CN1196781C - 一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 - Google Patents
一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1196781C CN1196781C CN 02139885 CN02139885A CN1196781C CN 1196781 C CN1196781 C CN 1196781C CN 02139885 CN02139885 CN 02139885 CN 02139885 A CN02139885 A CN 02139885A CN 1196781 C CN1196781 C CN 1196781C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- acid oxidase
- amino
- bacterium
- seeded
- ferment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，本发明是一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤，超滤浓缩、纯化固定化后得产物；可使产物有较高收率的D-氨基酸氧化酶的制备方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种半合成头孢菌素合成的关键中间体7-氨基头孢烷酸用的D-氨基酸氧化酶的发酵及提取生产方法。
背景技术：
头孢菌素是有着重要疗效的抗生素，而半合成头孢菌素则具有更强抗菌能力或可使药物动力学性质得到改善。而半合成头孢菌素的关键中间体为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，以往的传统生产的方法主要是通过化学方法，有四大步骤，过程复杂，所用试剂昂贵，污染严重，且收率较低，质量较差。而生物转化方法是一种较好的方法。研究表明，头孢菌素C可被D-氨基酸氧化酶氧化脱氨基，并进一步脱羧反应生成GL-7-ACA，到最后生成7-ACA，因而D-氨基酸氧化酶是生成7-ACA的关键酶。
发明内容：
本发明的目的旨在提供一种通过利用大肠杆菌基因工程菌发酵生产，可使产物有较高收率的D-氨基酸氧化酶的制备方法。
将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心收集菌体，浸泡提取酶液、板框过滤、超滤浓缩、纯化固定化后得产物；
其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量：
胰蛋白胨1.0％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％
发酵种子培养基的成分和含量：
酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％
发酵培养基的成分和含量：
氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 甘油0.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％
适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间为各为10-14小时。
发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V/V/M，培养时间为25-30小时。
本发明所使用的菌为大肠杆菌基因工程菌，D-氨基酸氧化酶产生菌(代号：E.coli-DAA02002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌均为RecombinantEscherichia coli BL21(DE3)，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsisvariabilis.其特征为1、细胞尺寸：0.6um×(1-4)um，长度在不同生长期有较大变化，细胞呈典型的杆状；2、菌落表面光滑、湿润，有光泽；3、为革蓝氏阴性菌；4、不产生蛋白酶；
D-氨基酸氧化酶的提取、纯化及固定化过程为：首先用稀盐酸将发酵液PH调7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离得离心菌液，控制菌液活力8-10u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用D290树脂搅拌脱色20分钟，脱色酶液过滤后超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，洗水酶放置在2-4℃的冰箱20小时左右，然后用固定化用载体固定化。
本发明用1500u固定化D-氨基酸氧化酶在20℃下转化，可连续使用120批以上，可将2300克头孢菌素C钾盐转化得到1616克GL-7-ACA。本发明固定化酶不易被降解，且D-氨基酸氧化酶有极强的抗过氧化氢的能力。
所得产物
固定化D-氨基酸氧化酶
外观：黄色或浅黄色球状颗粒
粒径(100um)： ≤1％
含水量 ≤70％
酶活力 50-65(u/g)(25℃)
具体实施方式：
实施例
取D-氨基酸氧化酶产生菌大肠杆菌基因工程菌(代号：E.coli-DAA02002)，从韩国进美有限公司购进，产生菌均为Recombinant Escherichiacoli BL21(DE3)，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsis variabilis.将該菌接种至装有100ml的摇瓶种子培养基的500ml三角瓶中，该培养基胰蛋白胨1.0克，酵母膏0.5克，氯化钠1.0克。培养温度控制在25℃，PH值为6.5，培养12小时。再将400ml摇瓶菌丝移入装有100升培养基的发酵罐中进行发酵种子培养，其中酵母膏1500克，氯化铵240克，苹果酸220克，磷酸二氢钾680克。培养温度为25℃，PH值为6.5，空气流量为1∶1V/V/M，培养12小时。在发酵培养阶段，2500升培养基的发酵罐中，培养基为氯化铵15千克，酵母膏60千克，甘油10千克，乳糖12.5千克，泡敌1.25千克。先进行消毒后冷至60℃，加入无菌的KH2PO4-K2HPO4缓冲液(KH2PO423.1g/l，K2HPO4164.3g/l)控制消毒后PH值为6.8。将发酵种子液移至2500升发酵罐中，控制培养温度为25℃，空气流量为1∶1.5V/V/M，PH值为6.5-8.2，培养28小时。发酵结束酶活力可达3-5u/ml，25 00升发酵液总活力为7.5-12.5百万单位(HPLC法，25℃)。
接下来进行D-氨基氧化酶的提取、纯化及固定化，首先用稀盐酸将发酵液PH调7.0-7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8。用高速离心机离得离心菌液。控制菌液活力8-10u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时。板框过滤，收集清液，清液超滤浓缩，浓缩酶用D290树脂搅拌脱色20分钟，脱色酶液过滤后超滤脱盐洗水至洗出液的电导40us/cm以下，洗水酶放置在2-4℃的冰箱20小时左右，然后用固定化用载体固定化，固定化酶活力为50-65(u/g)，2500升发酵液可得固定化酶0.6-1.0百万，总收率8-9％(HPLC法，25℃)。
Claims (3)
1、一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，将大肠杆菌基因工程菌在培养基中进行摇瓶种子培养，发酵种子培养，发酵培养，再通过离心菌液，板框过滤、超滤浓缩、纯化固定化后得产物；
所使用的菌为大肠杆菌基因工程菌，D-氨基酸氧化酶产生菌的代号：E.coli-DAA02002，产生菌为Recombinant Escherichia coli BL21的DE3溶原性细菌，D-氨基酸氧化酶的基因来源为Trigonopsis variabilis；
其中摇瓶种子阶段培养基的成分和含量为：
胰蛋白胨1.0％ 酵母膏0.5％ 氯化钠1.0％
发酵种子培养基的成分和含量：
酵母膏1.5％ 氯化铵0.24％ 苹果酸0.22％ 磷酸二氢钾0.68％
发酵培养基的成分和含量：
氯化铵0.6％ 酵母膏2.4％ 甘油0.4％ 乳糖0.5％ 泡敌0.05％
2、根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，适合摇瓶种子、发酵种子培养的条件为温度为25℃，PH值为6.1-7.0，培养时间各为10-14小时，发酵种子培养时的空气流量为1∶1V/V/M。
3、根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶的制备方法，发酵培养的条件为温度为25±1℃，PH值为6.5-8.2，空气流量为1∶1-1.5V/V/M，培养时间为25-30小时。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02139885 CN1196781C (zh) | 2002-12-30 | 2002-12-30 | 一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 02139885 CN1196781C (zh) | 2002-12-30 | 2002-12-30 | 一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1428421A CN1428421A (zh) | 2003-07-09 |
| CN1196781C true CN1196781C (zh) | 2005-04-13 |
Family
ID=4750266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 02139885 Expired - Fee Related CN1196781C (zh) | 2002-12-30 | 2002-12-30 | 一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1196781C (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112852773B (zh) * | 2021-01-27 | 2022-11-15 | 浙江工业大学 | 一种发酵生产d-氨基酸氧化酶的方法 |
-
2002
- 2002-12-30 CN CN 02139885 patent/CN1196781C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1428421A (zh) | 2003-07-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109153966B (zh) | 生产丙烯酰胺的生物技术方法及相关新菌株 | |
| CA1168999A (en) | Method for preparing 2,5-diketo-d-gluconic acid | |
| US4745064A (en) | Process for the degradation of s-triazine derivatives in aqueous solutions | |
| CN113817635A (zh) | 一种利用大豆乳清废水培养芽孢杆菌的方法 | |
| JP2001037469A (ja) | エピクロロヒドリンの微生物分解 | |
| FI70924C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av enzymen kolesteras | |
| CN1196781C (zh) | 一种d－氨基酸氧化酶的制备方法 | |
| CN113637651B (zh) | 一种亚硝酸还原酶的制备方法及应用 | |
| CN1428424A (zh) | 一种戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的制备方法 | |
| CN113174342A (zh) | 高效降解氨基甲酸乙酯的菌株及其应用 | |
| CN114657085B (zh) | 一种高产褐藻胶裂解酶菌株及其应用 | |
| JPH09154592A (ja) | 微細藻による乳酸の製造方法 | |
| CN1127573C (zh) | 利用产碱杆菌属的微生物制造杂芳香族羧酸的微生物学方法 | |
| CN107814440A (zh) | 一种用于污水处理的菌藻复合剂及其制备方法 | |
| WO1992018637A1 (en) | Method for the production of d-gluconic acid | |
| JPH04299980A (ja) | チオバチルス属細菌の高密度培養方法 | |
| CN1081714A (zh) | 利用微生物生产d-酒石酸的方法 | |
| JPS6075283A (ja) | 新菌株 | |
| KR880001680B1 (ko) | 발효에 의한 시소마이신의 제조방법 | |
| SE450007B (sv) | Forfarande for kontinuerlig odling av bacillus stearothermophilus varvid bakterieceller med hog halt acetatkinas erhalles | |
| CN1060802C (zh) | 枯草杆菌生长培养基的建立及其发酵方法 | |
| CN116515795A (zh) | 塔宾曲霉在制备植酸酶和/或降解植酸中的应用 | |
| DK148360B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af uricase | |
| CN110607266A (zh) | 产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用 | |
| JPH07102355B2 (ja) | ジメチルホルムアミドの除去方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Weiqida Pharmaceutical Ind Co., Ltd. Assignor: Hu'nan Fulaige Biological Technology Co., Ltd. Contract record no.: 2011990000263 Denomination of invention: Preparation method of D-amino acid oxidase Granted publication date: 20050413 License type: Exclusive License Open date: 20030709 Record date: 20110415 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050413 Termination date: 20181230 |