FI70924C - Foerfarande foer framstaellning av enzymen kolesteras - Google Patents

Description

1 70924

Menetelmä kolesteraasientsyymin valmistamiseksi Förfarande för framställning av enzymen kolesteras Tämä keksintö koskee prosessia kolesteraasi-entsyymin (E.C.3.1.1.13) tuottamiseksi viljelemällä Achromobacter suvun mikro-organismia. Rasvahappojen kolesteroliestereitä voidaan hydrolysoida käyttämällä tätä entsyymiä.

5 Kolesteroli, ihmisorganismin olennainen komponentti, on psoisyhdiste kaikkien kudosten solu membra n n i e n rakenteessa ja monien hormoonien tuotannossa. Kuten hyvin tiedetään, kokonaiskolesterolin määrityksestä verellä on suuri merkitys kliinisissä diagnooseissa, ja koska kolesteroli esiintyy 10 seerumissa pääasiassa rasvahappojen esteröimässä muodossa, kolesteraasientsyymi tarvitaan kolesterolin vapauttamisessa ja siten kolesterolin määrityksessä. Vain muutamat julkaisut kuvaavat entsymaattista prosessia kolesteroliestereiden hydrolysoimiseksi käyttäen entsyymejä, jotka ovat Fusarium, 13 Nocardia, Pseudomonas, Saccharomyces ja Streptomyces -sukujen mikro-organismeista. Yleensä entsyymi kuitenkin saadaan eläinkudoksista.

Nyt on keksitty prosessi, ja se muodostaa tämän keksinnön aiheen, kolesteraasi-entsyymin tuottamiseksi valitus-20 ta uudesta mikro-organismista, joka kuuluu Achromnbacter-su-kuun .

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän tärkeä etu on se, että tämän mikro-organismin, jäljessä annetuissa viljelmä-olosuhteissa tuottama entsyymi on solunulkoinen, ja siksi ei 25 ole tarpeen uuttaa entsyymiä, vaan ainoastaan konsentroida se .

Lisäksi mainitulla mikro-organismilla, koska se on bakteeri, on kaksinkertaistumisaika, joka on pienempi kuin homeilla ja Actinomycetesi1lä, ja tämä muodostaa merkityk-30 sellisen edun työskentelyssä.

Tämä mikro-organismi, joka on eristetty Tiberin rannan kasvimurskasta, on luokiteltu Achromobacter delica-tulus SM-1307:ksi ja on rekisteröity Northern Regional Centerissä, U.S. Department of Agriculture, Peoria (J 11) 3 5 numerolla N R R L . B . - 1 2.1.1 5 .

2 70924

Sen viljely-, morfologiset ja fysiologiset ominaisuudet on annettu seuraavassa:

A-VILJELY0M1NAISUUDET

1) Kiinteä kasvualusta 5 a) Ravinto-agarilla: 24 tunnin kasvatuksen jälkeen 30 ° C:ssa halkaisijaltaan 2 mmj^n bakteeripesäkkeitä, joissa on ehjät reunat, jotka seitsemän päivän seisoitamisen jälkeen pyrkivät kupruilemaan. Kuperia, ei täysin valkoisia pesäkkeitä, joilla kostea kermamainen konsistensio si, lievästi läpinäkyviä. Agar-alustal la ei pesäkkei den kasautumista.

b) Agar-hyytelöllä: kirkkaita, pehmeitä, hyyte 1ömäisiä pesäkkeitä.

2) Nestemäinen kasvualusta: 15 a) Suolainen lihaliemi + hiivauute: kermanväristä sa meutta, vähän sakkautumista.

b) Peptonoitu vesi: 24 tunnin jälkeen 30 °C:ssa selvästi sameutta. Sakkaa eikä pintakerroksen kuoria havaita.

B-M0RF0L0GISET OMINAISUUDET

20 1) Gram-negatiivinen sauva, keskimääräinen pituus 2 ^um.

2) Positiivinen liikkuvuus (riippuva pisara havaitaan).

3) Peritrikkinen cilia: Tiivistymistä navoilla ei havaita.

C-FYSI0L0GISET OMINAISUUDET

1) Optimikasvulämpötila 25-30 °C. Kasvaa hyvin 20 ^C:ssa.

25 ei kasvua 42° C:ssa.

2) Ei syövytä Agaria.

3) Ei tuota happoa eikä kaasua glukoosista.

4) Ei käytä hyödykseen ureaa.

5) Ei hallitse cytokromi-C oksidaasia.

30 6) Pelkistää nitraatit nitriiteiksi.

7) On inertti 0X/F -testissä.

8) Ei tuota tryptofaanista indolia.

9) Negatiivinen metyylipuna.

10) Positiivinen katalyysi.

35 11) Ei tuota happoa eikä kaasua laktoosista.

12) Nesteyttää gelatiinin.

13) Lakmus: vähäistä hapon muodostumista 7 päivän kuluttua.

Il 3 70924

Tunnistamistarkoituksiin käytettiin menetelmiä, jotka on esitetty kirjassa "Methods of Detection and Identification of Bacteria", B.M. M1TRUKA ja M.J. BONNFR, CRC PRESS INC., 1976 ja kirjassa Bergey ' s Manual of Determinative Bacteriology", 3 7. painos.

Tämän keksinnön mukainen laji voidaan kasvattaa anaerobisissa olosuhteissa veden alla kasvavana viljelmänä käyttäen ravistettavaa käymisastiaa.

Nestemäinen kasvualusta sisältää assimiloituvan hiilen, 10 typen ja mineraalisuolojen lähteen. Hii1ilähteet, joita voidaan käyttää , käsittävät aminohapot, glukoosin, oleiiniha-pon, linolihapon, kolesteroliesterit ja natriumasetaatin. Typ-pilähteet, joita voidaan käyttää, käsittävät orgaaniset ja epäorgaaniset typpiyhdisteet kuten lihauutteen, hiivauutteen, 13 peptonin, triptaanin, aminohapot, hydrolysoidun kaseiinin, soijajauheen, nitraatit ja NH+^:n suolat.

Sopivalla kasvualustalla on esimerkiksi seuraava koostumus :

Hi ivauute 1-3 g/1 20 Soijapulveri 1-5 g/1 k2hpo4 7

NaNO^, MgSO^ j pieniä määriä aina 1 g/1 asti

Viljelmän pH-alue vaihtelee 6:sta 8:aan, mieluiten 6,8:n ja 7,2:n välillä. lämpötila-alue 20 °C:n ja 30 nC:n 25 välillä, mieluiten 28 °C:n ja 32 °C:n välillä.

Entsyymiä tuotetaan lisäämällä kolesteryylioleaattia tai luonnollisia kasviöljyjä kasvualustaan ennen ymppäystä.

Induktioaika voi vaihdella 2 4 : s t a 72:een tuntiin, mieluiten 40:stä 48:aan tuntiin.

30 Käymisen aikana tai sen lopussa koottu elatusaine voi daan käyttää sellaisenaan.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää suodatetun tai sent-rifugoidun lihaliemen pinnalle nousevaa osaa.

Lopuksi, teknisiä ja taloudellisia lisäparannuksia 35 voidaan tehdä sitomalla entsyymi kombinaatioksi makromolekyy-listen yhdisteiden kanssa siten, että se muodostaa kemiallisia tai ionisia sidoksia sideaineen kanssa.

* 70924 Jäljessä annetut esimerkit kuvaavat tätä keksintöä koskevia käyttömenete Imiä.

Esimerkki 1

Valmistettiin elatusaine, jonka koostumus oli seuraa- 5 va:

NaNO-j 2 g/1 K2HP04 2 g/1 KC1 0,5 g/1

MgS04.7H20 0,5 g/1 10 Hiivauute 10 g/1

Kolesteryy1io1eaatti 5 g/1

Yllä mainitut yhdisteet lisättiin deionisoituun veteen. Mainitun elatusaineen pH säädettiin 7,0:ksi laimealla HCL:11 a . Täten valmistettu elatusaine jaetti in 250 ml:n 15 pulloihin, jokaiseen pulloon pantiin 50 ml e 1 atusaine11a; pullot oli steriloitu 116 °C:ssa 30 minuuttia.

Pullot ympättiin 1 ml:lla Achromobacter delicatulus SM 1307-lajia, joka saatiin huuhtomalla 10 ml :11a fysiologista liuosta 200 x 20 mm:n putkissa olevan 20 ml:n ravinto-20 agarin viljelmää, joka oli kasvanut 48 tuntia 30 °C:ssa.

Käymispu 1 loja pidettiin 30 °C:ssa pyörivässä ravistus-liikkeessä (180-200 r.p.m.).

Elatusaineet kerättiin 48 tunnin kuluttua ymppäykses-tä, ja niiden entsymaattinen aktiivisuus testattiin sellai-25 senaan. 1 ml elatusainetta sisälsi 0,2 entsyymiyksikköä.

Entsymaattinen aktiivisuus määritettiin seuraavalla tavalla: 1 ml elatusainetta, joka on sopivasti laimennettu 0,1 M fosfaattipuskuriin, pH 6,7, lisättiin 5 mlraan 0,3 ^umol 30 sisältävään kolesteryylioleaattiin 0,1 M fosfaattipuskuri-liuoksessa, jonka pH oli 6,7 ja joka sisälsi 0,5 % Triton X-100:a. Reaktio suoritettiin 37 °C:en vesihauteessa 10 minuutin ajan ravistellen ja pysäytettiin keittämällä reaktio-seoksesta otettuja näytteitä 3 minuuttia.

35 Kolesteryylioleaatista hydrolysoimalla valmistetun kolesterolin konsentraatio määritettiin kolorimetrisellä menetelmällä, jossa kolesterolioksidaasi hapettaa vapaan kolesterolin kolest-4-en-3-oniksi tuottaen samanaikaisesti vetyperoksidia, joka reagoi hapettavasti 4-aminoantipyriinin ja 5 70924 fenolin kanssa peroksidaasin läsnäollessa kehittäen väriaineen, jonka maksimiabsorptio on 500 nm:ssä.

Värillisten näytteiden optinen tiheys mitattiin DB-GT Beckmannin hilaspektrofotometrillä, jossa kyvetin optinen 5 leveys oli 1 cm, 500 nm:n aallonpituudella.

Jos yksikkö määritetään sinä määränä entsyymiä, joka tuottaa 1 yumol:n kolesterolia minuutissa edellä mainituissa testiolosuhteissa, entsyymiyksikköjen määrä ml:ssa elatus-ainetta lasketaan seuraavalla tavalla: 10 U 4 x 6 x (F10 - E0)

ml elatusainetta ” 5,45 x 0,1 x D

missä U = yksiköiden määrä ^10 = näytteen optinen tiheys hetkellä t = 10 min 15 Ep = näytteen optinen tiheys hetkellä t = 0 min 5,45 = 1 yumol/ml -vahvuisen koi estero1i1iuoksen optinen tiheys.

D = entsyymi 1aimennus.

Esimerkki 2 20 Valmistettiin elatusaine, jonka koostumus oli seuraava:

NaN03 2 g/1 K2HP03 2 g/1 KC1 0,5 g/1

MgS047H20 0,5 g/1 25 Hi ivauute 10 g/1

Oliiviöljy 5g/l

Yllä mainitut yhdisteet lisättiin deion.i soituun veteen ja säädettiin pH 6,7:ksi suolahapolla.

Achromobacter delicatulus SM 1307 -lajin viljelmät 30 mainitussa elatusaineessa ja valmistettuna kuten esimerkissä 1, pidettiin pyörivässä ravistusliikkeessä (180 r.p.m.) 30 n C : ssa.

Elatusliemet kerättiin 72 tunnin kuluttua ymppäyksestä ja niiden kolesteraasiaktiivisuus testattiin sellaisenaan.

35 1 ml elatusainetta sisälsi 0,4 entsyymiyk sikköä.

Esimerkki 3

Valmistettiin elatusaine, jonka koostumus oli sama kuin esimerkissä 2.

Achromobacter delicatulus SM 1307 -lajin viljelmät 6 70924 mainitussa elatusaineessa ja valmistettuna kuten esimerkissä 1, pidettiin pyörivässä ravistusliikkeessä (180 r.p.m.) 30 °C:ssa.

Elatusaineet kerättiin 72 tunnin kuluttua ymppäyksestä, 3 sentrifugoitiin ja pinnalle jääneen osan koiesteraasia käytettiin määritettäessä ihmisen veriseerumin kokonaiskolesterolia.

Tähän tarkoitukseen valmistetttiin seuraava reagenssi: Natriumkolaatti 6 mM

10 Triton X-100 15 g

Fenoli 7,5 mM

4-aminoantipyriini 0,5 mM

Peroksidaasi 16 400 U (Boehringer No luettelo sa 127361) 15 0V1 M natriumfos- faattipuskuri, pH 7,0 1000 ml

Kolesteroli määritettiin seurasvalla tavalla: 50 ^,ul ihmisen veriseerumia ja 0,25 ml e la t usa i ne t ta lisättiin 2,5 ml:aan reagenssia.

20 Reaktio tapahtui välittömästi lasikyvetissä , jonka optinen leveys oli 1 cm ja väriaineen kehittymistä seurattiin suoraa DB-GT Beckmannin hilaspektro fotometrissä aallonpituudella 500 nm, kunnes perumissa olevan kolesterolin konversio oli täydellinen.

25 Näissä plosuhteissa saavutettiin lopullinen optinen tiheys 0,500, mikä vastaa testatussa näytteessä kokonaiskolesterolia 164 mg/100 ml ihmisveren seerumi.

Claims (3)

70924 PATENTT IV/AAT IMUKSLT

1. Menetelmä kolesteraasin valmistamiseksi viljelemällä mikro-organismia hi i 1 i lähdettä , I yppi1ährie11ä ja r.ii-neraalisuoloja sisältävässä ravintoaineessa, t u n n e t -t u siitä, että mikro-organismina käytetään kon-5 taa Achromobacter delicatulus NRRL B—12315.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u s i i L ä , että mikro-organismia viljellään pH-arvossa, joka on 6:n ja B:n välillä, edullisesti 6,8:n ja 7,2:n välillä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n n e t t u s i i t ä , että mikro-organismia viljellään lämpötilassa, joka on 20 °C:n ja 37 °C:n välillä, edullisesti 28 °C:n ja 32 °C:n välillä.