DK148827B - Fremgangsmaade til fremstilling af cholesterolesterase samt fremgangsmaade til hydrolyse af cholesterolestere - Google Patents

Description

i 148827

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af enzymet cholesteroiesterase. (E.C.3.1.1.13) ved dyrkning af en mikroorganisme, samt hydrolyse af cholesterolestere af fede syrer under 5 anvendelse af enzymet.

Cholesterol, en essentiel komponent i den menneskelige organisme, er en grundbestanddel i opbygningen af cellemembraner i alle væv og er væsentligt ved fremstilling af talrige hormoner.

10 Som bekendt er bestemmelse af det totale chole- sterolindhold i blodet af stor betydning i den kliniske diagnose, og da cholesterol hovedsageligt er til stede i serum som estere med fede syrer, er enzymet dholesteroleste-rase nødvendigt for at frigøre cholesterolet, således 15 at mængden deraf kan bestemmes.

Kun få publikationer beskriver enzymatiske processer til hydrolyse af cholesterolestere under anvendelse af enzymer fra mikroorganismer af slægterne Fusarium, Nocardia, Pseudomonas, Saccharomyces og Strep-20 tomyces, idet enzymet fås fra animalsk væv.

Det har nu vist sig, at enzymet cholesterolesterase kan fremstilles ud fra en ny mikroorganisme, der er udvalgt af os og som hører til slægten Achromobacter.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen,der er af den 25 art, hvor cholesterolesterase fremstilles ved dyrkning af en mikroorganisme i et flydende kulturmedium indeholdende en cholesterolester eller en vegetabilsk olie,er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at mikroorganismen er Achromobacter delicatulus identificeret 30 med nummeret NRRL B-12115.

Det er en vigtig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at enzymet,der frembringes af denne mikroorganisme under de i det følgende beskrevne dyrkningsbetingelser, er exocellulært, hvorfor det ikke er nød-35 vendigt at ekstrahere det, men blot at koncentrere det.

Endvidere har nævnte mikroorganisme som følge af, at det er en bakterie,en fordoblingstid, der er mindre end, hvad gælder for svampe og Actinomyceter, 2 1A8827 og dette betegner en betydelig fordel ved den praktiske udøvelse.

Denne mikroorganisme/ der er isoleret fra vegetabilsk affald fra bredden af Tiber-floden, er klassifi-5 ceret som Achromobacter delicatulus,. og er deponeret hos Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria (J 11) under nummeret NRRL.

B.-12115.

Dens dyrkningsmæssige, morphologiske og fysiolo-10 giske egenskaber er anført nedenfor.

A. Dyrkningsegenskaber.

1) Fast medium: a) På næringsagar: kolonier med en diameter på 2 mm efter 24 timers inkubering ved 30°C, 15 med hele kanter, der har tendens til at bølge efter 7 døgns forløb. Konvekse, grå-hvide kolonier, der virker våde,har flødeagtig konsistens og er svagt gennemsigtige. Ingen sværmning på agarholdigt medium.

20 b) På agar-gelatine: lyse, bløde gelatinøse kolo nier.

2) Flydende medium: a) I salt kødsuppe + gærekstrakt: flødeagtig uklarhed med ringe sediment.

25 b) På peptoniseret vand: kraftig uklarhed efter 24 timer ved 30°C. Sediment og overfladefilm ikke synlig.

B. Morphologiske egenskaber.

1) Gramnegative stave med en gennemsnitslængde på 2 um.

30 2) Positiv mobilitet (observeret i hængende dråbe).

3) Peritriche cilier. Fortætning ved polerne ikke observeret .

C. Fysiologiske egenskaber.

1) Optimal væksttemperatur mellem 25° og 30°C. Gror 35 godt ved 20°C. Ingen vækst ved 42°C.

2) Angriber ikke agar.

3) Danner ikke syre eller gas af glucose.

4) Udnytter ikke urinstof.

148827 3 5) Besidder ikke cytochrom-C-oxidase.

6) Reducerer nitrater til nitriter.

7) Er indifferent ved OX/F-prøven.

8) Danner ikke indol ud fra tryptophan.

5 9) Methylrødt: negativ.

10) Positiv katalyse.

11) Danner ikke syre eller gas ud fra lactose.

12) Smelter gelatine.

13) Lakmusmælk: svag syrning efter 7 døgn.

10 De anvendte procedurer var de, der er angivet i "Methods of detection and identification of bacteria" af B.M. MITRUKA og M.J. BONNER, CRC PRESS INC. 1976, og i "Bergey Manual of Determinative Bacteriology" 7. udgave.

15 Den pågældende stamme kan dyrkes under aerobe betingelser ved submers kultur under anvendelse af omrørte gæringsbeholdere.

Et flydende kulturmedium indeholder en kilde for assimilerbar carbon, en nitrogenkilde samt mineral-20 salte. Carbonkilder, der kan anvendes omfatter aminosyrer, glucose, oliesyre, linolsyre, cholesterolestere og natriumacetat. Nitrogenkilder, der kan anvendes omfatter organiske og uorganiske nitrogenforbindelser så$om kødekstrakt, gærekstrakt, pepton, trypton, 25 aminosyrer, hydrolyseret casein, sojamel, nitrater og salte af NH^.

Et egnet dyrkningsmedium har f.eks. følgende sammensætning: Gærekstrakt 1-5 g/1 30 Sojamel 1-5 g/1 l^HPO^ fra spor op

NaN03, MgS04 til 1 g/1

Kulturmediets pH-værdi andrager mellem 6 og 8, fortrinsvis mellem 6,8 og 7,2. Temperaturområdet for 35 dyrkningen er mellem 20 og 37°C, fortrinsvis mellem 28 og 32°C.

148827 4

Enzymet dannes ved at sætte cholesteryloleat eller naturlige vegetabilske olier til kulturmediet før inoculeringen. Disse estere hydrolyseres i kulturmediet af den cholesterolesterase, der dannes af Achromobac-5 ter delicatulus NRRL B-12115.

Induktionstiden kan andrage fra 24 timer til 72 timer, fortrinsvis fra 40 timer til 48 timer.

Dyrkningsvæsken, der opsamles under eller ved afslutningen af dyrkningen kan anvendes som sådan. Al-10 ternativt,kan anvendes den væske, der fremkommer ved filtrering eller centrifugering af dyrkningsmediet.

Opfindelsen angår således yderligere en fremgangsmåde til hydrolyse af cholesterolestere af fede syrer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 15 man bringer esterne i kontakt med en dyrkningsvæske opnået ved dyrkning af Achromobacter delicatulus (NRRL B-12115) i et flydende kulturmedium indeholdende en cholesterolester eller en vegetabilsk olie.

Endelig kan der opnås en yderligere teknisk og 20 økonomisk forbedring ved at immobilisere enzymet ved kombination med makromolekylære forbindelser til dannelse af kemiske bindinger med matrixen eller til dannelse af ionbindinger.

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved 25 hjælp af eksempler.

Eksempel 1

Et dyrkningsmedium blev fremstillet med følgende sammensætning: 30 NaN03 2 g/1 K2HP04 2 g/1 KC1 0,5 g/1

MgS04.7H20 0,5 g/1 Gærekstrakt 10 g/1 35 Cholesteryloleat 5 g/1 idet de nævnte forbindelser blev sat til deioniseret vand.

148827 5 pH-Værdien blev indstillet til 7,0 med fortyndet HCl. Det således fremstillede medium blev fordelt i 250 ml kolber, idet der blev sat 50 ml væske til hver kolbe, hvorpå disse blev steriliseret ved 116°C i 30 5 minutter.

De blev inoculeret med 1 ml af en suspension af Achromobacter delicatulus NRRL B-12115 stammen opnået ved med 10 ml fysiologisk opløsning at vaske overfladen af en kultur på 20 ml næringsagar i 200 x 20 mm rør, 10 hvilken kultur havde været dyrket i 48 timer ved 30°C.

Dyrkningskolberne blev inkuberet under orbital-omrøring (180-200 omdrejninger pr. minut) ved 30°C.

Dyrkningsmedierne blev opsamlet 48 timer efter ino- culering og søm sådanne prøvet for enzymatisk aktivitet.

15 1 ml dyrkningsmedium indeholdt 0,2 enzymenheder.

Den enzymatiske virkning blev bestemt på følgende måde: 1 ml af dyrkningsmediet passende fortyndet i en 0,1 M phosphatstødpude med pH 6,7 blev sat til 5 ml af 20 en opløsning af cholesteryloleat indeholdende 0,3 ymol,M i en 0,1 M phosphatstødpude med pH 6,7 indeholdende 0,5%

Triton X-100. Man lod reaktionen forløbe ved 37°C i 10 minutter i et omrørt vandbad, og man standsede den ved at koge udtagne prøver fra reaktionsblandingen i 3 mi-25 nutter. Koncentrationen af cholesterolen, der var dannet ved hydrolyse af cholesteryloleat, blev bestemt ved den colorimetriske metode, ved hvilken det fri cholesterol oxideres af cholesteroloxidase til cholest-4-en- 3-on under samtidig dannelse af hydrogenperoxid, der 30 reagerer oxidativt med 4-aminoantipyrin og phenol under tilstedeværelse af peroxidase til udvikling af et chro-mogen, der har maksimal absorption ved 500 my.

Den optiske tæthed af de farvede prøver blev målt i et DB-GT Beckmann gitterspektrofotometer ved 35 en bølgelængde på 500 my under anvendelse af cuvetter med en optisk bane på 0,1 dm.

148827 6

Hvis en enhed defineres som den enzymmængde, der frembringer 1 ymol cholesterol pr. minut under de ovenfor anførte prøvebetingelser, beregnes antallet af enzymenheder pr. ml dyrkningsvæske efter følgende formel; 5 _P = 4 x 6 x (E10“Eo)

ml dyrkningsvæske 5,45 x 0,1 x D

hvori ; =10 = optisk tæthed af prøven udtaget efter 10 minutter Eq = optisk tæthed af prøven udtaget efter 0 minutter 10 5,45 = optisk tæthed af en cholesterolopløsning med 1 ymol/ml D = enzymfortynding.

Eksempel 2 15 En dyrkningsvæske blev fremstillet med følgende sammensætning s

NaN03 2 g/1 K2HP04 2 g/1 KC1 0,5 g/1 20 MgS04.7H20 0,5 g/1 Gærekstrakt 10 g/1

Olivenolie 5 g/1 ved at sætte de nævnte forbindelser til deioniseret vand og indstille pH-værdien til 6,7 med saltsyre.

25 Kulturer af Achromobacter delicatulus NBRL B ί?Π5 staranen i denne næringsvæske behandlet som i eksempel 1, blev inkuberet under orbital omrøring (180 omdrejninger pr. minut) ved 30°C.

Kulturvæskerne blev opsamlet 72 timer efter in-30 oculering og son sådan prøvet for cholesterasevirkningen.

1 ml kulturvæske indeholdt 0,4 enzymenheder.

Eksempel 3

Der blev fremstillet et kulturmedium med den i 35 eksempel 2 anførte sammensætning.

148827 7

Kulturer af Achromobacter delicatulus NRRL B 12115 stammen i dette medium, og behandlet som i eksempel 1, blev inkuberet under orbital omrøring (180 omdrejninger pr. minut) ved 30°C.

5 Dyrkningsvæskerne blev opsamlet 72 timer efter inoculering, centrifugeret og cholesterasen i væskefasen blev anvendt til at bestemme den totale mængde cholesterol, der var til stede i en prøve humant blodserum.

10 Til dette formål blev fremstillet følgende rea gens:

Natriumcholat 6 mM

Triton X-100 15 g

Phenol 7,5 mM

15 4-aminoantipyrin 0,5 mM

Peroxidase 16.400 U (Boehringer katalog No. 127361) 0,1 M natriumphosphatstødpude, pH 7,0 1000 ml 20 Cholesterolen blev bestemt på følgende måde: 50 yl human serum og 0,25 ml kulturvæske blev sat til 2,5 ml reagens.

Reaktionen skete direkte i glascuvetten, der havde en optisk bane på 1 cm, og udviklingen af chromo-25 genet blev fulgt direkte i et DB-GT Beckmann gitterspek-rofotometer ved en bølgelængde på 500 my, indtil der var sket fuldstændig omdannelse af det i serumet tilstedeværende cholesterol.

Under disse betingelser blev opnået en sluttelig 30 optisk tæthed på 0,500 svarende til 164 mg totalt cholesterol pr. 100 ml human serum, der var undersøgt.