JPS6057834B2 - 抗菌剤の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、ストレプトマイセス ジユモンジネンシス
（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｊｕｒｎＯｎｊｉｎｅｎｓ
ｉｓ）の醗酵を経由するクラバラン酸およびその塩類の
製造一法に関する。

クラバラン酸は式（１） を有する有用な抗菌性化合物であり、その塩類およびエ
ステルと共にベルギー特許第８２７９２６号（特開昭５
０−１４２７８＠）に記載されている。

このベル゛キー特許にはストレプトマイセス クラバリ
ゲルスの醸酵を経由するクラバラン酸およびその誘導体
の製法をも開示している。ストレプトマイセス ジユモ
ンジネンシスは、クラバラン酸以外の抗菌剤を生産する
ことがベルギー特許第８０４３４１号に記載されている
。

我々は、ストレプトマイセス ジユモンジネンシスの培
養中にクラバラン酸も生産されることを発見した。この
発明によれば、ストレプトマイセス ジユモンジネンシ
スの菌株を培養し培養物からクラバラン酸またはその塩
を採取することからなるクラバラン酸およびその塩類の
製造法が提供される。クラバラン酸は、その固形のリチ
ウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、バリウム、アルミニウム、アンモニウムまたは置換
アンモニウム塩類で採取するのが好ましい。置換アンモ
ニウム塩類の好ましいものとしては、第１級、第２級、
第３級および第４級アンモニウム塩が含まれる。クラバ
ラン酸は、ナトリウムまたはカリウム塩のような固形の
アルカリ金属塩で採取するのが好ましい。

クラバラン酸の固形の塩類という用語には、クラバラン
酸の結晶性塩類並びに無定形塩類を意味する。

クラバラン酸は例えば、クラバラン酸ナトリウム・４水
和物結晶性塩または結晶性カリウムまたはリチウム塩と
して結晶性の塩類を簡便に得ることができる。ストレプ
トマイセス ジユモンジネンシスＮＲＲＬ５７４ｌまた
はその高生産性変異株をこの発明に使用するのが好まし
い。

ストレプトマイセス ジユモンジネンシスＮＲＲＬ５７
４ｌは微工研菌寄第１５４５号として、またオランダの
バールンてＣＢＳｌ７７．７６としておよび微工研菌寄
第８３９４号として寄託されている。

ここで使用する用語゜゜培養゛とは、炭素，窒素および
ミネラル塩類の同化性源の存在下クラバラン酸生産微生
物を強制通気生育さすことを意味する。このような通気
生育は、固形または半固形の栄養培地、または養分を溶
解または懸濁した液体培地中で行うことができる。培養
は、通気表面または液内培養で行うことができる。栄養
培地は複合栄養物で構成してもまた化学的に限定しても
よい。ベルギー特許第８０４３４１号にはストレプトマ
イセス ジユモンジネンシスの培養についての一般的条
件を記載しているので参照される。

我々は酵母工キズ、大豆粉等のような複合栄養物が特に
適当であることを見出した。

ストレプトマイセス ジユモンジネンシスの培養に使用
しうる栄養培地には０．１〜１０％の範囲で、酵母工キ
ズ、コンスチープリカー、植物性タン白質、シート蛋白
質、このような蛋白質の加水分解物、ミルク蛋白加水分
解物、魚およびミート抽出物、およびペプトンのような
加水分解物のような複合有機窒素源を含めることができ
る。

または化学的に限定した窒素源、例えば尿素、アンモニ
ウム塩類、アミド類、またバリン、アスパラギン、グル
タミン酸、プロリンやフェニルアラニンのような通常の
アミノ酸類の単体または混合物を用いてもよい。炭水化
物は０．１〜５％を栄養培地に含めることができる。澱
粉またはデキストリン、シユークロース、ラクトースま
たは他の糖のような澱粉加水分解物やグリセロールやそ
のエステル類を用いてもよい。炭素源としては、植物性
油または動物性脂肪からのものであつてもよい。カルボ
ン酸類やその塩類をβ−ラクタマーゼ阻害剤の生育と生
産用の炭素源として含めることができる。消泡剤例えば
プルロニツクＬ８ｌのようなものを加えて、醗酵槽中の
ある媒体の発泡をコントロールする必要があるかも知れ
ない。

ＮａＣｅ，ＫＣ′，ＭｇＣｅ２，ＺｎＣｌ２，ＦｅＣｅ
３，Ｎａ２ｓＯ４，ＦｅｓＯ４，ＭｇｓＯ４やリン酸の
Ｎａ＋またはＫ＋塩のようなミネラル塩を特に化学的に
限定し、上記の媒地に加えてもよい。

ＣａｃＯ３はＣａ＋＋源としてまた緩衝作用をもたすた
めに加えることができる。ニッケル、コバルト、マンガ
ンのような塩類をごく少量加えることもできる。所望に
よりビタミン類を加えることもできる。こ）で使用した
用語“変異株゛には、突然に生じたりまたは外部剤を故
意にまたはその他で適用するかどうかにかかわりなく外
部剤の作用により生ずる何かなる変異菌をも含む。変異
菌を作る適当な方法はベルギー特許第８２７９２６号に
記載されている。ストレプトマイセス ジユモンジネン
シスの培養は、１６〜３５℃普通には２０〜３７７Ｃ１
好ましくは２５〜３０′Ｃ例えば約２ｒＣで、５〜８．
５のＰＨより適切には６〜７．５のＰＨで通常行われる
。ストレプトマイセス ジユモンジネンシスは、上記の
培地を用い、ガラス円錐状フラスコのような普通の容器
中、ロータリーシエーカーで振とうによるような攪拌で
通気するか、じやま板付ステンレススチール醗酵槽のよ
うな通気醗酵槽中で、羽根ディスクインペラで攪拌し、
スパージヤで通気して培養することができる。

醗酵は連続式に行うことができる。醸酵の初めのＰＨは
７．０が典型的で、２０〜３７Ｃで１〜１０日、例えば
２〜５日でクラバラン酸の最大収率に達する。

クラバラン酸は、ベルギー特許第８２７９２６号に記載
したような各種の方法を用いて培養沖液からその塩類と
して抽出できる。

冷培養ｐ液からの溶媒抽出は、ＰＨを酸性に調整し、ア
ニオン交換樹脂を使用するような代謝物のアニオン性を
利用した方法に付すのが特に有用であることが分つた。
ストレプトマイセス ジユモンジネンシスのセルは、抽
出処理を行う前に醗酵物から枦過または遠心分離で最初
に除去するのが普通である。溶媒抽出工程では、培養ｐ
液を冷却し、酸を加えてＰＨを２〜３の範囲に下げ、一
方酢酸ｎ−ブチル、メチルエチルケトン、メチルイソブ
チルケトン、ｎ−ブタノール、酢酸エチルのような水不
混合性有機溶媒でよく混合する。ＰＨを下げるのに用い
る酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などのような
鉱酸がある。ｎ−ブタノールは酸性化した培養枦液から
の抽出溶剤として特に適切なものである。遠心分離で層
を分けた後、クラバラン酸代謝物は、ＰＨをほぼ中性例
えばＰＨ７．Ｏに保ちながら、溶媒層から、水性の炭酸
水素ナトリウムもしくはリン酸水素ナトリウム緩衝液、
炭酸カルシウム懸濁液または水で逆抽出する。層を分離
し、水性抽出液を減圧濃縮し、クラバラン酸の粗製塩を
得るべく凍結乾燥する。この粗製塩は、−２０′Ｃで乾
燥固体として貯蔵すれば安定である。アニオン交換樹脂
工程では、ほＳ゛中性または僅かに酸性ＰＨ例えばＰＨ
６〜７の培養枦液を弱または強塩基アニオン交換樹脂例
えばアンパーライトＩＲ４ＢまたはゼオライトＦＦＩＰ
のペットと通常樹脂が飽和され、クラバラン酸がペット
からこぼれ出る迄接触させる。このペットを水洗し、食
塩のようなアルカリ金属クロリドの水性塩溶液で溶離さ
せる。クラバラン酸含有区分を集めバルク化し、脱塩、
凍結乾燥して、クラバラン酸の粗固形塩を得る。アンパ
ーライト１Ｒ４Ｂはポリアミン活性基と架橋ポリスチレ
ンージビニルーベンゼン母体を有する弱塩基性アニオン
交換樹脂の例である。他に弱塩基性アニオン交換樹脂の
適当な例としては、アンパーライトＩＲＡ６８とＩＲＡ
９３がある。ゼオライトＦＦＩＰは第４級アンモニウム
活性基と、架橋ポリビニルージビニルベンゼン母核を有
する強塩基性アニオン交換樹脂であつて、これに均等の
樹脂としては、イソボアＦＦＩＰとデアシダイトＦＦＩ
ＰＳＲＡ６４，６ｌおよび６２が含まれる。抽出法の別
の形としては、クラバラン酸塩含有の培養枦液（普通ほ
ぼ中性のＰＨ）を水非混合性アミンを溶解した有機層と
接触さす方法がある。適切な有機溶媒としては、メチル
エチルケトン、トリクロルエチレンなどのような普通の
水非混和性の極性溶媒が含まれる。適切なアミン類とし
ては、置換分の一つが長鎖脂肪族基例えば１２〜１ｅａ
の炭素原子のもので、他の置換分は分子が脂溶性である
ようにｔ−アルキル基である第２級または第４級アミン
類である。我々はアンパーライトＬＡ２がよいアミンで
あることを見出した。このアミンは、通常酸付加塩とし
て用いる。この抽出工程で、クラバラン酸はアミン塩と
なつて有機層に−存在する。次いで有機層を培養酒液か
ら分離する。

これから食塩、硝酸ナトリウムのようなアルカリ金属塩
の水性液でクラバラン酸を抽出することができる。クラ
バラン酸の粗塩が凍結乾燥などに付すことによつて得る
ことができる。使用可能な他の方法としては、カーボン
への吸着、沈澱、塩析や分子枦過のような通常の方法が
含まれる。これらの方法は、他の分離法と共に用いるの
が普通である。カーボンへの吸着は、培養泪液の水性液
を活性炭含有カラムのような活性炭床へ通過さすことに
よつて行うのが適切である。次いで活性炭床を水洗、ケ
トン例えばアセトンのような水性の水混和性溶媒で溶離
させるのが適当である。これによつてクラバラン酸含有
区分が得られる。最初にアセトン次いで水性アセトンで
溶離を行うのが便利なことがよくある。またクラバラン
酸をリチウム塩のような比較的水に不溶性な塩として作
ると便利なことが多いかも知れない。

この場合に、沈澱化と塩析が有用な手段である。沈澱化
は、水不溶性有機溶媒をクラバラン酸リチウムのような
比較的に水に不溶性のクラバラン酸塩の水性液に加える
ことにより行うのが便利である。この方法では、クラバ
ラン酸の塩をリチウム塩と接触させ、カラムから溶離さ
すか、同じ溶液中で塩を溶解しクラバラン酸リチウム含
有液に水混和性溶媒を加えるか何れかによりクラバラン
酸リチウムを沈澱さすことができる。クラバラン酸リチ
ウムは、それを含有する水性液をイオン性リチウム化合
物（クラバラン酸リチウム形成に使用したリチウム塩が
よい）の存在下、関連温度でクラバラン酸リチウムの溶
解度を大きく超えるように溶液中でのリチウムイオンの
濃度を高めることにより塩析さすことができる。クラバ
ラン酸リチウムは低温では溶解度が低いのでこの方法は
たとえば０〜５℃のごとき低められた温度で行うのが適
切である。上記の方法で得た粗製の固形物は、各種の方
法で更に精製することができるが、イソボア、デアシダ
イトＦＦＩＰＳＲＡ６４またはＤＥＡＥセルロースを用
いるイオン交換カラムクロマトグラフィーが特に適切で
ある。

デアシダイトカラムは食塩（０〜０．５モル）のような
塩水溶液で勾配的に溶離さすことができる。

ＰＨ７の０．０１モルリン酸緩衝液中でのＤＥ，ＡＥセ
ルロースは食塩水（ＰＨ７の０．０１モルリン酸緩衝液
中０〜０．２モル食塩）のような塩化アルカリ金属の溶
液を通常用いて溶離さすことができる。活性区分は、β
−ラクタマーゼ阻害活性とＫＡＧ系における活性によつ
て検出でき、この双方共ベルギー特許第８２７９２６号
に記載されている。この活性を多く含む区分を合し減圧
て濃縮し、脱塩される。クラバラン酸および／またはそ
の塩類を特に無機塩やまた他のコンタミ物質から分離す
るには、抗菌物質を無機塩が吸着しない脂溶性樹脂に吸
着さすことにより行うことができる。

アンパーライトＸＡＤ−４のようなポリスチレンージビ
ニルベンゼンコポリマーが特に好ましく、所望の抗生物
質を溶離（水や水性アルカノールによる）によつてカラ
ムから除き、得られる溶液を蒸発濃縮および凍結乾燥す
ると純度が上つた所望物質が得られることを見出した。
無機塩からクラバラン酸および／またはその塩類の分離
は、セフアデツクスＧｌ５のような架橋デキストランゲ
ルやバイオゲルＰ２のようなポリアクリルアミド ゲル
の如きゲルｐ過剤を詰めたカラムでのクロマトグラフィ
ーによつても行うことができる。（バイオゲルＰ２，セ
フアデツクスＧｌ５とアンパーライトＸＡＤ−４は米国
、リツチモンドのバイオラツド、英国、ロンドンＷ５．
ウツクスブリツジロード７５のフアルマシア グレート
ブリテンリミテツドと米国、フイラデルフイアのローム
アンドハースからそれぞれ供給されているものである。

）活性の脱塩物質は、セルロースカラムでブタノール／
エタノール／水（４１：５Ｖ／Ｖ上層）のような水性ア
ルコール溶媒系を使用するクロマトグラフィーで更に精
製することができる。

クラバラン酸またはその塩類の純粋な形のものを製造す
る一つの変形法としては、不純なりラバラン酸またはそ
の塩を得、常法によりそのエステルとし、エステルを精
製しその後エステルからクラバラン酸またはその塩を再
生することからなる。この観点に使用するのに適切なエ
ステルとしてはベンジルなどの加水分解性エステルがあ
る。この方法で精製に付されるクラバラン酸またはその
塩の不純な形としてはかなりの量の有機または無機の不
純物を含有する固体または溶液であつてもよい。クラバ
ラン酸またはその塩は後述のごときエステル化反応によ
つてエステルに導くことができる。

クラバラン酸の所望のエステルを形成さす好ましい方法
としては、クラバラン酸の塩と反応性ハライド、スルホ
ン酸エステルまたはそれと同等の試剤のようなエステル
化剤との反応がある。このような反応は、ジメメチルホ
ルムアミド、ジメチルホルムアミド／アセトン、ジメチ
ルスルホキシド、Ｎ−メチルアセタミド、ヘキサメチル
ホスホラミドなどのような高誘電率を有する有機溶媒中
で行われることが多い。所望により、クラバラン酸の塩
は常法で溶媒に溶解し、また重合体支持体と結合さすこ
とができる。

この方法に使用される適当な支持体としては、強塩基性
アニオン交換樹脂、特に非水性溶媒系の使用可能なマク
ロ網状性質を有するものが含まれる。我々はアンパーリ
ストＡ２６がこの目的に適当であることを見出した。ク
ラバラン酸塩は、培養枦液から樹脂に吸着させ、次いで
樹脂をヨウ化ナトリウムとベンジルプロミド含有のジメ
チルホルムアミドに懸濁することができる。または、ク
ラバラン酸はヨウ化ナトリウムのジメチルホルムアミド
溶液またはジメチルホルムアミドとベンゼンの混合物で
カラム的に溶離さすことができる。次いで溶離液中のク
ラバラン酸にベンジルプロミドを加えてエステル化がさ
れる。生成した不純なりラバラン酸エステルは通常クロ
マトグラフィーで精製される。

この操作では、エステルを通常、酢酸エチル、メチレン
クロリド、クロロホルムまたは類似の溶媒のような有機
溶媒に溶解させる。クロマト法で用いる固形層としては
シリカゲルのような物質またはセフアデツクスＬＨ２Ｏ
のようなゲル泊過剤またはクロマト的に類似の物質があ
る。カラムから流出する区分は、クラバラン酸エステル
の相剰作用性を用いまたは薄層クロマトグラフィーと組
合せトリフェニルテトラゾリウムクロリドとの反応のよ
うな化学テストでその存在をテストすることができる。

活性区分は通常合し、有機溶媒を減圧留去する。

この方法で得られたエステルは、一般にかなりの純度で
あるが、所望により再クロマトに付してもよい。

クラバラン酸の精製したエステルは、ベルギー特許第８
２７９２６号に記載の方法でクラバラン酸またはその塩
に導くことができる。

クラバラン酸またはその塩類を再び得るのに特に適当な
方法としては、ベンジルエステルを水添に付す方法があ
る。

この反応は、遷移金属触媒の存在下に、低または中圧の
水素を用いて通常行われる。高温、常温または冷却した
温度、例えば０〜１００℃でこの反応を行うことができ
る。この水添反応に特に適切な条件は、僅かに加圧の水
素を用い、ほＳ゛常温（１２〜２０℃）で行うことであ
る。この反応には低級アルカノール、例えばエタノール
のような普通の溶媒中で行うことができる。特に有用な
触媒は、パラジウム炭であることを見出した。水素添加
を塩基の存在下で行うと、クラバラン酸の塩が生成し、
例えは炭酸水素カリウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウ
ムまたは炭酸カリウムの存在下で行うとリチウム、ナト
リウムまたはカリウム塩が得られる。

この反応で得られるクラバラン酸またはその塩は一般に
良好な純度となり、例えば少なくとも９０％純度で通常
事実上全体として純品なものが作りうる。

次にこの発明を実施例を用いて説明する。

実施列１ ストレプトマイセス ジユモンジネンシスＮＲＲＬ５７
４ｌを次の組成の固形寒天斜面で７日間２８℃で発育さ
せた。

バクトー酵母工キズ（デイフコ） ４．０ｙ／′バクト
ー麦芽工キズ（デイフコ）１０．０ｙ／′バクトーデキ
ストロース（デイフコ）
４．０ｙ／′蒸留水に溶解し、ＰＨ７．３に調整次
いで下記を加える。

バクトー寒天 ２０．０ｆ／ｅ発泡プ
ラスチック栓を持つ５００ｍ１の三角プラス．コ中の１
００ｍ１のシードステージの培地に、上記斜面からかき
取つた生育物を直接接種した。

シート培地の組成は次の通りであつた。トリプトン（オ
キソイド） ５．０ｙ／′酵母工キズ
３．０ｙ／Ｅ．培地は、培養前に１２ｒＣ，
１紛間、１５ｅｂ／Ｓｑｉｎで加圧減菌した。

シードステージは、め℃で６時間、１インチ行程を持つ
回転式シエーカーで２４０ｒ′Ｐｍで培養した。シート
培地の５ｍ１宛を５００ｍｔ三角フラスコ中の−１００
ｅ（７）醗酵培地に接種し、発泡栓で封をした。次の三
種類の酷酵培地を使用した。培地組成は次の通りであつ
た。培地Ａグルコース ２０ｙ／ｅ
大豆粉 １０ｆ／１ｃａｃ０３０．２ｆＩ／Ｅ Ｎａ２ＳＯ４Ｏ．５ｆ／Ｆ ｃＯｃｅ２・６Ｈ２００．００１ｆ／ｅ 蒸留水中で調整した。

培地Ｂデキストリン ５５ｆ／ｅ 大豆
粉 ２０ｙ／ｅ モーラアセス ２
０ｆ／ＥＮａＨ２ＰＯ４ｌ．３ｙ／ＦＫＣｅｌ．Ｏｙ／
ｅ 蒸留水中で調整した。

培地Ｃ酵母工キズ １０ｆ／′ スコ
タゾル ２０ｙ／′ 蒸留水中で調整
し、滅菌前にＰＨを７に 調整した。

（大豆粉は、英国、マンチエスター、オルト・トラホー
ド、ブリテイシユ・アーカデイ・カンパニー・リミテッ
ド供給のアーカソイ５０を用いる。

スコタゾルは、英国、グラスゴウ、ウエリングトン●ス
トリート６９のトーマス・ボースウイク●リミテッド供
給の麦芽デイステイラース乾燥ソルブルスを用いる。デ
キストランは、英国、マンチエスター、トラフオード●
パークのシー●ピー●シー・リミテッドより供給された
ものである。）全ての酪酵培地は、培養前に１２１でＣ
，１５１ｅｂ／Ｓｑｉｎでｌ紛間加圧滅菌した。醗酵フ
ラスコを、２６℃において１インチ行程を持つ回転式シ
エーカーを用い２４０ｒ′Ｐｍで培養した。

醸酵２日目に滅菌状態で、５ｍ１のサンプルをフラスコ
より取り出し、次のように処理した。サンプルを２２０
０ｙで１紛間遠心分離し、上澄液を取つた。上澄液には
、標準β−ラクタマーゼ阻害アツセイにより、エシエリ
ヒア●コＩ月Ｔ４のβ−ラクタマーゼ製品に対し阻害作
用があることが分つた。適切なβ−ラクタマーゼ阻害ア
ツセイ法はベルギー特許第８２７９２６号を参照された
い。実施例２ストレプトマイセス ジユモンジネンシス
ＮＲＲＬ５７４ｌを実施例１に記載した培地中で発育さ
せた。

５ｍ１宛のサンプルを醗酵中に一定間隔で、滅菌下に採
取した。

これらのサンプルから２２００ｙ１１紛間の遠心分離に
より得た上澄液を下記の一連の操作でアツセイした。（
ａ）クレブシラ エロゲネスＡに対するそれらの抗菌活
性を寒天平板（ホールインプレート）拡張アツセイを用
いて測定した。

（ｂ）ベルギー特許第８２７９２６号に記載のＫＡＧ寒
天平板系でのそれらの活性を測定した。

醗酵４日のサンプノレを１ＣＴｎ巾のワットマンＮＯ．
ｌクロマト紙にスポットした。

この紙片を４℃で次の溶媒系を用いて一夜クロマトグラ
フィーに付した。ｎ−ブタノール／エタノール／水 ４：１：５Ｖ／Ｖ
（上層）ｎ−ブタノール／酢
酸／水１２：３：５Ｖ／Ｖテープを乾燥し、クレブシラ
エロゲネスＮＣＴＣ４ｌ８とを接種しペニシリンＧ含
有の寒天板上に置いた（ＫＡＧ板）。

２８℃で１６時間培養後、阻止帯が認められた。

両溶媒系において、ブタノール／酢酸／水系ではＲｆＯ
．７２に、ブタノール／エタノール／水系ではＲｆＯ．
２５にそれぞれ単一の阻止帯が認められた。

このＲｆ値は同一系で展関したクラバラン酸標品のそれ
と同一であつた。実施例３ ストレプトマイセス ジユモンジネンシスＮＲＲＬ５７
４６を、ロークス ピン中の固形寒天斜面で、２６゜Ｃ
において７日間発育させた。

寒天培地はバクト・イーストマルト・工キズ寒天（ＩＳ
Ｐ−培地２）（米国、ミシガン、デトロイトのデイフコ
・ラボラトリーズ）。０．０５％トリトンＸ（界面活性
剤）含有の滅菌水１００ｍ１をロークスピンに入れ、培
地の表面を胞子と菌糸体の懸濁を作るべくかきませた。

１００ｍ１の懸濁液を９０ｅのステンレススチール完全
邪魔板付醗酵槽中のシードステージ培地５０ｅに接種し
た。

シードステージ培地は次の組成を有するものであつた。

トリプトン（オキソイド） ５．０（ｆ／ｅ）酵母工
キズ（オキソイド） ３．０消泡剤
０．５市水で調整した。

（消泡剤は１０％プルロニツクＬ８ｌ（ユージン・クー
ルマン・ケミカル・リミテッド）の大豆油（ブリテイシ
ユ・オイル・アンド●ケーキ・ミイルズ）分散液よりな
るものであつた。

）培地を接種前に蒸気滅菌した。

接種後、５インチ直径羽根板インペラを用い７２４０ｒ
ｐｍでシードステージの振盪を行つた。

その際滅菌空気を５０ｅ／分供給し、温度を２６℃に維
持した。シードステージの発育は４ａ寺間続けた。７．
５ｅのシードステージを、３００ｅの完全邪魔板付ステ
ンレススチール醗酵槽中に含めた醗酵培地・１５０１に
接種した。

醗酵培地は次の組成であつた。

グルコース・１水和物 ２０．０ｙ／ｅ大豆粉
１０．０ｃａｃ０３０．２ｃ０ｃｅ２ ●６Ｈ２００．００１Ｎａ２ｓ０ ４０．５ 消泡剤 ０．５ 市水で調整した。

（大豆粉は、英国のブリテイシユ・アーカデイ・カンパ
ニー・リミテッドのアーカソイ５０を用いる。

）消泡剤はシードステージ培地に使用したものと同一。

培地は接種前に滅菌した。接種後、８．５インチ羽根板
インペラを用い３４０ｒ′Ｐｍて攪拌した。

滅菌空気を１５０′／分供給し、７時間の醗酵中２６℃
に保持した。全部の醗酵物を遠心分離で清澄にし、清澄
化した醸酵物１４０ｅをＰＨ６．２に調整した。

これをゼオリツトＦＦ（Ｉｐ）ＳＲＡ６ｌ（１５×１３
０ｃｍ）（英国ゼオリツト●リミテッド）の、強塩基性
アニオン交換樹脂に５００ｍ１／分の速度で流した。カ
ラムは、冷脱ミネラル水（１５ｅ）を用い５００ｍ１／
分の流速で洗浄し、同じ流速で冷１モル水性食塩水で溶
離させ、４ｅの区分を集めた。区分はＫＡＧプレート系
におけるプレートバイオアツセイ法の標準ホールを用い
て検査した。ＫＡＧ系で良好な活性を与える区分（２〜
１９）を合した。この区分をＰＨ６．２に調節し、冷却
し、アンパーライトＸＡＤ−４（米国、ローム アンド
ハース社製）のカラム（３０×１２５ｃｍ）に５００
ｗＬ１／分の割合で流入した。カラムを１モル冷食塩水
（５１）で洗い、次いで脱ミネラル水を用い５℃、５０
０７７１１／分で溶離させた。カラムから食塩の完全な
溶離が起る直前から始めて５１の区分を集めた。区分（
３〜９）のクラバラン酸含有分を合した。この区分（３
５１））を逆浸透膜（デ・ダンスケ・ズガーフアブリカ
ー・ラボラトリー．モジュール、メンブラン型９９５）
で１晧に濃縮した。

４５気圧の４０メンブランの差働圧を与えるようにセッ
トしたウルトラ枦過ユニットの出口弁を有し、冷却系を
有するステンレスタンク中の残留分を再循還する操作法
を用いた。温度を２〜５℃に、ＰＨを２規定塩酸で６．
８±０．１に保つた。得られる濃縮物（３．５１）を乾
燥し、かつ色無定形固形物（３４ｆ１）を得た。この無
定形の固形物２ｙをベルギー特許第８２７９２６号の実
施例１７の方法で精製し、実質的に純粋な結晶性クラバ
ラン酸ナトリウム・４水和物を得た。

この３２ｆＩを１０ｍｔのベンジルプロミドおよび３５
ｍ１のジメチルホルムアミドと混合し、これを室温で４
時間攪拌した。溶媒を減圧濃縮し、半固形残渣を得た。
酢酸エチル５０ｍιを加え、固形物を濾別した。枦液を
減圧濃縮し、油状物を得た。セフアデツクスＬＨ２Ｏカ
ラム（３．８×３４Ｃｒ！ｌフアルマシアリミテツド製
）をシクロヘキサン／クロロホルム１：１中で調整した
。

ベンジル化製品は最少量のシクロヘキサン／クロロホル
ム１：１に溶解し、カラムに流入し、同じ溶媒系で溶離
した。最初の１５０ｍιの溶離液を傾しやし、２５ｍ１
の区分を集めた。

クラバラン酸ベンジルの存在は、各区分の５μｌサンプ
ルをシリカゲル薄層板にスポットし、シクロヘキサン／
酢酸エチル１：１で展関して検査した。クラバラン酸ベ
ンジルはトリフェニルテトラゾリウムクロリド試薬を噴
霧して発色検出した。Ｒｆ値を標品のクラバラン酸ベン
ジルの同条件下でのそれと比較した。（トリフェニルテ
トラゾリウムクロリド試薬は４％メタノール性トリフェ
ニルテトラゾリウムクロリド溶液の１部と１規定水酸化
ナトリウムの１部とを混合して作つた）クラバラン酸ベ
ンジル含有の区分（３０〜３５）を集め減圧濃縮して、
油状物を得た。

セフアデツクスＬＨ２Ｏからの生成物を最少量のシクロ
ヘキサン／酢酸エチル１：１に溶解し、同溶媒系中で製
したシリカゲルカラム（２．５×２８ｃＥ）（メルク社
シリカゲルＨ薄層クロマトグラフィー用品質）に通した
。

シクロヘキサン／酢酸エチル１：１で溶離を行い２枢分
（容量で７ｍι）を集め、続いて１５ｍ１の区分を集め
た。シリカゲル薄層クロマト板上でトリフェニルテトラ
ゾリウムクロリド試薬噴霧により赤色を呈する区分（３
１〜３３）を合し、減圧濃縮した。残留油分をＮＭＲＩ
：．１Ｒに付すと、クラバラン酸ベンジルの標品と同一
であつた。

実施例４ クラバラン酸ナトリウムの製造実施例３で得たクラバラ
ン酸ベンジル０．５ｇを２０麗ｌのエタノールおよび５
ｍιの水中で、１０％Ｐｄ／ＣＯ．ｌ３ｙと炭酸水素ナ
トリウム０．１５ｙとで、室温・常圧下で２粉間水素添
加した。

触媒を炉別、水とエタノールで洗浄し、合した枦液を減
圧濃縮した。主成物は水−アセトン混液からクラバラン
酸ナトリウム・４水和物として結晶化した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセスジユモンジネンシスを培養し、
   培地からクラバラン酸またはその塩を採取することを特
   徴とするクラバラン酸およびその塩類の製造法。 ２ ストレプトマイセスジユモンジネンシスＮＲＲＬ５
   ７４１またはその高生産性変異株を培養することからな
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ クラバラン酸の固形のリチウム、ナトリウム、カリ
   ウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニ
   ウムまたは置換アンモニウム塩の製造に用いる特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４ 結晶性のクラバラン酸ナトリウム４水和物、結晶性
   のクラバラン酸カリウムまたは結晶性のクラバラン酸リ
   チウムの製造に用いる特許請求の範囲第３項記載の方法
   。 ５ ストレプトマイセスジユモンジネンシスの菌株を培
   養し、次いで醗酵物からストレプトマイセスジユモンジ
   ネンシスのセルを除去し、得られる培養濾液からクラバ
   ラン酸またはその塩を抽出することからなる特許請求の
   範囲第１〜４項の何れかに記載の方法。 ６ クラバラン酸またはその塩を培養ろ液から溶煤抽出
   する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 培養濾波を冷却し、そのｐＨを２〜３の範囲に調整
   し、そこでクラバラン酸をまず水と非混和性有機溶媒で
   抽出し、次いでｐＨをほぼ中性に保持し水性の炭酸水素
   ナトリウムもしくは燐酸水素カリウム緩衝液、炭酸カル
   シウム懸濁液または水で抽出し、得られる水性抽出物か
   らクラバラン酸またはその塩を採取することよりなる特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 培養濾波を水不溶性アミンを溶解した有機層と接触
   させ、クラバラン酸をアミン塩として有機層に抽出し、
   その後アルカリ金属塩の水溶液にクラバラン酸を逆抽出
   し、この水性抽出液からクラバラン酸またはその塩を採
   取することからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９ クラバラン酸のアニオン性に基づく方法を用いて、
   培養濾波からクラバラン酸またはその塩を抽出すること
   からなる特許請求の範囲第５項記載の方法。１０ 培養
   濾波をｐＨ６〜７において弱または強塩基アニオン交換
   樹脂と樹脂がクラバラン酸で飽和されるまで接触させ、
   次いで水性の塩溶液で溶離させ、溶離液からクラバラン
   酸塩を採取することからなる特許請求の範囲第９項記載
   の方法。 １１ 培養濾波の水性溶液をます活性炭床を通過させ、
   水洗後水性の水混和性溶液で溶離させることからなる特
   許請求の範囲第５項記載の方法。 １２ 水不溶性のクラバラン酸塩を塩析または沈澱さす
   付加工程を含む特許請求の範囲第５〜１１項の何れかに
   記載の方法。 １３ クラバラン酸の水不溶性塩がクラバラン酸リチウ
   ムである特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４ クラバラン酸の比較的に水不溶性塩の水性溶液に
   水不溶性溶媒を加えて沈澱化をさすことよりなる特許請
   求の範囲第１２または１３項記載の方法。 １５ クラバラン酸リチウムの水性溶液にイオン性リチ
   ウム化合物を加え関連温度でクラバラン酸リチウムの溶
   解度を大きく超えるように溶液中でのリチウムイオンの
   濃度を高めてクラバラン酸リチウムの塩析を行うことか
   らなる特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６ 常法によりクラバラン酸のエステルを形成させ、
   エステルを精製し、その後エステルからクラバラン酸ま
   たはその塩を再生さす付加工程を含む特許請求の範囲第
   ５〜１５項の何れかに記載の方法。 １７ クラバラン酸塩と反応性ハライドまたはスルホン
   酸エステルとの反応でクラバラン酸エステルを形成さす
   ことからなる特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８ 反応性ハライドがベンジルプロミドである特許請
   求の範囲第１７項記載の方法。 １９ エステルから水素添加でクラバラン酸またはその
   塩を再生さすことからなる特許請求の範囲第１６〜１８
   項の何れかに記載の方法。 ２０ イオン交換カラムクロマトグラフィーでクラバラ
   ン酸またはその塩を更に精製する付加工程を含む特許請
   求の範囲第５〜１９項の何れかに記載の方法。