JPS6279781A - ペルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
ペルオキシダ−ゼの製造法Info
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- JPS6279781A JPS6279781A JP21861085A JP21861085A JPS6279781A JP S6279781 A JPS6279781 A JP S6279781A JP 21861085 A JP21861085 A JP 21861085A JP 21861085 A JP21861085 A JP 21861085A JP S6279781 A JPS6279781 A JP S6279781A
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- Japan
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はペルオキシダーゼの製造法に関する。
さらに詳しくは担子菌を培養して、その培養物よりペル
オキシダーゼを製造する方法に関する。
オキシダーゼを製造する方法に関する。
ペルオキシダーゼは一般に植物界に広く存在しており、
特に西洋ワサビ、イチジクおよび大用箋番二名Ｚ今孝ｈ
、イいスー王Ｕ炸手り土面性ワ廿ビ根部のペルオキシダ
ーゼ含量が最も高いなどの理由により、西洋ワサビより
ペルオキシダーゼが工業生産され、臨床診断試薬、例え
ば各酸化酵素と併用して血清中のグルコース、総コレス
テロールなどの定量にあるいは酵素免疫測定法における
標識酵素として幅広く用いられている。
特に西洋ワサビ、イチジクおよび大用箋番二名Ｚ今孝ｈ
、イいスー王Ｕ炸手り土面性ワ廿ビ根部のペルオキシダ
ーゼ含量が最も高いなどの理由により、西洋ワサビより
ペルオキシダーゼが工業生産され、臨床診断試薬、例え
ば各酸化酵素と併用して血清中のグルコース、総コレス
テロールなどの定量にあるいは酵素免疫測定法における
標識酵素として幅広く用いられている。
また、微生物起源のペルオキシダーゼとしては細菌およ
び糸状菌の生産するチトクロームＣペルオキシダーゼや
ＮＡＤＨペルオキシダーゼ等があるが、これらは西洋ワ
サビなどの植物起源のペルオキシダーゼとは作用が異な
り、臨床診断試薬としては利用できない。
び糸状菌の生産するチトクロームＣペルオキシダーゼや
ＮＡＤＨペルオキシダーゼ等があるが、これらは西洋ワ
サビなどの植物起源のペルオキシダーゼとは作用が異な
り、臨床診断試薬としては利用できない。
最近、アルタナリア属、コクリオポラス属、ペリキユラ
リア属、カープラリア属（特開昭５７−９９１９２号）
およびバチルス属（特開昭５８−１７９４８８号）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なペルオキシダ
ーゼを生産するとの報告がなされた。しかし、これらの
菌株のペルオキシダーゼ生産量は少なく、工業生産には
不利である。
リア属、カープラリア属（特開昭５７−９９１９２号）
およびバチルス属（特開昭５８−１７９４８８号）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なペルオキシダ
ーゼを生産するとの報告がなされた。しかし、これらの
菌株のペルオキシダーゼ生産量は少なく、工業生産には
不利である。
本発明者らは、工業的にペルオキシダーゼを製造する方
法として先蚤こ担子菌の生産するペルオキシダーゼにつ
いて鋭意検討を重ねた結果ヒトヨタケ属に属する担子菌
が培養物中に臨床診断試薬として優れた性質を有するペ
ルオキシダーゼを生産することを見い出した（特願昭５
９−２５０９００号）。
法として先蚤こ担子菌の生産するペルオキシダーゼにつ
いて鋭意検討を重ねた結果ヒトヨタケ属に属する担子菌
が培養物中に臨床診断試薬として優れた性質を有するペ
ルオキシダーゼを生産することを見い出した（特願昭５
９−２５０９００号）。
本発明者らは、上述したヒトヨタケ属に属する担子菌の
生産するペルオキシダーゼの生産量をさら（こ増大させ
るためそこ鋭意検討を重ねた結果、上記担子菌培養のた
めの培地中に鉄塩を添加して培養すればペルオキシダー
ゼの生産量が、鉄塩を含まぬ同じ培地で培養した場合に
比し、ペルオキシダーゼ生産量を２〜４倍に増大するこ
とができることを見い出し、本発明を完成した。
生産するペルオキシダーゼの生産量をさら（こ増大させ
るためそこ鋭意検討を重ねた結果、上記担子菌培養のた
めの培地中に鉄塩を添加して培養すればペルオキシダー
ゼの生産量が、鉄塩を含まぬ同じ培地で培養した場合に
比し、ペルオキシダーゼ生産量を２〜４倍に増大するこ
とができることを見い出し、本発明を完成した。
従って本発明の目的はヒトヨタケ属に属する担子菌を培
養して、臨床診断試薬として優れた性質を有するペルオ
キシダーゼを工業的条こさらに安価に製造する方法を提
供することにある。
養して、臨床診断試薬として優れた性質を有するペルオ
キシダーゼを工業的条こさらに安価に製造する方法を提
供することにある。
本発明を概説すれば、本発明はペルオキシダーゼの製造
法に関するものであって、ヒトヨタケ属に属し、ペルオ
キシダーゼ生産量を有する担子菌を、鉄塩を含有させた
培地で培養し、培養物からペルオキシダーゼを採取する
ことからなる。
法に関するものであって、ヒトヨタケ属に属し、ペルオ
キシダーゼ生産量を有する担子菌を、鉄塩を含有させた
培地で培養し、培養物からペルオキシダーゼを採取する
ことからなる。
本発明方法で得られるペルオキシダーゼは過ｅ化水ｆｌ
の存在下、４−７ミノアンチビリン（以下４−ＡＡと略
す）−フェノール系、４−ＡＡ −ジメチルアニリン系
、４−Ａｈ−Ｎ−エチル−Ｎ−ハイドロキシエチル−ｍ
−トルイジン（以下ＥＨＭＴと略す）系および３−メチ
／Ｌ／−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下ＭＢ
ＴＨと略す）−ジメチルアニリン系などを水素供与体と
して発色する故臨床診断試薬として使用可能である。
の存在下、４−７ミノアンチビリン（以下４−ＡＡと略
す）−フェノール系、４−ＡＡ −ジメチルアニリン系
、４−Ａｈ−Ｎ−エチル−Ｎ−ハイドロキシエチル−ｍ
−トルイジン（以下ＥＨＭＴと略す）系および３−メチ
／Ｌ／−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以下ＭＢ
ＴＨと略す）−ジメチルアニリン系などを水素供与体と
して発色する故臨床診断試薬として使用可能である。
本発明に使用される担子菌には、ヒトヨタケ科（Ｃｏｐ
ｒｉｎａｃｅａｅ ）ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ
）に属する菌株、例えばコプリナス・マクロリーザスＫ
−１３３０（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚ
ｕｓ、和名ネナガノヒトヨタケ）がある。この菌株は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第６４８号
として寄託しである。
ｒｉｎａｃｅａｅ ）ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ
）に属する菌株、例えばコプリナス・マクロリーザスＫ
−１３３０（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｍａｃｒｏｒｈｉｚ
ｕｓ、和名ネナガノヒトヨタケ）がある。この菌株は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第６４８号
として寄託しである。
本発明方法をさらに詳しく説明すれば、縞地に加える栄
養源は使用する菌株が利用し、ペルオキシダーゼを生産
するものであればよく、炭素源としては例えばグルコー
ス、デンプン、シュクロース、マルトース、ラクトース
、グリセロール、デキストリン、油脂類などが利用でき
、窒素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大豆、コ
ーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの無機
質および金属塩類を加えてもよく、さらにはビタミン類
、生長促進因子を加えてもよい。
養源は使用する菌株が利用し、ペルオキシダーゼを生産
するものであればよく、炭素源としては例えばグルコー
ス、デンプン、シュクロース、マルトース、ラクトース
、グリセロール、デキストリン、油脂類などが利用でき
、窒素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大豆、コ
ーンスチープリカー、肉エキスなどが適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの無機
質および金属塩類を加えてもよく、さらにはビタミン類
、生長促進因子を加えてもよい。
ペルオキシダーゼの生産量を高めるために、培地成分に
ついてさらに詳細に検討した結果、各種鉄塩の培地中へ
の添加がベルオキシダーゼル荒格か２〜ｌ忙憎士七ぜス
ー〉ｈ；如１■日また一培地に加える鉄塩としては、例
えば硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄などがあげられ、これらは
それぞれ単独にまたは２種以上混合して使用できる。
ついてさらに詳細に検討した結果、各種鉄塩の培地中へ
の添加がベルオキシダーゼル荒格か２〜ｌ忙憎士七ぜス
ー〉ｈ；如１■日また一培地に加える鉄塩としては、例
えば硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄などがあげられ、これらは
それぞれ単独にまたは２種以上混合して使用できる。
また培地に添加する鉄塩の添加量としては０．０１％〜
０．５０％、好ましくは０１０８％〜０．２０％が適当
である。なお鉄塩の添加量は重量／容量％で示す。
０．５０％、好ましくは０１０８％〜０．２０％が適当
である。なお鉄塩の添加量は重量／容量％で示す。
担子菌を培養するにあたり、ペルオキシダーゼの生産量
は培養条件により大きく変動するが、一般に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、４〜１２日間
の通気攪拌培養でペルオキシダーゼの生産は最高に達す
る。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ペ
ルオキシダーゼの生産量が最大になるように設定するの
は当然である。本発明の菌株によって生成されたペルオ
キシダーゼは主に培養Ｆ液中にあり、培養ｐ液に沈澱剤
例えば硫安を２０〜８０ｗ ／ ｖ％加えることにより
、あるいは有機溶媒例えばアルコール、アセトンなどを
５０〜８０ｖ ／ ｖ％加えることにより沈澱として分
離される。得られた沈澱物を限外濾過、透析あるいはセ
ファデックス処理などによって脱塩し、粗酵素液を得る
。得られた粗酵素液を精側するには、あらかじめ０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ
−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸
着させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）テ洗浄後、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐ）１７．
０）で溶出して活性区分を集める。次に、この活性区分
を限外濾過で濃縮、脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース（Ｃ
Ｌ−６Ｂ）のカラムに再び吸着させ、吸着物を０．０２
Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性区分を集
める。
は培養条件により大きく変動するが、一般に培養温度は
２０〜３５℃、培地のｐＨ４〜８が良く、４〜１２日間
の通気攪拌培養でペルオキシダーゼの生産は最高に達す
る。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ペ
ルオキシダーゼの生産量が最大になるように設定するの
は当然である。本発明の菌株によって生成されたペルオ
キシダーゼは主に培養Ｆ液中にあり、培養ｐ液に沈澱剤
例えば硫安を２０〜８０ｗ ／ ｖ％加えることにより
、あるいは有機溶媒例えばアルコール、アセトンなどを
５０〜８０ｖ ／ ｖ％加えることにより沈澱として分
離される。得られた沈澱物を限外濾過、透析あるいはセ
ファデックス処理などによって脱塩し、粗酵素液を得る
。得られた粗酵素液を精側するには、あらかじめ０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ
−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸
着させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）テ洗浄後、０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐ）１７．
０）で溶出して活性区分を集める。次に、この活性区分
を限外濾過で濃縮、脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロース（Ｃ
Ｌ−６Ｂ）のカラムに再び吸着させ、吸着物を０．０２
Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性区分を集
める。
この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥し、２精製酵
素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動的に単一である。
素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動的に単一である。
本発明のペルオキシダーゼの酵素化学的および理化学的
性質は次のとおりである。
性質は次のとおりである。
（１）作 用：
本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体となりうる化合物の酸化
を融媒する。その作用機構は以下に示すとおりである。
素の存在下で種々の水素供与体となりうる化合物の酸化
を融媒する。その作用機構は以下に示すとおりである。
Ｈ２０□＋ＡＨ２→２Ｈ２０＋ Ａ
なお、ＡＨ２は水素供与体を、Ａは酸化された水素供与
体を示す。
体を示す。
（２）水素供与体に対する特異性：
４−ＡＡと種々の化合物を組合せて水素供与体として用
いた場合に本酵素の水素供与体に第 １ 表 フェノール ５００ １００レ
ゾルシン １０ピロカ
テコール “ ５８ヒドロキノン
１０α−ナフトール
“ １８２．４−ジブロムフ
５２０ ４フェノール ２．４−ジクロロフ “ １１５エノー
ル ２．６−シクロロフ “ １５４エノー
ル ２．４．６−）リフ “ ９６０ロフ
エノール ジメチルアニリン ５５０ ２１ジエチ
ルアニリン “ ４９ＥＨＭＴ
６２また、ＭＢＴ
Ｈとジメチルアニリン、ジエチルアニリンあるいはＥＨ
ＭＴを組合せて水素供与体とした場合の特異性について
検討した（第２主） す−）、 各ｔ
「η し １ イ ＪＡ ＾ −−−＋ Ｉ
＋１・を水素供与体とした場合の相対値を１０
０とした。
いた場合に本酵素の水素供与体に第 １ 表 フェノール ５００ １００レ
ゾルシン １０ピロカ
テコール “ ５８ヒドロキノン
１０α−ナフトール
“ １８２．４−ジブロムフ
５２０ ４フェノール ２．４−ジクロロフ “ １１５エノー
ル ２．６−シクロロフ “ １５４エノー
ル ２．４．６−）リフ “ ９６０ロフ
エノール ジメチルアニリン ５５０ ２１ジエチ
ルアニリン “ ４９ＥＨＭＴ
６２また、ＭＢＴ
Ｈとジメチルアニリン、ジエチルアニリンあるいはＥＨ
ＭＴを組合せて水素供与体とした場合の特異性について
検討した（第２主） す−）、 各ｔ
「η し １ イ ＪＡ ＾ −−−＋ Ｉ
＋１・を水素供与体とした場合の相対値を１０
０とした。
ジメチルアニリン ５９０ ５０ジエチ
ルアニリン “ ４９ＥＨＭＴ
４１（４−ＡＡ−
フェノール ５００ １００）（３）至
適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第１図のグラフで表わされる如（、
ｐＨ７，０付近に高い活性を有している。ｐＨ３〜３．
５は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８５はリン酸緩衝液、ｐＨ９
〜９．５はホウ酸緩衝液を使用した。本酵素を３７℃に
おいてそれぞれのｐＨで６０分間処理したときのｐＨ安
定性を第２図に示した。第２図より明らかなように本酵
素はｐＨ６，０−ｐＨ７，５の間で安定である。
ルアニリン “ ４９ＥＨＭＴ
４１（４−ＡＡ−
フェノール ５００ １００）（３）至
適ｐＨおよびｐＨ安定性： 本酵素の至適ｐＨは第１図のグラフで表わされる如（、
ｐＨ７，０付近に高い活性を有している。ｐＨ３〜３．
５は酢酸緩衝液、ｐＨ６〜８５はリン酸緩衝液、ｐＨ９
〜９．５はホウ酸緩衝液を使用した。本酵素を３７℃に
おいてそれぞれのｐＨで６０分間処理したときのｐＨ安
定性を第２図に示した。第２図より明らかなように本酵
素はｐＨ６，０−ｐＨ７，５の間で安定である。
（４）至適温度および熱安定性：
本酵素の至適温度は第３図のグラフで表わされる如く、
３５°Ｃ〜４０℃付近に至ａ温度を有している。本酵素
をｐＨ７，０においてそれぞれの温度で１０分間処理し
たときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５℃ま
で安定であった。
３５°Ｃ〜４０℃付近に至ａ温度を有している。本酵素
をｐＨ７，０においてそれぞれの温度で１０分間処理し
たときの熱安定性を第４図に示した。本酵素は４５℃ま
で安定であった。
（５）分子量：
本酵素の分子量は、セファクリルＳ−２００（ファルマ
シア製）によるゲ）ｖ濾過法では約３７０００であり、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では約４１
０００であつへ（６）均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐ１４９．４）を用
いてディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したとこ
ろ１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示
した。
シア製）によるゲ）ｖ濾過法では約３７０００であり、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法では約４１
０００であつへ（６）均一性： ７．５％ポリアクリルアミドゲル（ｐ１４９．４）を用
いてディスク電気泳動を行ない、タンパク染色したとこ
ろ１本の染色帯が認められ単一であった。また、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動でも単一バンドを示
した。
（７）等電点：
ファルマライト（ｐＨ３〜１０、ファルマシア製）を用
いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等電点はｐＬ
：３．４〜３，５であった。
いた焦点電気泳動法により求めた本酵素の等電点はｐＬ
：３．４〜３，５であった。
（８）阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影響：本
酵素は８８代 シアン化カリウム、アジ化ナトリウム、
チオウレアなどによって阻害された（第３表）。
酵素は８８代 シアン化カリウム、アジ化ナトリウム、
チオウレアなどによって阻害された（第３表）。
無添加 １００ ヨード首酸１００Ｌ−システィン
１０５ ＥＤＴＡ ９７ジチオ
スレイトール ９５ ＣｕＳ０． １
０５チオウレア ５７ ＭｎＣ１，８６
シ７ン化カリウム ２２ ＦｅＣ１１０７アジ
化ナトリウム ５２ ＢａＣ１□ ９６
ＰＣＭＢ’ ９８ ＣｏＣ１□ ９８Ｆ
ＭＳ−米 ９８ ＺｎＣ１ｚ ８５フツ化
ナトリウム １０３ ５ｎＣ１□ ９２硫化
ナトリウム ８２ ＮｉＳＯ４９２α、α′
−ジピリジル １０３ ＨｇＣｌ２６米米 フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（９）可視部吸収スペ
クトル； このスペクトルを第５図に示す。
１０５ ＥＤＴＡ ９７ジチオ
スレイトール ９５ ＣｕＳ０． １
０５チオウレア ５７ ＭｎＣ１，８６
シ７ン化カリウム ２２ ＦｅＣ１１０７アジ
化ナトリウム ５２ ＢａＣ１□ ９６
ＰＣＭＢ’ ９８ ＣｏＣ１□ ９８Ｆ
ＭＳ−米 ９８ ＺｎＣ１ｚ ８５フツ化
ナトリウム １０３ ５ｎＣ１□ ９２硫化
ナトリウム ８２ ＮｉＳＯ４９２α、α′
−ジピリジル １０３ ＨｇＣｌ２６米米 フェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（９）可視部吸収スペ
クトル； このスペクトルを第５図に示す。
α０）酵素活性測定法：
ペルオキシダーゼ活性の測定は水素供与体として臨床診
断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノール系を用いて行
なった。即ち、５ｍＭ過酸化水素溶液０．１ｍＪ１０．
３ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．０ｄ、２４
．６ｍＭ ４−ＡＡ溶液０．１コ、０．４２Ｍフェノー
ル溶液Ｑ、 ｌ ｍｌ、水１．６−および適当に希釈し
た酵素液０．１ ｍｌ 、反応液量３、０ ｍｌで３７
℃、６０秒間反応させた後５００ｎｍの吸光度（ＯＤサ
ンプ／Ｌ／）を測定する。別に対照として過酸化水素溶
液の代わりに水を０．１１加え、同様の操作によって吸
光度（ＯＤブランク）を測定し、△ＯＤ、。。（ＯＤサ
ンプル−〇Ｄブランク）を求めた。ペルオキシダーゼ活
性は下記の計算式によって求められる。
断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノール系を用いて行
なった。即ち、５ｍＭ過酸化水素溶液０．１ｍＪ１０．
３ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１．０ｄ、２４
．６ｍＭ ４−ＡＡ溶液０．１コ、０．４２Ｍフェノー
ル溶液Ｑ、 ｌ ｍｌ、水１．６−および適当に希釈し
た酵素液０．１ ｍｌ 、反応液量３、０ ｍｌで３７
℃、６０秒間反応させた後５００ｎｍの吸光度（ＯＤサ
ンプ／Ｌ／）を測定する。別に対照として過酸化水素溶
液の代わりに水を０．１１加え、同様の操作によって吸
光度（ＯＤブランク）を測定し、△ＯＤ、。。（ＯＤサ
ンプル−〇Ｄブランク）を求めた。ペルオキシダーゼ活
性は下記の計算式によって求められる。
６．１７ＸｔＸＶｓ
＝△ＯＤ５゜。Ｘ４．８６Ｘｄｆ
ｖｔ：反応液ｉ（３，０ｒｌＬｔ）
ｖ８：酵素液（Ｑ、 ｌ ｍｌ）
ｔ：反応時間（１分間）
ｄｆ：希釈率
〔実施例〕
以下に本発明によるペルオキシダーゼの製造方法を実施
例をもって示すが、本発明が以下の実施例に限定される
ものではない。
例をもって示すが、本発明が以下の実施例に限定される
ものではない。
実施例 １
ペルオキシダーゼ生産量に及ぼす鉄塩の添加効果
グルコース２％、エビオス０．５％および寒天１．５％
（エビオス培地）の組成の斜面培地にコプリナス・マク
ロリーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）を接
種し、２５℃にて１週間静置培養して種菌とした。グル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％、Ｍｇ５Ｏ，”７Ｈ，０，１％の組成
の培地１００ｍ１を５００Ｍ容の三角フラスコに分注し
、これにＦｅＳＯ４・７Ｈ２０が０％、０．０４％、０
．０８％、０．１２％、０．１６％、０．２０％、０．
２４％、０．３２％の濃度になるように各々のフラスコ
に添加して、１２０°Ｃで２０分間殺菌後、冷却し、こ
れに上記の種菌をかきとり接種して、２６℃で５〜１０
日間、毎分１００ ｒｐｍで振盪培養し、経時的にサン
プリングした。これらの培養液を濾過して菌体を除き、
得られたｐ液の各々のベルオキシダ、−ゼ活性（最大活
性）を第４表に示す。
（エビオス培地）の組成の斜面培地にコプリナス・マク
ロリーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）を接
種し、２５℃にて１週間静置培養して種菌とした。グル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％、Ｍｇ５Ｏ，”７Ｈ，０，１％の組成
の培地１００ｍ１を５００Ｍ容の三角フラスコに分注し
、これにＦｅＳＯ４・７Ｈ２０が０％、０．０４％、０
．０８％、０．１２％、０．１６％、０．２０％、０．
２４％、０．３２％の濃度になるように各々のフラスコ
に添加して、１２０°Ｃで２０分間殺菌後、冷却し、こ
れに上記の種菌をかきとり接種して、２６℃で５〜１０
日間、毎分１００ ｒｐｍで振盪培養し、経時的にサン
プリングした。これらの培養液を濾過して菌体を除き、
得られたｐ液の各々のベルオキシダ、−ゼ活性（最大活
性）を第４表に示す。
無添加 １９．４
０．０４ ２８．０
０．０８ ４６．４０．１２
７５．５０．１６
８０．２０．２０ ６
６．００．２４ ３６．８０
．３２ １７．０第４表より
明らかなように培地中に鉄塩を添加すれば、ペルオキシ
ダーゼの生産量が著しく増大した。なおＦｅ５０．・７
Ｈ２０の最適添加量は０．０８〜０．２０％であった。
７５．５０．１６
８０．２０．２０ ６
６．００．２４ ３６．８０
．３２ １７．０第４表より
明らかなように培地中に鉄塩を添加すれば、ペルオキシ
ダーゼの生産量が著しく増大した。なおＦｅ５０．・７
Ｈ２０の最適添加量は０．０８〜０．２０％であった。
実施例 ２
実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
，ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，１％およ
びＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，１６％の組成の培地１００
ｍ／を分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５ ０
０ｍ容の三角フラスコに接種し、２７℃で１０日間、毎
分１００ ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。このペルオキシダーゼ活性
は７９．４単位／ ｍｌであった。
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
，ＰＯ４０，３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，１％およ
びＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，１６％の組成の培地１００
ｍ／を分注して殺菌（１２０℃、２０分間）した５ ０
０ｍ容の三角フラスコに接種し、２７℃で１０日間、毎
分１００ ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。このペルオキシダーゼ活性
は７９．４単位／ ｍｌであった。
実施例 ３
実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４’７Ｈ２０，０，１
％の培地１００ｒＬｌを分注して殺菌（１２０°０１２
０分間）した５ ００ｍＪ容の三角フラスコに接種し、
２６℃で７日間培養して、種培養液とした。グルコース
２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、ＭｇＳＯ４Φ７Ｈ２００，１％、ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２００，１６％および消泡剤（日本油脂社製Ｃ
Ｂ−４４２） ０．０２％の組成の培地２０１を３０１
容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間
殺菌した。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２
６°Ｃで８日間、毎分１３１の通気速度と毎分２７０回
転の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４’７Ｈ２０，０，１
％の培地１００ｒＬｌを分注して殺菌（１２０°０１２
０分間）した５ ００ｍＪ容の三角フラスコに接種し、
２６℃で７日間培養して、種培養液とした。グルコース
２％、酵母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、ＭｇＳＯ４Φ７Ｈ２００，１％、ＦｅＳＯ
４・７Ｈ２００，１６％および消泡剤（日本油脂社製Ｃ
Ｂ−４４２） ０．０２％の組成の培地２０１を３０１
容のジャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間
殺菌した。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２
６°Ｃで８日間、毎分１３１の通気速度と毎分２７０回
転の攪拌速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過し
て菌体を除き、Ｆ液を得た。
このペルオキシダーゼ活性は８４．１単位／ＴＩＬｌで
あった。この培養戸液１７Ｊに硫酸アンモニウムを８０
％飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈
澱物を約５００−の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解した。この粗酵素液を限外炉渦で迫妹１−腫
市１各−予めｎｏ１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩
衝化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラ
ム（直径５．０ｃｒｒＬ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２ＭＩＪン酸緩倫液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集めｔ為次にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝
化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム
（直径２、５ ｃｒｒＬＸ長さ４ｃｒｒＬ）に再び吸着
させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０
）で洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
溶出して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透
析後、凍結乾燥し、精製酵素粉末１００７Ｔｎ９を得た
。この粉末の比活性は１１８２単位／ダであった。この
酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動的
に単一であった。以上の精第 ５ 表 培養ｐ液 ２４００００ １４３００００ ５９６
１００硫安塩析 ４０５４０ １４２７０００
３５．２ ９９．８限外濾過 １６３９０ １４
１１０００ ８６．１ ９８．７参考例 １ 実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキ７、０．３％、ペプトン１％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１
％の組成の培地１００−を分注して殺菌（１２０℃、２
０分間）ｌＪ、；５００ｍ１容の三角フラスコに接種し
、２７℃で１０日間、毎分１００ ｒｐｍで振盪培養し
た。培養終了後、濾過して菌体を除き、ｐ液を得た。こ
のペルオキシダーゼ活性は２０．０単位／４であった。
あった。この培養戸液１７Ｊに硫酸アンモニウムを８０
％飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈
澱物を約５００−の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解した。この粗酵素液を限外炉渦で迫妹１−腫
市１各−予めｎｏ１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩
衝化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラ
ム（直径５．０ｃｒｒＬ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２ＭＩＪン酸緩倫液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集めｔ為次にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝
化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム
（直径２、５ ｃｒｒＬＸ長さ４ｃｒｒＬ）に再び吸着
させ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０
）で洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
溶出して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透
析後、凍結乾燥し、精製酵素粉末１００７Ｔｎ９を得た
。この粉末の比活性は１１８２単位／ダであった。この
酵素粉末はポリアクリルアミドゲルディスク電気泳動的
に単一であった。以上の精第 ５ 表 培養ｐ液 ２４００００ １４３００００ ５９６
１００硫安塩析 ４０５４０ １４２７０００
３５．２ ９９．８限外濾過 １６３９０ １４
１１０００ ８６．１ ９８．７参考例 １ 実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキ７、０．３％、ペプトン１％、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１
％の組成の培地１００−を分注して殺菌（１２０℃、２
０分間）ｌＪ、；５００ｍ１容の三角フラスコに接種し
、２７℃で１０日間、毎分１００ ｒｐｍで振盪培養し
た。培養終了後、濾過して菌体を除き、ｐ液を得た。こ
のペルオキシダーゼ活性は２０．０単位／４であった。
参考例 ２
実施例１のエビオス培地で培養したコプリナス・マクロ
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキスＯ１３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１％
の培地１００ｍ１を分注して殺菌（１２０℃、２０分間
）した５００ｍ１容の三角フラスコに接種し、２６℃で
７日間培養して、種培養液とした。グルコース２％、酵
母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，３
％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ
２００，００５％および消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４
４２） ０．０２％の組成の培地２０１を３０１容のジ
ャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌し
た。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２６℃で
６日間、毎分１３Ｊの通気速度と毎分２７０回転の攪拌
速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過して菌体を
除き、ｒ液を得た。
リーザスに−１３３０（微工研条寄第６４８号）をグル
コース２％、酵母エキスＯ１３％、ペプトン１％、ＫＨ
２ＰＯ４０，３％およびＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，１％
の培地１００ｍ１を分注して殺菌（１２０℃、２０分間
）した５００ｍ１容の三角フラスコに接種し、２６℃で
７日間培養して、種培養液とした。グルコース２％、酵
母エキス０．３％、ペプトン１％、ＫＨ２ＰＯ４０，３
％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ
２００，００５％および消泡剤（日本油脂社製ＣＢ−４
４２） ０．０２％の組成の培地２０１を３０１容のジ
ャーファーメンタ−に入れ、１２０℃で２０分間殺菌し
た。冷却後上記の種培養液１００ｄを接種し、２６℃で
６日間、毎分１３Ｊの通気速度と毎分２７０回転の攪拌
速度の条件下で培養した。培養終了後、濾過して菌体を
除き、ｒ液を得た。
このペルオキシダーゼ活性は４１．５単位／ ｍｌであ
った。この培ＯＦ液１７１に硫酸アンモニウムを８０％
飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈澱
物を約５００罰の０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解した。この粗酵素液を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、予め０．０１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
緩尉化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカ
ラム（直径５．０ ｃｍ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２Ｍ１ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集め九人にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、脱
塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化
したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム（
直径２、５ Ｃ１ｒＬＸ長さ４ｃｒＩＬ）に再び吸着さ
せ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出
して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透析後
、凍結乾燥し、精製酵素粉末４９４ｒｎ９を得た。
った。この培ＯＦ液１７１に硫酸アンモニウムを８０％
飽和になるように加えて、−昼夜放置後、得た硫安沈澱
物を約５００罰の０． ＯＩ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解した。この粗酵素液を限外濾過で濃縮し、
脱塩後、予め０．０１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
緩尉化したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカ
ラム（直径５．０ ｃｍ×長さ４α）に吸着させ、吸着
物を０．０２Ｍ１ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄後
、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出して活性
区分を集め九人にこの活性区分を限外濾過で濃縮し、脱
塩後、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化
したＤＥＡＥ−セファロース（ＣＬ−６Ｂ）のカラム（
直径２、５ Ｃ１ｒＬＸ長さ４ｃｒＩＬ）に再び吸着さ
せ、吸着物を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
洗浄後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出
して活性区分を集めた。この活性区分を蒸留水で透析後
、凍結乾燥し、精製酵素粉末４９４ｒｎ９を得た。
この粉末の比活性は１１８０単位／即であった。
この酵素粉末はポリ７クリルアミドゲルデイスク？ｌｅ
ケ法＠Ｉ＋的にＢｔ−千木っｔ・へじＪμの詰ｎ母Ｔ程
を第６表に示す。
ケ法＠Ｉ＋的にＢｔ−千木っｔ・へじＪμの詰ｎ母Ｔ程
を第６表に示す。
培養ｒ液 ２３７５００ ７０７０００ ２．９８
１００硫安塩析 ４１２００ ７２４０００
１７．６ １０２限外Ｆ’過１７０００ ７０３０
００ ４１．４ ９９．４〔発明の効果〕 本発明により臨床診断試薬として有用なペルオキシダー
ゼの生産量が従来法と比較し２〜４倍に増大し、有利な
工業的生産に適した製造法が提供された。
１００硫安塩析 ４１２００ ７２４０００
１７．６ １０２限外Ｆ’過１７０００ ７０３０
００ ４１．４ ９９．４〔発明の効果〕 本発明により臨床診断試薬として有用なペルオキシダー
ゼの生産量が従来法と比較し２〜４倍に増大し、有利な
工業的生産に適した製造法が提供された。
第１図は本発明により得られるペルオキシダーゼのｐＨ
と活性の関係を表わす。第２図は本発明による酵素を３
７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理した後のｐ
Ｈと活性の関係を表わし、第３図は温度と活性の関係を
表わし、第４図はｐＨ７，０においてそれぞれの温度で
１０分開始理した後の温度と活性の関係を表わす。第５
図は本発明による酵素の可視部吸収スペクトル（酵素濃
度０．０５７％、ｐＨ７，０）を表わす。
と活性の関係を表わす。第２図は本発明による酵素を３
７℃においてそれぞれのｐＨで６０分間処理した後のｐ
Ｈと活性の関係を表わし、第３図は温度と活性の関係を
表わし、第４図はｐＨ７，０においてそれぞれの温度で
１０分開始理した後の温度と活性の関係を表わす。第５
図は本発明による酵素の可視部吸収スペクトル（酵素濃
度０．０５７％、ｐＨ７，０）を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトヨタケ属に属するペルオキシダーゼ生産菌を培
地で培養し、培養物よりペルオキシダーゼを採取するこ
とによるペルオキシダーゼの製造法において、上記培地
に鉄塩を含有させることを特徴とするペルオキシダーゼ
の製造法。 ２、鉄塩が硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄の１種または２種以
上の混合物である特許請求の範囲第１項記載のペルオキ
シダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21861085A JPS6279781A (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21861085A JPS6279781A (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6279781A true JPS6279781A (ja) | 1987-04-13 |
Family
ID=16722650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21861085A Pending JPS6279781A (ja) | 1985-10-01 | 1985-10-01 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6279781A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010281652A (ja) * | 2009-06-04 | 2010-12-16 | Kikkoman Corp | ペルオキシダーゼ化学発光測定試薬 |
-
1985
- 1985-10-01 JP JP21861085A patent/JPS6279781A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010281652A (ja) * | 2009-06-04 | 2010-12-16 | Kikkoman Corp | ペルオキシダーゼ化学発光測定試薬 |
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