ヒドロキシメチル-5-シクロヘキセン-1,2,3-トリオール］およびバリダミン［validamine;1L-(1,3,4/2,6)-4-アミノ-6-ヒドロキシメチル-1,2,3-シクロヘキサントリオール］が得られることが示されている。

また、特許文献４には、フラボバクテリウム・サッカロフィルム（Flavobacterium saccharophilum ）IFO13984が、特許文献５にはサイトファーガ・ヘパリナ（Cytophaga heparina）IFO12017、ATCC13125が、バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換しうることが開示されている。

さらに、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）IFO12664、IFO13258、IFO13259、IFO13532、IFO13533、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）IFO3058やアエロモナス・ハイドロフィラ・サブスピーシス・アナエロゲネス（Aeromonas hydrophila subsp. anaerogenes）IFO13282、同サブスピーシス・ハイドロフィラ（subsp. hydrophila）IFO13286、同サブスピーシス・プロテオリティカ（subsp. proteolytica）IFO13287、アエロモナス・パンクタータ・サブスピーシス・キャビエ（Aeromonas punctata subsp. cavice）IFO13288、およびアエロモナス・サルモニシダ・サブスピーシス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida）IFO12659についても、バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換しうることが知られている（特許文献６）。

特開昭５７−６４６４８号公報 特開昭５７−１１４５５４号公報 特開昭５７−２００３３５号公報 特開昭５７−５４５９３号公報 特開昭５８−１５２４９６号公報 特公平０６−６９３８０号公報 Journal of Chemical Society Chemical Communications ７４６−７４７頁 １９７２年

本発明者らは、公知微生物以外にもバリダマイシンやバリドキシルアミンを変換して効率よくバリエナミンおよび（または）バリダミンを生成しうるものが存在しないか鋭意研究を重ねてきた。その結果、バチルス（Bacillus）属に属する微生物またはその処理物がバリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用して効率よくバリエナミンおよび（または）バリダミンを生成しうることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、バチルス属に属し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用してバリエナミンおよび（または）バリダミンを生成しうる酵素を産生する微生物、またはその処理物をバリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用させることによるバリエナミンおよび（または）バリダミンの製造に関する。

本発明により、バチルス（Bacillus）属に属する微生物によって、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンを変換し、効率的にバリエナミンおよび（または）バリダミンを製造することができるようになった。

本発明の方法において原料として用いられるバリダマイシンの化学構造は、バリドキシルアミンとＤ−グルコースから成っている。バリドキシルアミンはＡ、Ｂ、Ｇが知られており、Ｄ−グルコースとの組み合わせによりバリダマイシンはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇが存在することが知られている［ザ・ジャーナル・オブ・アンティバイオティックス（J.Antibiotics）43巻 722〜726頁（1990年）］。

本発明においては、各種バリダマイシン、各種バリドキシルアミンあるいはその混合物を原料として用いることができ、例えばバリダマイシン生産菌の培養物あるいはその処理物も有利に用いることができる。

本発明の方法で用いられる微生物は、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンをバリエナミンおよび（または）バリダミンに変換する能力を有するバチルス属に属する微生物であればいずれでもよく、例えば、バチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）DSM8722、バチルス・クラウシィ（Bacillus clausii）DSM 8716、バチルス・キチノリティカス（Bacillus chitinolyticus）NBRC15660、バチルス・フレキサス（Bacillus flexus）NBRC15715、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）NBRC15535、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）NBRC15718、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）IAM1026等があげられる。

本発明には、これらの微生物の突然変異株や遺伝子組換え技術により製造した組換え体等も用いることができる。

本発明に使用される微生物の培養に用いられる培地は、本発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いることができる。

培地中の炭素源の具体例としては、例えば、グルコース、フラクトース、グリセロール、マルトース、スクロース、ソルビトール、スターチ等の炭水化物、酢酸、クエン酸等の有機酸、アルコール類や糖蜜等があげられる。

窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、乳酸アンモニウム等の各種無機酸アンモニウム塩や有機酸アンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、大豆粉、綿実かす等があげられる。

無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等があげられる。

また必要に応じて、チアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質を添加してもよい。

本発明に用いられる微生物の培養は、振盪培養、通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。通気攪拌培養の場合は、発泡を防ぐため消泡剤を適量添加するのが好ましい。培養は１０〜８０℃の温度範囲が好ましく、最も好ましくは２４〜４０℃で、２〜８日程度培養する。培養中ｐＨは５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜８．５に保持する。ｐＨ調整は無機酸あるいは有機酸、アルカリ溶液、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。

このようにして得られる微生物の培養物の処理物としては、培養菌体、該菌体の乾燥物、超音波処理物、溶菌酵素処理物、界面活性剤処理物、有機溶媒処理物、機械的摩砕物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物等があげられる。

こうして生成したバリエナミンおよびバリダミンを培養液または菌体懸濁液から分離、精製するには、公知の種々の方法を選択し組み合わせて行うことができる。例えば濾過、遠心分離、濃縮、乾燥、凍結乾燥、吸着、脱着、各種溶媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば沈殿、結晶化、再結晶）、クロマトグラフィーなどが用いられる。またバリエナミンおよびバリダミンが、水に可溶で、一般の有機溶媒に難溶な塩基性物質であることを利用して、いわゆる水溶性塩基性物質の単離精製に用いられる方法、例えばイオン交換樹脂、活性炭、ハイポーラスポリマー、セファデックス、セルロース、イオン交換セルロース、シリカゲル、アルミナ等を用いるクロマトグラフィーや吸脱着法が有利に用いられる。

上記のように、バチルス属に属する微生物またはその処理物をバリダマイシンやバリドキシルアミンに作用させることによって、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造原料として有用な化合物であるバリエナミンおよび（または）バリダミンを効率よく製造することができるようになった。本発明の方法は、更に発酵工学の分野で一般に行われている菌株の育種改良、培養条件や反応条件の改良を行うことによって、工業的規模のバリエナミンおよび（または）バリダミンの製造法の一つとして用いることが可能である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
バチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）DSM 8722をペプトン1.0g、酵母エキス0.7g、塩化ナトリウム0.3gを水100mLに溶解した前培養培地に接種し、30℃で24時間振盪培養した。次に、30L発酵槽中に硫酸アンモニウム150g、リン酸水素二カリウム105g、リン酸二水素カリウム45g、硫酸マグネシウム七水和物1.5g、酵母エキス30g、バリダマイシンＡの粗粉末（バリダマイシンＡ含有率：約60%）100gを15Lの水に溶解し、消泡剤3gを加えてpH7.1に調整した。この主発酵培地に前培養液全量を移植し、30℃、通気量15L/min、攪拌数250rpmで96時間培養を行った。

得られた培養液を遠心分離し、上澄み液全量をアンバーライトIRC-50（NH₄ ⁺型、ローム・アンド・ハース社製）のカラム12Lに通過吸着させ、カラムを水36Lで洗浄後、0.5Nアンモニア水20Lで溶出した。溶出画分を約500mLまで減圧濃縮した。この濃縮液の1/5量（100mL）をダウエックス１×２（OH^-型、ダウ・ケミカル社製）のカラムクロマトグラフィー（2.0L）に供し、水で溶出した。各溶出画分は薄層クロマトグラフィー（シリカゲル60F254（メルク社製）；展開溶媒 n-プロパノール／酢酸／水（4:1:1）；呈色試薬 ニンヒドリン；バリエナミンRf=0.42 バリダミンRf=0.35）で調べた。先に溶出してくるバリダミンの溶出画分を減圧濃縮後、凍結乾燥するとバリダミンの白色粉末が151mg得られた。バリダミンの後に溶出してくるバリエナミンの溶出画分を減圧濃縮後、得られた濃縮液にエタノールを加えるとバリエナミンの結晶1.53gが得られた。

参考例２
バチルス・クラウシィ（Bacillus clausii）DSM8716を上記実施例１と同様に操作し、バリダミンの白色粉末0.98gとバリエナミンの結晶1.53gを得た。

参考例３
バチルス・キチノリティカス（Bacillus chitinolyticus）NBRC15660、バチルス・フレキサス（Bacillus flexus）NBRC15715、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）NBRC15535、バチルス・モジャベンシス（Bacillus mojavensis）NBRC15718、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）IAM1026について、24mmφの試験管に入れた尿素0.15%、硫酸アンモニウム0.15%、硝酸アンモニウム0.15%、リン酸二水素カリウム0.15%、リン酸水素二ナトリウム12水和物0.15%、硫酸マグネシウム七水和物0.03%、塩化カルシウム二水和物0.001%、硫酸亜鉛七水和物0.001%、硫酸第二鉄七水和物0.001%、硫酸マンガン五水和物0.0001%、酵母エキス0.2%、精製バリダマイシンＡ0.5%を含む培地10mL(pH7.0)に一白金耳植菌し、30℃、250rpmで7日間振盪培養した。

培養終了後、培養液を遠心分離し、上澄み液1mLをセップパックプラスCM（ウォーターズ社製）に通過吸着させ、水2mLで洗浄後、0.2Nアンモニア水1.5mLで溶出した。溶出液を窒素風乾した後、水に溶解し分析用サンプルとした。HPLC（カラムはTransgenomic社製CARBOSep CHO-682 7.8φ×200mm移動相は20mM Pb(NO₃)₂、流速0.6mL/min）を使用、サンプルは10μLインジェクションで検出（RI）したところ、それぞれ144μg、69μg、27μg、26μg、18μgのバリエナミンの生成が確認された。

本発明により、バチルス（Bacillus）属に属する微生物によって、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンを分解させ効率的にバリエナミンおよび（または）バリダミンを製造することができるようになった。

Claims (2)

1. バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用してバリエナミンおよびバリダミンに変換する能力を有するバチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）を、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンを含有する培地で培養することにより、バリエナミンおよびバリダミンを製造する方法。
2. バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに作用してバリエナミンおよびバリダミンに変換する能力を有するバチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）由来であって、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンを、バリエナミンおよびバリダミンに変換する活性を有する酵素源をバリダマイシンまたはバリドキシルアミンを含む反応液中に添加して、バリエナミンおよびバリダミンを製造する方法。