JPS61128887A - ペルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
ペルオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS61128887A JPS61128887A JP59250900A JP25090084A JPS61128887A JP S61128887 A JPS61128887 A JP S61128887A JP 59250900 A JP59250900 A JP 59250900A JP 25090084 A JP25090084 A JP 25090084A JP S61128887 A JPS61128887 A JP S61128887A
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- Japan
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- culture
- enzyme
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- coprinus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はペルオキシダーゼの製造法に関する。
さらに詳しくは担子菌を培養して、その培養物よりペル
オキシダーゼを製造する方法に関する。
オキシダーゼを製造する方法に関する。
従来の技術
ペルオキシダーゼは一般に植物界に広く存在しており、
特に西洋ワサビ、イチジクおよび大根等に多く含まれて
いる。現在では西洋ワサビ根部のペルオキシダーゼ含量
か最も高いなどの理由により、西洋ワサビよりペルオキ
シダーゼか工業生産され、臨床診断試薬、例えば各酸化
酵素と併用して血清中のグルコース、総コレスチロール
などの定量にあるいは酵素免疫測定法における標識酵素
として幅広く用いられている。
特に西洋ワサビ、イチジクおよび大根等に多く含まれて
いる。現在では西洋ワサビ根部のペルオキシダーゼ含量
か最も高いなどの理由により、西洋ワサビよりペルオキ
シダーゼか工業生産され、臨床診断試薬、例えば各酸化
酵素と併用して血清中のグルコース、総コレスチロール
などの定量にあるいは酵素免疫測定法における標識酵素
として幅広く用いられている。
また、微生物起源のペルオキシダーゼとしては細菌およ
び糸状菌の生産するチトクロームＣペルオキシダーゼや
ＮＡＤＨペルオキシダーゼ等があるか、これらは西洋ワ
サビなどの植物起源のペルオキシダーゼとは作用が異な
り、臨床診断試薬としては利用できない。
び糸状菌の生産するチトクロームＣペルオキシダーゼや
ＮＡＤＨペルオキシダーゼ等があるか、これらは西洋ワ
サビなどの植物起源のペルオキシダーゼとは作用が異な
り、臨床診断試薬としては利用できない。
最近、アルタナリア属、コクリオポラス属、ベリキュラ
リア属、カープラリア属（特開昭５７−９９１９２号）
およびバチルス属（特開昭５８−１７９４８８号）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なペルオキシダ
ーゼを生産するとの報告がなされた。しかし、これらの
菌株のペルオキシダーゼ生産量は少なく、工業生産には
不利である。
リア属、カープラリア属（特開昭５７−９９１９２号）
およびバチルス属（特開昭５８−１７９４８８号）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なペルオキシダ
ーゼを生産するとの報告がなされた。しかし、これらの
菌株のペルオキシダーゼ生産量は少なく、工業生産には
不利である。
発明が解決しようとする間頴点
本発明者らは、上記現状に錯み担子菌の生産するペルオ
キシダーゼについて鋭意検討を重ねた結果、ある棹の担
子菌か培養物中に臨床診断試薬として使用Ｑ１能な優れ
た性質を有するペルオキシダーゼ、を著Ｍ生、竹するこ
とを見出！・本発明゛を完成した。従って本発明の目的
は担子菌を培養して、′臨床診断試薬として使用可能な
ペルオキシダーゼを下葉的に安価に製造する方法を提供
、することにある。
キシダーゼについて鋭意検討を重ねた結果、ある棹の担
子菌か培養物中に臨床診断試薬として使用Ｑ１能な優れ
た性質を有するペルオキシダーゼ、を著Ｍ生、竹するこ
とを見出！・本発明゛を完成した。従って本発明の目的
は担子菌を培養して、′臨床診断試薬として使用可能な
ペルオキシダーゼを下葉的に安価に製造する方法を提供
、することにある。
間頴点を解決するための手段
本発明をＩＩ既ＲＱすれば、本発明はペルオキシダーゼ
のＭｉ法に関するものであって、ヒトヨタケ属に属し、
ペルオキシダーゼ生産能を有する担子菌を培養し、培養
物からペルオキシダーゼを採取することからなる。
のＭｉ法に関するものであって、ヒトヨタケ属に属し、
ペルオキシダーゼ生産能を有する担子菌を培養し、培養
物からペルオキシダーゼを採取することからなる。
本発明方法で得られるペルオキシダーゼは過酸化水素の
存任下、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略す
）−フェノール系、４−ＡＡ−ジメチルアニリン糸、４
−ＡＡ−Ｎ−エチル−Ｎ−ハイＦロキシエチルーｍ−）
ルイジン（以下順と略す）系および３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下ＭＢＴＨと略す）−
ジメチルアニリン系などを水素供与体として発色する故
四床診断試薬として使用可能である。
存任下、４−アミノアンチピリン（以下４−ＡＡと略す
）−フェノール系、４−ＡＡ−ジメチルアニリン糸、４
−ＡＡ−Ｎ−エチル−Ｎ−ハイＦロキシエチルーｍ−）
ルイジン（以下順と略す）系および３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下ＭＢＴＨと略す）−
ジメチルアニリン系などを水素供与体として発色する故
四床診断試薬として使用可能である。
本発明に使用される１！１子閑には、ヒトヨタケ科（０
ｏｐｒｉｎａｃｅａｅ ）ヒトヨタケ属（０ｏｐｒｉｎ
ｕｓ）に属する菌株、例えばコプリナス・マクロリーザ
スＫ −１３３Ｑ （０ｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｏｒｏｒ
、ｈｌｚｕｓ 、和名ネナガノヒトヨタケ）がある。こ
の菌株は工業技術院微生物工業技術（ｉｆｆ究所に微工
研条寄第６４８号として奇託しである。
ｏｐｒｉｎａｃｅａｅ ）ヒトヨタケ属（０ｏｐｒｉｎ
ｕｓ）に属する菌株、例えばコプリナス・マクロリーザ
スＫ −１３３Ｑ （０ｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｏｒｏｒ
、ｈｌｚｕｓ 、和名ネナガノヒトヨタケ）がある。こ
の菌株は工業技術院微生物工業技術（ｉｆｆ究所に微工
研条寄第６４８号として奇託しである。
本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、ペルオキシダーゼを生産す
るものであればよく、炭素源としては例えばグルコース
、デンプン、シュクロース、マルトース、ラクトース、
グリセロール、デキストリン、油脂バ１などか利用でき
、窒素源としてはｆｌｌｄエキス、ペプトン、脱脂大υ
、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である。
源は使用する菌株が利用し、ペルオキシダーゼを生産す
るものであればよく、炭素源としては例えばグルコース
、デンプン、シュクロース、マルトース、ラクトース、
グリセロール、デキストリン、油脂バ１などか利用でき
、窒素源としてはｆｌｌｄエキス、ペプトン、脱脂大υ
、コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である。
その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの
無機質および金属塩ｈ″１を加えてもよく、更にはビタ
ミン類、生長促進因子を加えてもよい。
無機質および金属塩ｈ″１を加えてもよく、更にはビタ
ミン類、生長促進因子を加えてもよい。
担子菌を培養する。にあたり、ペルオキシダーゼの生産
ははｔｉ！−ｆＪ条件により太き（変動するが、一般に
培養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、４
〜１２日間の通気攪拌培養でペルオキシダーゼの生産は
最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成など
に応じ、ペルオキシダーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然である。本発明の菌株によって生成さ
れたベルオ、キシダーゼは主に培養ｆ液中にあり１、培
養ｆ液に沈澱剤例えば硫安を２０〜８０ ｗ／ｖ％加え
ることにより、・あるいは有機溶媒例えはアルコール、
アセトンなどを５０〜８０ｖ／ｖ％加えるこ・とによ、
り沈澱として分離される。得られた沈澱物を限外１．過
、透析あるいはセファデックス処理などによって脱塩し
、粗酵素液を得る。得られた粗酵素液を精製するには、
予め０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（、ｐＨ７，０、）で緩
衝化したＤｌＣＡＩＣ−＋ ７７ Ｃ１−ス（ＯＬ −
６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸着さ、せ、吸着物を０．
０２−Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性区分を集
める。次にこの活性区分を限外１過で濃縮、脱塩後、０
．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤ
Ｂ！ＡＦｔ−セファロース（ＯＬ−６Ｂ）のカラムに再
び吸着させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ
７，Ｏ）で洗浄後、０、０５ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で溶出して活性区分を集める。この活性区分を蒸
留水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素粉末を得る。この
酵素粉末はポリアクリルアミＶゲルディスク電気泳動的
に単＝である。
ははｔｉ！−ｆＪ条件により太き（変動するが、一般に
培養温度は２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、４
〜１２日間の通気攪拌培養でペルオキシダーゼの生産は
最高に達する。培養条件は使用する菌株、培地組成など
に応じ、ペルオキシダーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然である。本発明の菌株によって生成さ
れたベルオ、キシダーゼは主に培養ｆ液中にあり１、培
養ｆ液に沈澱剤例えば硫安を２０〜８０ ｗ／ｖ％加え
ることにより、・あるいは有機溶媒例えはアルコール、
アセトンなどを５０〜８０ｖ／ｖ％加えるこ・とによ、
り沈澱として分離される。得られた沈澱物を限外１．過
、透析あるいはセファデックス処理などによって脱塩し
、粗酵素液を得る。得られた粗酵素液を精製するには、
予め０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（、ｐＨ７，０、）で緩
衝化したＤｌＣＡＩＣ−＋ ７７ Ｃ１−ス（ＯＬ −
６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸着さ、せ、吸着物を０．
０２−Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性区分を集
める。次にこの活性区分を限外１過で濃縮、脱塩後、０
．０１Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤ
Ｂ！ＡＦｔ−セファロース（ＯＬ−６Ｂ）のカラムに再
び吸着させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（Ｉ）Ｈ
７，Ｏ）で洗浄後、０、０５ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で溶出して活性区分を集める。この活性区分を蒸
留水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素粉末を得る。この
酵素粉末はポリアクリルアミＶゲルディスク電気泳動的
に単＝である。
本発明のペルオキシダーゼの酵素化学的および理化学的
性質は次のとおりである。
性質は次のとおりである。
（１）作用：
本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体となりつる化合物の酸化
を触媒する。その作用機構は以下に示すとおりである。
素の存在下で種々の水素供与体となりつる化合物の酸化
を触媒する。その作用機構は以下に示すとおりである。
・・Ｈ虞Ｏｍ＋ＡＨ１→２Ｈ，０，−１−、Ａなお
、ＡＨ，は水素供与体を、Ａは酸化された水素供与体を
示す。
、ＡＨ，は水素供与体を、Ａは酸化された水素供与体を
示す。
（２）水素供与体に対する特異性：
４−’ＡＡと種々の化合物を組合せて水素供与体として
用いた場合に不酵素の水素供与体に対する特異性につい
て検、討した（第１表）。
用いた場合に不酵素の水素供与体に対する特異性につい
て検、討した（第１表）。
第１表
レゾルシン １
０ピロカテコール
５８ヒドロキノン
１０α−ナフトール
１８２．４−ジブロムフエ
５２０ 、 ４７ノール。
０ピロカテコール
５８ヒドロキノン
１０α−ナフトール
１８２．４−ジブロムフエ
５２０ 、 ４７ノール。
２．４．−ジクロロフエ Ｉ−ｉ、１５ノー
ル ２．６−シクロロフエ
１５４ノ一ノ、し ２．４．６−）リクロロ ｌ
９６フエノール ジエチルアニリン ゛ ５５’０
’２１ジエチノげシリン ′ ｌ
４９ｘａｕＴ ” ’ｙ’
” ６２また、ＭＢＴＨとジメチルアニリン、ジ
エチルアニリンあるいはＥＨＭＴを組合せて水素供与体
とした場合の特異性について検討した（第２表）。なお
、対照として４−ＡＡ−フェノールを水素供与体とした
場合の相対値を１．００とした。
−＠ ２ 表 ジエチルアニリン
４９ｇｕＭＴ ’
４’１（４−ＡＡ−フェノー
ル ５００ １００ ）（３）至適ｐＨ
およびｐＨ安定性： 一本酵素の至適ｐＨ
は第１図のグラフで表わされる如＜、ｐＨ７，０′行近
に高い活性を有している。ｐＨ−３〜３５は酢′酸ｉ衝
液、ｐＨ６〜８，５はリン酸緩衝液、ｐＨ９〜９．５は
ホウ酸緩補液を゛使用した。本酵素を３７℃においてそ
れぞれのｐＨで１０分間処理したときのｐＨ安定性を第
２図に示した。第２図より明らかなように本酵素はｐＨ
６，、Ｏ〜ｐＨ７，５の間で安定で、ある。
ル ２．６−シクロロフエ
１５４ノ一ノ、し ２．４．６−）リクロロ ｌ
９６フエノール ジエチルアニリン ゛ ５５’０
’２１ジエチノげシリン ′ ｌ
４９ｘａｕＴ ” ’ｙ’
” ６２また、ＭＢＴＨとジメチルアニリン、ジ
エチルアニリンあるいはＥＨＭＴを組合せて水素供与体
とした場合の特異性について検討した（第２表）。なお
、対照として４−ＡＡ−フェノールを水素供与体とした
場合の相対値を１．００とした。
−＠ ２ 表 ジエチルアニリン
４９ｇｕＭＴ ’
４’１（４−ＡＡ−フェノー
ル ５００ １００ ）（３）至適ｐＨ
およびｐＨ安定性： 一本酵素の至適ｐＨ
は第１図のグラフで表わされる如＜、ｐＨ７，０′行近
に高い活性を有している。ｐＨ−３〜３５は酢′酸ｉ衝
液、ｐＨ６〜８，５はリン酸緩衝液、ｐＨ９〜９．５は
ホウ酸緩補液を゛使用した。本酵素を３７℃においてそ
れぞれのｐＨで１０分間処理したときのｐＨ安定性を第
２図に示した。第２図より明らかなように本酵素はｐＨ
６，、Ｏ〜ｐＨ７，５の間で安定で、ある。
（４）至適温度および熱安定、性： ・本酵素の
至適温度は第３図のグラフで表わ５される如、く、３５
℃〜４０℃付近に至適温度を有している。本酵素をｐＨ
７，Ｏにおいてそれぞれの温度で１０分間処理したとき
の熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５℃まで安定
であった。
至適温度は第３図のグラフで表わ５される如、く、３５
℃〜４０℃付近に至適温度を有している。本酵素をｐＨ
７，Ｏにおいてそれぞれの温度で１０分間処理したとき
の熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５℃まで安定
であった。
（５）分子量：
本酵素の分子量は、セファクリルＳ−２００（）乙ルマ
シア製）によるゲルｅ過法、では約３７０００であり、
５ＤＳ−ボリアクリルア、ミドゲ、ル電気泳動法では約
４．１０００であった。
シア製）によるゲルｅ過法、では約３７０００であり、
５ＤＳ−ボリアクリルア、ミドゲ、ル電気泳動法では約
４．１０００であった。
（６）均一性：
７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ９，４）を用い
てディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したところ
１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示し
た。
てディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したところ
１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示し
た。
を男 ＃徊す ＋にニー
ファルマライト（ｐＨ３〜１０．ファルマシア＠）を用
いた焦点電気泳動法により８求めた本酵素の等電点はｐ
工＝３，４〜３．５であった。
いた焦点電気泳動法により８求めた本酵素の等電点はｐ
工＝３，４〜３．５であった。
（８）■害剤、金属イオン、金属キレート剤の影響二本
酵素は、、Ｈｇ 、ンアン化カリウ、ム、アジア化ナ
トリウム、チオウレアなどによって阻害された（第３表
）。
酵素は、、Ｈｇ 、ンアン化カリウ、ム、アジア化ナ
トリウム、チオウレアなどによって阻害された（第３表
）。
Ｌ−システィン １０５ ＥＤＴＡ
９７ ”ジチオスレイト−／ｌ／ ９５
．、 ０ｕＳＯ４’ １０５チオウレア 、
、５７ Ｍｎ０１１８．ａシアン化カリウム
ｙｅａｌｍ 、 ＩＱ、７、アジ
化ナトリウム ５２ Ｂａ１ｌ！
９６フツ化ナトリウム １０３ ５ｎＣ１
１’ｌ ９２ ”硫化ナトリウム、
、８２ Ｈｌｓｏ、、９２ 、α、／Ｐ ’
−ジピリジル １０３Ｈ１０３Ｈ６゜０−フェナン
スロリン ８８ （９）可視部吸収スペクトル： このスペクトルを第５図に示す。
９７ ”ジチオスレイト−／ｌ／ ９５
．、 ０ｕＳＯ４’ １０５チオウレア 、
、５７ Ｍｎ０１１８．ａシアン化カリウム
ｙｅａｌｍ 、 ＩＱ、７、アジ
化ナトリウム ５２ Ｂａ１ｌ！
９６フツ化ナトリウム １０３ ５ｎＣ１
１’ｌ ９２ ”硫化ナトリウム、
、８２ Ｈｌｓｏ、、９２ 、α、／Ｐ ’
−ジピリジル １０３Ｈ１０３Ｈ６゜０−フェナン
スロリン ８８ （９）可視部吸収スペクトル： このスペクトルを第５図に示す。
（１０）酵素活性測定法：
ペルオキシダーゼ活性の測定は水素供与体として臨床診
断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノール系を用いて行
なった。１１ち、５ｍＭ過酸化水素溶液０．１ ｍｌ、
’ ０．３ ’Ｍ リン酸綴剣液（ｐＨ７，０） １．
０ ｍｌ、 ２４．６ｍＭ４−ＡＡ溶液０．１ ｍ、
０４２Ｍフェノール溶液０．１ ｍｌ、水１．６−およ
び適当に希釈した酵素液０１−１反応液敏３、 ＯＴｎ
ｌで３７℃、６０秒間反応させた後５００ｎｍの吸光度
ＣＯＤサンプル）を測定する。別に対照として過酸化水
素浴液の代わりに水を０．１−加え、同様の操作によっ
て吸光Ｋ （、ＯＤブランク）を測定し、△０Ｄａｏｏ
（ＯＤサンプル−〇Ｄブランク）を求めた。ペルオキ
シダーゼ活性は下記の計算式によって求められる。
断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノール系を用いて行
なった。１１ち、５ｍＭ過酸化水素溶液０．１ ｍｌ、
’ ０．３ ’Ｍ リン酸綴剣液（ｐＨ７，０） １．
０ ｍｌ、 ２４．６ｍＭ４−ＡＡ溶液０．１ ｍ、
０４２Ｍフェノール溶液０．１ ｍｌ、水１．６−およ
び適当に希釈した酵素液０１−１反応液敏３、 ＯＴｎ
ｌで３７℃、６０秒間反応させた後５００ｎｍの吸光度
ＣＯＤサンプル）を測定する。別に対照として過酸化水
素浴液の代わりに水を０．１−加え、同様の操作によっ
て吸光Ｋ （、ＯＤブランク）を測定し、△０Ｄａｏｏ
（ＯＤサンプル−〇Ｄブランク）を求めた。ペルオキ
シダーゼ活性は下記の計算式によって求められる。
△０Ｄｉｏｏ （ＯＤサンプル−〇Ｄブランク）ＸＶｔ
Ｘｄｆ＝△０ＤｉｏｏＸ ４．８６ Ｘ ｄｆｄｆ：希
釈率 実施例 以下１こ本発明によるペルオキシダーゼの製造方法を実
施例をもって示すか、本発明か以下の実施例に限定され
るものではない。
Ｘｄｆ＝△０ＤｉｏｏＸ ４．８６ Ｘ ｄｆｄｆ：希
釈率 実施例 以下１こ本発明によるペルオキシダーゼの製造方法を実
施例をもって示すか、本発明か以下の実施例に限定され
るものではない。
実施例 １
グルコース２％、エビオス０．５％および４天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面培地にコプリナス・マク
ロリーザスｘ−１３３０（微工研条寄第６４８号）を接
種し、２５℃にて１週間静置培養して種菌とした。グル
コース２％、酵母エキス０３％、ペプトン１％、ＫＨ１
ＰＯ４０，３％、およびＭｇＳＯ４・７ａ、ｏ Ｏ，１
％の組成の培地１００ｍを５００−容の三角フラスコに
分注し、１２０℃で２０分間殺菌後、冷却し、これに上
記の種菌をかきとり接種して、２７℃で１゛０日間、毎
分１ｏ ｏ ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後１過し
て菌体を除き、ｒ液を得た。このペルオキシダーゼ活性
は２０．０単位／ ｍｅであった。
（エビオス培地）の組成の斜面培地にコプリナス・マク
ロリーザスｘ−１３３０（微工研条寄第６４８号）を接
種し、２５℃にて１週間静置培養して種菌とした。グル
コース２％、酵母エキス０３％、ペプトン１％、ＫＨ１
ＰＯ４０，３％、およびＭｇＳＯ４・７ａ、ｏ Ｏ，１
％の組成の培地１００ｍを５００−容の三角フラスコに
分注し、１２０℃で２０分間殺菌後、冷却し、これに上
記の種菌をかきとり接種して、２７℃で１゛０日間、毎
分１ｏ ｏ ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後１過し
て菌体を除き、ｒ液を得た。このペルオキシダーゼ活性
は２０．０単位／ ｍｅであった。
実施例 ２
実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスＫ −’１３．３０ （ｅｆｔ工研条寄第６４
８号）をグルコース２％、酵母エキス０．３％、ペプト
ン１％、ＫＨ２ＰＯａ ０．３ ％およびＭｇ５Ｏ，ａ
７Ｈｚ０ ０．１％の培地１００−を分注して殺菌（１
２，０℃、２０分間） Ｌ タ５００ ＝容ノ三角フラ
スコに接種し、２６℃で７日間培養して、種培養液とし
た。グルコース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１
％、ＫＨ，ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４＠７Ｈｔ（ｌ
Ｑ、１％、０ｕＳＯ４ｅ ５ ＨＩＯＱ、００５％お
よび消泡剤（日本油脂社＠ ０Ｂ−４４２） ０．０２
％の組成の培地２０１を３０１容のジャーファーメンタ
−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。
リーザスＫ −’１３．３０ （ｅｆｔ工研条寄第６４
８号）をグルコース２％、酵母エキス０．３％、ペプト
ン１％、ＫＨ２ＰＯａ ０．３ ％およびＭｇ５Ｏ，ａ
７Ｈｚ０ ０．１％の培地１００−を分注して殺菌（１
２，０℃、２０分間） Ｌ タ５００ ＝容ノ三角フラ
スコに接種し、２６℃で７日間培養して、種培養液とし
た。グルコース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１
％、ＫＨ，ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４＠７Ｈｔ（ｌ
Ｑ、１％、０ｕＳＯ４ｅ ５ ＨＩＯＱ、００５％お
よび消泡剤（日本油脂社＠ ０Ｂ−４４２） ０．０２
％の組成の培地２０１を３０１容のジャーファーメンタ
−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。
冷却後上記の種培ＩＩ液１００ゴを接種し、２６℃で６
日間、毎分１３１の通気速度と毎分２７０回転の攪拌速
度の条件下で培養した。培養終了後、濾過して菌体を除
き、ｅ液を得た。このペルオキシダーゼ活性は４１．５
単位／−であった。
日間、毎分１３１の通気速度と毎分２７０回転の攪拌速
度の条件下で培養した。培養終了後、濾過して菌体を除
き、ｅ液を得た。このペルオキシダーゼ活性は４１．５
単位／−であった。
この培養ｒ液１７ｔに硫酸アンモニウムを８０％飽和に
なるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈澱物を約
５００ｒｎｌの０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ＴｉＨ２，
０）に溶解した。この粗酵素液を限外濾過で濃縮し、脱
塩後、予め０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
緩衝化したＤ１ｎＡ１！！−セファロース（ＯＬ−６Ｂ
）のカラム（直径５．０口×長さ４ Ｃ１１）に吸着さ
せ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ）！７．０）
で洗浄後、０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で溶出して活性区分を集めた。次にこの活性区分を限外
濾過で濃縮し、脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（Ｔｉ
Ｈ７，０）で緩衝化したｌ１ＫＡＩＩ！−セファロース
（ＯＬ−６Ｂ）のカラム（直径２．５ ａｍ Ｘ長さ４
ａｉ ）に再び吸着させ、吸着物を０．０２ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０、０５ Ｍリン酸
緩衝液（ＰＨ７，０）で溶出して活性区分を集めた。こ
の活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素粉
末４９４■を得た。
なるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈澱物を約
５００ｒｎｌの０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ＴｉＨ２，
０）に溶解した。この粗酵素液を限外濾過で濃縮し、脱
塩後、予め０．ＯＩＭ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
緩衝化したＤ１ｎＡ１！！−セファロース（ＯＬ−６Ｂ
）のカラム（直径５．０口×長さ４ Ｃ１１）に吸着さ
せ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ）！７．０）
で洗浄後、０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
で溶出して活性区分を集めた。次にこの活性区分を限外
濾過で濃縮し、脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（Ｔｉ
Ｈ７，０）で緩衝化したｌ１ＫＡＩＩ！−セファロース
（ＯＬ−６Ｂ）のカラム（直径２．５ ａｍ Ｘ長さ４
ａｉ ）に再び吸着させ、吸着物を０．０２ Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０、０５ Ｍリン酸
緩衝液（ＰＨ７，０）で溶出して活性区分を集めた。こ
の活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥し、精製酵素粉
末４９４■を得た。
この粉末の比活性は１１８０単位／＋＋ｙであった。
この酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳
動的に単一であった。以上の精製工程を第４表に示す。
動的に単一であった。以上の精製工程を第４表に示す。
培養１液 ２３’７５００ ７０７０００ ２．９
８ １００硫安塩析 ４１２００ ７２４０００
１７．６ １０２限外１過 １’７０００
’７０３０００ ４１．４ ９９．４１回目Ｄｌｌｎ−
セファ １４４０ ６９９０００ ４Ｂ５ ９８
．９０−ス（ＯＬ −６Ｂ） ２回目ＤＩＫ−セフ７ ４９４ ５８３０００
１１８０ ８２．５０−ス（ＯＬ −ｆ）Ｂ） 開明の効果 本発明により臨床診断試薬として有用なペルオキシダー
ゼの新たな工業的生産に適した製造法が提供された。
８ １００硫安塩析 ４１２００ ７２４０００
１７．６ １０２限外１過 １’７０００
’７０３０００ ４１．４ ９９．４１回目Ｄｌｌｎ−
セファ １４４０ ６９９０００ ４Ｂ５ ９８
．９０−ス（ＯＬ −６Ｂ） ２回目ＤＩＫ−セフ７ ４９４ ５８３０００
１１８０ ８２．５０−ス（ＯＬ −ｆ）Ｂ） 開明の効果 本発明により臨床診断試薬として有用なペルオキシダー
ゼの新たな工業的生産に適した製造法が提供された。
第１図は本発明により得られるペルオキシダーゼのｐＨ
と活性の関係を表わす。第２図は本発明による酵素を３
７°Ｃ１こおいてそれぞれのｐＨで６０分間処理した後
のｐＨと活性の関係を表わし、第３図は温度と活性の関
係を表わし、第４１ΔはｐＨ７，０においてそれぞれの
温度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わす
。第５図は本発明による酵素の可視部吸収スペクトル（
酵素濃度０．０５７％、ｐＨ７，０）を表わす。
と活性の関係を表わす。第２図は本発明による酵素を３
７°Ｃ１こおいてそれぞれのｐＨで６０分間処理した後
のｐＨと活性の関係を表わし、第３図は温度と活性の関
係を表わし、第４１ΔはｐＨ７，０においてそれぞれの
温度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わす
。第５図は本発明による酵素の可視部吸収スペクトル（
酵素濃度０．０５７％、ｐＨ７，０）を表わす。
Claims (1)
- １、ヒトヨタケ属に属するペルオキシダーゼ生産菌を培
養し、培養物よりペルオキシダーゼを採取することを特
徴とするペルオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59250900A JPS61128887A (ja) | 1984-11-28 | 1984-11-28 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| US06/792,731 US4698306A (en) | 1984-11-28 | 1985-10-28 | Process for producing peroxidase |
| DE19853541242 DE3541242A1 (de) | 1984-11-28 | 1985-11-21 | Verfahren zur herstellung von peroxidase |
| GB08529159A GB2167421B (en) | 1984-11-28 | 1985-11-27 | Process for producing peroxidase |
| FR8517528A FR2573771B1 (fr) | 1984-11-28 | 1985-11-27 | Procede de production de peroxydase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59250900A JPS61128887A (ja) | 1984-11-28 | 1984-11-28 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128887A true JPS61128887A (ja) | 1986-06-16 |
Family
ID=17214697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59250900A Pending JPS61128887A (ja) | 1984-11-28 | 1984-11-28 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4698306A (ja) |
| JP (1) | JPS61128887A (ja) |
| DE (1) | DE3541242A1 (ja) |
| FR (1) | FR2573771B1 (ja) |
| GB (1) | GB2167421B (ja) |
Families Citing this family (9)
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|---|---|---|---|---|
| JPS61104784A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-23 | Suntory Ltd | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS61254189A (ja) * | 1985-05-02 | 1986-11-11 | Nissin Food Prod Co Ltd | パ−オキシダ−ゼの製造法 |
| JP2528457B2 (ja) * | 1987-03-09 | 1996-08-28 | サントリー株式会社 | 過酸化水素の定量法 |
| US4992372A (en) * | 1989-02-02 | 1991-02-12 | Pokora Alexander R | Method for removing impurities from peroxidase solutions |
| US5273896A (en) * | 1989-10-13 | 1993-12-28 | Novo Nordisk A/S | Hemopeptide having peroxidase activity for bleaching dyes |
| US5728550A (en) * | 1990-01-15 | 1998-03-17 | Phytera, Inc. | Peroxidase production |
| US5112752A (en) * | 1990-10-18 | 1992-05-12 | The Mead Corporation | Biocatalytic oxidation using soybean and other legume peroxidases |
| US5491085A (en) * | 1991-05-14 | 1996-02-13 | Enzymol International, Inc. | Method of recovering peroxidase from seed hulls using a freeze-thaw technique |
| CA2175047A1 (en) * | 1993-10-26 | 1995-05-04 | Carsten Sjýholm | Myxococcaceae peroxidase |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55135589A (en) * | 1979-04-11 | 1980-10-22 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | Preparation of peroxidase |
| US4328312A (en) * | 1979-04-11 | 1982-05-04 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for production of peroxidase |
| JPS6013668B2 (ja) * | 1980-09-25 | 1985-04-09 | 協和醗酵工業株式会社 | グルタチオン・パ−オキシダ−ゼの製造法 |
| JPS585035B2 (ja) * | 1980-12-11 | 1983-01-28 | 上田化学工業株式会社 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS6013670B2 (ja) * | 1983-03-28 | 1985-04-09 | 大阪市 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS61104784A (ja) * | 1984-10-26 | 1986-05-23 | Suntory Ltd | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS61254189A (ja) * | 1985-05-02 | 1986-11-11 | Nissin Food Prod Co Ltd | パ−オキシダ−ゼの製造法 |
-
1984
- 1984-11-28 JP JP59250900A patent/JPS61128887A/ja active Pending
-
1985
- 1985-10-28 US US06/792,731 patent/US4698306A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-21 DE DE19853541242 patent/DE3541242A1/de active Granted
- 1985-11-27 FR FR8517528A patent/FR2573771B1/fr not_active Expired
- 1985-11-27 GB GB08529159A patent/GB2167421B/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8529159D0 (en) | 1986-01-02 |
| DE3541242C2 (ja) | 1987-08-06 |
| GB2167421B (en) | 1988-09-14 |
| GB2167421A (en) | 1986-05-29 |
| DE3541242A1 (de) | 1986-05-28 |
| US4698306A (en) | 1987-10-06 |
| FR2573771B1 (fr) | 1988-10-14 |
| FR2573771A1 (fr) | 1986-05-30 |
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