JPH044896A - セファレキシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン
酸とフェニルグリシンおよびその反応性誘導体に酵素を
作用させて効率的にセファレキシンを製造する方法に関
する。

〔従来の技術〕

従来より、７−アミノデスアセトキシセファロスポラン
酸とフェニルグリシンおよびその反応性誘導体からセフ
ァレキシンを得る方法としては、化学的アシル化法が主
流を占めてきたが、反応液中に存在する有機溶媒や五塩
化燐などの取扱い上の安全性および化学物質の製品への
混入などの問題があった。

一方、これらの問題点の解決とともに光学活性体の選択
的な合成が可能であるなどの利点から、生物学的アシル
化法が注目され、各種微生物およびその生成する酵素を
用いる方法が報告されている。これらの報告の中でセフ
ァレキシンの製造に関するものには、特公昭５２−２０
５２２号、特公昭５５−４８７９７号、特公昭５５−４
８７９８号、特公昭５４−３９４７３号公報などがある
。

さらに、酵素法によるセファレキシンの製造法について
は、総説を含めてアドバンス・イン・７プライド・マイ
クロバイオロジー（＾ｄｖａｎｃｅ　１ｎＡｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　＋　Ｖｏｌ、１７（１
９７４）、　Ｖｏｌ、２０（１９７６）、　　Ｖｏｌ、
２１（１９７７）　）およびザ・ジャバニズ・ジャーナ
ル・オブ・アンティバイオティクス・サブリメント（Ｔ
ｈｅ　Ｊａｐ、　Ｊ、　Ａｎｔｉｂ、　５ｕｐｐ１．（
１９７７））をはじめとして、多くの報告がなされてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、これら生物学的アシル化法によるセファレキシ
ンの製造が産業上で利用されているのは、バシルス・メ
ガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕ
ｍ）Ｂ−４００を用いる方法（東洋醸造■、バイオイン
ダストリー（Ｂｉｏｔｎｄｕｓｔｒｙ＋　νｏ１．２（
Ｎｏ、１）、νｏ】、３（Ｎｏ、３））およびペニシリ
ンアシラーゼを用いる方法（協和醗酵工業■、化学と生
物Ｖｏ［、ｌ６（Ｎｏ、８）などの掻く少数例が報告さ
れている程度であり、他のβ−ラクタム誘導体の製造法
に生物学的方法を用いるためにも、より工業的な酵素的
製造法の開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、従来知られた酵素的製造法をより効率よ
く行なうために、今回新たにセファロスポリン誘導体の
アミド結合を分解する酵素を生産する微生物を検索した
結果、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）　ｓ
ｐ、　ＹＴ−１０９９株が強力なセファロスポリン誘導
体のアミド結合分解能を有すると共に７−アミツデスア
セトキシセフアロスボラン酸とフェニルグリシンおよび
その反応性誘導体をアシル化させてセファレキシンを製
造させる強力な能力を有することを見出して本発明を完
成させるに至った。

すなわち、本発明は７−アミノデスアセトキシセファロ
スポラン酸とフェニルグリジンおよびその反応性誘導体
を反応させてセファレキシンを製造する方法において、
キサントモナスｓｐ、　ＹＴ１０９９株の産生ずるペニ
シリンアシラーゼを反応させることを特徴とするセフブ
レキシンの製造法に関する。

本発明をさらに詳細に説明すると、本発明に用いられる
キサントモナスｓｐ、　ＹＴ−１０９９株は、吉冨製薬
株式会社・吉富工場内から分離されたものである。

本微生物の菌学的性質を常法の細菌の分離同定法、たと
えば、長谷用武治編著（微生物の分離と同定法、学会出
版センター）に記載の条件等に従って調べた。

その結果は、次に示す通りである。

ａ、形態 本菌株は、普通寒天平板培地上で黄色、半透明で湿潤し
たコロニーを形成し、色素産生はない。

位相差顕微鏡観察では、運動性のある桿菌で、細胞の大
きさは１〜１．５　Ｘ　３〜３．５ｍμである。

ｂ、ｐＨ生育範囲 本菌株を普通液体培地に接種２４時間後、１２０時間後
および１６８時間後に、生育状況を観察した結果、ｐ　
Ｈ６，０〜８，０が最適生育範囲であることが分かった
。ｐ　Ｈ５，０および９．０では徐々に生育が認められ
たが、ｐ　Ｈ４，０以下およびｐＨ１０，０以上での生
育は認められなかった。

Ｃ９培養的性質 （１１背ｉｌ！寒天培地 ３０℃、２４時間の培養ではコロニーは小すいが、４８
〜７２時間の培養で１〜１．５１の円形番こなり、辺縁
性、表面平滑で黄色半透明で湿潤し、光沢があり、水溶
性色素の産生は見られなかった。

（２＋　　９ｉ１１斜面培地 ３０℃、２４〜４８時間の培地で直答は糸状に生育し、
黄色半透明で湿潤し、光沢があり、水溶性色素の産生は
見られなかった。

（３）普通液体培地 ３０℃、２４時間の培地で、菌の生育に伴って培養液は
均等に混濁し、４８〜７２時間で試験管底に沈殿を生じ
たが、菌膜は形成されなかった。

（４）ゼラチン培地 ３０℃、２４〜４８時間の培養で培養表面に菌の生育が
見られ、７２時間ごろからゼラチンの液化が起こり、１
６８時間で完全に液化した。

以下余白 上記の同定実験により、本菌株はキサントモナス−フル
トフィリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈ
ｉｌｉａ）に類似した性状を有することが判明した。

本発明にＲ４Ｑｌする菌株として、キサントモナスマル
トフィリア　＾ＴＣＣ１７８０８、キサントモナス・マ
ルトフィリアＩＦＯ１２０２０およびキサントモナスマ
ルトフィリアＩＦＯ１２６９０が存在するため、これら
を対照菌株として、本発明のキサントモナスＳ［ＹＴ−
１０９９株の生理学的性質を詳細に比較検討した。

その結果を第３表および第４表に示した。

表中、ＹＴ−１０９９はキサントモナスｓｐ、　ＹＴ−
１０９９ＡＴＣＣ１７８０８はキサントモナス・マルト
フィリアＡＴＣＣ１７８０８、ＩＦＯ１２０２０はキサ
ントモナス・マルトフィリアＩＦＯ１２０２０およびＩ
ＦＯ１２６９０はキサントモナス・マルトフィリアＩＦ
Ｏ１２６９０をそれぞれ示し、ＮＴは未試験を意味する
。

以下余白− 上記の蘭学的性質を有する本面の分類学上の位置をバー
シース・マニュアル・オプ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｂ　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ　）第８版を参照して検討すると、本面はキサントモ
ナス属に属し、これら対照菌株に類似することが認めら
れた。

しかし、本菌株は対照菌株とは炭素源の利用性および糖
の資化性の点で相違点を有するので、キサントモナス属
に属するｌ新菌株と認め、キサントモナスｓｐ、　ＹＴ
−１０９９株と命名した。

なお、本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に微
生物受託番号［微工研菌寄第１１４０１号（ＦＥＩ？Ｍ
Ｐ４１４０１）　Ｊのもとに寄託されている。

これらの菌株から酵素を得るために、まず培養物を得る
必要があるが、培養物を得るための培養方法としては、
通常、好気的培養が望ましく、好適には液体通気攪拌培
養により行なわれる。培地組成としては、通常バクテリ
アの培地として使用される培地、たとえばペプトン、肉
エキス、酵母エキス、大豆分解物、大豆浸出液、コーン
スチープリカーなどの窒素源、糖密、ブドウ、糖、グリ
セリンなどの炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩、食塩
その他の無機塩または場合によりその他の生長促進物質
などを適宜含有する栄養培地をｐ　Ｈ６〜７に調整して
使用する。培養温度は２５〜３０℃、培養時−間は培養
条件、特に培養装置、培地組成、培養温度などにより異
なるが、セファレキシン生産活性が最大を示す時期に培
養を終了するように決定するのがよく、通常１２〜２０
時間が適当である。

こうして得られた培養物またはその処理物がセファレキ
シン生産反応に使用されるが、ここでいう培養物の処理
物とは、培養物に適当な処理を加えてセファレキシン生
産活性を高め、セファレキシンの製造に有利な形にした
ものを指す。たとえば、本発明におけるセファレキシン
生産活性は、通常、菌体内に存在するので、培養液から
集菌して得られた菌体または菌体を破砕して得られる酵
素液を既知の酵素精製法、たとえば、硫安、食塩などの
可溶性塩類で塩析するか、メタノール、エタノール、ア
セトンなどの親水性有機溶媒を加えて沈殿させるか、ま
たは沈殿物を水に溶解し、これを半透膜で透析すること
により不純物を除去する。また、無機または有機吸着剤
もしくはゲル濾過剤に対する吸着親和力の差を利用して
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーもしくはゲル濾過などの通常の手段を適用して低分子
、高分子の不純物、蛋白質などを有効に分離することが
できる。得られる活性体溶液は、減圧濃縮、凍結乾燥な
どの手段により固形物として得ることもでき、そのまま
セファレキシンの生産反応に使用してもよい。さらに精
製を必要とする場合は、蛋白質、酵素などの精製に通常
使用される手段、たとえば吸着剤、ゲル濾過剤を駆使す
ることにより分離精製することができる。

このようにして得られる活性体はアシラーゼ活性を有し
、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルを基質とする加
水分解で測定した場合、５〜４５℃およびｐＨ４，５〜
８．０で活性を示すが、５〜３０°Ｃおよびｐ　Ｈ５，
５〜６．０の範囲で強い活性を示した。また、その活性
は５〜３０℃およびｐＨ５〜８の範囲では、安定であっ
た。

この活性体を弱酸性溶液中で、７−アミノデスアセトキ
シセファロスポラン酸とフェニルグリシンまたはその反
応性誘導体に作用させることにより、セファレキシンを
得る。この反応はｐＨ４〜７で進行するが、ｐ　Ｈ５〜
５．５における反応活性が最も強い。

また、この培養物または部分精製または精製された処理
物は物理的あるいは化学的手段によって水不溶性高分子
物質に結合された固定化酵素などの活性体としてもよい
。

これらの培養物またはその処理物を用いてセファレキシ
ンを製造する場合、通常、水溶液中で行なうのがよく、
その場合、反応液のｐＨは４〜７に調整するのが望まし
い。培養物またはその処理物が水に可溶な場合、上記反
応は緩衝液中で行なわれるが、培養物の処理物が水に不
溶な場合は、上記反応は懸濁液の形で実施されるかある
いは水不溶性の活性体をカラムに充填し、基質を溶解し
た水溶液がこのカラム内を通過する際に、生成反応が行
なわれるような形で実施される。そのような担体として
は、ＣＮＢｒ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　（ファ
ルマシア社製）　、ＡＦ−）レシルトヨパール６５０Ｍ
（東ソー社製）などの担体から選ばれる。

反応時間は基質濃度、培養物またはその処理物の活性の
強さ、反応温度などにより変化しうるが、通常１〜１０
時間程度であって、セファレキシンが最高に生成される
時間を検討して適当な時間に反応を終了すればよい。カ
ラム弐の場合は基質の添加量を増減することにより適宜
変更できる。

反応温度は５〜２０℃の間で選ばれる。基質濃度は主と
して培養物およびその処理物の活性の強さとの関係で決
められるが、通常０．１〜５％の範囲で選ばれる。

本発明における出発物質である７−アミノデスアセトキ
シセファロスポラン酸は様々の既知の方法により得られ
るが、反応液からセファレキシンを分離、精製する段階
で、本発明の培養物またはその処理物および本発明の反
応に悪影響を与えない範囲内の精製度で充分であり、水
）８液であればこれを特に精製することなく、適宜希釈
して、本発明に直接使用することができる。

こうして上記の微生物の培養物またはその処理物の存在
下で生成されたセファレキシンは公知の方法、たとえば
カラムクロマトグラフィー、活性炭吸着法、非イオン性
樹脂吸着法、等電点沈殿法を使用することにより、反応
液から分離、精製することができる。

以下余白 〔作用および発明の効果〕 キサントモナス　ｓｐ、　ＶＴ−１０９９株の産生ずる
活性の強力なペニシリンアシラーゼを用いることにより
、抗生物質として繁用されているセファレキシンを効率
的に製造することができる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明方法をさらに詳細に説明する
が、これにより本発明方法を限定するものではない。

実施例中で使用される二種類の培地組成を次に記す。

Ａ培地 グルタミン酸ナトリウム　　　　　０．２　　％酵母エ
キス　　　　　　　　　　　０．２　　％ペプトン　　
　　　　　　　　　０．５　　％リン酸水素二カリウム
　　　　　　０．２　　％塩化マグネシウム　　　　　
　　　０．１　　％硫酸第二鉄　　　　　　　　　　　
０．０１％スクロース　　　　　　　　　　　　２．０
　　％脱イオン水 ｐ　Ｈ７，２ Ｂ培地 グリセリン　　　　　　　　　　３．０　　％ポリペプ
トン　　　　　　　　　　１．０　　％肉エキス　　　
　　　　　　　　　１．０　　％グルコース　　　　　
　　　　　　２．０　　％脱イオン水 ｐ　Ｈ６，５ 実施例１ キサントモナスｓｐ、　ＹＴ−１０９９（ＦＥＲＭ　Ｐ
４１４０１）を１００ｍ１容三角フラスコ中のＡ培地２
０ｍ１中に接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。遠
心分離によって菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）２０ｍ］で１回洗浄した後、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）５ｍｌに懸濁した。この懸濁液に
２％（Ｗ／Ｖ）の７−アミノ−３−デ人アセトキシセフ
ァロスポラン酸（以後、’１−ＡＤＣＡと略記すること
もある）、４％（Ｗ／Ｖ）のＤ−フェニルグリシンメチ
ルエステルおよび２０％のメタノールを含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５ｍｌを加え、振盪しながら
３７℃で６０分間反応させた。反応液中に蓄積したセフ
ァレキシンを高速液体クロマト法で定量したところ、５
．８■／　ｍ　１に達した。

実施例２ キサントモナスｓｐ、　ＹＴ−１０９９を１００ｍ１容
三角フラスコ中のＡ培地１５ｍ１中に接種し、３０°Ｃ
で２４時間振盪培養した。２！容三角フラスコ中のＡ培
地２５０ｍ１中に接種し、３０°Ｃで３０時間振盪培養
した後、３０／用培養装置中のＢ培地２０１に接種し、
２８℃で１６時間培養した。培養終了後、遠心分離によ
って４５５ｇの湿り菌体を得た。これを５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）１１に懸濁した。この懸濁液５ｍ
ｌに２％（Ｗ／Ｖ）の７−ＡＤＣＡ、４％（Ｗ／Ｖ）の
Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルおよび２０％のメ
タノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）５
ｍｌを加え、振盪しながら３７℃で６０分間反応させた
。反応液中に蓄積したセファレキシンを高速液体クロマ
ト法で定量したところ、８．４■／ｍｌに達した。

実施例３ アルギン酸ナトリウム３ｇを１００ｍ１の脱イオン水に
溶解し、オートクレーブにて滅菌し、４０℃まで冷却し
た。これに実施例１と同様にして培養して得た湿り菌体
１ｇを５ｍｌの滅菌水に懸濁して加えた。この混合液を
オートクレーブ滅菌された５％塩化カルシウム水に滴下
し、生ずるアルギン酸カルシウムゲルビーズを濾取した
。ＩＩ！容三角フラスコ中でＡ培地２００ｍ１を加え、
２８°Ｃで２４時間培養した後、培養液を除き固定化菌
体ビーズを得た。これを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）２００ｍｌに懸濁し、０．６％（Ｗ／Ｖ）の７−
ＡＤＣＡ、　１．８％（Ｗ／Ｖ）のＤ−フェニルグリシ
ンメチルエステルおよび２０％のメタノールを含む５０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）　　１００ｍｌを加
え、振盪しながら３７℃で６０分間反応させた。

反応液中に蓄積したセファレキシンを高速液体クロマト
法で定量したところ、１．６■／ｍｌに達した。

実施例４ キサントモナスｓｐ、　ＹＴ−１０９９を実施例２と同
様に培養して得られた湿り菌体４５５ｇを０．１　Ｍ　
）リス緩衝液（ｐＨ８，０）１ρに懸濁し、圧力式細胞
破砕機（ボウリン）で菌体を破砕した後、デオキシリボ
ヌクレアーゼ■　（シグマ社）４■と硫酸マグネシウム
５ｇを加え、５℃にて４時間攪拌した。これに酢酸カル
シウム７６ｇとリン酸水素二カリウム１１５ｇの５００
ｍ１水溶液を加え、さらに５℃にて６時間攪拌した後、
遠心分離して得た上滑をセファレキシン合成酵素の粗酵
素抽出液とした。酵素活性は、２７℃、ｐＨ５，５で１
０ｍＭのＤ−フェニルグリシンメチルエステル質とする
時の氷解速度をｐＨスタンドを用いて測定した。この条
件下で１分間当り１ｇＭの基質を加水分解する酵素量を
１ユニツト（Ｕ）と定める。

この粗酵素抽出液１ｍｌ（酵素活性１５Ｕ）を５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し５ｍｌとし、２％
（Ｗ／Ｖ）の７−ＡＤＣＡ、４％（Ｗ／Ｖ）のＤフェニ
ルグリシンメチルエステルおよび２０％のメタノールを
含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６、０）５ｍｌを加え
、振盪しなから５°Ｃで６０分間反応させた。反応液中
に、蓄積したセファレキシンを高速液体クロマト法で定
量したところ、９．８■／　ｍ　ｌに達した。

実施例５ 実施例４で得た粗酵素抽出液ｌβに硫酸アンモニウムを
７０％飽和濃度になるように加え、５℃で４時間静置し
た。ついで遠心分離して得た沈殿を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐ　Ｈ６．０）　　１　１．ｍ溶解し、さらに遠心
分離して得た上滑を硫安塩析酵素液とした。硫安塩析酵
素液２００ｍｌをセファデックスＧ−２５（ファルマシ
ア社）カラムを用いてゲル濾過、脱塩した。この脱塩酵
素液４００ｍｌに０、３Ｍリン酸緩衝液２００ｍｌを加
え、ｐＨ７．５の固定化用酵素液６００ｍｌを調製し、
これに固定化用樹脂として臭化シアン活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社）１０ｇを加え、５℃で１６時
時間中かに振盪しながら反応後、樹脂をグラスフィルタ
ーで濾過し、さらに０．２Ｍグリシン溶液１００ｎ＋ｌ
、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液１００ｍｌ、５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（１）　Ｈ６．５）　　１　０　０ｍｌの順
で洗浄して、３５ｍｌ容の固定化酵素を得た。実施例４
と同様の測定法によるとこの固定化酵素の全酵素活性は
１５４０Ｕであり、活性収率は８１．１％であった。こ
うして調製した固定化酵素を用いて、床体積３５ｍｌの
カラムを作り、５℃において、７　−　ＡＤＣＡ　０．
　５％、Ｄ−フェニルグリジンメチルエステル１．５％
、メタノール１０％を含み、ｐＨ６、０に調整した基質
溶液を流速３５ｍｌ／ｈｒの一定流速で通過させると約
９０％の変換率でセファレキシンが生成した。カラムに
よる連続合成反応で得た７．３０■／ｍｌのセファレキ
シンを含む反応液１０００ｍｌを床体積１００ｍｌのＨ
Ｐ−２０　（三菱化成）カラムに通し、セファレキシン
を吸着させた。カラムを５００ｍｌの脱イオン水で洗浄
後、５０％メタノール−塩酸水でセファレキシンを溶出
させ、これをｐＨ　４．　０として析出した結晶を濾取
し、５０％メタノール水５０ｍｌとメタノール５０ｍｌ
で洗浄後乾燥し、７．１ｇのセファレキシン結晶を得た
。すなわち、セファレキシンの合成反応収率は９０％、
精製収率９７％であり、−貫収率として８７％であった
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸と
   フェニルグリシンおよびその反応性誘導体を反応させて
   セファレキシンを製造する方法において、キサントモナ
   スｓｐ．ＹＴ−１０９９株の産生するペニシリンアシラ
   ーゼを反応させることを特徴とするセファレキシンの製
   造法。